SK282961B6 - Purifikovaný proteín, spôsob jeho výroby a použitia a farmaceutický prostriedok na jeho báze - Google Patents
Purifikovaný proteín, spôsob jeho výroby a použitia a farmaceutický prostriedok na jeho báze Download PDFInfo
- Publication number
- SK282961B6 SK282961B6 SK270-95A SK27095A SK282961B6 SK 282961 B6 SK282961 B6 SK 282961B6 SK 27095 A SK27095 A SK 27095A SK 282961 B6 SK282961 B6 SK 282961B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- collagen
- protein
- purified protein
- platelet aggregation
- ability
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 44
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 19
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 claims description 7
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 230000003366 colagenolytic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 9
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 49
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 7
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 7
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 7
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108010027805 Azocoll Proteins 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010051489 calin Proteins 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000237664 Haementeria officinalis Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- -1 hydrogen salts Chemical class 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000031915 positive regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical group C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- JVVXZOOGOGPDRZ-UHFFFAOYSA-N (1,4a-dimethyl-7-propan-2-yl-2,3,4,9,10,10a-hexahydrophenanthren-1-yl)methanamine Chemical compound NCC1(C)CCCC2(C)C3=CC=C(C(C)C)C=C3CCC21 JVVXZOOGOGPDRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N (e)-2-hydroxybut-2-enedioic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(\O)C(O)=O UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- SYZJDGAOLGLIDX-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxyazocane Chemical compound ON1CCCCCCC1 SYZJDGAOLGLIDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 1
- 101000783577 Dendroaspis angusticeps Thrombostatin Proteins 0.000 description 1
- 101000783578 Dendroaspis jamesoni kaimosae Dendroaspin Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 229940123251 Platelet activating factor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710183568 Serine/threonine-protein kinase PknK Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940083124 ganglion-blocking antiadrenergic secondary and tertiary amines Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009236 leech therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- CHKVPAROMQMJNQ-UHFFFAOYSA-M potassium bisulfate Chemical compound [K+].OS([O-])(=O)=O CHKVPAROMQMJNQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 239000003848 thrombocyte activating factor antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 125000005270 trialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
- Y10S530/858—Proteins from animals other than mammals or birds insects; venom
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Purifikovaný proteín izolovaný zo slín pijavice lekárskej Hirudo medicinalis i) má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 14 do 15,5 kD, ii) má schopnosť inhibovať kolagénom stimulovanú agregáciu krvných doštičiek, iii) má schopnosť inhibovať kolagénom stimulovanú adhéziu krvných doštičiek, iv) má schopnosť zabraňovať interakcii medzi kolagénom a von Willebrandovým faktorom, vWF, v) postráda kolagenolytickú účinnosť a vi) má schopnosť viazať sa ku kolagénu. Spôsob výroby tohto proteínu, pri ktorom sa surové sliny pijavice lekárskej Hirudo medicinalis purifikujú ionexovou chromatografiou, po ktorej sa vykoná stupeň gélovej permeačnej chromatografie, alebo, alternatívne, jednostupňovou preparatívnou elektroforézou. Farmaceutický prostriedok obsahujúci ako účinnú prísadu opísaný purifikovaný proteín, v spojení s jedným alebo viacerými farmaceuticky vhodnými nosičmi, excipientmi alebo riedidlami na tento proteín. Použitie uvedeného purifikovaného proteínu v imobilizovanom stave na biokompatibilizáciu a dodanie tromborezistencie povrchu implantovateľného alebo mimotelového lekárskeho zariadenia prichádzajúceho do styku s telesnými tekutinami. Použitie tohto proteínu na výrobu liečiva na prevenciu agregácie krvných doštičiek in vitro, in vivo pri mimotelovom spracovaní a na prevenciu väzby von Willenbrandovho faktora, vWF, ku kolagénu in vitro, in vivo a pri mimotelovom spracovaní.ŕ
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka purifíkovaného proteínu, ktorý' pôsobí ako silný inhibitor kolagén-stimulovanej aktivácie a agregácie krvných doštičiek a ktorý má predovšetkým schopnosť brániť interakciám medzi kolagénom a Willebrandovým faktorom. Ďalej sa vynález týka spôsobu jeho výroby, jeho použitia na výrobu liečiv a farmaceutického prostriedku na jeho báze. Konečne sa vynález takisto týka použitia uvedeného purifíkovaného proteínu v imobilizovanom stave na biokompatibilizáciu a dodanie tromborezistencie povrchu implantovateľného alebo mimotelového lekárskeho zariadenia prichádzajúceho do styku s telesnými tekutinami.
Doterajší stav techniky
Normálna hemostáza je u človeka regulovaná zložitou sériou vzájomne prepojených mechanizmov, na ktorých sa podieľajú tak bunkové, ako humorálne biochemické zložky. Táto biochemická dráha zahŕňa poškodenie intaktných buniek endotelia, stimuláciu krvných doštičiek a aktiváciu koagulačných mechanizmov. Pri poškodení cievnej steny je jedným z prvých javov expozícia subendotelia krvi. Subendoteliálny kolagén je považovaný za jeden z najčasnejších stimulov vedúcich k adhézii krvných doštičiek, po ktorej nasleduje zmena tvaru, agregácie a vznik trombu.
Terapeutická intervencia na úrovni adhézie krvných doštičiek a/alebo agregácie krvných doštičiek je preto užitočná na prevenciu alebo liečbu väčšiny trombotických porúch.
Je známe, že sliny pijavíc obsahujú niekoľko činidiel, ktoré sú schopné inhibovať agregáciu krvných doštičiek.
Dobre známou zlúčeninou je teda hirudín (Merck Index 1983, č. 4613; FEBS Lett. 165, 180 (1984)). Hirudín zabraňuje agregácii krvných doštičiek indukovanú trombínom, tým, že sa viaže k trombínu v stechiometrickom komplexe 1:1. Tento komplex inhibuje konverziu fíbrinogénu na fibrín, ktorá je katalyzovaná trombínom.
Nízkomolekulárny antagonista receptorom mediovaného aktivačného faktora krvných doštičiek získaný zo slín Hiridinidae, ktorý má inhibičnú účinnosť proti agregácii krvných doštičiek indukovanej agregačnými činidlami, ako je PAF-aceter, je opísaný v EP-A-03 48 208.
Kolagenáza, ktorá špecificky degraduje kolagén hydrolytickým štiepením pcptidových väzieb v helikálnych oblastiach molekuly kolagénu, je opísaná vo WO 87/00 860.
Pijavica lekárska (Hirudo medicinalis) používa na zabránenie vzniku trombu v mieste prisatia nielen hirudín. Výraznou vlastnosťou prisatia pijavice je dlhodobé krvácanie s dĺžkou viac ako 10 až 24 hodín, napriek tomu, že sa zdá, že hirudín je z rany vypláchnutý v priebehu 15 až 30 minút. Za tento jav musia byť preto zodpovedné iné faktory ako hirudín. Nedávno bol opísaný proteín z Hirudo medicinalis (WO/92/07005) s molekulovou hmotnosťou 65 kD, označovaný názvom „calin“. ktorý’ je schopný brániť agregácii krvných doštičiek stimulovanej kolagénom. Iný nízkomolekulárny (16 kD) inhibitor agregácie krvných doštičiek indukovanej kolagénom, nazvaný LAPP, bol zistený v Haementeria officinalis (EP-A-0480651).
Pri žiadnom z týchto proteínov nebola zistená schopnosť ovplyvňovať dôležitý znak adhézie krvných doštičiek sprostredkovanej von Willebrandovým faktorom (vWF). Tento faktor predstavuje komplexný multimerový glykoproteín, ktorý má dôležitú úlohu pri funkcii krvných doštičiek. Je potrebný na normálnu adhéziu krvných doštičiek k exponovanému subendoteliu a na normálnu tvorbu uzáveru z krvných doštičiek v miestach cievneho poranenia. Funkcia vWF je dôležitá najmä v cievach s malým priemerom, kde prevládajú podmienky vysokej šmykovej rýchlosti v stene. V súčasnosti sa predpokladá, že mechanizmy, o ktoré sa opiera funkcia vWF, zahŕňajú interakciu so zložkami subendotelia a špecifickými receptormi na doštičkovej membráne (Ruggeri et al., 1992, Meth. Enz. 215, 263 až 275). Interferencia zodpovedajúceho proteínu s vWF by teda predstavovala prídavnú výhodu pri terapeutických použitiach.
Teraz sa zistilo, že ako silný inhibitor kolagénom stimulovanej agregácie a adhézie krvných doštičiek, ktorý navyše zabraňuje interakciám medzi kolagénom a vWF, pôsobí nový proteín s molekulovou hmotnosťou približne 15 kD.
Úlohou tohto vynálezu je teda získať v podstate čistý proteín so schopnosťou inhibovať kolagénom stimulovanú agregáciu krvných doštičiek a zabraňovať interakciám medzi kolagénom a vWF, zo slín pijavice lekárskej Hirudo medicinalis.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je purifikovaný proteín izolovaný zo slín pijavice lekárskej Hirudo medicinalis
i) majúci molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 14 do 15,5 kD, ii) majúci schopnosť inhibovať kolagénom stimulovanú agregáciu krvných doštičiek, iii) majúci schopnosť inhibovať kolagénom stimulovanú adhéziu krvných doštičiek, iv) majúci schopnosť zabraňovať interakcii medzi kolagénom a von Willebrandovým faktorom, vWF,
v) postrádajúci kolagenoíytickú účinnosť a vi) majúci schopnosť viazať sa ku kolagénu.
Nový proteín podľa vynálezu má molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 14 do 15,5 kD, prednostne od 14,5 do 15 kD (v závislosti od použitých metód merania) a zabraňuje interakciám medzi kolagénom a vWF. Na rozdiel od nej, známy LAPP má relatívnu molekulovú hmotnosť 16 000 a bol izolovaný z Haementeria officinalis. Vplyv LAPP na vWF nebol až dosiaľ demonštrovaný. Ďalším dôležitým rozdielom je, že aminokyselinové sekvencie LAPP a proteínu podľa vynálezu (Brandininu) sú odlišné.
Tieto a iné rozdiely, ktoré sú uvedené ďalej, odlišujú proteín podľa vynálezu od iných proteínov, ktoré majú inhibičnú účinnosť pri agregácii krvných doštičiek.
Proteín podľa vynálezu zahŕňa tiež variácie opísaného purifíkovaného proteínu, ktoré si zachovávajú účinnosť izolovaného proteínu, vrátane fragmentov, podjednotiek, mutácií vzniknutých prirodzeným spôsobom a náhodne vzniknutých umelých mutantov. Takisto zahŕňa hybridné proteíny, ako sú fúzované proteíny odvodené od opísaného proteínu.
Predmetom vynálezu je ďalej takisto spôsob výroby definovaného purifíkovaného proteínu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa surové sliny pijavice lekárskej Hirudo medicinalis purifikujú ionexovou chromatografiou, po ktorej sa vykoná stupeň gélovej permeačnej chromatografie, alebo, alternatívne, jednostupňovou preparatívnou elektroforézou. Typický spôsob podľa vynálezu zahŕňa rekonštitúciu lyofilizovaných surových slín Hirudo medicinalis v konvenčnom systéme tlmivého roztoku s pH 7,5 až 8,5 a purifikácii aspoň jedným konvenčným chromatografickým stupňom, prednostne gélovou permeačnou chromatografiou.
Ďalším predmetom vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že ako účinnú prísadu obsahuje definovaný protein, v spojení s jedným alebo viacerými farmaceutický vhodnými nosičmi, excipientmi alebo riedidlami na tento protein.
Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu prípadne obsahujú tiež prídavné účinné prísady, ako sú antikoagulanty, ako je hirudín alebo heparín, alebo trombolytické činidlá, ako je aktivátor plazminogénu alebo haementín.
Nový protein a farmaceutické prostriedky na jeho báze podľa vynálezu je možné používať pri liečbe rôznych tromboembolických porúch, ako je žilná trombóza, periférna arteriálna trombóza, cerebrovaskulárna trombóza a infarkt myokardu. Ďalej sa môžu používať pri pacientoch, ktorí majú naoperované arteriovenózne umelé cievky alebo ktorí sa podrobujú koronárnemu chirurgickému zákroku by pass. Prostriedky podľa vynálezu sa tiež môžu používať pri liečbe autoimunitných chorôb, ako je lupus erytrematosus, reumatoidná artritis a polyartritis nodóza. Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sú tiež užitočné pri simulácii dlhodobého krvácania, ku ktorému dochádza po prisatí pijavice, a môžu teda sčasti alebo úplne nahradiť pijavice pri aplikáciách, pri ktorých sa indikuje terapia pijavicami.
Nový protein podľa vynálezu môže tvoriť farmaceutický vhodné soli s akýmikoľvek netoxickými organickými alebo anorganickými kyselinami. Ako príklady vhodných anorganických kyselín je možné uviesť kyselinu chlorovodíkovú, kyselinu bromovodíkovú, kyselinu sírovú alebo kyselinu fosforečnú a hydrogensoli kovov, ako je monohydrogenortofosforečnan sodný a hydrogensíran draselný. Ako príklady organických kyselín je možné uviesť mono-, di- a trikarboxylové kyseliny, ako je kyselina octová, kyselina glykolová, kyselina mliečna, kyselina pyrohroznová, kyselina malónová, kyselina jantárová, kyselina glutárová, kyselina fumarová, kyselina jablčná, kyselina vínna, kyselina citrónová, kyselina askorbová, kyselina maleínová, kyselina hydroxymaleínová, kyselina benzoová a kyselina hydroxybenzoová, kyselina fenyloctová, kyselina škoricová, kyselina salicylová a sulfónové kyseliny, ako je kyselina metánsulfónová. Soli karboxyterminálneho aminokyselinového zvyšku zahŕňajú netoxické soli karboxylových kyselín s akoukoľvek vhodnou anorganickou alebo organickou bázou. Tieto soli zahŕňajú napríklad soli s alkalickými kovmi, ako je sodík a draslík, kovy alkalických zemín, ako je vápnik a horčík, ľahkými kovmi zo skupiny IIIA periodickej tabuľky, ako je hliník a soli s organickými primárnymi, sekundárnymi a terciámymi amínmi, ako s trialkylamínmi, napríklad trietylamínom, prokaínom, dibenzylamínom, 1 -etylénamínom, NjN'-dibenzyletyléndiamínom, dihydroabietylamínom a N-alkylpiperidínom.
Prostriedky podľa vynálezu je možné podávať v jednotkovej dávkovacej forme obsahujúcej konvenčné netoxické farmaceutický vhodné nosiče, riedidlá, pomocné látky a vehikulá, ktoré sú typické na parenterálne podávanie. Pod označením „parenterálne“ sa tu rozumie subkutánne, intravenózne, intraartikulárne a intratracheálne podávanie vo forme injekcií alebo infúzií. Jednotkové dávky podľa vynálezu môžu obsahovať požadované denné množstvo proteínu podľa vynálezu alebo jeho zlomky, z ktorých je možné požadovanú dávku zostaviť. Optimálna terapeuticky vhodná dávka pre daného pacienta (cicavca, vrátane človeka) závisí od rôznych faktorov, ako je účinnosť konkrétne použitej účinnej látky, vek, telesná hmotnosť, celkový zdravotný stav, pohlavie, strava pacienta, čas a spôsob podávania, rýchlosť vylučovania atď. Potrebná koncentrácia účinnej látky v sére inhibujúca stimuláciu krvných doštičiek kolagénom leží prednostne v rozmedzí od 0,1 do 50 mg/liter.
Pod označením „farmaceutický vhodný nosič“ sa v tomto opise rozumejú inertné netoxické pevné alebo kvapalné nosiče, riedidlá alebo zapuzdrovacie látky, ktoré nereagujú nepriaznivo s účinnou zlúčeninou alebo nevyvolávajú nepriaznivú reakciu u pacienta. Vhodné nosiče sú prednostne kvapalné a ako ich príklady, ktoré sú dobre známe z doterajšieho stavu techniky, je možné uviesť sterilnú vodu, vodný roztok chloridu sodného, vodný roztok dextrózy, cukomé roztoky, etanol, glykoly a oleje, ako sú oleje ropného, živočíšneho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, napríklad arašidový olej, sójový olej a minerálny olej. Ako nosiče, ktoré sú vhodné podľa vynálezu, je ďalej tiež možné uviesť farmaceutický vhodné gély alebo krémy, ktoré sú vhodné na poťahovanie lekárskych predmetov obyčajne zrobených z plastov a syntetických vláken (pozri ďalej) pred použitím.
Predmetom vynálezu je ďalej tiež spôsob tromborezistentnej úpravy povrchu implantovateľného alebo mimotelového lekárskeho zariadenia na použitie v styku s telesnými tekutinami, ktorého podstata spočíva v tom, že sa toto zariadenie potiahne definovaným imobilizovaným proteínom. Protein podľa vynálezu sa imobilizuje na lekárskom zariadení z toho dôvodu, aby bol jeho povrch biokompatibilný a tromborezistentný. Také zariadenia majú niekedy namáčateľné povrchy, ktoré obyčajne indukujú agregáciu krvných doštičiek, čo je nevýhodné pri ich zamýšľanom použití pri implantovateľných a mimotelových zariadeniach prichádzajúcich do styku s krvou alebo inými telovými tekutinami. Ako príklady takých zariadení je možné uviesť protézy, umelé orgány, stehy, umelé vaskulárne segmenty, katétry, dialyzátory, skúmavky a nádoby na uchovávanie krvi.
Nanášanie povlakov na lekárske zariadenia a imobilizácia proteínov sa vykonáva štandardnými technológiami (pozri napríklad US patent č. 4 885 207).
Predmetom vynálezu je konečne tiež použitie definovaného proteínu na výrobu liečiva na prevenciu kolagénom stimulovanej agregácie krvných doštičiek a väzby vWF na kolagén in vitro, in vivo a pri mimotelovom spracovaní.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 je znázornený výsledok purifikácie Brandinínu zo slín pijavice gélovou permeačnou chromatografiou. Podrobnosti vzťahujúce sa k tejto purifikácii sú uvedené v príklade 2. Účinné frakcie sú označené šrafovaním. Čísla pod krivkou (3 až 14) označujú jednotlivé frakcie.
Na obr. 2 je znázornený výsledok purifikácie Brandinínu elektroforézou na SDS-gélu. Podrobnosti vzťahujúce sa k tejto purifikácii sú uvedené v príklade 4. Sú tu uvedené čísla frakcií (8 až 12) a markery (M). Frakcie 10 a 11 sú pozitívne pri skúške vykonávanej spôsobom opísaným v príklade 1.
Na obr. 3 je uvedená štandardná krivka kolagenolytickej účinnosti meranej pomocou Azocolľ1*1. Podrobnosti tohto merania sú uvedené v príklade 4. Na zvislú os je vynesená optická denzita (OD) pri 560 nm a na vodorovnú os je vynesená aktivita kolagenázy (mU/skúška).
Na obr. 4a je charakterizovaná inhibícia kolagénom stimulovanej agregácie krvných doštičiek závislá od dávky. Podrobnosti sú uvedené v príklade 5. Na zvislú os je vynesená agregácia (%) a na vodorovnú os koncentrácia Brandinínu (nM).
Na obr. 4b je charakterizovaná špecifickosť inhibície krvných doštičiek pre prípad stimulácie kolagénom. Podrobnosti sú uvedené v príklade 5. Na zvislú os je vynesená ag3 regácia (%) a na vodorovnej os sú jednotlivé stĺpce označené takto: 1 = kontrolný, 2 = kolagén, 3 = ADP.
Na obr. 5 je znázornená inhibícia väzby vWF ku kolagénu závislá od dávky. Podrobnosti sú uvedené v príklade
6. Na zvislú os je vynesená optická denzita (OD) pri 405 nm a na vodorovnú os koncentrácia purifikovaného proteínu (nM). Trojuholníčkami sú označené body na purifikovaný proteín a krúžkami body na kontrolný proteín w/o.
Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch vykonávania. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
In vitro účinnosť proteínu z Hirudo medicinalis, ako inhibítora kolagénom stimulovanej agregácie krvných doštičiek
V surových slinách Hirudo medicinalis je možné stanovú aktivitu, ktorá inhibuje agregáciu krvných doštičiek v plazme bohatej na krvné doštičky (PRP), vyvolanú prítomnosťou kolagénu spôsobom, ktorý je závislý od dávky.
Krv sa odoberá dobrovoľníkom pri použití citranu sodného s konečnou koncentráciou 0,38 %. Diferenciálnou ccntrifugáciou sa vyrobí plazma bohatá na krvné doštičky a plazma chudobná na krvné doštičky.
Agregácia krvných doštičiek sa meria v agregometre PAP-4 (Biodata) po prídavku rôznej koncentrácie kolagénu Horm(R> (Hormonchemie). Parametrom je maximálna extinkcia po prídavku kolagénu. Antitrombotiká znižujú tieto hodnoty.
Opísané stanovenie sa používa v priebehu nasledujúcej purifikácie proteínu a tiež na charakterizáciu čistého proteínu podľa vynálezu.
Príklad 2
Izolácia a chromatografická purifikácia proteínu
Proteín podľa vynálezu sa izoluje zo surových slín Hirudo medicinalis. Lyofilizované sliny sa rekonštituujú v 20 mM Tris-HCl, 10 mM chloridu vápenatom, pH 8,0 (TC-tlmivý roztok) na koncentrácii 20 mg/ml. Sliny sa aplikujú na stĺpec CM-Fraktogél|R) (E. Merck, Darmstadt, SRN) a elúcia sa vykonáva gradientom chloridu sodného v rovnakom tlmivom roztoku. Frakcie eluované zo stĺpca, ktoré sú aktívne pri skúške inhibicie krvných doštičiek opísané v príklade 1, už neobsahujú hirudínovú aktivitu. Záverečná purifikácia sa vykoná gélovou permeačnou chromatografiou na stĺpci silikagélu modifikovaného diolom v 20 mM Tris.HCl, 10 mM chloridu vápenatého, 200 mM chloridu sodného, pH 8,0 (TCN-tlmivý roztok). Typický príklad tohto purifikačného stupňa je znázornený na obr. 1. Výťažok purifikovaného proteínu, ktorý je vztiahnutý' na množstvo proteínu v surových slinách, je 5 %. Pri iných pokusoch sa dosiahne výťažok 2 a 7 %.
Príklad 3
Jednostupňová purifikácia proteínu preparatívnou elektroforézou
Alternatívne je možné proteín úspešne izolovať jednostupňovou preparatívnou elektroforézou. V prístroji „Prep-cell“<R) (Biorad, Mníchov, SRN) sa podľa inštrukcií výrobca polymeráciou vyrobí valcovité teleso polyakrylamidového gélu, ktorého typický obsah akrylamidu robí 10 %. Vzorka sa aplikuje do tlmivého roztoku pre elektroforézu.
V priebehu clektroforézy slúži prúd tlmivého roztoku uvádzaný kolmo na smer elektroforézy na transport eluovaných proteínov do zberača frakcii. Frakcie sa analyzujú analytickou elektroforézou na SDS-polyakrylamide a zhromaždia sa frakcie s molekulovou hmotnosťou 15,0 kD. Pri inom obmenenom pokuse je zistená molekulová hmotnosť 14,5 kD.
Príklad 4
Charakterizácia proteínu
Purifikovaný proteín majúci aktivitu nameranú v príklade 1, má molekulovú hmotnosť približne 15 000 D pri SDS-PAGE za redukčných podmienok. Na obr. 2 sú znázornené účinné frakcie identifikované pri typickej gélovej permeačnej chromatografii opísanej v príklade 2. Pásy proteínu na géli sa vizualizujú farbením striebrom.
Pri purifikovanom proteíne sa nedá stanoviť žiadna proteolytická aktivita pri použití opísanej prednostnej skúšobnej metódy. Ako substrát sa používa kazeín kovalentne modifikovaný resorufinom(R* (Boehringer Mannheim, Nemecko) a na pozitívnu kontrolu sa používa proteináza K. K 50 μΐ 0,4 % roztoku resorufínom značeného kazeínu sa pridá 50 μΐ 200 mM Tris, 20 mM chloridu vápenatého, pH 7,8 a potom sa pridá 100 μΐ roztoku vzorky. Po 24-hodinovej inkubácii pri 37 °C sa reakcia zastaví prídavkom 450 μΐ 5 % roztoku kyseliny trichlóroctovej. Reakčná zmes sa odstredí a 400 μΐ supematantu sa prevedie do kyvety obsahujúcej 600 μΐ 500 mM Tris, pH 8,8. Bezprostredne nato sa zmeria absorbancia pri 574 nm. Pri 24-hodi-novej inkubácii sa zistí významná proteolytická aktivita surových slín, zatiaľ čo v prípade purifikovaného proteínu ležia hodnoty absorbancie mierne pod hodnotami pozadia (pozri uvedenú tabuľku 1).
Okrem opísanej proteolytickej aktivity majú surové sliny tiež kolagenolytickú aktivitu. Prednostný spôsob merania tejto aktivity spočíva v použití Azocollu, nešpecifického chromogénneho substrátu na kolagenázu, Čo sa vykonáva takto: Azoco11(Ri (Calbiochem) sa suspenduje v 50 mM Tris, 200 mM chloridu sodného, 0,1 % Brij 35, 0,01 % azidu sodného, pH 8,0 (tlmivý roztok A) na koncentráciu 20 mg/ml a suspenzia sa 2 x premyje centrifugáciou, odsatím a resuspendovanim. 100 μΐ vzorky alebo kontrolného tlmivého roztoku sa odpipetuje do jamiek 96-jamkovej mikrotitrovej misky vo forme zrieďovacej série v tlmivom roztoku A. Potom sa do jamiek odpipetuje vždy 100 μΐ suspenzie Azocollu. Vzniknuté zmesi sa inkubujú pri 37 °C, obyčajne 18 hodín. Na zastavenie reakcie sa nestrávený substrát sedimentuje 10-minútovým odstreďovaním pri 1000 x g. Supematanty sa prenesú do novej mikrotitrovej misky a odčíta sa absorbancia pri 560 nm. Na zostrojenie štandardných kriviek (pozri obr. 3) sa používa kolagenáza z Clostridium histolyticum (Sigma).
| Tabuľka 1 Proteolytická aktivita slín a purifikovaného proteínu | ||
| OD (574 nm) | OD-kontrolný | |
| tlmivý rožtok | 0,0592 +/- 0,0013 | 0 |
| sliny (5,0 ^g/ml) | 0,0761 +/- 0,0014 | 0,0169 |
| Brandlnín (37 ug/ml) | 0,0522 +/- 0,0001 | -0,0070 |
| proteínkináza K (0,5 gg/ml) | 1,5572 +/- 0,1429 | 1,4980 |
+f- znamená smerodajnú odchýlku, počet experimentov: 3
V tabuľke 2 sú uvedené výsledky typických meraní pri použití tejto skúšky. Na rozdiel od surových slín a iného hirudo-proteínu s názvom Calin (WO 92/07005). ktoré majú aktivitu pri skúške s Azocollom, sa s prekvapením zistilo, že purifikovaný proteín podľa tohto vynálezu nemá žiadnu významnú kolagenolytickú aktivitu prevyšujúcu úroveň pozadia.
Tabuľka 2
Kolagenolytická aktivita pri skúške s Azocollom
| Proteín (jig/skúška) | OD (560 nm) po 18 hodinách | ÄZOCOllová aktivita (mU/skúška) | Špecifická aktivita (nU/iig) | |
| Slina | 2,10 | 0,1090 | 54,5 | 26,0 |
| Calin | 0,74 | 0,0966 | 48,3 | 65,3 |
| Purif. proteín | 1,80 | 0,0030 | 1,5 | 0,8 |
Príklad 5
Inhibicia agregácie krvných doštičiek purifikovaným proteínom, závislá od dávky
Plazma bohatá na krvné doštičky sa inkubuje 2 minúty pri 37 °C spolu so skúšanou zlúčeninou a potom agreguje prídavkom kolagénu do výslednej koncentrácie 1,25 pg/ml. Proteín podľa tohto vynálezu (Brandinín) má hodnotu IC5o asi 15 nM. Pri ďalších experimentoch sa získajú výsledky v rozmedzí od 0,5 do 100 nM. Surový extrakt zo slín má inhibíciu tak kolagénom stimulovanej, ako ADP stimulovanej agregácie krvných doštičiek. Naproti tomu Brandinín je neúčinný i pri najvyššej dostupnej koncentrácii. Podrobnosti sú uvedené na obr. 4a a 4b.
Príklad 6
Inhibicia vWF väzby ku kolagénu in vitro pri použití purifikovaného proteinu
Okrem toho, že purifikovaný proteín podľa tohto vynálezu inhibuje priamu interakciu krvných doštičiek s kolagénom, má i prekvapujúcu prídavnú schopnosť interferovať s väzbou vWF.
Táto skutočnosť sa dá potvrdiť nasledujúcim postupom: 96-jamkové mikrotitrové misky sa potiahnu 5 mg (vztiahnuté na jamku) kolagénu typu 1 z konských šliach. Kolagén sa rozpustí v 0,1 M kyseline octovej a 18 hodín dialyzuje proti fosforečnanovému tlmivému roztoku s pH 7,2. Po jednohodinovej inkubácii pri 37 CC sa jamky blokujú 250 μΐ BSA v PBS s koncentráciou 10 mg/ml a 3 x premyjú tlmivým roztokom PBS bez BSA. Potom sa do jamiek pridá 25 μΐ vzorky obsahujúcej proteín podľa vynálezu a ďalej tiež 75 μΙ humánnej plazmy zriedenej v pomere 1 : 80 tlmivým roztokom PBS obsahujúcim 5 mM EDTA, 0,1 % BSA, 0,001 Tween 80, pH 7,4, potom sa zmesi 2 hodiny inkubujú pri 37 °C. Po novom premytí sa viazaný vWF deteguje prídavkom 100 μί polyklonálneho králičieho anti-vWF antiséra konjugovaného ku chrenovej peroxidáze, so zriedením 1/4000 (Dáko, Kodaň, Dánsko). Antisérum sa inkubuje 1 hodinu pri 37 °C. Zafarbenie sa vyvíja pomocou ABTS 30 minút pri 37 °C a meranie sa vykonáva pri 405 nm. V niektorých experimentoch sa používa purifikovaný vWF (Serbio, Remagen, SRN) miesto humánnej plazmy, pričom sa dosiahnu veľmi podobné výsledky v porovnaní s pokusmi uskutočňovanými s plazmou.
Väzbe vWF, tak z plazmy, ako v purifikovanej forme, je možné zabrániť Brandinínom, čo je purifikovaný proteín podľa tohto vynálezu, spôsobom, ktorý je závislý od dávky. 50 % inhibície sa v štandardných podmienkach dosiahne približne pri 40 nM (rozmedzí 0,5 až 100 nM) (pozri obr. 5).
Tým, že sa Brandinín viaže ku kolagénu, neinhibuje len inhibíciu interakcie krvných doštičiek s kolagénom, ale i väzbu von Willebrandovho faktora k tejto zložke subendoteliálnej matrice.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Purifikovaný proteín izolovaný zo slín pijavice lekárskej Hirudo medicinalisi) majúci molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 14 do 15,5 kD, ii) majúci schopnosť inhibovať kolagénom stimulovanú agregáciu krvných doštičiek, iii) majúci schopnosť inhibovať kolagénom stimulovanú adhéziu krvných doštičiek, iv) majúci schopnosť zabraňovať interakcii medzi kolagénom a von Willebrandovým faktorom, vWF,v) postrádajúci kolagenolytickú účinnosť a vi) majúci schopnosť viazať sa ku kolagénu.
- 2. Spôsob výroby purifikovaného proteinu podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa surové sliny pijavice lekárskej Hirudo medicinalis purifikujú ionexovou chromatografiou, po ktorej sa vykoná stupeň gélovej permeačnej chromatografie, alebo, alternatívne, jednostupňovou preparativnou elektroforézou.
- 3. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že ako účinnú prísadu obsahuje purifikovaný proteín podľa nároku i v spojení s jedným alebo viacerými farmaceutický vhodnými nosičmi, excipientmi alebo riedidlami pre tento proteín.
- 4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3. vyzná č u j ú c i sa tým, že ďalej obsahuje trombolytické činidlo alebo antikoagulant.
- 5. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že nosičom je gélová báza alebo krém vhodný na poťahovanie lekárskeho zariadenia pred jeho použitím.
- 6. Použitie purifíkovaného proteinu podľa nároku 1 v imobilizovanom stave na biokompatibilizáciu a dodanie tromborezistencie povrchu implantovateľného alebo mimotelového lekárskeho zariadenia prichádzajúceho do styku s telesnými tekutinami.
- 7. Použitie purifíkovaného proteinu podľa nároku 1 na výrobu liečiva na prevenciu agregácie krvných doštičiek in vitro, in vivo a pri mimotelovom spracovaní.
- 8. Použitie purifíkovaného proteinu podľa nároku 1 na výrobu liečiva na prevenciu väzby von Willenbrandovho faktora, vWF, ku kolagénu in vitro, in vivo a pri mimotelovom spracovaní.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93110528 | 1993-07-01 | ||
| PCT/EP1994/002087 WO1995001375A1 (en) | 1993-07-01 | 1994-06-28 | Inhibitor of collagen-stimulated platelet aggregation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK27095A3 SK27095A3 (en) | 1995-08-09 |
| SK282961B6 true SK282961B6 (sk) | 2003-01-09 |
Family
ID=8213032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK270-95A SK282961B6 (sk) | 1993-07-01 | 1994-06-28 | Purifikovaný proteín, spôsob jeho výroby a použitia a farmaceutický prostriedok na jeho báze |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5710131A (sk) |
| EP (1) | EP0662088B1 (sk) |
| JP (1) | JP3742429B2 (sk) |
| KR (2) | KR100445309B1 (sk) |
| CN (1) | CN1134451C (sk) |
| AT (1) | ATE210679T1 (sk) |
| AU (1) | AU680929B2 (sk) |
| CA (1) | CA2143416C (sk) |
| CZ (1) | CZ287472B6 (sk) |
| DE (1) | DE69429419T2 (sk) |
| DK (1) | DK0662088T3 (sk) |
| ES (1) | ES2169080T3 (sk) |
| HU (1) | HU214580B (sk) |
| NO (1) | NO320150B1 (sk) |
| PL (1) | PL180752B1 (sk) |
| PT (1) | PT662088E (sk) |
| RU (1) | RU2160280C2 (sk) |
| SK (1) | SK282961B6 (sk) |
| TW (1) | TW281678B (sk) |
| UA (1) | UA41332C2 (sk) |
| WO (1) | WO1995001375A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA944738B (sk) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2153760B1 (es) * | 1998-11-25 | 2001-07-01 | Univ Barcelona Autonoma | Inhibidor de metalocarboxipeptidasas como agente fibrinolitico. |
| US6774107B1 (en) | 1999-03-18 | 2004-08-10 | Merck Patent Gmbh | Protein for blocking platelet adhesion |
| US7928066B1 (en) | 1999-05-07 | 2011-04-19 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Recombinant platelet collagen receptor glycoprotein vi and its pharmaceutical use |
| MY128992A (en) | 2000-08-25 | 2007-03-30 | Merck Patent Gmbh | Saratin for inhibiting platelet adhesion to collagen |
| GB0031448D0 (en) * | 2000-12-22 | 2001-02-07 | Leuven K U Res & Dev | Inhibition of the vWF-collagen interaction by anti-human vWF monoclonal antibody (82D6A3) results in abolition of in vivo arterial platelet thrombus formation |
| AU2005287273B2 (en) | 2004-09-07 | 2011-05-12 | Archemix Corp. | Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics |
| US20070066551A1 (en) * | 2004-09-07 | 2007-03-22 | Keefe Anthony D | Aptamer medicinal chemistry |
| US7566701B2 (en) * | 2004-09-07 | 2009-07-28 | Archemix Corp. | Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics |
| US20060286548A1 (en) * | 2005-06-16 | 2006-12-21 | Gregory Liposky | Method of making recombinant human antibodies for use in biosensor technology |
| US7691839B2 (en) * | 2005-09-28 | 2010-04-06 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for blocking platelet and cell adhesion, cell migration and inflammation |
| US20110034396A1 (en) * | 2005-09-28 | 2011-02-10 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for inhibiting cell migration and treatment of inflammatory conditions |
| TWI391143B (zh) * | 2005-11-04 | 2013-04-01 | Otsuka Pharma Co Ltd | 血小板凝集抑制劑組成物 |
| US20080015145A1 (en) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Maria Gyongyossy-Issa | Mimotope receptors and inhibitors for platelet-platelet and platelet-endothelium interactions |
| WO2008150495A2 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Archemix Corp. | Vwf aptamer formulations and methods for use |
| EP2316465A1 (en) * | 2009-10-15 | 2011-05-04 | Centre National De La Recherche Scientifique | Use of extract of leeches' saliva as anti-bacterial agent for the manufacture of different compositons |
| EP2670722B1 (en) | 2011-01-31 | 2016-10-12 | Council of Scientific & Industrial Research | Chiral 1-(4-methylphenylmethyl)-5-oxo-{n-[(3-t-butoxycarbonyl-aminomethyl)]-piperidin-1-yl}-pyrrolidine-2-carboxamides as inhibitors of collagen induced platelet activation and adhesion |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE120206T1 (de) * | 1986-05-30 | 1995-04-15 | Scripps Clinic Res | Peptide, die die bindung des von-willebrand- faktors inhibieren. |
| US5238919A (en) * | 1986-05-30 | 1993-08-24 | Scipps Clinic And Research Foundation | Peptides that inhibit von Willebrand Factor binding to the platelet SPIB receptor |
| US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| IL86856A0 (en) * | 1988-06-24 | 1988-11-30 | Yissum Res Dev Co | Bovine xa factor and pharmaceutical compositions containing the same |
| WO1990006128A1 (en) * | 1988-12-05 | 1990-06-14 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| CA2008116C (en) * | 1989-02-23 | 2001-11-20 | Thomas Weller | Glycine derivatives |
| CA2052486A1 (en) * | 1990-10-09 | 1992-04-10 | Thomas M. Connolly | Protein for inhibiting collagen-stimulated platelet aggregation |
| GB9022040D0 (en) * | 1990-10-10 | 1990-11-21 | Biopharm Ltd | Platelet adhesion inhibitor |
| US5342830A (en) * | 1990-11-16 | 1994-08-30 | Cor Therapeutics, Inc. | Antithrombosis agents |
-
1994
- 1994-06-28 JP JP50326095A patent/JP3742429B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-28 CA CA002143416A patent/CA2143416C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-28 ES ES94923690T patent/ES2169080T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-28 PT PT94923690T patent/PT662088E/pt unknown
- 1994-06-28 SK SK270-95A patent/SK282961B6/sk unknown
- 1994-06-28 CZ CZ1995528A patent/CZ287472B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-06-28 KR KR1019950700766A patent/KR100445309B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-06-28 AT AT94923690T patent/ATE210679T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-28 HU HU9500613A patent/HU214580B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-06-28 AU AU73836/94A patent/AU680929B2/en not_active Ceased
- 1994-06-28 KR KR10-2004-7002282A patent/KR100455639B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-06-28 WO PCT/EP1994/002087 patent/WO1995001375A1/en active Application Filing
- 1994-06-28 US US08/392,970 patent/US5710131A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-28 DK DK94923690T patent/DK0662088T3/da active
- 1994-06-28 DE DE69429419T patent/DE69429419T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-28 CN CNB941904229A patent/CN1134451C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-28 PL PL94307726A patent/PL180752B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-06-28 EP EP94923690A patent/EP0662088B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-28 UA UA95028198A patent/UA41332C2/uk unknown
- 1994-06-28 RU RU95108596/13A patent/RU2160280C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-30 ZA ZA944738A patent/ZA944738B/xx unknown
- 1994-07-18 TW TW083106615A patent/TW281678B/zh active
-
1995
- 1995-02-27 NO NO19950732A patent/NO320150B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK282961B6 (sk) | Purifikovaný proteín, spôsob jeho výroby a použitia a farmaceutický prostriedok na jeho báze | |
| Tillett et al. | The intravenous infusion of the streptococcal fibrinolytic principle (streptokinase) into patients | |
| Marlar et al. | Serial studies of protein C and its plasma inhibitor in patients with disseminated intravascular coagulation | |
| Jakubowski et al. | Inhibition of coagulation and thrombin-induced platelet activities by a synthetic dodecapeptide modeled on the carboxy-terminus of hirudin | |
| CA1335666C (en) | Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii | |
| Kumada et al. | Comparative study on heparin and a synthetic thrombin inhibitor No. 805 (MD-805) in experimental antithrombin III-deficient animals | |
| EP0255206A2 (en) | Peptides that inhibit von Willebrand factor binding | |
| Vinazzer | Clinical use of antithrombin III concentrates | |
| KR20010005529A (ko) | 덴드로아스핀 스캐폴드에 기초한 이 또는 다기능성 분자 | |
| US5583111A (en) | Thrombin inhibitors | |
| US5587360A (en) | Platelet adhesion inhibitor | |
| LANE et al. | Factor V antibody and disseminated intravascular coagulation | |
| JPH11507664A (ja) | 第ｖｉｉｉ因子由来の第ｉｘ因子結合ペプチド及び血液凝固のインヒビターとしてのそれらの使用 | |
| Iatridis et al. | Thrombogenic Properties of Surface Factor; Evidence for an Anti-Surface Factor Activity in Canine Plasma. | |
| Matsuo et al. | Application of argatroban, direct thrombin inhibitor, in heparin‐intolerant patients requiring extracorporeal circulation | |
| EP0239644A1 (en) | Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity | |
| Tripodi et al. | Inherited deficiency of antithrombin III in an Italian kindred | |
| DE4241659C1 (de) | Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern | |
| Wu | TFPI levels in patients subjected to elective hip or knee arthroplasty and treated prophylactically with low molecular weight (LMW) heparin or warfarin | |
| Escolar et al. | 123 INHIBITION OF THE PGI, BY THE AC TRANEXAMIC (AMCHA). Diez. MM, Lasierra. J., Fernandez, A. and Vi lades, E. Hematology department. Residencia Sanitaria de la SS Logrono. Spain. The liberation of PG12 according to the biotest tecnic of Moncada and col.(Lancet i: 18, 1977) is investigated in groups of 2, 5 Kg weight albino rabbits with an ateroge | |
| DE4304731A1 (de) | Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern | |
| MXPA99008525A (en) | Bi- or multifunctional molecules based on a dendroaspin scaffold | |
| IE66266B1 (en) | Method and therapeutic compositions for the treatment of bleeding disorders |