KR20040030124A - 콜라겐-자극 혈소판 응집을 위한 단백질 및 이로 코팅된의료 기기 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 콜라겐에 대한 혈소판의 결합, 및 혈소판 응집 및 혈전 형성을 유도하는 혈소판의 연속적인 활성을 강하게 억제하는, 약용거머리 히루도 메디시날리스 (Hirudo medicinalis)의 조 추출물로부터 단리된 단백질을 개시하고 있다. 추가로, 상기 단백질은 콜라겐에 대한 폰 빌레브란트 인자의 결합을 방지한다. 상기 단백질의 단리 및 정제 뿐만 아니라 콜라겐-자극 혈소판 응집을 차단하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 신규한 단백질 (브란디닌(Brandinin))은 분자량이 대략 15 kD이고 콜라겐에 결합하지만, 콜라겐을 절단하는 활성은 갖지 않는다. 상기 단백질은 혈전성 질환을 예방 및 치료하는데 및 혈전 저항성을 갖게하는 혈액-접촉 물질을 코팅하는데 유용하다.
Description
본 발명은 콜라겐-자극 혈소판 활성 및 응집에 대한 강한 억제제로서 작용하고, 특히 콜라겐과 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand's factor: vWF) 사이의 상호작용을 방지하는 능력을 가진 신규한 단백질에 관한 것이다.
인간의 통상적인 혈액응고는 세포 및 체액의 생화학적 성분 모두를 포함하는 상호관계적 메카니즘의 복잡한 시리즈에 의해 조절된다. 상기의 생화학적 경로는 손상되지 않은 내피 세포, 혈소판의 자극 및 응고 메카니즘의 활성에 손상을 주는 것에 관련한다. 혈관 벽이 손상되는 경우, 첫번째 현상중 하나는 내피하층이 혈액에 노출되는 것이다. 내피하층의 콜라겐은 혈소판 유착, 이어서 형태 변화, 응집 및 혈전 형성을 유도하는 가장 첫번째 자극물이라고 여겨진다. 따라서, 혈소판 유착 및/또는 혈소판 응집 수준에서의 치료 방법은 대부분의 혈전증 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.
거머리의 타액은 혈소판 응집을 억제할 수 있는 몇개의 인자를 함유하고 있다고 알려져 있다: 또한 히루딘은 공지된 화합물이다 (문헌 [Merck Index 1983, No.4613; FEBS Lett. 165, 180 (1984)]). 히루딘은 트롬빈에 1:1의 화학량론적 복합체로 결합함으로써 트롬빈-유발 혈소판 응집을 방지한다. 다시 말해서, 트롬빈-촉매화되어 피브리노겐이 피브린으로 전환되는 것을 억제한다.
PAF-아세터와 같은 응집 인자에 의해 유발되는 혈소판 응집에 대한 억제 활성을 가진 거머리문 (Hirudinidae)의 타액에서 유도된 저분자량의 수용체-매개 혈소판 활성 인자 길항물질이 유럽 특허원 제 0348208 호에 개시되어 있다.
콜라겐 분자의 나선 영역중의 펩티드 결합을 가수분해적으로 절단함에 의해, 콜라겐을 특이적으로 분해시키는 콜라게나제가 제 WO 87/00860 호에 개시되어 있다. 약용거머리 (히루도 메디시날리스)(Hirudo medicinalis)는 상처 부위에서의 혈전 형성을 방지하기 위해 히루딘만을 사용하는 것은 아니다. 상기 거머리에 의해 물린 상처의 아주 명백한 특징이 10 내지 24시간 이상동안 계속 출혈된다는 것에 반해, 히루딘은 15 내지 30분내에 상처로부터 씻겨나가는 것으로 나타난다. 따라서, 히루딘과 전혀 다른 기타 원리가 상기 효과에 영향을 주고 있음에 틀림없다.
최근, 히루도 메디시날리스의 단백질은 분자량이 65 kD이고, "칼린 (Calin)"으로 명명되며, 콜라겐-자극 혈소판 응집을 방지할 수 있다고 기재되어 있다 (제WO 92/07005 호). 콜라겐-유발 혈소판 응집에 대한 또다른 저분자량 (16 kD) 억제제인 LAPP는 헤멘테리아 오피시날리스(Haementeria officinalis)에서 발견되었다 (유럽 특허원 제 0480651 호).
이들 단백질 모두 폰 빌레브란트 인자 (vWF) 매개의 혈소판 유착의 중요한 특징에 영향을 주는 것은 없다.
상기 인자는 혈소판 작용에서 중요한 역할을 하는 복합 다량체성 당단백질이다. 이는 노출된 내피하층에서의 정상적인 혈소판 응집 및 혈관 손상 부위에서의 정상적인 혈소판 플러그 형성을 위해 필요하다. vWF의 기능은 소구경의 혈관에서 특히 중요하며, 이는 벽 전단률이 높은 조건에서 우세하다. 현재, vWF 기능의 기초가 되는 메카니즘은 내피하층의 성분들 뿐만 아니라 혈소판 막상의 특이적 수용체들과의 상호작용을 포함하는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Ruggeri et al., 1992, Meth. Enz. 215, 263-275]). 따라서, vWF와 상응하는 단백질에 대한 간섭은 치료 용도에서 또다른 잇점을 제공할 것이다.
이제, 분자량 약 15 kD의 신규한 단백질이 콜라겐-자극 혈소판 응집 및 유착에 대한 강한 억제제로서 작용하고, 특히 콜라겐과 vWF 사이의 상호작용을 방지한다는 것을 밝혀 내었다.
따라서, 본 발명의 목적은 약용거머리 히루도 메디시날리스의 타액으로부터 입수가능하며, 콜라겐-자극 혈소판 응집을 억제하고 콜라겐과 vWF 사이의 상호작용을 방지하는 능력을 가진 실질적으로 순수한 단백질을 제공하는 것이다.
제 1 도: 약용거머리의 타액으로부터 겔 투과 크로마토그래피에 의한 브란디닌의 정제. 실시예 2에서 설명한다. 빗금친 어두운 영역은 활성 부분을 나타낸다. 곡선 밑의 숫자 (3 내지 14)는 분획을 나타낸다.
제 2 도: SDS-겔 전기영동에 의한 브란디닌의 정제. 실시예 4에서 설명한다. 분획 번호 (8 내지 12) 및 마커 (M)가 표시되어 있다. 분획 (10) 및 (11)은 실시예 1에 따르는 분석에서 양성이다.
제 3 도: 아조콜R(AzocollR)에 의해 측정된 콜라겐 분해 활성의 표준 곡선. 실시예 4에서 설명한다. 세로축은 560 nm에서의 광학 밀도 (OD)이고, 가로축은 콜라게나제 활성 (mU/분석)을 나타낸다.
제 4a 도: 콜라겐-자극 혈소판 응집에 대한 투여량에 따른 억제. 실시예 5에서 설명한다. 세로축은 응집 %를 나타내고, 가로축은 브란디닌의 농도 (nM)를 나타낸다.
제 4b 도: 혈소판 응집 억제에 대한 콜라겐 특이성. 실시예 5에서 설명한다. 세로축은 응집 %를 나타내고, 가로축에서 1은 대조군, 2는 콜라겐, 3은 ADP를 나타낸다.
제 5 도: 콜라겐으로의 vWF의 결합에 대한 투여량에 따른 억제. 실시예 6에서 설명한다. 세로축은 405 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 나타내고, 가로축은 정제된 단백질의 농도 (nM)을 나타낸다.
----▲----정제된 단백질; ----●---- 단백질을 포함하지 않은 대조군
본 발명에 따르는 신규한 단백질은 분자량이 14 내지 15.5 kD, 바람직하게는 14.5 내지 15.0 kD (사용된 방법에 따라서)이고, 콜라겐과 vWF 사이의 상호작용을 방지한다. 이들 결과와 대조적으로, 공지된 LAPP는 분자량이 16 kD이고, 헤멘테리아 오피시날리스로부터 단리된다. vWF에 대한 LAPP의 영향은 이제까지 증명된 바가 없다. 또다른 중요한 특징은 LAPP 및 본 발명에 따르는 단백질(브란디닌(Brandinin))의 아미노산 서열이 상이하다는 것이다.
하기에 예시되는 이러한 차이점 및 기타 차이점은 혈소판 응집에 대해 억제 활성을 가진 기타 단백질과 본 발명에 따르는 단백질을 구분한다.
본 발명의 단백질은 분절, 서브유니트, 자연발생 돌연변이 및 임의로 발생된 인공 돌연변이를 비롯한 단리된 단백질의 활성을 유지시키는 개시된 다양한 정제 단백질을 포함한다. 개시된 단백질로부터 유도되는 융합 단백질과 같은 잡종 단백질 또한 포함한다.
또한, 본 발명은 공지된 표준 기술 그대로를 사용하여 신규한 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 선택적으로 표본 전기영동에 의한 일단계 정제에 의해 약용거머리 히루도 메디시날리스의 타액으로부터 단리되고 정제됨을 특징으로 하는, 콜라겐-자극 혈소판 응집을 억제하고 콜라겐과 폰 빌레브란트 인자 사이의상호작용을 방지하는 능력을 가지며 분자량이 14 내지 15.5 kD인, 실질적으로 순수한 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르는 전형적인 방법은 pH 7.5 내지 8.5에서 통상적인 완충액 시스템에서 히루도 메디시날리스의 동결건조된 조 타액의 복원 및 적어도 하나의 통상적인 크로마토그래피 단계, 바람직하게는 겔 투과 크로마토그래피에 의한 정제를 포함한다.
추가로, 본 발명은 약제 및 의료 기기에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 또다른 목적은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 상기 및 특허청구범위에서 정의된 바와 같은 활성 성분으로서의 단백질을 포함하는 약제를 제공하는 것이다.
본 발명에 따르는 약제는 선택적으로 히루딘 또는 헤파린과 같은 항응고제, 또는 플라스미노겐 활성제 또는 헤멘틴과 같은 혈전융해제와 같은 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 신규한 단백질 및 약제는 각각 정맥 혈전증, 말초 동맥 혈전증, 뇌혈관 혈전증 및 심근 혈전증을 포함하는 다양한 혈전색전성 질환의 치료 뿐만 아니라 동정맥 단락 환자 또는 관상 동맥 이식 수술을 받은 환자를 위해 사용될 수 있다. 피부 홍반성 낭창, 만성 류마티스 관절염 및 결절성 다발성관절염을 포함하는 자가면역 질환의 치료에 상기 제제를 사용할 수 있다. 본 발명의 제제는 거머리에 물린 후 겪게 되는 계속적인 출혈 현상을 모의하는데 또한 유용하고, 따라서 거머리 치료를 위해 현재 고려되는 이들의 적용시에 거머리를 완전히 또는 부분적으로 대체할 수 있다.
본 발명에 따르는 신규한 단백질은 임의의 무독성, 유기산 또는 무기산과 함께 약학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 인산 및 일수소 오르토인산 나트륨 및 황산 수소 칼륨과 같은 산 금속 염이다. 유기산의 예는 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코브산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산과 같은 모노-, 디-, 트리-카복실산 및 메탄 설폰산과 같은 설폰산이다. 카복시 말단 아미노산 잔기의 염은 임의의 적합한 무기 또는 유기 염기에 의해 형성된 무독성 카복실산 염을 포함한다. 이들 염은, 예를들면 나트륨 및 칼륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속, 알루미늄을 포함하는 제 3A 족의 경량 금속 및 트리에틸아민, 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디하이드로아비에틸아민 및 N-알킬피페리딘을 포함하는 트리알킬아민과 같은 유기 1급, 2급 및 3급 아민을 포함한다.
비경구적 투여에 전형적인, 통상적으로 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 보조제 및 비히클을 함유하는 단위 투여량으로 본 발명에 따르는 제제를 투여할 수 있다. "비경구적"이란 용어는 본원에서 피하, 정맥내, 동맥내 및 기관내 주사 및 주입 기술을 포함한다. 본 발명에 따르는 단위 투여량은 본 발명에 따르는 단백질의 일일 필요량을 함유할 수 있거나, 또는 여러개로 나누어 목적하는 투여량을 만들 수 있다. 환자(인간을 비롯한 포유류)에게 최적의 치료적으로 허용가능한 투여량은 사용된 특정 활성 물질의 활성, 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 음식, 투여 시간, 투여 방법 및 제거율등과 같은 다양한 요소에 따라 달라진다. 따라서, 콜라겐에 의한 혈소판 응집의 자극을 억제하는데 필요한 혈액 농도는 바람직하게는 0.1 mg/l 내지 50 mg/l의 범위내에 든다.
본원에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"란 용어는 활성 화합물과 또는 환자와 불리하게 반응하지 않는, 불활성, 무독성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 적합한 액체 담체는, 바람직하게는 석유, 동물, 식물, 또는 합성원에 포함되는 멸균수, 식염수, 수성 덱스트로즈, 당분 용액, 에탄올, 글리콜 및 오일, 예를들면 피넛유, 대두유 및 광유와 같은 당분야에 공지된 것들이다. 본 발명에 따르는 담체는 또한 사용하기 전에, 플라스틱 물질 및 합성 섬유 (하기 참조)로 통상 제조되는 의료 기기를 코팅하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 겔 또는 크림이다.
본 발명의 목적은 또한 표면이 실질적으로 혈전 저항성을 갖도록 상기 및 특허청구범위에서 정의된 고정된 단백질로 코팅된, 체액과 접촉하여 사용하기 위한 이식가능하거나 또는 체외적인 의료 기기를 제공하는 것이다. 상기 표면에 생체 적합성 및 혈전 저항성을 부여하기 위해 본 발명에 따르는 단백질을 의료 기기상에 고정시킨다. 상기 의료 기기는 전형적으로 혈소판 응집을 유발시키는 습식 표면을 때때로 가지는데, 이 표면은 이식가능하고 체외적인 장치를 혈액 또는 기타 체액과 접촉시켜 사용하는 이들의 목적된 용도에 있어서 불리하다. 상기 의료 기기의 예는 보철, 인공 장기, 봉합사, 인공 혈관 분절, 카테터, 투석기, 관 및 혈액 전달수송관이다.
의료 기기를 코팅하고 단백질을 고정시키는 방법은 표준 기술 (예: 미합중국 특허 제 4,885,207 호)에 따라 수행된다.
최종적으로, 본 발명은 시험관내에서, 생체내에서 콜라겐-자극 혈소판 응집 및 콜라겐에 대한 vWF의 결합을 방지하고 체외적인 치료에 사용하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 및 특허청구범위에 정의된 단백질의 용도에 관한 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1
콜라겐-자극 혈소판 응집에 대한 억제제로서 히루도 메디시날리스로부터 얻은 단백질의 시험관내 활성
히루도 메디시날리스의 조 타액에서, 혈소판이 풍부한 혈장(platelet-rich plasma, PRP)중에서 콜라겐에 의한 혈소판의 응집을 투여량 의존적 방식으로 억제하는 활성을 검출 할 수 있다.
혈액을 자원자로부터 채취하고 나트륨 시트레이트로 최종 농도가 0.38%이 되도록 하였다. 혈소판이 풍부한 혈장 및 혈소판이 부족한 혈장을 상이한 원심분리에 의해 제조하였다.
상이한 농도의 콜라겐 홈R(hormR) (호르몬케미에사 (Hormon chemie) 제품)을 첨가함으로써 응집기 PAP-4 (바이오데이타사 (Biodata) 제품)에서 혈소판 응집을예비형성시켰다. 콜라겐을 첨가한 후 최대 소멸을 변수로 하였다. 항혈전성에 의해 이 변수값이 감소된다.
이어서 단백질을 정제하고, 본 발명에 따르는 순수한 단백질의 특징을 분석하기 위해 상기 분석법을 내내 사용하였다.
실시예 2
단백질의 단리 및 크로마토그래피 정제
본 발명에 따르는 단백질을 히루도 메디시날리스의 조 타액으로부터 단리시킬 수 있었다. 동결건조된 타액을 20 mM 트리스-HCl, 10 mM CaCl2(pH 8.0) (TC-완충액)중에서 농도 20 mg/ml로 재구성시켰다. 상기 타액을 CM-프라크토겔R(CR-FraktogelR) 칼럼 (FRG, 다름스타트 소재의 이. 메르크사 (E. Merck) 제품)에 올려 놓고, 상기와 동일한 완충액중 NaCl-구배로 용출시켰다. 실시예 1에 기재된 혈소판-억제-분석법에서 활성인 칼럼 분획은 더이상의 히루딘 활성이 없었다. 20 mM 트리스-HCl, 10 mM CaCl2, 200 mM NaCl (pH 8.0) (TCN-완충액)중 디올-변성 실리카-칼럼상에서 겔 투과 크로마토그래피에 의해 최종 정제를 수행하였다. 상기 정제 단계의 전형적인 예는 제 1 도에서 예시된다. 조 타액의 단백질량과 비교한 정제된 단백질의 수율은 5%이었다. 기타 실험에서, 수율 2 내지 7%를 얻었다.
실시예 3
표본 전기영동법에 의한 단백질의 일단계 정제
선택적으로 표본 전기영동법에 의한 일단계로 단백질을 성공적으로 단리시킬 수 있었다. "프렙-셀R(Prep-cellR) 장치 (FRG, 무니크 소재의 바이오라드사 (Biorad) 제품)에서 전형적으로 10% 아크릴아미드를 가진 원통형 폴리아크릴아미드 겔을 제조업자의 지시에 따라 중합시켰다. 샘플을 전기영동 완충액중에 적용하였다. 전기영동 동안, 전기영동 방향에 직각 방향인 완충액 스트림은 용출된 단백질을 분획 수집기로 이동시키는 작용을 하였다. 분석용 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 상기 분획을 분석한 결과, 분자량 15.0 kD에 모였다. 또다른 변형된 실험에서, 분자량값은 14.5 kD을 나타내었다.
실시예 4
단백질의 특징 분석
실시예 1에 따르는 활성을 가진 정제된 단백질은 환원 조건하에서 SDS-PAGE에서 분자량이 대략 15000 D을 나타냈다. 제 2 도는 실시예 2에 기재된 전형적인 겔 투과 크로마토그래피로부터의 활성 분획을 예시한다. 겔상의 단백질 밴드를 은색 염색에 의해 가시화하였다.
정제된 단백질에 의해서는 하기 기재된 바람직한 분석 방법을 사용한 임의의 단백질분해 활성에 대해 검출할 수 없었다. 레소루핀R(ResorufinR) (FRG, 만하임소재의 뵈링거사 (Boehringer) 제품)에 의해 공유적으로 변성된 카세인을 기질로서 사용하고 프로테이나제 K를 양성 대조군으로서 사용하였다. 0.4% 카세인 용액 50 μl에 레소루핀으로 표식된 200 mM 트리스, 20 mM CaCl2(pH 7.8) 50 μl 및 샘플 용액 100 μl를 첨가하였다. 37℃에서 24시간동안 항온반응시킨 후, 트리클로로아세트산 5% 용액 450 μl를 첨가하므로써, 반응을 중단시켰다. 반응 혼합물을 원심분리시키고, 상청액 400 μl를 500 mM 트리스 (pH 8.8) 완충액 600 μl를 함유하는 큐벳트(cuvette)에 옮겼다. 574 nm에서의 흡광도를 즉시 측정하였다. 24시간동안의 항온처리 결과, 조 타액에서는 상당한 단백질분해 활성을 나타낸 반면, 정제된 단백질의 경우에 흡광도 값은 주변 수준을 약간 못미치는 것으로 관찰되었다 (하기 표 1 참조).
상기 기재된 단백질분해 활성이외에, 조 타액은 또한 콜라겐분해 활성을 갖고 있다. 상기 활성을 측정하는데 바람직한 방법은 하기 방법에서 비특이적 색소형성 콜라게나제 기질인 아조콜(azocoll)을 사용하는 것이다. 아조콜R(칼바이오켐 (Calbiochem))을 농도 20 mg/ml에서 50 mM 트리스, 200 mM NaCl, 0.1% 브리즈 (Brij) 35, 0.01% NaN3(pH 8.0) (완충액 A)중에 현탁시키고, 원심분리, 흡인 및 재현탁에 의해 두번 세척하였다. 샘플 또는 완충액 대조군 100 ㎕를 피펫으로 완충액 A중에 연속적으로 희석하면서 96-웰 미소역가 평판 웰에 옮겼다. 이 혼합물을 전형적으로 18시간동안 37℃에서 항온반응시켰다. 반응을 중단시키기 위해, 분해되지 않은 기질을 10분동안 1000 xg에서 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을새로운 미소역가 평판에 옮기고, 흡광도를 560 nm에서 측정하였다. 표준 곡선 (제 3 도)을 만들기 위해 클로스트리듐 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum)에서 얻은 콜라게나제 (시그마사 (Sigma) 제품)를 사용하였다.
표 2는 상기 분석법을 사용한 전형적인 측정 결과를 나타낸다. 놀랍게도, 조 타액 및 아조콜 분석법에서 활성을 나타내는 또다른 히루도 단백질[칼린 (Calin) (제 WO 92/07005 호)이라 명명됨]과는 대조적으로, 본 발명에 따르는 정제된 단백질은 주변 수준을 넘는 콜라겐분해 활성이 거의 없었다.
실시예 5
혈소판 응집에 대한 투여량에 따른 정제된 단백질의 억제
혈소판이 풍부한 혈장을 시험 화합물과 함께 37℃에서 2분동안 항온반응시키고, 콜라겐의 첨가에 의해 응집시켜 최종 농도 1.25 ㎍/ml로 만들었다. 본 발명의 단백질 (브란디닌)은 약 15 nM의 IC50을 나타냈다. 또다른 실험에서, 0.5 내지 100 nM의 결과가 얻어졌다. 타액의 조 추출물은 콜라겐-자극 뿐만 아니라 ADP-자극 혈소판 응집에 대한 억제를 나타냈다. 대조적으로, 브란디닌은 이용가능한 가장 높은 농도에서 효과를 나타내지 않았다. 제 4a 및 4b 도로부터 이해할 수 있다.
실시예 6
시험관내에서 콜라겐으로의 vWF의 결합에 대한 정제된 단백질의 억제
본 발명에 따르는 정제된 단백질은, 혈소판의 콜라겐과의 직접적인 상호작용을 억제하는 것 이외에, vWF의 결합을 방해한다는 놀라운 추가의 능력을 갖는다.
이는 96-웰 미소역가 평판을 웰당 말 힘줄로부터의 콜라겐 I 형 5㎍으로 코팅함으로써 나타났다. 0.1 M 아세트산중에 콜라겐을 용해시키고, 인산염 완충액 (pH 7.2)에 대해 18시간동안 투석하였다. 37℃에서 1시간동안 항온반응시킨 후, PBS 완충액중 10 mg/ml BSA 250 ㎕에 의해 웰을 차단하고, BSA가 없는 PBS 완충액으로 3회 세척하였다. 본 발명에 따르는 단백질을 함유한 샘플 25㎕를 첨가하고, 5 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.001% 트윈 80 (pH 7.4)을 함유한 PBS중에 1:80으로 희석된 인간 혈장 75 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 2시간동안 항온반응시켰다. 다시 세척하고, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (덴마크 코펜하겐 소재의 다코사 (Dako) 제품)에 결합된 1/4000 희석된 다클론성 래빗 항-vWF 항혈청 100 ㎕에 의해 결합된 vWF를 검출하였다. 항혈청을 37℃에서 1시간동안 항온반응시켰다. 37℃에서 30분동안 ABTS에 의해 색 발생을 수행하고, 405 nm에서 측정하였다. 일부 실험에서 인간 혈장 대신에 정제된 vWF 인자 (FRG, 레마겐 소재의 세르비오사 (Serbio) 제품)를 사용한 결과, 혈장 측정과 비교하여 매우 유사한 결과가 나타났다.
혈장 및 정제된 형태 둘다에서 vWF의 결합은 본 발명에 따르는 정제된 단백질인 브란디닌에 의해 투여량을 의존적 방식으로 방지될 수 있다. 표준 조건하에서 50% 억제는 대략 40 nM에서 나타났다 (0.5 nM 내지 100 nM) (제 5 도).
본 발명에 따른 단백질인 브란디닌은 콜라겐에 결합함으로써 콜라겐과 혈소판의 상호작용을 억제할 뿐만 아니라, 상기 내피하층 세포질 성분에 폰 빌레브란트 인자가 결합함을 억제한다.
Claims (2)
- 콜라겐-자극 혈소판 응집을 억제하고 콜라겐과 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand's factor: vWF) 사이의 상호작용을 방지하는 능력을 가지며 약용거머리 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)의 타액으로부터 입수가능하고 분자량이 14 내지 15.5 k인 고정된(immobilized) 단백질로 코팅되어 표면이 생체 적합성 및 혈전 저항성을 갖고, 보철, 인공 장기, 봉합사, 인공 혈관 분절, 카테터, 투석기, 관 및 혈액 전달 수송관으로 구성된 군에서 선택되는체액과 접촉하여 사용하기 위한 이식가능하거나 체외적인 의료 기기.
- 콜라겐-자극 혈소판 응집을 억제하고 콜라겐과 폰 빌레브란트 인자(vWF) 사이의 상호작용을 방지하는 능력을 가지며 약용거머리 히루도 메디시날리스의 타액으로부터 입수가능하고 분자량이 14 내지 15.5 kD이며, 보철, 인공 장기, 봉합사, 인공 혈관 분절, 카테터, 투석기, 관 및 혈액 전달 수송관으로 구성된 군에서 선택된 이식가능하거나 체외적인 의료 기기를 코팅하기 위한단리된 단백질.
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