PL180752B1

PL180752B1 - Sposób wytwarzania oczyszczonego białka

Info

Publication number: PL180752B1
Application number: PL94307726A
Authority: PL
Inventors: Jürgen Hemberger; Guido Melzer
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 2001-04-30
Also published as: KR100455639B1; CA2143416A1; HU214580B; CA2143416C; KR950703004A; PL307726A1; US5710131A; DK0662088T3; CN1111058A; ES2169080T3; CZ287472B6; KR20040030124A; JPH08500848A; AU7383694A; HUT71399A; CZ52895A3; NO320150B1; ATE210679T1; PT662088E; NO950732D0

Abstract

1. Sposób wytwarzania oczyszczonego bialka, pozbawionego aktywnosci kolageno- litycznej, wiazacego sie z kolagenem i hamujacego stymulowana kolagenem agregacje plytek krwi oraz zapobiegajacego oddzialywaniom pomiedzy kolagenem i czynnikiem von Wille- branda (vWF) polegajacego na pobraniu sliny od odpowiedniego gatunku pijawki, izolowa- niu bialek a nastepnie ich oczyszczaniu, znamienny tym, ze ze sliny pijawki lekarskiej Hirudo medicinalis izoluje sie bialko w jednym etapie technika preparatywnej elektroforezy na zelu poliakryloamidowym w warunkach redukujacych (SDA-PAGE) i otrzymane frakcje bialka o masie czasteczkowej 14000 do 15500 laczy sie. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania oczyszczonego białka. Białko to działa jako silny inhibitor stymulowanej kolagenem aktywacji i agregacji płytek aprzede wszystkim, wykazuje właściwość zapobiegania interakcjom między kolagenem a czynnikiem von Willebranda.

Zatrzymanie krwawienia u ludzi jest regulowane w normalnych warunkach szeregiem złożonych, powiązanych wzajemnie mechanizmów z zaangażowaniem czynników biochemicznych zarówno komórkowych jak i humoralnych. W szlaku biochemicznym, uszkodzenie zdrowych komórek śródbłonka wywołuje stymulację płytek i aktywację mechanizmów krzepnięcia. W przypadku uszkodzenia ściany naczynia, jednym z pierwszych wydarzeń jest narażenie tkanki podśródbłonkowej na zetknięcie z krwią. Uznaje się, że kolagen tkanki podśródbłonkowej jest jednym z pierwszych bodźców prowadzących do adhezji płytek, następnie zmiany kształtu, agregacji i powstawania zakrzepu.

Interwencja lecznicza na poziomie adhezji i/lub agregacji płytek jest zatem użyteczna do zapobiegania lub leczenia większości zaburzeń na tle zakrzepowym.

Wiadomo, że ślina pijawki zawiera wiele czynników hamujących agregację płytek.

I tak, dobrze znanym związkiemjekt hirudyna(Merck Mdex, nrd613; FEBS Lett. 165,180, 1984). Hirudyna zapobiega indukowanej trnmbiza agregacji płytek przez wiązanie z trombinąz wytworzeniem kompleksu w stosunku s1dchiome1rycznym 1:1. To z kolei hamuje katalizowane trombiną przekształcenie fibeenogezu w fibrynę.

W opisie patentowym europejskim nr EP-A-0S48208 ujawniony jest zisZoczasleczZowy, modulowany receptorem, antagonista czynnika aktywacji płytek pochodzący ze śliny organizmów z rodziny HiruZiZiZae, posiadający aktywność hamowania agregacji płytek indukowanej przez środki agregacyjne, takie jak czynnik aktywujący płytki (PAF). Kolagenaza, która specyficznie rozkłada kolagen na drodze hydrolityczzdgn rozszczepienia wiązań peptydowych w rejonach helikalnych cząsteczki kolagenu, jest ujawniona w opisie patentowym PCT, WO 87/00860.

Pijawka lekarska (Hirudo medicinalis) używa nie tylko hieudyzy do zapobiegania powstawania zakrzepu w miejscu ukłucia. Wyraźną cechą charakterystyczną ukłucia tej pijawki jest długotrwałe krwawienie, trwające ponad 10 a nawet 24 godziny natomiast hirudynajes1 wypłukiwana z rany w ciągu 15 do S0 minut. Tak więc, oprócz hiruclyny, inne składniki muszą być odpowiedzialne za ten efekt. Ostatnio zostało opisane białko z Hirudo medicizalis (opis patentowy PCT, WO 92/07005), o masie cząsteczkowej równej 65000, nazwane białkiem „Calin”, wykazujące właściwość zapobiegania stymulowanej kolagenem agregacji płytek.

Inny nisZocząs1dczZowy (16000) inhibitor indukowanej kolagenem agregacji płytek, o nazwie 5APP znaleziono w Haemdz1dπa officinalis (opis patentowy europejski, EP-A-0480651).

180 752

Żadne z tych białek nie posiada ważnej właściwości wpływu na adhezję płytek, w której pośredniczy czynnik von Willebranda (vWF). Czynnik von Willebranda jest złożoną multimeryczną glikoproteiną odgrywającą podstawową rolę w funkcji płytek. Jest on potrzebny dla normalnej adhezji płytek przy zetknięciu z tkanką podśródbłonkową i do utworzenia czopu płytkowego w miejscach uszkodzeń naczyń krwionośnych. Funkcja czynnika von Willebranda jest szczególnie ważna w naczyniach mniejszych, gdzie przeważają warunki wysokich sił ścinania. Obecnie wykryto, że mechanizmy leżące u podstaw funkcji czynnika von Willebranda obejmują interakcję ze składnikami tkanki podśródbłonkowej oraz ze specjalnymi receptorami na błonie płytki (Ruggeri i wsp., Meth. Enz. 215, 263-275, 1992).

Tak więc, interferacja odpowiedniego białka z czynnikiem von Willebranda mogłaby być korzystna w zastosowaniach terapeutycznych.

Obecnie okazało się, że nowe białko o masie cząsteczkowej około 15000 działa jako silny inhibitor stymulowanej kolagenem agregacji i adhezji płytek, a przede wszystkim, zapobiega interakcjom między kolagenem a czynnikiem von Willebranda. Pożądanym byłoby zatem opracowanie sposobu otrzymywania białka o takich właściwościach. Nieoczekiwanie okazało się, że białko to można otrzymać na drodze techniki elektroforezy.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czyszczonego białka, pozbawionego aktywności kolagenolitycznej, wiążącego się z kolagenem i hamującego stymulowaną kolagenem agregację płytek krwi oraz zapobiegającego oddziaływaniom pomiędzy kolagenem i czynnikiem von Willebranda (vWF) polegającego na pobraniu śliny od odpowiedniego gatunku pijawki, izolowaniu białek a następnie ich oczyszczaniu, charakteryzujący się tym, że ze śliny pijawki lekarskiej Hirudo medicinalis izoluje się białko w jednym etapie techniką preparatywnej elektroforezy na żelu poliakryloamidowym w warunkach redukujących (SDS-PAGE) i otrzymane frakcje białka o masie cząsteczkowej 14000 do 15500 łączy się. Korzystnie surowy materiał oczyszcza się metodąchromatografii jonowymiennej a następnie metodą chromatografii żelowej.

Nowe białko otrzymywane sposobem według wynalazku ma masę cząsteczkową wynoszącą 14000 - 15500, korzystnie 14500 - 15000 (zależnie od metody oznaczania) i zapobiega interakcjom między kolagenem a czynnikiem von Willebranda. Znane białko LAPP ma natomiast masę cząsteczkową 16000 i zostało wyizolowane z Haementeria officinalis. Dotychczas nie udowodniono wpływu LAPP na czynnik von Willebranda. Inną ważną cechą nowego białka otrzymanego sposobem według wynalazku (temu białku nadano nazwę Brandinin; Brandynina) jest skład sekwencji aminokwasowych białka LAPP.

Te i inne, wyszczególnione poniżej różnice odróżniają białko otrzymywane zgodnie ze sposobem według wynalazku od innych białek wykazujących aktywność hamującą na agregację płytek.

W skład białka uzyskanego zgodnie ze sposobem według wynalazku wchodzą odmiany oczyszczonego białka zachowujące aktywność wyizolowanego białka.

Białko otrzymane sposobem według wynalazku może wchodzić w skład różnych leków farmaceutycznych jako czynnik aktywny. Leki te zawierają wtedy zwykle także jeden lub większą ilość dopuszczalnych farmaceutycznie nośników, środków pomocniczych lub rozcieńczalników.

Farmaceutyczne formy leku mogą ewentualnie zawierać dodatkowe składniki aktywne, takie jak środki przeciwzakrzepowe, np. hirudynę lub heparynę albo środki trombolityczne, np. aktywator plazminogenu lub hementynę.

Białko i farmaceutyczne formy leku zawierające białko otrzymane sposobem według wynalazku mogą być stosowane do leczenia różnych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych, w tym, zakrzepicy naczyń żylnych, zakrzepicy tętnic obwodowych, zakrzepów naczyń mózgowych i zawału mięśnia sercowego oraz pacjentów z zespoleniem obocznym tętniczo-żylnym lub podlegającym operacji przeszczepu wieńcowego omijającego. Formy te mogąbyć również stosowane do leczenia chorób autoimmunologicznych, w tym tocznia rumieniowatego, pierwotnie postępującego gośćca stawowego i guzowatego zapalenia wielostawowego. Te formy leku sąrównież użyteczne do stymulowania zjawiska przedłużonego krwawienia obserwowanego po ukłuciach

180 752 pijawek. Mogą zastępować pijawki, całkowicie lub częściowo, w tych stanach, jakie są obecnie wskazaniem do stosowania pijawek.

Wspomniane białko może tworzyć dopuszczalne farmaceutycznie sole z nietoksycznymi kwasami nieorganicznymi lub organicznymi. W solach tych jako kwas nieorganiczny może występować np. kwas solny, bromowodorowy, siarkowy lub fosforowy albo kwaśne sole metali, np. ortofosforan dwusodowy, wodorosiarczan potasowy. Jako przykłady kwasów organicznych można podać kwasy mono- di- i trójkarboksylowe, np. kwas octowy, glikolowy, mlekowy, pirogronowy, malonowy, bursztynowy, glutarowy, fumarowy, jabłkowy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, maleinowy, hydroksymaleinowy, benzoesowy, hydroksybenzoesowy, fenylooctowy, cynamonowy, salicylowy oraz kwasy sulfonowe, takie jak kwas metanosulfonowy. Sole z grupą karboksylową końcowej reszty aminokwasowej obejmują nietoksyczne sole reszty kwasu karboksylowego z odpowiednimi zasadami nieorganicznymi lub organicznymi. Do soli takich należą np. sole z metalami alkalicznymi, np. sodem lub potasem, metalami ziem alkalicznych, np. wapniem, magnezem, z metalami lekkimi grupy IIIA, np. z glinem oraz z organicznymi pierwszorzędowymi, drugorzędowymi i trzeciorzędowymi aminami, takimi jak trójalkiloaminy, np. trój etyloamina, prokaina, dibenzyloamina, 1-etenoamina, N, N'-dibenzyloetylenodiamina, dihydroabietyloamina i N-alkilopiperydyna.

Formy leku można podawać w formie dawek jednostkowych zawierających zwykle używane, nietoksyczne, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, rozcieńczalniki, środki pomocnicze oraz nośniki typowe dla form podawanych parenteralnie. Termin „parenteralny” oznacza w niniejszym opisie podawanie drogą iniekcji podskórnych, dożylnych, dostawowych i dotchawiczych oraz drogą infuzji. Formy dawekjednostkowych mogą zawierać wymagane dziennie ilości białka otrzymanego sposobem według wynalazku albo ich podwielokrotności, tak, aby można było dopasować żądaną dawkę.Optymalna akceptowalna dawka lecznicza dla danego pacjenta (ssaka, w tym człowieka) zależy od wielu czynników, takichjak aktywność zastosowanego materiału aktywnego, wieku, wagi ciała, stanu zdrowia, płci, diety, czasu i drogi podania, szybkości eliminacji z organizmu i podobnych. Niezbędne stężenie we krwi, które hamuje stymulację agregacji płytek przez kolagen wynosi korzystnie od 0,1 mg/litr do 50 mg/litr.

Używany w opisie termin „nośnik dopuszczalny farmaceutycznie” oznacza obojętny, nietoksyczny, stały lub ciekły wypełniacz, rozcieńczalnik lub materiał zamykający w kapsułce, nie reagujący niekorzystnie ze związkiem aktywnym ani nie oddziałujący niekorzystnie na pacjenta. Odpowiednie, korzystne ciekłe nośniki są znane i zalicza się do nich wodę sterylną, sól fizjologiczną, wodny roztwór glukozy, roztwory cukru, etanol, glikole i oleje, w tym nafta, oleje zwierzęce, roślinne lub syntetyczne, np. olej arachidowy, sojowy i olej mineralny. Nośniki mogą być również dopuszczalnymi farmaceutycznie żelami albo kremami, nadającymi się do powlekania przed użyciem, przyrządów medycznych, które powszechnie wykonuje się z tworzyw sztucznych i włókien syntetycznych (o czym w dalszej części opisu).

Opracowano też materiały medyczne do implantacji albo użycia poza ciałem, przeznaczone do stosowania w kontakcie z płynami organizmu, nadano powierzchni tych materiałów znaczącą oporność na powstawanie zakrzepów przez ich powlekanie immobilizowanym białkiem otrzymanym sposobem według wynalazku i zdefiniowanym powyżej. Białko to immobilizuje się na materiale medycznym w celu nadania powierzchni tego materiału właściwości zgodności biologicznej (biokompatybilności) i oporności na krzepnięcie. Takie materiały mają niekiedy powierzchnie zwilżalne, z zasady wywołujące agregację płytek, co stanowi cechę niekorzystnąw odniesieniu do zamierzonego zastosowaniajako materiałów przeznaczonych do implantacji bądź do użycia poza ciałem, w kontakcie z krwią lub innymi płynami organizmu. Przykładami takich materiałów medycznych są protezy, sztuczne narządy, nici chirurgiczne, sztuczne segmenty naczyń krwionośnych, katetery, dializatory, probówki i naczynia na krew.

Powlekanie materiałów medycznych i immobilizację białka prowadzi się wykorzystując techniki standardowe (np. podane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, nr 4.885.207).

180 752

Krótki opis figur na rysunkach

Na figurze 1 przedstawionejest oczyszczanie Brandyniny ze śliny pijawki metodą chromatografii żelowej. Szczegóły sąpodane w przykładzie II. Zakreskowane obszary wskazują na frakcje aktywne. Liczby podane pod krzywą (1 do 14) oznaczają numery frakcji. Na fig. 2 przedstawione jest oczyszczanie Brandyniny metodą elektroforezy żelowej z dodecylosulfonianem sodowym (SDS). Szczegóły sąpodane w przykładzie IV. Przedstawione są frakcje o numerach 8 do 12 oraz znaczniki (M). Frakcje 10 i 11 są dodatnie według analizy prowadzonej w sposób opisany w przykładzie I. Figura 3 przedstawia krzywą aktywności kolagenolitycznej oznaczanej z użyciem odczynnika AzocollR Szczegóły sąpodane w przykładzie IV. Na osi pionowej odłożona jest gęstość optyczna (OD) przy długości fali 560 nm. Na osi poziomej odłożona jest aktywność kolagenazy (milijednostek/próbę).

Na figurze 4a przedstawione jest zależne od dawki hamowanie stymulowanej kolagenem agregacji płytek. Szczegóły sąpodane w przykładzie V. Na osi pionowej odłożona jest agregacja (w procentach), na osi poziomej: stężenie Brandyniny (w milimolach). Na fig. 4b przedstawione jest kolageno-swoiste hamowanie agregacji płytek. Szczegóły sąpodane w przykładzie V. Na osi pionowej odłożona jest agregacja (w procentach), na osi poziomej: 1 = kontrola, 2 = kolagen, 3 = kwas adenozynodwufosforowy (ADP). Na fig. 5 przedstawione jest zależne od dawki hamowanie wiązania czynnika von Willebranda z kolagenem. Szczegóły sąpodane w przykładzie VI. Na osi pionowej odłożona jest gęstość optyczna (OD) przy długości fali 405 nm. Na osi poziomej odłożone jest stężenie oczyszczonego białka (nM).

• oczyszczone białko • kontrola w stosunku do białka

Wynalazek opisany jest bardziej szczegółowo w następujących przykładach.

Przykład I

Aktywność in vitro białka z Hirudo medicinalis jako inhibitora stymulowanej kolagenem agregacji płytek

W surowej ślinie z Hirudo medicinalis wykrywa się aktywność hamowania w sposób zależny od dawki agregacji płytek w obecności kolagenu w osoczu bogatym w płytki (PRP). Od ochotników pobiera się krew i dodaje cytrynianu sodowego do końcowego stężenia wynoszącego 0,38%. Osocza bogate w płytki i ubogie w płytki przygotowuje się metodą wirowania różnicowego. Agregację płytek oznacza się w agregometrze PAP-4 (firmy Biodata), dodając różne stężenia kolagenu o nazwie handlowej Collagen horm® (dostarczonego przez Hormonchemie). Oznaczanym parametrem jest maksymalna ekstynkcja po dodaniu kolagenu. Środki antytrombotyczne obniżają te wartości.

Opisane powyżej oznaczenie prowadzono w ciągu całego procesu oczyszczania białka i charakteryzacji oczyszczonego białka według wynalazku.

Przykład II

Izolacja i oczyszczanie chromatograficzne białka

Białko według wynalazku można izolować z surowej śliny pijawki Hirudo medicinalis. Liofilizowaną ślinę odtwarza się w buforze TC o składzie: 20 mM Tris HCl, 10 mM CaCl₂ (pH = 8,0) pobranym w takiej ilości aby uzyskać stężenie 20 mg/ml. Roztwór śliny podaje się następnie na kolumnę CM-FraktogelR (E. Merck, Darmstadt, Niemcy) i prowadzi się eluowanie gradientem NaCl w tym samym buforze. Schodzące z kolumny frakcje wykazujące aktywność w opisanej w przykładzie I próbie na hamowanie agregacji płytek nie wykazywały aktywności hirudyny. Końcowe oczyszczanie prowadzi się metodą chromatografii żelowej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym modyfikowanym diolem, stosując do eluowania bufor TCN o składzie: 20 mM Tris HCl, 10 mM CaCl₂,200 mM NaCl (pH = 8,0). Typowa próbka otrzymana w tym etapie oczyszczaniajest przedstawiona na fig. 1. Wydajność oczyszczonego białka w stosunku do ilości białka w surowej ślinie wynosi 5%. W innych doświadczeniach otrzymano wydajności w zakresie 2 i 7%.

Przykład III

Jednoetapowe oczyszczanie białka metodą preparatywnej elektroforezy

180 752

Alternatywnie, białko można z powodzeniem izolować jednoetapowo, metodą preparatywnej elektroforezy. W zestawie „Prep-cell”^R (Biorad, Monachium, Niemcy) polimeryzuje się cylindryczną warstwę żelu poliakryloamidowego z dodatkiem na ogół 10% akryloamidu, postępując według instrukcji producenta. Próbki wprowadza się w buforze do elektroforezy. Podczas elektroforezy strumień buforu prostopadły do kierunku elektroforezy służy do transportu eluowanych białek do kolektora frakcji. Kolejne frakcje analizuje się metodą analitycznej elektroforezy w poliakryloamidzie z dodecylosiarczanem sodu (SDS) i zbiera według masy cząsteczkowej, łącząc frakcje o masie cząsteczkowej 15000. W innym doświadczeniu oznaczona wartość masy cząsteczkowej wynosiła 14500.

Przykład IV

Charakterystyka białka

Oczyszczone białko wykazujące aktywność według przykładu I ma masę cząsteczkową około 15000 oznaczaną w warunkach redukujących metodą elektroforezy dodecylosiarczan sodu - żel poliakryloamidowy (SDS-PAGE). Na fig. 2 przedstawione są aktywne frakcje z typowej chromatografii żelowej opisane w przykładzie II. Pasma białka na żelu wizualizowano przez barwienie srebrem.

W oczyszczonym białku nie można było wykryć żadnej aktywności proteolitycznej stosując preferowany sposób oznaczania opisany poniżej. Jako substrat zastosowano kazeinę modyfikowaną rezorufinąR (Boehringer Mannheim, Niemcy) a jako kontrolę pozytywną proteinazę K. Do 50 μΐ roztworu zawierającego 0,4% znaczonej resorufinąkazeiny dodano 50 μΐ buforu o składzie: 200mMTris,20mMCaCl₂(pH=7,8)i 100 μΐ roztworu próbki. Po inkubacji w czasie do 24 godzin w temperaturze 37°C reakcję zatrzymuje się przez dodanie 450 μΐ 5 % roztworu kwasu trójchlorooctowego. Mieszaninę reakcyjną wiruje się i przenosi się 400 μΐ supematantu do kuwety zawierającej 600 pl 500 mM Tris (pH = 8,8). Natychmiast odczytuje się absorbancję przy długości fali 574 nm. Po 24 godzinnych inkubacjach, próbki zawierające surową ślinę pijawki wykazywały znaczącą aktywność proteolitycznąnatomiast wartości absorbancji w próbkach oczyszczonego białka plasowały się nieco poniżej próbek kontrolnych (tabela 1, poniżej).

Oprócz opisanej powyżej aktywności proteolitycznej, surowa ślina posiada również aktywność kolagenolityczną. Korzystną metodą pomiaru tej aktywności jest metoda z użyciem _odczynnika Azocoll (sproszkowana skóra nasycona barwnikiem), będącego substratem dla nieswoistej chromogennej kolagenazy w następującej procedurze. Odczynnik Azocoll (firmy Calbiochem) zawiesza się w roztworze o składzie: 50 mM Tris, 200 mM NaCl, 0,1 % odczynnika Brij 35 (roztwór eteru polioksyetylenowego), 0,01% NaN₃ (pH = 8,0; bufor A) w stężeniu 20 mg/ml i przemywa się dwukrotnie przez wirowanie, zassanie i powtórne zawieszenie. Do wgłębień w 96-dołkowej płytce do mikromiarowania wkrapla się po 100 μ! próbki albo kontrolnego buforu A w postaci seryjnych rozcieńczeń w buforze A, a następnie dozuje się po 100 pl zawiesiny A_zocolru. Tę mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C na ogół w czasie 18 godzin. Dla zatrzymania reakcji osadza się niestrawiony substrat przez wirowanie z prędkością 1000 x g pre^ 10 _min_ut. S_up_ernat_anty przenosi się do nowej płytki do mikromianowania i odczytuje się abso_rba_ncję p_rzy długości fali 560 nm. Dla przygotowania krzywych standardowych stosuje się kolagena^ _z Clostridium histolyticum firmy Sigma (fig. 3).

Tabela 1

Aktywność proteolityczna w ślinie i w oczyszczonym białku

	OD (574 nm)	OD - kontrola
Bufor	0,0592+/-0,0013	0
Ślina (5,0 Ρ£^1)	0,0761 +/-0,0014	0,0169
Brandynina (37 pg/ml)	0,0522 +/- 0,0001	-0,0070
Proteinaza K (0,5	1,5572+/-0,1429	1,.4980

średnie +/- odchylenia standardowe, n = 3 doświadczenia

180 752

W tabeli 2 podane sąwyniki typowych pomiarów wykonanych powyższąmetodą. W odróżnieniu od surowej śliny i innego białka z pijawki o nazwie Calin ujawnionego w opisie patentowym PCT, WO 92/07005, które to białka wykazują aktywność w próbie z Azocoll'em, niespodziewanie okazało się, że oczyszczone białko według wynalazku nie wykazuje znaczącej aktywności proteolitycznej przewyższającej wartość tła.

Tabela 2

Aktywność kolagenolityczna w próbie z Azocoll'em

	Białko (pg/próbę)	OD (560 nm) po 18 godz.	Aktywność w próbie z Azocoll'em (mjed./próbę)	Aktywność właściwa (mjedn./pg)
Ślina	2,10	0,1090	54,5	26,0
Calin	0,74	0,0966	48,3	65,3
Oczyszczone białko	1,80	0,0030	1,5	0,8

Przykład V

Zależne od dawki hamowanie agregacji płytek przez oczyszczone białko

Osocze bogate w płytki inkubuje się z badanym związkiem przez 2 minuty w temperaturze 37°C i wywołuje agregację przez dodanie kolagenu w ilości potrzebnej do końcowego stężenia 1,25 pg/ml. Białko według wynalazku (Brandynina) charakteryzuje się stężeniem hamującym IC₅₀ wynoszącym około 15 nM. W następnych badaniach otrzymano wyniki od 0,5 do 100 nM. Surowy ekstrat ze śliny wykazuje aktywność hamowania agregacji płytek zarówno stymulowanej kolagenem jak i stymulowanej ADP. Brandynina natomiast była nieaktywna nawet w najwyższym dostępnym stężeniu. Szczegółowe dane są uwidocznione na fig. 4a i 4b.

Przykład VI

Hamowanie wiązania czynnikiem von Willebranda z kolagenem in vitro przez oczyszczone białko

Poza hamowaniem bezpośredniej interakacji płytek z kolagenem, oczyszczone białko otrzymane sposobem według wynalazku posiada zdumiewającą dodatkową właściwość zaburzania wiązania z czynnikiem von Willebranda. Wykazano to w próbie, w której 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania pokrywano ilościąpo 5 pg/dołek kolagenu typu I ze ścięgien końskich. Kolagen rozpuszczono w 0,1 M kwasie octowym i dializowano przez 18 godzin wobec buforu fosforanowego o pH = 7,2. Po godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C dołki blokowano przez dodanie 250 pl roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 10 mg/ml w buforze PBS i przemywa się trzy razy fizjologicznąbuforowaną fosforanem (bufor PBS) bez dodatku BSA. Następnie dodaje się próbkę 25 pl roztworu zawierającego białko otrzymane sposobem według wynalazku i z kolei 75 pl osocza ludzkiego rozcieńczonego w stosunku do 1:80 w buforze PBS zawierającym 5 mM EDTA, 0,1 % BSA, 0,001% Tween'u 80 (pH = 7,4) i prowadzi się inkubację przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Po powtórnym przemyciu wykrywa się związany czynnik von Willebranda w reakcji z ilością 100 pl rozcieńczonej w stosunku 1:4000 poliklonalnej antysurowicy królika przeciw vWF skoniugowanej z peroksydazą chrzanu (Dako, Kopenhaga, Dania). Antysurowicą inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37°C. Barwę wywołuje się w reakcji z kwasem 2,2'-azynobis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowym) (ABTS) prowadzonej przez 30 minut w temperaturze 37°C. Pomiary wykonywano przy długości fali 405 nm. W niektórych badaniach zamiast ludzkiego osocza stosowano oczyszczony czynnik von Willebranda (Serbio, Remagen, Niemcy), uzyskując bardzo podobne wyniki do tych, jakie otrzymano w próbach z osoczem.

Wiązaniu czynnika von Willebranda zarówno obecnego w osoczu jak i występującego w formie oczyszczonej, można zapobiec Brandyniną, oczyszczonym białkiem otrzymanym sposobem według wynalazku, w stopniu zależnym od dawki. W standardowych warunkach 50% ha8

180 752 mow^ie występowało przy stężeniu około 40 zM (badano zakres stężeń od 0,5 nM do 100 zM (fig. 5).

Przez wiązanie z kolagenem Brazdyzinr wywiera nie tylko hamujący wpływ na interakcję płytek z kolagenem lecz również na wiązanie czynnika von Willdbranda z matrycowymi składnikami tkanki pndśródbłnnZowej.

tt 1712Λ 6.5 KD

FIG.1

180 752

FIC. 2

180 752

FIG. 3

Kolagenaza (milijednostek/próbę)

180 752

FIG.4a

O 9 18 36

Stężenie (nM·)

FIG.4b

-f Z 3

Fig 5.

180 752

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania oczyszczonego białka, pozbawionego aktywności kolagenolitycznej, wiążącego się z kolagenem i hamującego stymulowaną kolagenem agregację płytek krwi oraz zapobiegającego oddziaływaniom pomiędzy kolagenem i czynnikiem von Willebranda (vWF) polegającego na pobraniu śliny od odpowiedniego gatunku pijawki, izolowaniu białek a następnie ich oczyszczaniu, znamienny tym, że ze śliny pijawki lekarskiej Hirudo medicinalis izoluje się białko w jednym etapie techniką preparatywnej elektroforezy na żelu poliakryloamidowym w warunkach redukujących (SDA-PAGE) i otrzymane frakcje białka o masie cząsteczkowej 14000 do 15500 łączy się.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że surowy materiał oczyszcza się metodą chromatografii jonowymiennej a następnie metodą chromatografii żelowej.