PL180403B1

PL180403B1 - Zwiazki merkaptoalkilopeptydylowe oraz zawierajace je srodki farmaceutyczne PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180403B1
Application number: PL94314300A
Authority: PL
Inventors: John Montana; Jonathon Dickens; David Alan Owen; Andrew Douglas Baxter
Original assignee: Darwin Discovery Ltd
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 2001-01-31
Also published as: DE69422726D1; NO961888D0; PL314300A1; CA2173470A1; AU8113394A; NO961888L; CZ134996A3; HUT73799A; FI961976A7; FI961976A0; DE69422726T2; BR9408025A; ES2143611T3; AU679286B2; CZ287780B6; PT728144E; ATE188969T1; JPH09505041A; HK1015139A1; CN1134705A

Abstract

1 Z w ia z k i m erkaptoalkilopeptydylow e o w z o rz e (I) w którym R 1 o znacza g rupe C 2-6-alkilow a albo C 1 -6-alkilo-O H , R2 oznacza atom w odoru albo grupe C 1 -6-alkilow a, R4 oznacza atom w odoru albo grupe C 1 -6-alkilow a; R5 oznacza atom w odoru albo grupe C 1 -6-alkilow a, R6 oznacza grupe C1-6 -alkilowa, benzylowa albo 3-indolilome- tylowa, A lk ozn acza grupe C 1-6-a lk ilo w a alb o C 2-6-alken ylow a, n ozn acza 0 alb o 1, R 7 oznacza atom w odoru albo grupe R 1 0 C O , w której R 10 o zna- cza grupe C 1 -4-alkilow a; R 8 oznacza atom w odoru, grupe C 1 -4 -alkilow a albo grupe ( C 1 -4-alkilo)arylow a. 4 Srodek farm aceutyczny zaw ierajacy fizjologicznie dopusz- czalny rozcienczalnik lub nosnik i substancje czynna, z n am ien n y ty m , ze substancje czynna stanow i zw iazek m erkaptoalkilopepty- dy lo w y o w zorze ( I), w którym . R oznacza grupe C 2-6-alkilow a albo C 1 -6-alkilo-O H , R 2 oznacza atom w odoru albo grupe C 1 -6-alkilow a, R4 oznacza atom w odoru albo grupe C 1 -6-alkilow a, R 5 oznacza atom w odoru albo grupe C 1 -6-alkilow a, R6 o znacza grupe C 1 -6-alkilow a, benzylow a albo 3 -indolilom e- tylow a, A lk oznacza grupe C 1 -6-alkilow a albo C 2-6-alkenylow a, n oznacza 0 albo 1, R 7 oznacza atom w odoru albo grupe R 1 0 C O , w której R 1 0 o zna- cza grupe C 1 -4-alkilow a, R8 oznacza atom w odoru, grupe C 1-4-alkilowa albo grupe (C 1-4-alkilo)arylow a. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku sąnowe związki merkaptoalkilopeptydylowe o wzorze (I), w którym:

R¹ oznacza grupę C₂.₆-alkilową albo C|.₆-alkilo-OH;

R² oznacza atom wodoru albo grupę C ^-alkilową

R⁴ oznacza atom wodoru albo grupę C ^-alkilową

R⁵ oznacza atom wodoru albo grupę C^-alkilową

R⁶ oznacza grupę C^-alkilową, benzylową albo 3-indolilometylową

Alk oznacza grupę C ^-alkilową albo C₂.₆-alkenylową n oznacza 0 albo 1;

R⁷ oznacza atom wodoru albo grupę R'°CO, w której R¹⁰ oznacza grupę C^-alkilową

R⁸ oznacza atom wodoru, grupę C_M-alki Iową albo grupę (C_t.₄-alkilo)arylową.

Związki według wynalazku mogą zawierać jeden lub więcej asymetrycznie podstawionych atomów węgla, na przykład atomów oznaczonych gwiazdką we wzorze (I). Obecność jednego lub więcej tych centrów asymetrii w związku o wzorze (I) może powodować występowanie stereoizomerów i w każdym przypadku rozumie się, że wynalazek obejmuje wszystkie takie stereoizomery, włączając enancjomery i diastereomery, oraz ich mieszaniny włącznie z mieszaninami racemicznymi.

Stosowane w niniejszym opisie, samo lub w zestawieniach, wyrażenie „C^-alkil” lub „C₂.₆-alkil” oznacza prosty lub rozgałęziony rodnik alkilowy o odpowiednio 1 -6 lub 2-6 atomach węgla, obejmujący na przykład metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl, heksyl. Tak więc na przykład [Alk]_nR6 może oznaczać tert-butyl.

Określenie „C].₄-alkil” oznacza prosty lub rozgałęziony rodnik alkilowy o 1-4 atomach węgla, taki jak na przykład metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl i tert-butyl.

Określenie „C₂._ć-alkenyl” oznacza prosty lub rozgałężiony rodnik alkilowy zawierający 2-6 atomów węgla i posiadający dodatkowo jedno podwójne wiązanie o stereochemii E albo Z, jeśli to możliwe. Termin ten oznacza na przykład winyl, 1-propenyl, 1- i 2-butenyl oraz 2-metylo-2-propenyl.

Wyrażenie „aryl” oznacza grupę fenylową lub naftylową.

Określenie „chroniona grupa aminowa” i „chroniona grupa karboksylowa” oznacza grupę aminową i karboksylową które są chronione w sposób znany fachowcom. Na przykład grupa aminowa może być chroniona za pomocą grupy benzyloksykarbonylowej, tert-butoksykarbonylowej, acetylowej lub podobnych grup, albo w postaci grupy ftalimidowej lub grup podobnych. Grupa karboksylowa może być chroniona w formie łatwo rozszczepialnego estru, takiego jak ester metylowy, etylowy, benzylowy lub III-rz.butylowy.

Związki o wzorze (I) mogą tworzyć sole, w tym sole farmaceutycznie dopuszczalne, na przykład sole addycyjne z kwasami, pochodzące od kwasów nieorganicznych lub organicznych, takie jak chlorowodorki, bromowodorki, p-toluenosulfoniany, fosforany, siarczany, nadchlorany, octany, trifluorooctany, propioniany, cytryniany, maloniany, bursztyniany, mleczany, szczawiany, winiany i benzoesany.

Sole mogą się tworzyć również z zasadami. Sole takie obejmują sole pochodzące od zasad nieorganicznych lub organicznych, na przykład sole metali alkalicznych, takie jak sole magnezowe i wapniowe, oraz sole z organicznymi zasadami aminowymi, takimi jak morfolina, piperydyna, dimetyloamina lub dietyloamina.

Korzystnymi związkami według wynalazku są takie związki, w których niezależnie lub w dowolnej kombinacji R¹ oznacza grupę C^-alkiIową albo C^-alkilo-OH, na przykład grupę 2-metylopropylo-(izobutylową) albo 2-hydroksyetylową R² oznacza atom wodoru; n oznacza zero; R⁴ oznacza atom wodoru albo grupę C ^-alkilową na przykład grupę metylową R⁵ oznacza atom wodoru albo grupę C[^-alkilową na przykład grupę metylową R⁶ oznacza grupę benzylową albo 3-indolilometylową

Szczególnie korzystne są związki według wynalazku wybrane spośród następujących związków:

metyloamid N-[N-(merkaptoacetylo)-L-leucylo]-L-fenyloalaniny, metyloamid N-[(acetomerkaptoacylo)-L-leucylo]-L-fenyloalaniny,

180 403

N-metyloamid 2-(acetylotio)pentanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)propanoilo-L-leucyIo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)-3-metylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)-2-fenyloacetylo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)-3-fenylopropanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)-4-fenylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, metyloamid N-(acetylomerkaptoacylo)-L-treonylo-L-fenyloalaniny, metyloamidN-(acetylomerkaptoacylo)-L-leucylo-L-tryptofanu, N-metyloamid 2-merkaptopentanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkaptopropanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkapto-3-metylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkapto-2-fenyloacetylo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkapto-3-fenylopropanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkapto-4-fenylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, metyloamid N-[N-(merkaptoacetylo)-L-treonylo]-L-fenyloalaniny i metyloamid N-[N-(merkaptoacetylo)-L-leucylo]-tryptofanu.

Związki o ogólnym wzorze (I) można wytwarzać dowolną odpowiednią znaną metodą i/lub za pomocą sposobów, które są częścią wynalazku. Należy zaznaczyć, że gdy pożądany jest określony stereoizomer o wzorze (I), to opisane tu procesy syntezy prowadzi się, stosując odpowiedni homochiralny związek wyjściowy i/lub izomery rozdziela się z mieszanin, stosując konwencjonalne techniki rozdzielania (np. wysokociśnieniową chromatografię cieczowąHPLC).

Związki według wynalazku można wytwarzać w następujący sposób. W poniższym opisie i wzorach grupy R¹, R², R⁶, R⁷ i R⁸ mają znaczenie wyżej podane, chyba że zaznaczono inaczej, R³ oznacza [Alk]„R⁶, zaś X oznacza NR⁴R⁵. Należy podkreślić, że grupy funkcyjne, takie jak grupa aminowa, hydroksylowa lub tiolowa, występujące w różnych związkach niżej opisanych i które mająpozostać w związku, mogą wymagać ochrony przed rozpoczęciem reakcji. W takich przypadkach usuwanie grup ochronnych może być ostatnim etapem danej reakcji. Odpowiednie grupy ochronne dla takich grup funkcyjnych są oczywiste dla fachowca. Szczegółowe dane opisane są w „Protective Groups in Organie Synthesis”, Wiley Interscience, T.W. Greene, PGM Wuts.

Sposób wytwarzania związków o ogólnym wzorze (1) polega na usuwaniu grup ochronnych (na przykład drogą hydrolizy) ze związku o ogólnym wzorze (II), który odpowiada wzorowi (I), w którym R⁷ oznacza odpowiednią grupą ochronną (np. tert-butylową lub octanową).

Należy zaznaczyć, że gdy pożądany jest określony stereoizomer o wzorze (I), można go otrzymywać drogą konwencjonalnych technik rozdzielania, takich jak wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa. Jeśli to pożądane, to można też stosować do reakcji sprzęgania odpowiednie homochiralne związki wyjściowe, otrzymując określony stereoizomer o wzorze (I). Jest to niżej przykładowo opisane.

Związki pośrednie o wzorze (II) można wytwarzać przez sprzęganie kwasu o wzorze (ΙΠ), w którym R⁷ i R⁸ maja znaczenie wyżej podane, albo jego aktywnej pochodnej z aminą o wzorze (IV). Aktywne pochodne kwasów o wzorze (III) obejmują na przykład bezwodniki kwasowe albo halogenki kwasowe, takie jak chlorki kwasowe.

Reakcje sprzęgania można prowadzić, stosując standardowe warunki dla reakcji aminowania tego typu. Tak więc reakcję można prowadzić w rozpuszczalniku, takim jak na przykład obojętny rozpuszczalnik organiczny, taki jak eter, np. eter cykliczny, taki jak tetrahydrofuran, amid, np. podstawiony amid, taki jak dimetyloformamid, albo chlorowcowany węglowodór, taki jak dichlorometan, w niskiej temperaturze, np. -30°C do temperatury pokojowej, jak -20°C do 0°C, ewentualnie w obecności zasady, np. zasady organicznej, takiej jak amina, np. trietyloamina albo amina cykliczna, taka jak N-metylomorfolina. W przypadku stosowania kwasu o wzorze (111) reakcję dodatkowo prowadzi się w obecności środka kondensującego, na przykład diimidu, takiego jak Ν,Ν'-dicykloheksylokarbodiimid, korzystnie w obecności triazolu, takiego jak 1-hydroksy

180 403 benzotriazol. Kwas można też poddawać reakcji z chloromrówczanem, na przykład chloromrówczanem etylu, przed reakcją z aminą o wzorze (IV).

Aminę o ogólnym wzorze (IV) można wytwarzać drogą sprzęgania kwasu o wzorze (V) albo jego aktywnej pochodnej z aminą o wzorze (VI), po czym usuwa się grupy ochronne.

Aktywne pochodne kwasów o wzorze (V) obejmują na przykład bezwodniki kwasowe albo halogenki kwasowe, takie jak chlorki kwasowe, jak wyżej podano.

Aminokwasy i ich pochodne, jak przedstawiono we wzorach ogólnych (V) i (VI), można otrzymać w postaci chiralnej lub racemicznej. W postaci chiralnej zawierają one asymetryczne bloki strukturalne dla chiralnej syntezy związków o ogólnym wzorze (1). Wiele z tych pochodnych można łatwo otrzymywać z dostępnych w handlu materiałów wyjściowych, stosując metody znane fachowcom. (Patrz „The Practice of Peptide Synthesis”, M. Bodanszky i inni, wydawnictwo Springer, Nowy Jork, 1984; WO 92/21360).

Związki o ogólnym wzorze (II) można wytwarzać drogą nukleofilowego podstawiania związków o ogólnym wzorze (VII), w którym R₁₄ oznacza odpowiednią grupę odszczepialną (np. chlorowiec, taki jak bromek, albo ester alkilosulfonianowy, taki jak metanosulfonian) tiolem o ogólnym wzorze (VIII), w którym R⁷ oznacza odpowiednią grupę ochronną (np. grupę tertbutylową lub octanową), stosując standardowe warunki znane fachowcom, jak przykładowo opisano w WO 90/05719.

Tiole o ogólnym wzorze (VIII) można wytwarzać z dostępnych w handlu materiałów wyjściowych, stosując metody znane fachowcom. Liczne tiole o ogólnym wzorze (VIII) są również dostępne w handlu.

Związki o ogólnym wzorze (VII) można wytwarzać drogą sprzęgania kwasu o ogólnym wzorze (IX), w którym R¹⁴ i R⁸ mająznaczenie wyżej podane, (albo jego odpowiednich chronionych wersji) albo jego aktywnej pochodnej z aminą o wzorze (IV), stosując warunki sprzęgania analogiczne do opisanych przy wytwarzaniu związków o wzorze (II).

Kwasy karboksylowe przedstawione we wzorach (III) i (IX) można otrzymywać w postaci chiralnej lub racemicznej. Wiele z tych pochodnych można łatwo otrzymywać z dostępnych w handlu związków wyjściowych, stosując metody znane fachowcom (patrz WO 90/05719).

Związki o wzorze (I) można również wytwarzać drogąinterkonwersji innych związków o wzorze (I). Tak więc na przykład związek o wzorze (I), w którym R¹ oznacza grupę C7.6-alkilową, można wytwarzać drogą uwodorniania (z zastosowaniem palladu na węglu w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak alkohol, np. etanol) związku o wzorze (I), w którym R¹ oznacza grupę C2.₆-alkenylową. Związek o wzorze (I), w którym R⁷ oznacza grupę R'°CO, można wytwarzać drogąacylowania (z zastosowaniem odpowiedniego chlorku kwasowego R^l0COCl, w obecności zasady, takiej jak trietyloamina, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak rozpuszczalnik chlorowany, np. dichlorometan) związku o wzorze (I), w którym R⁷ oznacza atom wodoru.

Mieszaniny produktów końcowych lub związków pośrednich można rozdzielać na podstawie fizyko-chemicznych różnic składników w znany sposób na czyste produkty końcowe lub związki pośrednie, na przykład drogą chromatografii, destylacji, frakcjonowanej krystalizacji, albo przez tworzenie soli, jeśli to odpowiednie lub możliwe w danych okolicznościach.

Związki według wynalazku wykazująin vitro działanie hamujące wobec stromelizyny, kologenazy i żelatynazy. Związki według wynalazku wykazująrównież in vitro działanie hamujące uwalnianie TNF. Aktywność i selektywność związków można oznaczać, stosując odpowiedni test na hamowanie enzymów, na przykład jak opisano niżej w przykładzie A.

Związki o wzorze (I) można stosować do leczenia pacjentów, w tym człowieka i/lub ssaków hodowanych dla celów mleczarstwa, mięsa lub dla celów przemysłowych albo jako hobby, cierpiących na schorzenia lub choroby, które można wiązać ze stromelizyną, oraz do leczenia chorób lub stanów występujących za pośrednictwem TNF lub MMP, miedzy innymi do leczenia zapalenia kości i stawów oraz reumatoidalnego zapalenia stawów, oraz w przypadku chorób i wskazań wynikających z nadekspresji tych macierzowych metaloproteinaz, jak to stwierdzono w niektórych liniach komórkowych przerzutów nowotworowych.

180 403

W tym celu związek o wzorze (I) można stosować do wytwarzania środków do traktowania (przez co rozumie się leczenie lub zapobieganie) chorób lub stanów występujących za pośrednictwem TNF i/lub MMP.

Powyższe choroby lub stany obejmują zapalenia, gorączkę, objawy sercowonaczyniowe, krwotoki, krzepnięcie i odpowiedź fazy ostrej, charłactwo i anoreksję, ostre infekcje, stany wstrząsowe, reakcję przeszczepu przeciwko gospodarzowi i choroby autoimmunologiczne; oraz choroby obejmujące rozkład tkanki, takie jak choroby kości, schorzenia zapalne, choroby dermatologiczne, wzrost nowotworów, angiogeneza i inwazja wtórnych przerzutów, zwłaszcza reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, zapalenie ozębnej, zapalenie dziąseł, owrzodzenie rogówki, wzrost nowotworów, angiogeneza i inwazja wtórnych przerzutów.

Do leczenia reumatologicznego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów oraz w chorobach i wskazaniach wynikających z nadekspresji macierzowych metaloendoproteinaz, takich jak stwierdzono w niektórych liniach komórkowych przerzutów nowotworowych lub innych chorobach wywoływanych przez macierzowe metaloendoproteinazy lub wzmożone wytwarzanie TNF, związki o wzorze (I) można podawać doustnie, miejscowo, pozajelitowe, drogą inhalacji, za pomocą rozpylania albo doodbytniczo, w preparatach dawek jednostkowych zawierających nie toksyczne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, środki pomocnicze i podłoża. Stosowane tu określenie „pozajelitowy” obejmuje iniekcje podskórne, dożylne, domięśniowe, techniki domostkowych iniekcji lub infuzji. Dodatkowo do leczenia zwierząt ciepłokrwistych, takich jak myszy, szczury, konie, bydło, owce, psy i koty, związki według wynalazku są skuteczne w leczeniu ludzi.

Tak więc przedmiotem wynalazku są środki farmaceutyczne, zawierające fizjologicznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik, charakteryzujące się tym, że substancję czynną stanowi związek merkaptoalkilopeptydylowy o wzorze (I), w którym:

R¹ oznacza grupę C₂.₆-alkilową albo C|.₆-alkilo-OH;

R² oznacza atom wodoru albo grupę C|.₆-alkilową

R⁴ oznacza atom wodoru albo grupę C ^-alkilową;

R³ oznacza atom wodoru albo grupę C|.₆-alkilową

R⁶ oznacza grupę C|.₆-alkilową, benzylową albo 3-indolilometylową

Alk oznacza grupę C|.₆-alkilową albo C₂.₆-alkenylową n oznacza 0 albo 1;

R⁷ oznacza atom wodoru albo grupę R^l0CO, w której R¹⁰ oznacza grupę C_M-alkilową;

R⁸ oznacza atom wodoru, grupę C_M-alkilowąalbo grupę (C₁.₄-alkilo)arylową.

Środki farmaceutyczne zawierające substancję czynną mogą występować w postaci odpowiedniej do podawania doustnego, na przykład jako tebletki, pastylki, pastylki do ssania, wodne lub olejowe zawiesiny, zwilżalne proszki lub granulki, emulsje, twarde lub miękkie kapsułki, syropy lub eliksiry. Kompozycje do podawania doustnego można wytwarzać według metod znanych dla wytwarzania kompozycji farmaceutycznych, przy czym kompozycje takie mogą zawierać jeden lub więcej środków, takich jak środki słodzące, środki aromatyzujące, środki barwiące i środki konserwujące, w celu uzyskania preparatów farmaceutycznie doskonałych i smacznych. Tabletki zawierają substancję czynną w mieszaninie z nie toksycznymi farmaceutycznie dopuszczalnymi podłożami, które nadają się do wytwarzania tabletek. Podłożami tymi mogą być na przykład obojętne rozcieńczalniki, takie jak węglan wapnia, węglan sodu, laktoza, fosforan wapnia albo fosforan sodu; środki granulujące i rozkruszające, na przykład skrobia kukurydziana lub kwas alginowy; środki wiążące, na przykład skrobia, żelatyna lub guma arabska oraz środki zwiększające poślizg, na przykład stearynian magnezu, kwas stearynowy lub talk. Tabletki mogą być niepowlekane albo powlekane znanymi technikami dla opóźnienia dezintegracji i absorpcji w przewodzie żołądkowo-jelitowym, zapewniając przedłużone działanie w dłuższym okresie czasu. Można na przykład stosować materiał opóźniający, taki jak monostearynian glicerylowy lub distearynian glicerylowy. Można je ponadto powlekać za pomocą technik opisanych w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4256108, 4166452 i 4265874, w celu uzyskania osmotycznych tabletek leczniczych o kontrolowanym uwalnianiu.

180 403

Preparaty do podawania doustnego mogą występować również w postaci twardych kapsułek żelatynowych, w których substancję czynną miesza się z obojętnym stałym rozcieńczalnikiem, na przykład węglanem wapnia, fosforanem wapnia lub kaolinem, albo w postaci miękkich kapsułek żelatynowych, w których substancję czynną miesza się z wodą lub środowiskiem olejowym, na przykład olejem arachidowym, ciekłą parafiną łub oliwą z oliwek.

Zawiesiny wodne zawierają substancję czynną w mieszaninie z podłożem odpowiednim do wytwarzania zawiesin wodnych. Podłożem takim są środki utrzymujące zawiesinę, na przykład sodowa pochodna karboksymetylocelulozy, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, alginian sodu, poliwinylopirolidon, tragakant i guma arabska; jako środki dyspergujące lub zwilżające stosuje się naturalnie występujące fosfatydy, na przykład lecytynę, albo produkty kondensacji tlenku alkilenu z kwasami tłuszczowymi, na przykład stearynian pohoksyetylenu, albo produkty kondensacji tlenku etylenu z alkoholami alifatycznymi o długim łańcuchu, na przykład heptadekaetylenooksycetanol, albo produkty kondensacji tlenku etylenu z częściowymi estrami pochodzącymi od kwasów tłuszczowych i heksytolu, takie jak polioksyetyleny z częściowymi estrami pochodzącymi od kwasów tłuszczowych i bezwodników heksytolu, na przykład monooleiniany polioksyetylenosorbitanu. Zawiesiny wodne mogą również zawierać jeden lub więcej środków konserwujących, na przykład p-hydroksybenzoesan etylu lub n-propylu, jeden lub więcej środków barwiących, jeden lub więcej środków aromatyzujących i jeden lub więcej środków słodzących, takich jak sacharoza lub sacharyna.

Zawiesiny olejowe można otrzymywać przez zawieszenie substancji czynnej w oleju roślinnym, na przykład w oleju arachidowym, oliwie z oliwek, oleju sezamowym lub oleju kokosowym, albo w oleju mineralnym, takim jak ciekła parafina. Zawiesiny olejowe ,mogą zawierać środek zagęszczający, na przykład wosk pszczeli, twardą parafinę lub alkohol cetylowy. Można dodawać środki słodzące, takie jak wyżej podano oraz środki aromatyzujące w.celu polepszenia smaku preparatów doustnych. Środki takie można konserwować przez dodawanie przeciwutleniaczy, takich jak kwas askorbinowy.

Zwilżalne proszki i granulaty nadające się do wytwarzania wodnych zawiesin przez dodawanie wody zawierają substancję czynną w mieszaninie ze środkiem dyspergującym lub zwilżającym, środkiem utrzymującym zawiesinę i jednym lub więcej środkiem konserwującym. Odpowiednie środki dyspergujące lub zwilżające i utrzymujące zawiesinę są tu przykładowo podane. Można dodawać również środki słodzące, aromatyzujące i barwiące.

Środki farmaceutyczne według wynalazku mogą występować również w postaci emulsji olej-w-wodzie. Faząolejowąmoże być olej roślinny, na przykład oliwa z oliwek albo olej arachidowy, albo olej mineralny, na przykład ciekła parafina, albo ich mieszaniny. Jako środki emulgujące stosuje się naturalnie występujące żywice, na przykład gumę arabską albo tragakant, naturalnie występujące fosfatydy, na przykład soję, lecytynę oraz estry lub częściowe estry pochodzące od kwasów tłuszczowych i bezwodników heksytolu, na przykład monooleinian sorbitanu oraz produkty kondensacji tych częściowych estrów z tlenkiem etylenu, na przykład monooleinian polioksyetylenosorbitanu. Emulsje mogą zawierać także środki słodzące i aromatyzujące.

Syropy i eliksiry można wytwarzać z zastosowaniem środków słodzących, na przykład gliceryny, glikolu propylenowego, sorbitolu lub sacharozy. Preparaty takie mogą również zawierać środki łagodzące podrażnienie, środki konserwujące i aromatyzujące oraz środki barwiące.

Środki farmaceutyczne mogą też występować w postaci sterylnych wodnych lub olejowych zawiesin do wstrzykiwania. Zawiesiny takie można otrzymywać w znany sposób z zastosowaniem wyżej wymienionych odpowiednich środków dyspergujących lub zwilżających i środków utrzymujących zawiesinę. Sterylny preparat do wstrzykiwania może występować również w postaci sterylnego dającego się wstrzykiwać roztworu lub zawiesiny w nie toksycznym pozajelitowo dopuszczalnym rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, na przykład w postaci roztworu w 1,3-butanodiolu. Jako dopuszczalne podłoża i rozpuszczalniki, które można stosować, wymienia się wodę, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Ponadto jako rozpuszczalniki lub środowisko zawiesiny można stosować sterylne, trwałe oleje. W tym

180 403 celu można stosować łagodne, trwałe oleje, włącznie z syntetycznymi mon- lub diglicerydami. Ponadto kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy, znajdują zastosowanie w wytwarzaniu preparatów do iniekcji.

Związki o wzorze (I) można też podawać w postaci czopków do doodbytniczego stosowania leku. Środki takie można wytwarzać drogą zmieszania leku z odpowiednim nie drażniącym podłożem, które jest stałe w temperaturze pokojowej, lecz ciekłe w temperaturze odbytnicy i w związku z tym topniejące w odbytnicy, uwalniając lek. Jako produkty takie stosuje się masło kakaowe i glikole polietylenowe.

Do użytku miejscowego stosuje się kremy, maści, żele, roztwory lub zawiesiny itp. zawierające związki o wzorze (I). Preparaty do podawania miejscowego obejmują również płukanki do ust i gardła.

Do leczenia w przypadku wyżej podanych schorzeń stosuje się dawki od około 0,05 do około 140 mg na kg wagi ciała dziennie (około 2,5 mg do około 7 g na pacjenta dziennie). Na przykład stany zapalne leczy się skutecznie przez podawanie od około 0,01 do 50 mg związku na kg wagi ciała dziennie (około 0,5 mg do około 3,5 g na pacjenta dziennie).

Ilość substancji czynnej, którą zestawia się z nośnikiem w celu otrzymania pojedynczej dawki zmienia się w zależności od traktowanego obiektu i sposobu podawania. Na przykład preparat do doustnego podawania człowiekowi może zawierać od około 5 do około 95% całej kompozycji. Postacie dawek jednostkowych zawierają na ogół od około 1 mg do około 500 mg substancji czynnej.

Rozumie się jednakże, że specyficzny poziom dawkowania dla danego pacjenta zależy od różnych czynników, takich jak aktywność specyficznego stosowanego związku, wiek, waga ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, czas podawania w stosunku do posiłków, droga podawania, wydalanie, zestawienie leków oraz stopień schorzenia podlegającego leczeniu.

Następujące nie ograniczające przykłady 1-20 ilustrują sposób wytwarzania związków o wzorze (I) z zastosowaniem materiałów obejmujących następujące związki pośrednie. Przykłady A do D przedstawiają przeprowadzone testy.

W przykładach stosuje się następujące skróty:

DCC dicykloheksylokarbodiimid

RT temperatura pokojowa

EDC chlorowodorek l-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu

THF tetrahydrofuran

TNFa czynnik martwiczy guza a

PMA 12-octan 13-mirystynianu forbolu

ELISA enzymatyczny test immunosorpcyjny

Związek pośredni 1. N-metyloamid L-fenyloalaniny

DCC (3,02 g) wprowadza się do roztworu N-benzylokarbaminianu L-fenyloalaniny (4,00 g) i N-hydroksysukcynimidu (1,69 g) w bezwodnym THF (35 ml) w temperaturze 0°C. Mieszaninę miesza się w tej temperaturze w ciągu 16 godzin i sączy przez Celit. Do przesączu dodaje się wodny roztwór metyloaminy (40% aq., 5 ml) i mieszaninę miesza się w RT w ciągu 24 godzin. Mieszaninę reakcyjną zatęża się w próżni, a surowy produkt (6,01 g) rozpuszcza się w etanolu (250 ml). Do etanolowego roztworu w zamkniętym naczyniu dodaje się zawiesinę 10% palladu na węglu w wodzie (około 2 ml). Mieszaninę miesza się w obecności wodoru przy 724 kPa (105 psi) w ciągu 18 godzin. Roztwór sączy się przez Celit, a przesącz odparowuje w próżni. Pozostałość rozdziela się pomiędzy 1 N kwas solny (110 ml) i dichlorometan (50 ml). Warstwy rozdziela się i warstwę wodną ekstrahuje dichlorometanem (50 ml). Warstwę wodnąalkalizuje się za pomocą 3 N roztworu wodorotlenku potasu do wartości pH ~14 i ekstrahuje dichlorometanem (3 x 50 ml). Te ostatnie ekstrakty łączy się, suszy (Na₂SO₄), sączy i odparowuje, otrzymując związek tytułowy w postaci bezbarwnego lepkiego oleju, który zestala się w wysokiej próżni (2,24 g)

180 403

TLC R_f 0,15 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

Analogicznie wytwarza się:

Związek pośredni 2. N-metyloamid L-tryptofanu

Związek ten otrzymuje się zN-benzylokarbaminianu L-tryptofanu (50 g) w postaci bezbarwnego oleju (14,3 g).

TLC R_f 0,30 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

Związek pośredni 3. Metyloamid N-[N-(karbobenzyloksy)-L-leucylo]-L-fenyloalaniny

Związek pośredni 1 (1,33 g), N-benzylokarbaminian L-leucyny (1,98 g), N-hydroksybenzotriazol (1,21 g) i EDC (1,57 g) miesza się razem w bezwodnym THF (30 ml) w temperaturze 0°C w ciągu 24 godzin. Dodaje się wodę (10 ml) i dichlorometan (10 ml) i rozpuszczalnik organiczny usuwa się w próżni, fazę wodną rozdziela się pomiędzy rozcieńczony kwas solny (IN, 10 ml) i octan etylu (20 ml). Fazę organiczną oddziela się, przemywa nasyconym roztworem wodorowęglanu (8%, 20 ml) i solanką (20 ml), suszy (Na₂SO₄), sączy i odparowuje, otrzymując mętny żel. Produkt ten ponownie rozpuszcza się w dichlorometanie i odparowuje w próżni, otrzymując produkt w postaci bezbarwnej substancji stałej (2,78 g).

TLC R_f 0,60 (EtOAc).

Analogicznie wytwarza się:

Związek pośredni 4. Metyloamid N-[N-(karbobenzyloksy)-L-leucylo]-L-tryptofanu

Związek ten otrzymuje się ze związku pośredniego 2 (11,4 g) w postaci białej substancji stałej (20 g).

TLC R_f 0,46 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

Związek pośredni 5. Metyloamid N-[N-(karbobenzyloksy)-L-treonylo]-L-fenyloalaniny

Związek ten otrzymuje się z N-benzylokarbaminianu L-treoniny (4,3 g) w postaci bezbarwnego oleju (7,7 g).

TLC R_f 0,31 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

Związek pośredni 6. Metyloamid N-(L-leucylo)-L-fenyloalaniny

Związek pośredni 3 (2,78 g) rozpuszcza się w etanolu (140 ml), po czym dodaje się 10% pallad na węglu (0,5 g) (w postaci zawiesiny w około 3 ml wody). Zawiesinę miesza się w atmosferze wodoru w ciągu 16 godzin. Mieszaninę sączy się przez Celit, przemywając dichlorometanem (20 ml). Po odparowaniu przesączu otrzymuje się bezbarwny półstały produkt, który rozpuszcza się w 1 N kwasie solnym (100 ml) i ekstrahuje dichlorometanem (3 x 50 ml), po czym alkalizuje się wodorotlenkiem sodu (3 N, 50 ml) i ekstrahuje dichlorometanem (3 x 50 ml). Wyciągi te łączy się, suszy (Na₂SO₄), sączy i odparowuje, otrzymując związek tytułowy w postaci bezbarwnej substancji stałej (1,66 g).

TLC Rf 0,13 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

Związek pośredni 7. Metyloamid N-(L-leucylo)-L-tryptofanu

Roztwór związku pośredniego 4 (2 g) w cykloheksanie (50 ml) i etanolu (50 ml) traktuje się 10% palladem na węglu (0,2 g). Mieszaninę miesza się pod chłodnicą zwrotna w ciągu 2 godzin. Rozpuszczalnik usuwa się w próżni po przesączeniu przez Celit, a pozostałość oczyszcza się drogą szybkiej chromatografii kolumnowej (SiO₂, 10% MeOH, CH₂C1₂), otrzymuj ąchigroskopijną bezbarwną substancję stałą (1,05 g).

TLC Rf 0,38 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

Analogicznie wytwarza się:

Związek pośredni 8. Metyloamid N-(L-treonylo)-L-fenyloalaniny

Związek ten otrzymuje się ze związku pośredniego 5 (6,6 g) w postaci białej substancji stałej (3,31 g).

TLC R_t· 0,05 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

Związek pośredni 9. Kwas acetylomerkaptooctowy

Sód (460 mg) wprowadza się do etanolu (20 ml), po czym do roztworu dodaje się kwas tiolooctowy (1,50 ml). Po upływie 5 minut dodaje się kwas bromooctowy (2,78 g) i mieszaninę miesza się w RT w ciągu 18 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się dichlorometanem (60 ml) i sączy przez Celit. Przesącz odparowuje się, otrzymując blado żółty olej. Surowy produkt rozpu

180 403 szcza się w dichlorometanie (10 ml), ponownie sączy i odparowuje, otrzymując związek tytułowy w postaci blado żółtego oleju (2,84 g).

Ή NMR (200 MHz; CDC1₃; Ref TMS) 2,41 (s, 3H) i 3,75 (s, 2H)

Związek pośredni 10. Kwas (RS)-2-bromowalerianowy

Roztwór D,L-nor-waliny (10 g) i bromku potasu (35,5 g) w wodnym kwasie siarkowym (1,25 M, 130 ml) traktuje się w temperaturze 0°C porcjami stałego azotynu sodu (8,8 g) w ciągu 1 godziny. Następnie roztwór pozostawia się do ogrzania do RT i miesza w ciągu 2 godzin. Mieszaninę ekstrahuje się dichlorometanem (2 x 100 ml), połączone ekstrakty suszy się (MgSO₄) i odparowuje w próżni, otrzymując związek tytułowy (11,53 g) w postaci bezbarwnego oleju.

TLC R_f 0,60 (EtOAc).

Analogicznie wytwarza się:

Związek pośredni 11. Kwas (RS)-2-bromo-3-metylomasłowy

Związek ten otrzymuje się ze D,L-waliny (10 g) w postaci bezbarwnego oleju (11,48 g).

TLC R_f0,54 (EtOAc).

Związek pośredni 12. Kwas (RS)-2-bromo-2-fenylooctowy

Związek ten otrzymuje się ze D,L-fenyloglicyny (10 g) w postaci blado żółtego oleju (7,24 g).

TLCR_f 0,58 (EtOAc).

Związek pośredni 13. Kwas (RS)-2-bromo-3-fenylopropionowy

Związek ten otrzymuje się ze D,L-fenyloalaniny (5 g) w postaci blado żółtego oleju (6,72 g).

TLC R_f0,58 (EtOAc).

Związek pośredni 14. Kwas (RS)-2-bromo-4-fenylomasłowy

Związek ten otrzymuje się z D,L-homo-fenyloalaniny (970 mg) w postaci białej substancji stałej (1,0 g).

TLC Rf0,13 (EtOAc).

Związek pośredni 15. Kwas (RS)-2-(acetylotio)-Walerianowy

Roztwór związku pośredniego 10 (3,0 g) w etanolu (50 ml) traktuje się tiolooctanem potasu (2,1 g) i mieszaninę miesza w RT przez noc. Roztwór odparowuje się w próżni, a pozostałość rozdziela pomiędzy wodę (30 ml) i dichlorometan (30 ml). Warstwę organiczną przemywa się solanką (30 ml), suszy (MgSO₄) i odparowuje w próżni, otrzymuje związek tytułowy (2,23 g) w postaci żółtego oleju.

TLC R_f0,55 (EtOAc).

Analogicznie wytwarza się:

Związek pośredni 16. Kwas (RS)-2-(acetylotio)-propionowy

Związek ten otrzymuje się z kwasu (RS)-2-bromopropionowego (1,63 g) w postaci żółtego oleju (1,38 g).

TLC R_f 0,4 (5% EtOH-CHCl₃).

Związek pośredni 17. Kwas (RS)-2-(acetylotio)-3-metylomasłowy

Związek ten wytwarza się ze związku pośredniego 11 (5 g) w postaci blado żółtego oleju (4,1 g).

TLCR_t· 0,5 (EtOAc).

Związek pośredni 18. Kwas (RS)-2-(acetylotio)-2-fenylooctowy

Związek ten otrzymuje się ze związku pośredniego 12 (3,0 g) w postaci żółtego oleju (1,64 g).

TLC R_f0,5 (EtOAc).

Związek pośredni 19. Kwas (RS)-2-(acetylotio)-3-fenylopropionowy

Związek ten otrzymuje się ze związku pośredniego 13 (2,0 g) w postaci żółtego oleju (1,41 g).

TLC R_f0,80 (EtOAc).

Związek pośredni 20. Kwas (RS)-2-(acetylotio)-4-fenylomasłowy

Związek ten otrzymuje się ze związku pośredniego 14 (860 mg) w postaci brunatnego oleju (340 mg).

TLC R_f0,35 (EtOAc).

180 403

Przykład I.N-metyloamid N-[N-(acetylomerkaptoacetylo)-L-leucylo]-L-fenyloalaniny

Związek pośredni 6(113 mg) i związek pośredni 9 (52 mg) rozpuszcza się w bezwodnym THF (10 ml), dodaje N-hydroksybenzotriazol (63 mg) i następnie EDC (82 mg) i roztwór miesza w temperaturze 0°C w ciągu 16 godzin. Mieszaninę reakcyjnązatęża się w próżni, a pozostałość rozdziela pomiędzy 1 N kwas solny (20 ml) i octan etylu (20 ml). Warstwy rozdziela się i fazę organiczną ekstrahuje nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 20 ml) i solanka (20 ml), suszy (MgSO₄) i odparowuje, otrzymując surowy produkt w postaci bezbarwnej substancji stałej (146 mg). Po oczyszczaniu drogą szybkiej chromatografii kolumnowej (8 x 1,5 cm, EtOAc jako eluent, załadowanie za pomocą CH₂C1₂) otrzymuje się związek tytułowy w postaci bezbarwnej substancji stałej (110 mg).

TLC R_r0,35 (EtOAc).

Ή NMR (200 MHz; CDC1₃; Ref TMS): 0,90 (m, 6H), 1,3-1,8 (m, 3H). 2,4 (s, 3H), 2,7 (d, 3H), 2,9-3,3 (m, 2H), 3,5 (s, 2H), 4,2 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 6,1 (m, 1H), 6,45 (br.d, 1H), 6,6 (br, d, 1H), 7,1-7,4 (m, 5H).

Analogicznie wytwarza się:

Przykładll. N-metyloamid (RS)-2-(acetylotio)-pentanoilo-L-Ieucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten wytwarza się ze związku pośredniego 15 (300 mg) i związku pośredniego 6 (500 mg) w postaci białej substancji stałej (540 mg).

TLC R_t 0,63 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C₂₃H₃₅N₃O₄S [449,6]; [MH⁺] = 450; [MNa⁺] = 472.

P r z y k ł a d III. N-metyloamid (RS)-2-(acetylotio)-propanoilo-L-leucyIo-L-fenyloalaniny

Związek ten wytwarza się ze związku pośredniego 16 (180 mg) i związku pośredniego 6 (355 mg) w postaci białej substancji stałej (314 mg).

TLC R_f 0,33 (EtOAc).

C₂₁H₃₁N₃O₄S [421,6]; [MH⁺] = 422

Przykład IV.N-metyloamid(RS)-2-(acetylotio)-3-metylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten otrzymuje się ze związku pośredniego 17 (330 mg) i związku pośredniego 6 (553 mg) w postaci białej substancji stałej (570 mg) po przekrystalizowańiu z eteru dietylowego.

TLC R_f 0,36, 0,40 (diastereomery) (EtOAc).

C₂₃H₃₅N₃O₄S [449,6]; [MH⁺] = 450; [MNa⁺] = 47,2.

Przykład V. N-metyloamid (RS)-2-(acetylotio)-2-fenyloacetylo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten wytwarza się ze związku pośredniego 18 (360 mg) i związku pośredniego 6 (500 mg) w postaci białej substancji stałej (660 mg).

TLC R_f 0,37 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C₂₆H₃₃N₃O₄S [483,6]; [MH⁺] = 484, [MNa⁺] - 496.

Przykład VI. N-metyloamid (RS)-2-(acetylotio)-2-fenyloproparioilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten wytwarza się ze związku pośredniego 19 (420 mg) i związku pośredniego 6 (553 mg) w postaci białej substancji stałej (410 mg) po przekrystalizowańiu z eteru dietylowego.

TLC R_r0,36, 0,43 (diastereomery) (EtOAc).

C₂₇H₃₅N₃O₄S [497,7]; [MH⁺] = 498, [MNa⁺] = 520.

Przykład VII.N-metyloamid(RS)-2-(acetylotio)-4-fenylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten wytwarza się ze związku pośredniego 20 (350 mg) i związku pośredniego 6 (500 mg) w postaci białej substancji stałej (640 mg).

TLC R_f 0,39 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C₂₈H₃₇N₃O₄S [511,7]; [MH⁺] = 512, [MNa⁺] = 534.

180 403

Przykład VIII. Metyloamid N-[N-(acetylomerkaptoacetylo)-L-treonylo]-L-fenyloalaniny

Związek ten otrzymuje się ze związku pośredniego 9 (0,48 g) i związku pośredniego 8 (1,0 g) w postaci białej substancji stałej (0,83 g).

TLC R_f 0,35 (7% MeOH-CH₂Cl₂).

Ή NMR (200 MHz; CDC1₃ + CD₃OD: Ref TMS): 1,1 (d, 3H), 2,4 (s, 3H), 2,7 (d, 3H), 3,1 (m, 2H), 3,6 (d, 2H), 4,2 (m 2H), 4,6 (m, 1H), 7,2 (m, 5H).

Przykład IX. Metyloamid N-[N-(acetylomerkaptoacetylo)-L-leucylo]-L-tryptofanu

Związek ten otrzymuje się ze związku pośredniego 9 (220 mg) i związku pośredniego 7 (500 mg) w postaci białej substancji stałej (590 mg).

TLC R_t 0,22 (EtOAc).

C₂₂H₃₀N₄O₄S [446,6]; [MH⁺] = 447.

Przykład X. Metyloamid N-[N-(merkaptoacetylo)-L-leucylo]-L-fenyloalaniny

Związek z przykładu 1(16 mg) miesza się z nasyconym roztworem wodorotlenku amonu (220 mg) i metanolem (400 ml) w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu w ciągu 2 godzin. Roztwór zakwasza się rozcieńczonym kwasem solnym (2 N) i mieszaninę ekstrahuje się dichlorometanem (3 x 40 ml). Połączone frakcje organiczne suszy się (Na₂SO₄), sączy i odparowuje, otrzymując surowy produkt w postaci bezbarwnej substancji stałej (14,2 mg). Po oczyszczaniu drogą szybkiej chromatografii kolumnowej (1,5 x 10 cm; EtO Ac jako eluent; załadowanie za pomocą CH₂C1₂) otrzymuje się związek tytułowy w postaci bezbarwnej substancji stałej (6,0 mg).

TLC R_f0,23 (EtOAc).

Ή NMR (200 MHz; CDC1₃; Ref TMS): 0,90 (d, 3H), 0,93 (d, 3H), 1,48-1,71 (m, 3H), 1,86 (t, 1H), 2,74 (d, 3H), 3,02-3,17 (m, 4H), 4,40 (m, ,1H), 4,62 (q, 1H), 6,03 (br m, 1H), 6,82 (br d, 1H), 6,99 (br d, 1H) i 7,12-7,37 (m, 5H).

Analogicznie wytwarza się:

Przykład XI.N-metyloamid(RS)-3-merkaptopentanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten otrzymuje się ze związku z przykładu II (200 mg) w postaci białej substancji stałej (180 mg).

TLC R_f 0,37 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C₂,H₃₃N₃O₃S [407,6]; [MH⁺] = 408; [MNa⁺] = 430.

Przykład XII. N-metyloamid (RS)-2-merkapto-3-metylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten otrzymuje się ze związku z przykładu IV (200 mg) w postaci białej substancji stałej (190 mg).

TLC R_f 0,41 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C_2IH₃₃N₃O₃S [407,6]; [MH⁺] = 408, [MNa⁺] - 430.

Przykład XIII. N-metyloamid (RS)-2-merkapto-2-fenyloacetylo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten otrzymuje się ze związku z przykładu V (200 mg) w postaci białej substancji stałej (173 mg).

TLC R_f 0,28 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C₂₄H_3IN₃O₃S [441,6]; [MH⁺] = 442, [MNa⁺] = 464.

Przykład XIV. N-metyloamid (RS)-2-merkapto-3-fenylopropanoilo-L-leucylo-Lfenyloalaniny

Związek ten wytwarza się ze związku z przykładu VI (202 mg) w postaci białej substancji stałej (185 mg).

TLC R_t· 0,28 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C₂₅H₃₃N₃O₃S [455,6]; [MH⁺] = 456.

Przykład XV. N-metyloamid (RS)-2-merkapto-4-fenylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Związek ten otrzymuje się ze związku z przykładu VII (150 mg) w postaci białej substancji stałej (138 mg).

180 403

TLC R_f 0,20 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C₂₆H₃₅N₃O₃S [469,6]; [MH⁺] = 470, [MNa⁺] - 492.

Przykład XVI. MetyloamidN-[N-(merkaptoacetylo)-L-leucylo]-L-tryptofanu

Związek ten otrzymuje się ze związku z przykładu IX (120 mg) w postaci białej substancji stałej (100 mg).

TLC R_f 0,12 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

C₂₀H₂₈N₃O₃S [390,5]; [MH⁺] = 391.

Przykład XVII. Metyloamid N-[N-(merkaptoacetylo)-L-treonylo]-L-fenyloalaniny Związek ten otrzymuje się w postaci białej substancji stałej (0,09 g).

TLC R_t· 0,09 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

‘HNMR (200 MHz; DMSO): 1,0 (d, 3H), 2,5 (d, 3H), 2,8 (m, 3H), 3,0 (d.d, 1 H), 3,2 (m, 2H), 3,9 (m, 1H), 4,2 (d.d, 1H), 4,4 (m, 1H), 5,0 (d, 1H), 7,2 (m, 5H), 7,8 (m, 1H), 8,0 (m, 2H).

Przykład XVIII. N-metyloamid (RS)-2-merkaptopropanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny

Roztwór metanolanu sodu (10 mg) w metanolu (1,5 ml) traktuje się związkiem z przykładu III (56 mg, 0,133 mmola) i mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny. Rozpuszczalnik odparowuje się w próżni, a pozostałość rozdziela pomiędzy dichlorometan (15 ml) i 2 M kwas solny (10 ml). Fazę wodną ponownie ekstrahuje się dichlorometanem (10 ml) i połączone ekstrakty suszy się (Na₂SO₄) i odparowuje w próżni, otrzymując białą substancję stałą. Po oczyszczaniu za pomocą chromatografii kolumnowej (SiO₂, 3% metanolu, dichlorometan) otrzymuje się związek tytułowy (13 mg) w postaci białej substancji stałej .

C₁₉H₂₉N₃O₃S [379,5]; MS [MH⁺] = 380.

TLC Rf 0,32 (5% MeOH-CH₂Cl₂).

Przykłady ΧΙΧ-ΧΧ. Poniższe związki, które można wytwarzać w sposób analogiczny do wyżej opisanych, stanowią związki o wzorze (I), w którym R² = R⁴ = R⁸ = H, R⁵ = CH3, R⁶ = benzyl, R⁷ = CH3CO, n = O oraz:

R¹ = <CH₂OH (przykład XIX);

R¹ = <CH₂CH₂OH (przykład XX).

Przykład A. Działanie hamujące kolagenazę

Siłę działania związków o ogólnym wzorze (I) jako inhibitorów kolagenazy oznacza się metodą Cawston i Barrett (Anal. Biochem., 99:340-345,1979), przy czym testuje się 1 mM roztwór inhibitora albo jego rozcieńczenia poddając inkubacji w temerpaturze 37°C w ciągu 16 godzin z kolagenem i kolagenazą (buforując za pomocą 50 mM Tris, pH 7,6, o zawartości 5 mM CaCl₂, 0,05% Brij 35, 60 mM NaCl i 0,02% NaN₃). Kolagen acetyluje się przy użyciu ³H albo ¹⁴C-kolagen wytwarza się metodą Cawston i Murphy (Methods in Enzymology 80:711, 1981). Wybór radioznacznika nie zmienia zdolności kolagenazy do degradowania substratu kolagenowego. Próbki odwirowuje się w celu osadzenia nieprzetrawionego kolagenu i próbki radioaktywnej cieczy znad osadu usuwa się do przetestowania na liczniku scyntylacyjnym dla pomiaru hydrolizy. Aktywność kolagenazy w obecności 1 mM inhibitora albo jego rozcieńczeń porównuje się z aktywnością próby kontrolnej pozbawionej inhibitora i jako wyniki podaje stężenia inhibitora, przy których uzyskuje się 50% hamowanie kolagenazy (IC₅₀).

Przykład B. Działanie hamujące stromelizynę

Siłę działania związków o ogólnym wzorze (I) jako inhibitorów stromelizyny oznacza się, stosując metodę Cawston i inni (Biochem. J. 195:159-165, 1981), przy czym testuje się 1 mM roztwór inhibitora albo jego rozcieńczenia, poddając je inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin ze stromelizynąi ^l4C-acetylowanąkazeiną (buforując za pomocą 50 mM Tris, pH 7,6, o zawartości 5 mM CaCl2, 0,05% Brij 35 i 0,02% NaN3). Kazeinę poddaje się ¹⁴C-acetylowaniu według metody opisanej w wyżej podanej publikacji Cawston i inni. Aktywność stromelizyny w obecności 1 mM inhibitora lub jego rozcieńczeń porównuje się z aktywnością próby kontrolnej pozbawionej inhibitora i jako wyniki podaje stężenia inhibitora, przy których uzyskuje się 50% hamowanie stromelizyny (IC50).

180 403

Przykład C. Działanie hamujące żelatynazę

Siłę działania związków o ogólnym wzorze (I) jako inhibitorów żelatynazy oznacza się, stosując metodę Hariis & Krane (Biochem. Biophys. Acta 258:566-576, 1972), przy czym testuje się 1 mM roztwór inhibitora albo jego rozcieńczenia, poddając inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin z żelatynaząi zdenaturowanym za pomocą ciepła ³H albo ^l4C-acetylowanym kolagenem (buforując za pomocą 50 mM Tris, pH 7,6, o zawartości 5 mM CaCL2,0,05% Brij 35 i 0,02% NaN3). ³H albo ^l4C żelatynę otrzymuje się przez denaturowanie ³H albo ^l4C-kolagenu wytwarzanego wyżej opisaną metoda Cawston i Murphy drogą inkubacji w temperaturze 60°C w ciągu 30 minut. Nieprzetrawionążelatynę wytrąca się przez dodawanie kwasu trichlorooctowego i odwirowanie. Aktywność żelatynazy w obecności 1 mM inhibitora lub jego rozcieńczeń porównuje się z aktywnością próby kontrolnej pozbawionej inhibitora i jako wyniki podaje stężenia inhibitora, przy których uzyskuje się 50% hamowanie żelatynazy (IC50).

Przykład D. Hamowanie wytwarzania TNF-a

Siłę działania związków o ogólnym wzorze (I) jako inhibitorów wytwarzania TNF-α oznacza się, stosując następujący sposób postępowania. 1 mM roztwór inhibitora lub jego rozcieńczenia testuje się, poddając inkubacji w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ z komórki U937 (ludzki chłoniak histiocytowy) zawieszonymi w pożywce RPMI 1640 przy gęstości komórek 2 x 10⁶/ml i stymulowanymi za pomocą50 mM stężenia końcowego PMA. Po upływie 18 godzin ciecz znad osadu poddaje się testowaniu na poziom TNF-α, stosując handlowo dostępny zestaw testowy ELISA (system R&D). Aktywność w obecności 1 mM inhibitora lub jego rozcieńczeń porównuje się z aktywnością próby kontrolnej pozbawionej inhibitora i jako wyniki podaje się stężenia inhibitora powodujące 50% hamowanie wytwarzania TNF-a.

Związki według wynalazku wykazująaktywność zmierzoną we wszystkich przykładach A do D.

180 403

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związki merkaptoalkilopeptydylowe o wzorze (I), w którym:

R¹ oznacza grupę C₂.₆-alkilową albo C|.₆-alkilo-OH;

R² oznacza atom wodoru albo grupę C ^-alkilową;

R⁴ oznacza atom wodoru albo grupę C ^-alkilową;

R⁵ oznacza atom wodoru albo grupę C]_₆-alkilową;

R⁶ oznacza grupę C_b6-alkilową, benzylową albo 3-indolilometylową;

Alk oznacza grupę C|.₆-alkilowąalbo C₂.₆-alkenylową;

n oznacza 0 albo 1;

R⁷ oznacza atom wodoru albo grupę R'°CO, w której R¹⁰ oznacza grupę CM-alkilową; R⁸ oznacza atom wodoru, grupę CM-alkilowąalbo grupę (C|.₄-alkilo)arylową.
2. Związek według zastrz. 1, w którym R¹ oznacza grupę alkilową, a R⁷ i R⁸ oznaczają atomy wodoru.
3. Związek według zastrz. 1, wybrany spośród następujących związków: metyloamid N-[N-(merkaptoacetylo)-L-leucylo]-L-fenyloalaniny, metyloamid N-[(acetomerkaptoacylo)-L-leucylo]-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)pentanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)propanoilo-L-leucylo-L-fenyloalanihy, N-metyloamid 2-(acetylotio)-3-metylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)-2-fenyloacetylo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)-3-fenylopropanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-(acetylotio)-4-fenylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, metyloamid N-(acetylomerkaptoacylo)-L-treonylo-L-fenyloalaniny, metyloamid N-(acetylomerkaptoacylo)-L-leucylo-L-tryptofanu, N-metyloamid 2-merkaptopentanoilo-L-leucylo-L-fenyloaIaniny, N-metyloamid 2-merkaptopropanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkapto-3-metylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkapto-2-fenyIoacetylo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkapto-3-fenylopropanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, N-metyloamid 2-merkapto-4-fenylobutanoilo-L-leucylo-L-fenyloalaniny, metyloamid N-[N-(merkaptoacetylo)-L-treonylo]-L-fenyloalaniny i metyloamid N-[N-(merkaptoacetylo)-L-leucylo]-tryptofanu.
4. Środek farmaceutyczny zawierający fizjologicznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik i substancję czynną, znamienny tym, że substancję czynną stanowi związek merkaptoalkilopeptydylowy o wzorze (I), w którym:

R¹ oznacza grupę C₂.₆-alkiIową albo C^-alkilo-OH;

R² oznacza atom wodoru albo grupę C|.₆-alkilową;

R⁴ oznacza atom wodoru albo grupę C|.₆-alkilową;

R⁵ oznacza atom wodoru albo grupę C|_₆-alki Iową;

R⁶ oznacza grupę C^-alkilową benzylową albo 3-indolilometylową;

Alk oznacza grupę C|.₆-alkilową albo C₂_₆-alkeny Iową;

n oznacza 0 albo 1;

R⁷ oznacza atom wodoru albo grupę R^l0CO, w której R¹⁰ oznacza grupę C|.4-alkilową; R⁸ oznacza atom wodoru, grupę Cj.4-alkilową albo grupę (C_M-alkilo)arylową.

180 403

Wynalazek dotyczy nowej klasy pochodnych merkaptoalkilopeptydylowych oraz zawierających je środków farmaceutycznych.

W normalnych tkankach syntetyzowanie komórkowej tkanki łącznej jest równoważone przez degradację pozakomórkowej substancji międzykomórkowej (matriks), przy czym obydwa przeciwstawne działania występują w równowadze dynamicznej. Degradacja substancji międzykomórkowej jest powodowana działaniem proteinaz uwalnianych ze stałych komórek tkanki łącznej i inwazyjnych komórek nacieku zapalnego i jest po części związana z aktywnością co najmniej trzech grup metaloproteinaz substancji międzykomórkowej (MMP - matrix metalloproteinase). Są to kolagenazy (kolagenaza śródmiąższowa, MMP-1: kolagenaza limfocytów o różnokształtnych jądrach PMN (polymorphonuclear), MMP-8), żelatynazy (żelatynaza A, MMP-2,72kDażelatynaza, kolagenaza typ IV: żelatynaza B, MMP-9,92kDażelatynaza, kolagenaza typ IV) i stromelizyny (proteoglikanaza, MMP-3, stromelizyna-1, tranzyna; stromelizyna-2, MMP-10; stromelizyna-3, MMP-11). Zazwyczaj te kataboliczne enzymy są ściśle regulowane na poziomie ich syntezy i wydzielania, a także na poziomie ich pozakomórkowej aktywności, przy czym tę ostatnią reguluje się przez działanie specyficznych inhibitorów, takich jak TIMP (tkankowe inhibitory metaloproteinaz), które tworzą nieaktywne kompleksy z metaloproteinazami, a bardziej ogólnie inhibitorów proteinazy, takich jak o^-makroglobulina.

Przyspieszony niekontrolowany rozkład tkanki łącznej drogą katalizowanej metaloproteinazami resorpcji pozakomórkowej substancji międzykomórkowej jest cechą wielu stanów patologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, septyczne zapalenie stawów, owrzodzenie rogówki, naskórka lub żołądka; przerzuty lub inwazja nowotworu; choroby okołozębowe, białkomocz, zakrzepica tętnicy wieńcowej połączona z pęknięciem płytki miażdżycowej i choroby kości. Inhibitory można również stosować do zapobiegania stanom patologicznym po uszkodzeniach urazowych, które mogąprowadzić do trwałego kalectwa. Związki te mogą również znaleźć zastosowanie jako środki do regulacji urodzeń przez zapobieganie owulacji albo zagnieżdżeniu. Można oczekiwać, że patogenezę takich chorób można łatwo zmodyfikować w korzystny sposób przez podawanie inhibitorów metaloproteinazy, przy czym do tego celu zaproponowano już liczne związki (dla ogólnego przeglądu patrz Wahl i inni, Ann. Rep. Med. Chem. 25: 175-184, Academic Press Inc., San Diego (1990)).

Opisano już wiele związków typu małych peptydów, które hamują metaloproteinazy. Prawdopodobnie większość z nich dotyczy enzymu przekształcającego angiotensyną (ACE), przy czym środki takie blokują konwersję dekapeptydu angiotensyny I do angiotensyny II, silnego czynnika presyjnego. Związki tego typu opisane są w europejskim opisie patentowym EP-A-0012401. Również odpowiednie merkaptoamidowe pochodne peptydylowe wykazują aktywność hamującą ACE in vitro i in vivo (Weller i inni (1984) Biochem. Biophys. Res. Comm. 125 (1):82-89).

TNF (czynnik martwiczy guza, tumour necrosis factor) jest cytokiną, która jest wytwarzana początkowo jako związany z komórką prekursor 28 kD. Jest on uwalniany w postaci aktywnej formy 17 kD (Jue i inni (1990) Biochemistry 29:8371-8377), za pośrednictwem której może zachodzić wiele szkodliwych działań in vivo. Podczas podawania zwierzętom lub ludziom powoduje ona zapalenia, gorączkę, objawy sercowo-naczyniowe, krwotoki, krzepnięcie i odpowiedzi fazy ostrej, zbliżone do obserwowanych w czasie ostrych infekcji i stanów wstrząsowych. Chroniczne podawanie może powodować także charłactwo i anoreksję. Akumulowanie nadmiaru TNF może być śmiertelne.

Z testów na zwierzętach jasno wynika, że blokowanie działania TNF za pomocą specyficznych przeciwciał może być korzystne w przypadku ostrych infekcji, stanów wstrząsowych, reakcji przeszczepu przeciwko gospodarzowi i chorób autoimmunologicznych. TNF stanowi również autohormonalny czynnik wzrostu wobec niektórych szpiczaków i chłoniaków i może hamować normalne tworzenie się krwinek u pacjentów z tymi nowotworami.

Zapobieganie wytwarzaniu lub działaniu TNF stanowi więc silną strategię terapeutyczną w przypadku wielu schorzeń zapalnych, infekcyjnych, immunologicznych lub nowotworowych. Schorzenia te obejmują, lecz nie są do nich ograniczone, przypadki takie jak wstrząs septyczny,

180 403 wstrząs hemodynamiczny i zespół posocznicowy (Mathison i inni (1988) J. Clin. Invest. 81:1925-1937; Miethke i inni (1992) J. Exp.Med. 175:91-98), reperfuzyjne uszkodzenie po niedokrwieniu, malaria (Grau i inni (1989) Immunol. Rev. 112:49-70); infekcje prątkami (Bames i inni (1992) Infect. Imm. 60:1441-6), zapalenie opon, łuszczyca, zastoinowa niewydolność serca, choroby zwłóknieniowe, charłactwo, odrzucenie przeszczepu, rak, choroby autoimmunologiczne, reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, uszkodzenia popromienne, toksyczność po podawaniu immunosupresyjnych monoklonalnych przeciwciał, takich jak OKT3 lub CAMPATH-1, oraz hiperoksyczne uszkodzenia pęcherzykowe.

Stosowane obecnie kliniczne strategie przeciw TNF obejmują zastosowanie kortykosteroidów, takich jak deksametazon oraz zastosowanie cyklosporyny-A lub FK506, które sąniespecyficznymi inhibitorami transkrypcji genu cytokinowego. Inhibitory fosfodiesterazowe, takie jak pentoksyfilina, okazały się bardziej specyficznymi inhibitorami transkrypcji genu TNF (Endres S (1991) Immunol. 72:56-60, Schandene i inni (1992) Immunol. 76:30-34, Alegre i inni (1991) Transplantation 52:674-679, Bianco i inni (1991) Blood 78:1205-1221). Stwierdzono, że również talidomid hamuje wytwarzanie TNF przez leukocyty (Sampajo i inni (1991) J. Exp. Med. 173:699-703). W badaniach doświadczalnych wykazano, że monoklonalne przeciwciała anty-TNF, rozpuszczalne receptory TNF i rozpuszczalne układy receptory TNF/immunoadhezyny specyficznie hamują skutki działania TNF (Bagby i inni (1991) J. Infect. Dis. 163:83-88, Charpentier i inni (1991) Presse-med. 20:2009-2011, Silva i inni (1990) J. Infect. Dis. 162:421-427, Franks i inni (1991) Infect. Immun. 59:2609-2614, Tracey i inni (1987) Naturę 330:662-664, Fischer i inni (1992) PNAS USA in press, Lesslauer i inni (1991) Eur. J. Immunol. 21:2883-2886, Ashkenazi i inni (1991) PNAS USA 88:10535-10539). .

Ostatnio stwierdzono, że działanie TNF zachodzi za pośrednictwem dwóch peptydów TNF-α i TNF-β. Chociaż peptydy te wykazują tylko 30% homologiczności wobec siebie, aktywująone te same receptory i sąkodowane przez bezpośrednio sąsiadujące geny. W opisie niniejszym określenie czynnik martwicy nowotworowej albo TNF oznacza czynnik martwicy nowotworowej a i peptydy wykazujące wysoki stopień homologiczności sekwencji z TNF-a albo wykazujące zasadniczo podobne efekty fizjologiczne, na przykład TNF-β.

Związki posiadające właściwość hamowania działania metaloproteinaz biorących udział w rozkładzie tkanki łącznej, takich jak kolagenazy, stromelizyny i żelatynazy, hamuj ąuwalnianie TNF zarówno in vitro jak i in vivo (Gearing i inni (1994) Naturę 370:555-557, McGeehan i inni (1994) Naturę 370:558-561, WO 93/20047). Wszystkie wymienione inhibitory zawierają grupę kwasu hydroksamowego wiążącą cynk.

Związki hamujące kolagenazę są opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4511504 opublikowanym 16 kwietnia 1985, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4568666 opublikowanym 4 lutego 1986. Związki o podobnej budowie, które zastrzega się jako inhibitory stromelizyny (proteoglikanazy), opisane są w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4771037 opublikowym 13 września 1988.

Inhibitory stromelizyny i kolagenazy można stosować do zapobiegania uszkodzeniom chrząstek stawowych związanym z septycznym zapaleniem stawów. Bakteryjne infekcje stawów mogą wywoływać odpowiedź zapalną, która może się następnie dalej utrwalić, co wymaga usunięcia czynnika zakaźnego, powodując trwałe uszkodzenie składników strukturalnych. W testach na zwierzętach stosowano czynniki bakteryjne w celu wywołania odpowiedzi artretycznej z pojawieniem się działania proteolitycznego. Patrz Case i inni (1989) J. Clin. Invest. 84:1731-40 i Williams i inni (1990) Arth. Rheum. 33:533-41.

Inhibitory stromelizyny, kolagenazy i żelatynazy można stosować do hamowania przerzutów nowotworowych, ewentualnie w zestawieniu z bieżącą chemoterapią i/lub napromieniowaniem. Patrz Matrisian i inni (1986) PNAS USA 83:9413-7, Wilhelm i inni (1987) tamże 84:6725-29, Werb i inni (1989) J. Celi Biol. 109:872-889, Liotta i inni (1983) Lab. lnvest. 49:636-649 oraz Reich i inni w Metastasis; CibaFoundation Symposium, Wiley, Chicester, 1988, str. 193-210.

180 403

Wydzielanie proteinaz, takich jak stromelizyna, kolagenaza i żelatynaza, odgrywa ważną rolę w procesach związanych z ruchem komórek w czasie inwazji przerzutów nowotworowych. Okazuje się również, że macierzowe metaloproteinazy wykazują podwyższoną ekspresję w liniach komórkowych niektórych nowotworów przerzutowych. W związku z tym funkcje enzymowe penetrują leżące niżej błony podstawne i pozwalają komórkom nowotworowym wyrwać się z miejsca tworzenia pierwotnego nowotworu i wejść do krążenia. Po przywarciu do ścian naczyń krwionośnych komórki nowotworowe stosują te same metaloproteinazy do przenikania leżących niżej błon podstawnych i penetrowania innych tkanek, co prowadzi do przerzutów nowotworowych. Zahamowanie tego procesu może zapobiegać przerzutom i polepszać skuteczność bieżącego leczenia za pomocą środków chemoterapeutycznych i/lub napromieniowania.

Inhibitory te nadają się również do hamowania chorób okołozębowych, takich jak zapalenie dziąseł. Czynność kolagenazy i stromelizyny wynika z fibroblastów pochodzących z dziąseł w stanie zapalnym (Uitto i inni (1981) J. Periodontal Res. 16:417-424). Poziom enzymów jest skorelowany z powagą choroby dziąseł; Overall i inni (1987) J. Periodontal Res.22:81-88.

Procesy proteolityczne obserwuje się również przy owrzodzeniu rogówki po oparzeniu alkaliami (Brown i inni (1969) Arch. Ophthalmol. 81:370-373). Peptydy zawierające grupy merkapto hamują kolagenazę wyodrębnioną z oparzonej alkaliami rogówki królika (Burns (1989) Invest. Ophthalmol. 30:1569-1575). Traktowanie oczu oparzonych alkaliami albo oczu wykazujących owrzodzenie rogówki w wyniku infekcji inhibitorami tych metaloendoproteinaz w zestawieniu z cytrynianem sodu lub askorbinianem sodu i/lub środkami przeciwbakteryjnymi może być skuteczne w zapobieganiu degradacji rogówki.

Stromelizyna jest związana z degradacją składników strukturalnych kłębuszkowej błony podstawnej (GBM) nerki, której główną funkcją jest ograniczenie przepływu protein osocza do moczu (Baricos i inni (1989) Biochem. J. 254:609-612). Proteinuria, skutek choroby kłębuszków, stanowi nadmiar protein w moczu spowodowany podwyższoną przepuszczalnością GBM dla protein osocza. Przyczyny podwyższonej przepuszczalności GBM nie są znane, lecz zawierająca proteinazy stromelizyna może odgrywać ważną rolę w chorobach kłębuszkach. Zahamowanie tego enzymu może powstrzymać proteinurię związaną ze złym funkcjonowaniem nerek.

Hamowanie działania stromelizyny może zapobiegać pękaniu płytek miażdżycowych, co prowadzi do zakrzepicy naczyń wieńcowych. Rozrywanie lub pękanie płytek miażdżycowych jest najczęściej spotykaną przyczyną powodującą zakrzepicę naczyń wieńcowych. Destabilizacja i degradacja macierzy tkanki łącznej otaczającej te płytki przez enzymy proteolityczne lub cytokiny uwalniane przez wnikające komórki zapalne uważa się za przyczynę pękania płytek. Takie rozerwanie tych płytek może być powodem ostrego przypadku trombolitycznego, gdy krew nagle wypływa z naczynia krwionośnego. Zgodnie z informacjąRNA stwierdzono wysoki poziom stromelizyny występujący w poszczególnych komórkach w płytkach miażdżycowych uzyskanych od pacjentów w czasie operacji transplantacji serca (Henney i inni (1991), PNAS USA 88:8154-8158). Hamowanie stromelizyny za pomocą tych związków może pomagać w zapobieganiu lub opóźnianiu degradacji macierzy tkanki łącznej stabilizującej płytki miażdżycowe, zapobiegając przypadkom ostrej zakrzepicy wieńcowej.

Specyficzne inhibitory stromelizyny i kolagenazy można stosować jako środki kontroli urodzeń. Stwierdzono, że ekspresję metaloproteinaz, takich jak stromelizyna i kolagenaza, obserwuje się w niezapłodnionych jajach i zygotach i w dalszych stadiach podziału, przy czym wzrasta ona w stadium blastocystowym rozwoju płodowego i ze zróżnicowaniem entodermowym (Brenner i inni (9189) Genes & Develop. 3:848-59). Przez analogię do inwazji nowotworu blastocysty mogą poddawać ekspresji metaloproteinazy w celu penetrowania pozakomórkowej macierzy ściany macicy w czasie zagnieżdżania jaja. Hamowanie stromelizyny i kolagenazy w czasie tych procesów wczesnego rozwoju, zapobiega prawdopodobnie normalnemu rozwojowi embrionu i/lub zagnieżdżeniu w macicy. Taka interwencja może stanowić sposób kontroli urodzin. Ponadto wiadomo, że kolagenaza jest ważna w procesach owulacyjnych. W przykładzie tym powłoka kolagenu powyżej rejonu szczytowego pęcherzyka jajnikowego musi być penetrowana w celu umożliwienia wyjścia jaja. W czasie tego procesu wykryto kolagenazę i stwierdzo

180 403 no, że inhibitor skutecznie zapobiega owulacji (Woessner i inni (1989) Steroids 54:491-499). Aktywność stromelizyny również odgrywa rolę podczas owulacji (Too i inni (1984) Endocrin. 115:1043-1050).

Działanie kolagenolityczne i działanie stromelizyny obserwuje się również w dystroficznym pęcherzowym oddzielaniu się naskórka (Kronberger i inni (1982) J. Invest. Dermatol. 79:208-211; Sawamura i inni (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:1003-8). Hamowanie metaloproteinaz powinno ograniczać szybką destrukcję tkanek łącznych skóry.

Dodatkowo do pozakomórkowej macierzy zawierającej składniki strukturalne stromelizyna może poddawać degradacji in vivo inne substraty zawierające inhibitor a,-proteinazy i może w związku z tym wpływać na aktywność innych proteinaz, takich jak elastaza (Winyard i inni (1991) EFBS Letts. 279(1):91-94). Hamowanie macierzowych metaloproteinaz może wzmagać przeciwproteinazową aktywność tych endogennych inhibitorów.

Z ostatnich publikacji wiadomo, że zidentyfikowano kilka nowych enzymów z rodziny MMP, z których niektóre odgrywają ważną rolę w chorobach. Kolagenaza 3, enzym unikalny dla komórek raka sutka, może znaleźć zastosowanie w przypadku raka sutka (Freije i inni (1994) J. Biol. Chem. 269(24): 16766-16773, MT-MMP, inny przedstawiciel rodziny MMP, okazał się enzymem kluczowym w aktywowaniu żelatynazy A (Sato i inni (1994) Naturę 370:61-65). Żelatynaza A jest enzymem ważnym dla wzrostu i przerzutów nowotworów (jak wyżej podano).

Stwierdzono, że degradacja β-amyloidowych prekursorowych protein (APP) wytwarza płytki amyloidowe, główny składnik płytek starczych, wykrytych u pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) Dwie ostatnie publikacje identyfikują enzymy metaloproteinazowe rozszczepiające APP do płytek amyloidowych (Abraham i inni (1994) Biochemistry 33:192-199; Huber i inni (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 201(1):45-53).

Wiadomo fachowcom, że dzięki znacznej homologiczności pomiędzy tymi nowymi enzymami i innymi MMP istnieje możliwość, że związek hamujący jeden enzym może w pewnym stopniu hamować te nowe enzymy. Tak więc inhibitory objęte wynalazkiem mogą być użyteczne w chorobach, z którymi związane są te nowe enzymy.

W publikacji międzynardowego zgłoszenia patentowego WO88/06890 ujawniono syntetyczne merkapto-podstawione związki peptydowe, będące inhibitorami kolagenazy ssaczej. Ujawnione w tej publikacji związki posiadają mostek siarczkowy oddzielony od C-końca peptydu grupą etylenową, ewentualnie podstawioną grupami alkilowymi. W publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego EP 273689 ujawniono pochodne aminokwasów, podstawione grupą merkaptanową również o czynności hamowania kolagenazy. Związki według wynalazku różnią się od związków znanych z powyższych publikacji przede wszystkim skróceniem o jeden atom węgla odległości między atomem siarki a najbliższym asymetrycznym atomem węgla w peptydzie/aminokwasie. Jak stwierdzono, budowa taka zapewnia silniejsze hamowanie metaloproteinaz (zmniejszona wartość IC₅₀).

Celem wynalazku jest dostarczenie związków, które zasadniczo hamująuwalnianie TNF z komórek i które w związku z tym można stosować do leczenia schorzeń występujących za pośrednictwem TNF. Zastosowanie takie obejmuje, lecz nie jest do tego ograniczone, leczenie stanów zapalnych, gorączki, objawów sercowonaczyniowych, krwotoków, krzepnięcia i odpowiedzi fazy ostrej, charłactwa i anoreksji, ostrych infekcji, stanów wstrząsowych, reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi i chorób autoimmunologicznych.

Innym celem wynalazku jest dostarczenie związków, które - możliwie dodatkowo do hamowania uwalniania TNF - hamująrównież działanie MMP i w związku z tym można je stosować do leczenia pacjentów cierpiących na schorzenia występujące za pośrednictwem TNF i/lub MMP.

Wynalazek dotyczy nowych związków merkaptoalkilopeptydylowych o wzorze (I), które nadają się do stosowania jako inhibitory macierzowej metaloproteinazy i/lub chorób występujących za pośrednictwem TNF, włącznie z chorobami degeneracyjnymi (jak wyżej podano) i niektórymi postaciami raka.

180 403