PL170591B1

PL170591B1 - Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierajacej lipofilowy antybiotyk oligosacharydowy PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL170591B1
Application number: PL92303189A
Authority: PL
Inventors: Mahesh Patel; Vincent P Gullo; Roberta Hare; David Loebenberg; James B Morton; George H Miller; Heewon Y Kwon
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1992-10-14
Publication date: 1997-01-31
Also published as: YU92192A; NO307326B1; HUT75157A; HK1001085A1; FI941723A7; CA2121345A1; EP0610295A1; PH31675A; NZ244735A; CA2121345C; SI9200260A; HU9401104D0; ES2104845T3; WO1993007904A1; DE69221252T2; FI941723A0; CN1035923C; AU678344B2; HRP921069B1; US5624914A

Abstract

Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, zawierajacej lipofilowy antybio tyk oligosacharydowy o wzorze III do leczenia lub zapobiegania zakazeniom bakteriami gramododatnimi lub gramoujemnymi u zwierzat, znamienny tym, ze dodaje sie zwiazek o wzorze III: do wodnego roztworu N-m etyloglukaminy i 2-hydroksypropylo-ß-cyk lodekstryny (HPßCD), zawierajacy 2-15 grup hydroksypropylowych na mol HPßCD, w stosunku molowym 1:3:5, do otrzymania pierwszego homogenicznego roztworu, naste- pnie do tak otrzymanego homogenicznego roztworu dodaje sie mannitol i mono-9-okta dekanian poli(oksy-1,2-etyleno)sorbitanu (Tween) tak, aby wytworzyc drugi homogeniczny roztwór o zawartosci 18,1% wagowych mannitolu i 0,36% wagowych Tweenu, w odniesieniu do ciezaru podstawowej kompozycji, po czym drugi homogeni- czny roztwór poddaje sie filtrowaniu do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej kompozycji farmaceutycznej, która nieoczekiwanie umożliwiła dostarczenie zwierzętom, a zwłaszcza ssakom, włączając w to człowieka, dotkniętym zakażeniem wrażliwymi bakteriami gramdodatnimi lub gramujemnymi, lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych wykazujących dobre działanie przeciwbakteryjne skierowane przeciw zakażeniom wrażliwymi bakteriami gramododatnimi i/lub gramujemnymi, w wyniku czego osiąga się skuteczne wyleczenie tych zakażeń i/lub zapobieżenie tym zakażeniom, przy jednoczesnym uniknięciu wystąpienia zespołu szkodliwej reakcji ubocznej.

Kompozycja wytwarzana sposobem według wynalazku obejmuje połączenie lipofilowego antybiotyku oligosacharydowego z co najmniej, w przybliżeniu, stechiometryczną ilością określonej zasady oraz z taką ilością środka takiego jak hydroksypropylo-/)-cyklodekstryna, zawierająca około 2 do 15 grup hydroksypropylowych na cząsteczkę cyklodekstryny, która jest dostatecznie duża aby zapewnić skuteczne uwalnianie lipofilowego antybiotyku oligosacharydowego do surowicy zwierzęcia przy jednoczesnym uniknięciu wystąpienia zespołu szkodliwej reakcji ubocznej.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wywarzania kompozycji farmaceutycznej, zawierającej: lipofilowy antybiotyk oligosacharydowy o wzorze III do leczenia lub zapobiegania zakażeniom bakteriami gramdodatnimi lub gramujemnymi u zwierząt, zwłaszcza u ssaków polegających na tym, że dodaje się związek o wzorze III

170 591

Ιο-β-cyklodekstryny (ΗΡβCD), zawierający 2-15 grup hydroksypropylowych na mol ΗΡβCD, w stosunku molowym 1:3:5, do otrzymywania pierwszego homogenicznego roztworu, następnie do tak otrzymanego homogenicznego roztworu dodaje się mannitol i mono-9-oktadekanian poli/orksy-1,2-etyIeno/-s<orbit.anu (Tween) tak, aby wytworzyć drugi homogeniczny roztwór o zawartości 18,1% wagowych mannitolu i 0,36% wagowych Tweenu, w odniesieniu do ciężaru podstawowej kompozycji, po czym drugi homogeniczny roztwór poddaje się filtrowaniu do wybworzenia kompozycji farmaceutycznej.

Wytworzona w ten sposób kompozycja nadaje się szczególnie do podawania pozajelitowego, zwłaszcza w przypadku podawania in vivo ludziom drogą dożylną.

Kompozycja wytwarzana sposobem według wynalazku znajduje też zastosowanie dla zapobiegania wystąpieniu zespołu szkodliwej reakcji u zwierząt w następstwie pozajelitowego wstrzyknięcia lipofilowego antybiotyku oligosacharydowego, przedstawionego wzorem III z jednoczesnym dostarczaniem danemu zwierzęciu przeciwzakaźnie skutecznej ilości wspomnianego antybiotyku. Zapobieganie to obejmuje pozajelitowe podawanie temu zwierzęciu powyższej kompozycji w ilości wystarczająco wysokiej do tego celu, razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Załączona fig. 1 przedstawia w sposób graficzny przebieg w funkcji czasu typowej fermentacji zachodzącej z udziałem Micromonospora carbonacea var. africana, NRRL 15099, ATCC 39149.

Jak wiadomo, lipofilowe antybiotyki oligosacharydowe, na przykład antybiotyki typu eweminomycyny, przejawiają in vitro użyteczne działanie przeciwbakteryjne, ale niezbyt łatwo tworzą wodne roztwory zupełne, nadające się do bezpiecznego i skutecznego podawania in vivo (to znaczy bez wystąpienia zespołu szkodliwej reakcji ubocznej). Ponadto, sole tych antybiotyków utworzone za pomocą ich zmieszania z zasadą przydatną dla celów niniejszego wynalazku, taka jak na przykład N-metyloglukamina (NMG), użytą w ilości co najmniej, w przybliżeniu, stechiometrycznej, nie tworzą przy użytecznych wartościach pH wodnych roztworów zupełnych. W przypadku, gdy wspomniane sole zostały dodane do wody w użytecznym stężeniu, zaobserwowano utworzenie się jedynie zawiesin koloidalnych. Te zawiesiny koloidalne przejawiały tendencję do agregowania się i ostatecznie ulegały zżelowaniu, zwłaszcza w obecności zaabsorbowanego ditlenku węgla oraz wtedy,

170 591 gdy pH tego rodzaju zawiesin koloidalnych wynosiło mniej niż około 9,3. Zaobserwowano, że roztwory zupełne w wodzie tworzyły się w wyniku zwiększenia stosunku molowego NMG do związku o wzorze III z 2:1 lub 3:1 do 12:1. Jednakże tak utworzony roztwór o stosunku 12:1 miał niepożądanie wysokie pH, był w wysokim stopniu zbuforowany i wywoływał podrażnienie.

Tak więc, zaobserwowano, że pozajelitowe wstrzyknięcie szczurom, lub wyższym naczelnym, takim jak małpy, preparatu wodnego zawierającego 12 moli NMG na jeden mol związku o wzorze III, nie prowadziło w rezultacie do wystąpienia zespołu szkodliwej reakcji ubocznej, (przypuszczalnie powodowanego przez zżelowanie i wytrącenie związku o wzorze IU). Preparat powodował podrażnienie po wstrzyknięciu, które przypuszczalnie wywoływane jest obecnością dużej ilości zasady, NMG, i wynikającym z tego wysokim pH w miejscu wstrzyknięcia. Aczkolwiek różne środki typu cyklodekstryny znane są z tego, że dopomagają w uzyskiwaniu roztworów konkretnych leków (na przykład tak, jak w przypadku powyżej wspomnianych odnośników Bodora i Pithy), to jednak użycie reprezentatywnych środków z tej grupy związków jako takich nie zapewniało uzyskania pożądanego wyniku w przypadku lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych. I tak, na przykład, użycie konkretnej pochodnej cyklodekstryny i konkretnej hydroksypropyloβ-cyklodekstryny na mol antybiotyku typu eweminomycyny o wzorze III, nie doprowadziło do wytworzenia wodnego roztworu właściwego w przypadku przyjęcia stosunku 6 moli konkretnej hydroksypropylo-β-cyklodekstryny na mol antybiotyku typu ewerninomycyny o wzorze III. Nieoczekiwanie stwierdzono, że kompozycja objemująca lipofilowy antybiotyk oligosacharydowy o wzorze III, określona ilość konkretnej zasady, na przykład NMG oraz konkretny środek, na przykład hydroksypropylo-β-cyiklodekstrynę w określonej ilości, zapewnia, po zmieszaniu z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, a zwłaszcza z wodą, preparat, który można używać bezpiecznie i skutecznie do podawania in vivo.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że w przypadku zmieszania 1 mola lipofilowego antybiotyku oligosacharydowego, na przykład związku o wzorze III z co najmniej 2 do około 12 moli właściwej zasady, na przykład NMG, w wodzie i z 6 molami hydroksypropyloβ-cyklodekstryny, na przykład zawierającej około 3 do 7,5 grup hydroksypropylowych na cząsteczkę β-cyklodekstryny, tworzył się klarowny wodny roztwór kompleksu (według pomiaru metodą analizy nefelometrycznej i pomiarów szerokości linii widmowej w protonowym NMR; patrz: przykład 4), oraz, że pozajelitowe wstrzyknięcie takich kompleksów zwierzętom nie powodowało wystąpienia zespołu szkodliwej reakcji ubocznej, nawet w przypadku dawek wysokich, to znaczy 800 mg takiego kompleksu na kg masy ciała. Patrz: Tablica 4.

Jak stanie się to oczywiste na podstawie wyników otrzymanych in vivo i zestawionych w tabeli 1, pozajelitowe wstrzyknięcie wodnych zawiesin soli, na przykład soli NMG antybiotyku typu eweminomycyny o wzorze III, myszom i małpom wywoływało zespół szkodliwej reakcji ubocznej. Jedynie w tym przypadku, gdy zwierzętom wstrzyknięto wodne roztwory jednej z kompozycji według niniejszego wynalazku, takiej jak kompozycja zawierająca wyszczególniony środek kompleksujący, na przykład hydroksypropylo-β-cyklodekstrynę zawierającą około 3 do 7,5 grup hydroksypropylowych na cząsteczkę βcyklodekstryny, z solami NMG antybiotyku typu eweminomycyny, całkowicie umknięto zaistnienia zespołu szkodliwej reakcji ubocznej.

Tabela 2 pokazuje, że występowania zespołu szkodliwej reakcji ubocznej można ograniczyć lub w zupełności wyeliminować za pomocą wstrzyknięcia myszom klarownych wodnych roztworów soli NMG antybiotyku typu eweminomycyny o wzorze III z wyszczególnionymi środkami według niniejszego wynalazku, takimi jak, na przykład, hydroksypropylo-β -cyklodekstryna.

Tabela 3 objaśnia, że podwyższenie stosunku molowego zasady do antybiotyku typu eweminomycyny o wzorze III od 2:1 do 9:1 całkowicie eliminuje wystąpienie zespołu

170 591 szkodliwej reakcji ubocznej w następstwie pozajelitowego wstrzyknięcia myszom we wszystkich zbadanych stężeniach.

Przykład porównawczy

Tabela 1

WYSTĘPOWANIE ZESPOŁU SZKODLIWEJ REAKCJI UBOCZNEJ PO PODANIU PREPARATÓW WODNYCH ZAWIERAJĄCYCH JEDEN MOL ZWIĄZKU O WZORZE III I DWA MOLE NMG ŁĄCZNIE Z HP-^-CD¹ LUB BEZ NIEJ

Myszy
(Stężenie wstrzykniętego związku III:80 mg/ml)	% zespołu szkod 100³	liwej reakcji uboc (MI 200³	:znej² przy następ ’K³) 500³	ujących dawkach 800³
III⁴: 2 NMG	100	-	-	-
III : 2MG G: 6HPCCD⁵	0	0	0	0
Małpy makaki
(Stężenie wstrzykniętego związku III:50 mg/ml)	% zespołu szkodliwej 10⁶	reakcji ubocznej² przy r (MPK⁶) 40⁴	tastępujących dawkach 806
III: 2 NMG	50
III: 5 NMG	-	33	50
III: 2 NMG : 6 HP CD⁵	-	0	0

Przypisy do Tabeli 1:

HP-p-CD oznacza liydroksypropylo-P-cyklodekstrynę zawierającą 7,4 grup hydroksypropylowych na cząsteczkę /J-CD.

Objawy zespołu szkodliwej reakcji ubocznej obserwowano u zwierząt w 2 minuty po wstrzyknięciu IV (dawka pojedyncza).

MPK oznacza ilość mg leku na kg masy ciała myszy (grupy po 5 do 10, CF-1, średnia masa 20 g, Harlan Sprague-Dawley, głodzone przez 18 godzin).

III oznacza związek stanowiący antybiotyk typu eweminomycyny przedstawiony wzorem III

Utworzony kompleks. Patrz. Przykłady 3 i 4.

MPK oznacza ilość mg leku na kg masy ciała małp makaków (masa ciała w zakresie wynoszącym 2,9 kg do 9,6 kg; Schering Corporation Colony, głodzone prze 18 godzin). W eksperymencie oznaczonym skrótami 40 MPK, 5 NMG użyto 3 małp, a w pozostałych dwóch eksperymentach użyto 2 małp.

Tabela 2

ZESPÓŁ SZKODLIWEJ REAKCJI UBOCZNEJ (ARS/ PO PODANIU PREPARATÓW WODNYCH ZAWIERAJĄCYCH JEDEN MOL ZWIĄZKU O WZORZE III I DWA MOLE NMG ORAZ WYBRANE DODATKI

% ARS u myszy przy następujących dawkach (MPK²) leku o wzorze III (20 mg/ml)
Wstrzyknięty lek o wzorze III	100	200	250	300
1	2	3	4	5
Tween3 (Stężenie) III: 2 NMG 0	10	100		100
III: 2 NMG 0,1%	10	100		100
III: 2 NMG 0,25%	80	100		100
III: 2 NMG 0,5%	100	100		100
III: 2 NMG 1%	100	100		100
III: 2 NMG 2%	-	0	0	40

170 591 ciąg dalszy tabeli

1	2	3	4	5
III: 2 NMG	3%	0	0	0	0
III: 2 NMG	DMSO⁴ (Stężenie) 0	0	90		100
III: 2 NMG	1%	0	40	100	100
III: 2 NMG	5%	0	10	20	50
III: 2 NMG	10%	0	0	10	50
III: 2 NMG	Gliceryna (Stężenie) 0	0	100		100
III: 2 NMG	5%	0	90	90	100
III: 2 NMG	10%	0	60	100	100
III: 2 NMG	Dekstran 40⁵(Stężenie) 0	0	100
III: 2 NMG	1%	20	100		-
III: 2 NMG	10%	0	50	70	100
III: 2 NMG	Dekstran 70⁶(Stężenie) 6%	0	90	100
III: 2 NMG	HP/3CD⁷ (Stosunek molowy) 0	0	100		100
III:: 2 NMG	1:0,5		0		50
III: 2 NMG	1:1,5		0		60
III: 2 NMG	1:2,5		0		30
III: 2 NMG	1:3		0		10
III: 2 NMG	1:3				10
III: 2 NMG	1:6				0

Przypisy do Tabeli 2:

Objawy zespołu szkodliwej reakcji ubocznej obserwowano u myszy (grupy po 5 do 10, CF-1, średnia masa ciała 20 g, Harlan Sprague Dawley, głodzone przez 18 godzin) w 2 minuty po wstrzyknięciu IV (dawka pojedyncza)

MPK oznacza ilość mg substancji leczniczej o wzorze III na kg masy ciała zwierzęcia.

Tween jest to monoolemian poli/oksyetyleno/sorbitanu dostępny jako Polysorbate 80 z ICI Americas Inc., Wilimington Delaware, pod nazwą handlową Tween 80.

DMSO oznacza sulfotlenek dunetylowy.

Dekstran 40 jest to wielkocząsteczkowy (40000) polimer glukozy dostępny z Sigma Chemical.

Dekstran 70 jest to wielkocząsteczkowy (70000) po limer glukozy dostępny z Sigma Chemical.

HP/3CD oznacza hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę zawierającą 7,4 grup hydroksypropylowych na cząsteczkę CD.

170 591

Tabela 3

Wpływ stężenia lipofilowego antybiotyku oligosacharydowego w postaci soli z NMG oraz stosunku molowego NMG do antybiotyku na zespół szkodliwej reakcji ubocznej u myszy

Lek o wzorze III	% ARS¹ przy następujących dawkach (MPK²):
(Stężenie leku)	50	100	200	300	400
III³ : 2 NMG (10 mg/ml)	-	-	50	-	-
III: 2 NMG (20 mg/ml)	-	20	100	-	-
III: 2 NMG (50 mg/ml)	70	100	-	-	-
III: 3 NMG (20 mg/ml)	-	-	0	0	20
III: 3 NMG (40 mg/ml)	-	-	0	15	40
III: 3 NMG (80 mg/ml)	-	-	100	-	-
III: 5 NMG (20 mg/ml)	-	-	0	0
III: 5 NMG (50 mg/ml)	-	-	0	-	40
III: 9 NMG (20 mg/ml)	-	-	0	0	0
III: 9 NMG (40 mg/ml)	-	-	0	0	0
m: 9 NMG (80 mg/ml)	-	-	0	-	0

Przypisy do Tabeli 3

Objawy zespołu szkodliwej reakcji ubocznej obserwowano u myszy (grupy po 5 do 10, CF-1, średnia masa ciała 20 g, Harlan Sprague Dawley, głodzone przez 18 godzin) w 2 minuty po wstrzyknięciu IV (dawka pojedyncza).

MPK oznacza ilość leku o wzorze III na kg masy ciała

Jeszcze bardziej, być może, nieoczekiwaną była obserwacja, że wartości najmniejszego stężenia hamującego (MIC) w przypadku modeli in vitro oraz wielkość 50% dawki ochronnej (PD50) w przypadku myszy jako ochronnego modelu in vivo, dla kompleksu 3 do 6 moli hydroksypropylo-β-cyklodekstryny ΗΡβ Cd w połączeniu z jednym molem związku o wzorze III i 2-3 molami NMG, były w istocie takie same jak wartości MIC i PD50 dla związku o wzorze III i jak wartości, o których mowa, dla soli związku III z NMG z HPe CD w tych modelach. Wskaźnik wiązania białka dla kompleksu 2 lub 3 moli NMG na związku o wzorze III z 6 molami HP^ CD utrzymywał się na poziomie 96-98% wartości wskaźnika wiązania obserwowanego w przypadku soli związku o wzorze III z 2 molami NMG.

Tak więc, nieoczekiwanie udało się wytworzyć farmaceutycznie dopuszczalne kompozycje zawierające lipofilowy antybiotyk oligosacharydowy, umożliwiające skuteczne uwalnianie tego antybiotyku do surowicy zwierzęcia, takiego jak ssak, włączając w to, zwłaszcza człowieka.

2-Hydroksypropylowe pochodne β-cyklodekstryny stosowane w sposobie według wynalazku zawierają około 2 do 15 grup hydroksypropylowych na cząsteczkę cyklodekstryny i wytwarza się je łatwo za pomocą poddania jednej z β-dekstryn reakcji z tlenkiem

1,2-propylenu w obecności zasady, w sposób zapewniający otrzymanie wieloskładnikowych mieszanin bezpostaciowych, takich jakie są opisane przez J. Fithę w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4727064 i Fithę i in. w International Journal of Pharmaceutics (1986), 29, 73-82 oraz przez Mullera w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4870060. Produkty samokondensacji tlenku propylenu usuwa się i oznac2zi stopień podstawienia, to znaczy liczbtę grup hydroksypropylowych nil cząsteczkę cyklodekstryny, dogodnie metodą protonowego NMR i/lub metodą spektroskopii masowej

170 591 zgodnie ze sposobami postępowania, które opisał Pitha w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4727064 oraz w International Journal of Pharmaceutics (1986), 29, 73-82, a także C.T. Ras i in. w Pharmaceutical Research (1990), 7, (nr 6), 612-61S. 2-Hydroksypropylo-e-cyklodekstryny zawierające około 2 do 1S korzystnie około 3 do 9, korzystniej około S -7,S grup hydroksypropylowych na cząsteczkę β-cyklodekstryny wytwarza się łatwo z wykorzystaniem typowych sposobów postępowania, a także są handlowo dostępne z Cyclolab, należącego do CHINOIN, Pharmaceutical and Chemical Work Ltd., 132S Budapeszt, Węgry, Walker-Chemie GmBH, Division L. Biotechnology Prinzregentenstrasse 22 D-800, Monachium 22, RFN; American Maize, Hammond, Indiana; Pharmatec Inc. P.O. Box 730, Alachua FL 3261S i Janssen, Biotech N.V. Lammerdries SS, B-2430 Olen, Belgia. Sole lipofilowego antybiotyku oligosacharydowego przedstawionego wzorem III są w wyjątkowy sposób odpowiednie do tworzenia roztworów zupełnych w wodzie i to dla szerokiego zakresu hydroksypropylo-β-cyklodekstryn, zawierających od około 2 do 1S grup hydroksypropylowych na cząsteczkę. Jak to pokazano w tabeli 4, szeroki zakres HP--SCD zawierających od 3,9 do 7,S grup hydroksypropylowych na cząsteczkę HP-β-CD w zasadniczy sposób zapobiegał wystąpieniu zespołu szkodliwej reakcji ubocznej w następstwie pozajelitowego wstrzyknięcia myszy, jako modelu, kompleksu złożonego z 1 mola związku o wzorze III, 2 moli NMG i 6 moli HP-β-CD.

Tabela 4

Zespól szkodliwej reakcji ubocznej 1 po pozajelitowym wstrzyknięciu(800 MPK, 80 mg związku o wzorze III na ml) myszom wodnego roztworu kompleksów złożonych z jednego mola związku o wzorze III, dwóch moli HMG i sześciu moli HP^-CD zawierającej od 3,9 do 7,S grup hydroksypropylowych

Liczba grup hydroksypropylowych na cząsteczkę HP^-CD	% zespołu szkodliwej reakcji ubocznej
Bez HP^-CD	90
7,4	0
7ó	0
7,4	0
7,4	0
7,2	0
6,9	0
6,7	0
6,3	0
6,2	0
ó,2	0
4,ó	0
4,4	0
4,1	10
3,9	0

Zespół szkodliwej reakcji ubocznej obserwowano u myszy (grupy po 10, CF-1, średnia masa ciała 20 g, Harlan Sprague Dawley, głodzone przez 18 godzin) w 2 minuty po wstrzyknięciu IV (dawka pojedyncza).

170 591

Związek o wzorze III, stosowany w sposobie według wynalazku stanowi antybiotyk typu eweminomycyny, o nazwie 56-/2,4-dihy(^d^i^o_lcss^-(S-r^t^1t)^]ofc^r^5^^i^i^.s:^in/ 56-dezacetylo-57-demetyk)-45-0~de/2-metylo-1-ok.sopropylo/-12-0-/2,3,6-trideoksy-3-0-metylo-4-0-metylo-3-nitro-a -L-arabinoheksopiranozo-iilo/flamb^tur^y^cyny ma wzór cząsteczkowy C70H97NO38O2, masę cząteczkową 1629.

Związek o wzorze III można otrzymać za pomocą fermentacji z udziałem Micromonospora carbonacea var. africana NRRL 15099, ATCC 39149, albo korzystniej polepszonego szczepu tego mikroorganizmu, otrzymanego w sposób opisany w poniższej części niniejszego opisu.

Z wykorzystaniem szczepu SCC 1413 hodowli NRRL 15099, ATCC 39149, związek o wzorze III można dogodnie otrzymać według sposobu postępowania przedstawionego w Przykładzie I opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 4597968. W konkretnym przykładzie, zgodnie z tym sposobem postępowania, inokulum wyjściowe dla fermentacji szczepu SCC 1413 otrzymano przy użyciu 2,5 ml zamrożonej pełnej brzeczki i 50 ml podłoża do zarodnikowania w 250 kolbach Erlenmeyera. Skład podłoża do zarodnikowania był następujący: ekstrakt mięsny, 0,3% ; trypton, 0,5%; dekstroza, 0,1%; skrobia ziemniaczana, 2,4%; ekstrakt drożdżowy, 0,5%; węglan wapniowy, 0,2%. Przed sterylizacją pH podłoża doprowadzono do 7,5. Kolby inkubowano w temperaturze 30°C na wstrząsarce obrotowej przy 250 obr/min w ciągu 48 godzin. W celu przeprowadzenia zarodnikowania drugiego stopnia, 2-litrowe kolby Erlenmeyera zawierające 500 ml takiego samego podłoża posiano 5% obj. materiału z pierwszego stopnia zarodnikowania. Warunki inkubacji były takie same jak poprzednio. Inokulum trzeciego stopnia zastosowano dla wszystkich fermentacji w tkankach z mieszaniem i otrzymano je za pomocą 24tgodzinnej inkubacji hodowli w tych samych warunkach, jakie przyjęto w stopniu drugim.

10-lltrowe fermentacje prowadzono początkowo w 144 itrowych fermentorach laboratoryjnych NRS z zastosowaniem podłoża o składzie następującym: ekstrakt drożdżowy, 0,5% hydrolizat kazeiny, 0,5%; cereloza, 1%; skrobia rozpuszczalna, 2,0%; węglan wapniowy, 0,4%; chlorek kobaltu, 0,24 mg %. Przed sterylizacją pH podłoża doprowadzono do 6,7 a przed posianiem do 7,0. Dla zapoczątkowania fermentacji użyto inokulum trzeciego stopnia (2,5%) i prowadzono ją w temperaturze 30°C przy napowietrzaniu wynoszącym 0,35 obj/obj/min i mieszaniu wynoszącym 350 obr/min.

W trakcie fermentacji, wytwarzanie antybiotyku kontrolowano co 24 godziny metodą biologiczną, z użyciem pełnej brzeczki wobec Staphylococcus aureus 209F (pH agaru 7,0) i Escherichia coli ATCC 10536 (pH agaru 8,0). Oznaczano także, w sposób okresowy lub ciągły, wzrost organizmu produkcyjnego (objętość masy komórkowej), pH i poziom rozpuszczonego tlenu. Przebieg typowej fermentacji w tanku 10-Htrowym przedstawiono na fig. 1.

Opracowano polepszony szczep wywodzący się z SCC 1413, NRRL 15099, ATCC 39149, przy u życiu typowych środków mutagennych. Otrzymane szczepy wytwarzały z podwyższoną wydajnością związki o wzorze III, stanowiące antybiotyki typu ewerninomycyny. W konkretnym przykładzie, macierzysty szczep SCC 1413, NRRL 15099, ATCC 39149, poddano działaniu środka mutagennego, N-nitrozoguanidyny (NTG) użytego w ilości wystarczającej do zabicia 90% hodowli SCC 1413, ATCC 39149, NRRL 15099. Tysiąc pięćset przewyższających izolatów poddano badaniu pod względem wzmożonej aktywności biologicznej skierowanej przeciw S. aureus i E. coli, w celu określenia, które izolaty wykazywały podwyższoną produktywność jeśli chodzi o pożądany antybiotyk o wzorze

III. Do określania wzmożonej aktywności stosowano następującą metodę badawczą. Izolaty pojedynczych kolonii doprowadzano do zarodnikowania w probówkach zawierających 10 ml podłoży do zarodnikowania opisanych w przykładzie I opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 4597968 i wytrząsano przy 250 obr/min na wstrzzisarce obrotowej, w temperaturze 30°C w ciągu 48 godzin. Badanie przebiegu fermentacji rozpoczynano po przeniesieniu 2,5 ml zawiesiny zarodników do 250 ml kolb Erelnmeyera zawierających 50 ml podłoży fermentacyjnych i inkubowaniu w temperaturze 30°C w ciągu 96 godzin,

170 591 przy 250 obr/min, na wstrząsarce obrotowej. Następnie, antybiotyk otrzymany w wyniku fermentacji badano pod względem zwiększonej jego produktywności za pomocą oceny aktywności skierowanej przeciw S. aureus i E. coli. Identyfikowano izolaty dające podwyższoną wydajność pożądanego antybiotyku. Wyniki otrzymane dla reprezentatywnego polepszonego izolatu, oznaczonego w niniejszym opisie jako szczep SCC 1631, podano w tabeli 5.

Powyższy sposób postępowania, przyjęty przy opracowaniu szczepu, powtórzono, poddając reprezentatywny polepszony izolat, SCC 1631, dalszemu działaniu NTG, użytej ponownie w ilości wystarczającej do zabicia 90% hodowli. Następnie przeprowadzono selekcję izolatów na płytkach z agarem zawierającym eweminomycynę D w ilości 150 /zg/ml. Izolaty, które dają wzmożoną produkcję pożądanego antybiotyku poddano ponownej selekcji na podstawie oceny ich aktywności biologicznej skierowanej przeciw S. aureus i E. coli. Jeden z tych izolatów, oznaczony w niniejszym opisie jako szczep SCC 1756, wykorzystano następnie do wytwarzania korzystnego antybiotyku o wzorze III.

W dalszym ciągu, mutageneza z udziałem NTG szczepu SCC 1756 doprowadziła do otrzymania naszego obecnego szczepu produkcynego, a mianowicie SCC 2146.

W przypadku przedstawionych powyżej sposobów przeprowadzania mutacji, protokoły dla obu tych badań były takie, jakie opisano w powyższej części mniejszego opisu. W przypadku dwóch ostatnich badań dotyczących mutacji, brzeczki fermentacyjne poddawano ekstrakcji octanem etylu i zatężone ekstrakty poddawano chromatografii na płytkach do chromatografii cienkowarstwowej Whatman LKGDF w układzie rozpuszczalników złożonych z chloroformu i metanolu (9:1 obj/obj), a następnie bioautografii wobec S. aureus i E. coli w celu potwierdzenia wytwarzania wszystkich składników kompleksu antybiotycznego. Dla śledzenia wzrastających mian związku o wzorze III, płytki do chromatografii cienkowarstwowej odczytywano przy użyciu aparatu Shimadzu CS-930 TLC plate scanner i obserwacje wyrażano ilościowo w przypadku bogatszych ekstraktów z wykorzystaniem HPLC. Mianem łącznym określa się sumę związku o wzorze III (antybiotyk 13-384, składnik 1 z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 4597968) i nitrozowego analogu wspomnianego składnika 1, to znaczy antybiotyku 13-384, składnika la.

Wczesne obserwacje wskazywały na to, że chociaż szczep macierzysty wzrastał szybko w temperaturze 34°C, to wytwarzanie antybiotyku było na poziomie optymalnym w przypadku temperatury niższej. Zjawisko to przebadano aby posłużyć się nim do optymalizacji fermentacji. Wyniki badań dotyczących temperatury wykazały, że optymalną produkcję uzyskiwano wtedy, gdy temperaturę po upływie 24 godzin inkubacji, obniżono od 34°C do 30°C. Wszystkie następne eksperymenty w tankach z mieszadłami prowadzono według protokołu, zgodnie z którym w ciągu 24 godzin inkubacja odbywała się w temperaturze 34°C, po czym następowało obniżenie temperatury do 30°C na cały dalszy okres prowadzenia fermentacji.

Badania nad podłożami prowadzono łącznie z wyodrębnianiem polepszonych szczepów produkcyjnych. Badano zastępowanie źródeł węgla i azotu jak również dodawanie składników mineralnych i innych złożonych środków odżywczych. Zastąpienie hydrolizatu kazeiny peptonem mięsnym lub rybnym, oraz zastąpienie skrobi rozpuszczalnej dekstryną ziemniaczaną (PDP 650) prowadziło do wzmożenia produkcji antybiotyku przez zastosowane szczepy SCC 1413 u SCC 1651. W badaniach nad szczepem SCC 1756 zaobserwowano dalsze wzmożenie wytwarzania związku o wzorze III w przypadku dodania namoku kukurydzianego i chlorku niklu (II). Skład obecnie przyjętego produkcyjnego podłoża fermentacyjnego (4I + 1/2 Ni), zoptymalizowanego z uwzględnieniem związku o wzorze III, jest następujący: glukoza, 2,2% wag; dekstryna PDP 650, 4,0% wg; ekstrakt drożdżowy, 0,5% wag; pepton mięsny, 0,6% wag; namok kukurydziany, 0,5% obj; chlorek niklu, 2,5 x 10'⁶M; węglan wapniowy, 0,4% wag. Przed wprowadzeniem węglanu wapniowego pH podłoża doprowadzono do 6,7. Tabela 6 przedstawia wyniki porównania mian dla szczepów SCC 1413, SCC 1631, sCc 1756 i SCC 2146, otrzymane w badaniach w skali kolb na trzęsawkach (50 ml obecnie przyjętego podłoża produkcynego w 250 ml kolbach Erlenmeyera, w temperaturze 30°C, w ciągu 96 godzin, przy 300 obr/min.

170 591

Wyraźnie zademonstrowano wybitne polepszenie miana (wzrost 15-krotny w stosunku do wyjściowego szczepu macierzystego, SCC 1413).

W przypadku fermentacji prowadzonej w skali 100-litrowej, dla obecnie przyjętego podłoża i naszego najlepszego szczepu produkcyjnego^ SCC 2146, uzyskano miana w zakresie 555-750 wg/ml (suma związku o wzorze III i jego pochodnej nitrozowej) (Tabela 7).

Tabela 5

Porównanie szczepów SCC 1413 i SCC 1631 w fermentacjach z wykazaniem stref zahamowania (mm) na płytkach z agarem¹

TEST 1
Szczep		S.aureus pH 7		E.coli pH 8
SCC		Nierozcieńczony	1:20		Nierozcieńczony
1631	28,7	28,7		22,0	20 17,5
1431	28,7	28,7		19,0	12 H³ 12H³
TEST 2
Szczep		S.aureus	pH 7		E. coli pH 8
SCC		Nierozcieńczony	1:20		Nierozcieńczony
1631	28,1	28,8	23,3	23,1	14,8 C² 15,0 C²
1413	23,8	23,1	20,5	19,8	12H³ 12H³

1. Oznaczenia powtórzone tam, gdzie było to stosowne

2. Strefa przezroczysta.

3. Strefa zamglona.

Tabela 6

Porównanie w skali kolb szczepów SCC 1413,1631,1756 i 2146 Micromonospora carbonacea var. africana NRRL 15099, ATCC 39149

Miano związku o wzorze III i jego analogu nitrozowego (1A) (wg/ml)
Hodowla	1 (NO2)	la (NO)	Łącznie (1 + 1a)
SCC 1413	5	3	8
SCC 1631	14	4	18
SCC 1756	17	16	33
SCC 2146	39	85	124

Tabela 7

Fermentacja w skali 100 litrów z udziałem SCC 2146

Miano związku o wzorze III i jego analogu nitrozowego (1A) (wg/ml)
Podłoża	1 (NO2)¹	1a (NO)2	Łącznie (1 + 1a)
1	2	3	4
4I	105	315	420
4I	135	170	305
4I + 1/2 Ni³	55	500	555

ciąg dalszy tabeli na str. 14

170 591

1	2	3	4
4I + Ni⁴	150	575	725
4I + 1/2 Ni3	100	650	750
4I + 1/2 Ni³	130	470	600

Przypisy do tabeli 7:

1. Antybiotyk typu eweminomycyny o wzorze III.

2. Analog nitrozowy antybiotyku o wzorze III.

3. Stężenie niklu (1/2 Ni) = 2,5 x 10”M

4. Stężenie niklu Ni = 5 x 10'^<’M.

Wyodrębnienia kompleksu lipofilowego antybiotyku oligosacharydowego zawierającego związek o wzorze III i jego analog nitrozowy, dokonano z wykorzystaniem sposobów postępowania z Przykładu IC opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 4597968. pH brzeczki fermentacyjnej doprowadzono do 7 i dwukrotnie poddano ekstrakcji octanem etylu użytym w objętości równej dwóm objętościom brzeczki fermentacyjnej. Połączone ekstrakty octanowe zatężono i metodą HPLC oznaczono w nich ilość związku o wzorze III i jego analogu nitrozowego. Analog nitrozowy przekształcono w związek nitrowy o wzorze III przy użyciu środka utleniającego, takiego jak wodoronadtlenek tertbutylu (t-BuO2H) z acetyloacetonianem wanadylu w roztworze w protonowym rozpuszczalniku organicznym, w temperaturze pokojowej. Przebieg reakcji śledzono z wykorzystaniem, na przykład metody HPLC. Mieszaninę reakcy'ną szybko zadano fosforynem trialkilu i produkt surowy poddano oczyszczaniu z zastosowaniem standardowych metod chromatograficznych, takich jak na przykład chromatografia kolumnowa na żelu krzemionkowym (aceton/CH2Cl2), albo z użyciem kolumny zawierającej polimer polihydroksywinylowy, taki jak Fractogel (Toyo Pearl), dostępny z Toyo Hase, Philadelphia, Pensylvania.

Nieoczekiwanie stwierdzono, Ze średnia geometryczna wartości MIC (GMM) wobec rozmaitych bakterii oraz wskaźniki wiązania białka surowicy kompozycji wytwarzanej według wynalazku obejmującej jeden mol związku przedstawionego wzorem III, 3 mole NMG i 5 moli 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny zawierającej 7,4 grup hydroksypropylowych na cząsteczkę β-cyklodekstryny, są zasadniczo takie same jak odpowiednie wartości dla związku o wzorze III jako takiego. Oczekuje się, że wszystkie kompozycje wytwarzane sposobem według wynalazku będą zachowywać się podobnie.

Testy na działanie przeciwbakteryjne in vitro wykonywano z zastosowaniem typowych metod rozcieńczeniowych w agarze przy użyciu agaru Muellera-Hintona. Wartość GMM dla powyżej wyszczególnionej kompozycji otrzymanej sposobem według niniejszego wynalazku i dla związku o wzorze. III oznaczono wobec rozmaitych bakterii, na przykład bakterii gramdodatnich i gramujemnych. Termin zakażenia wrażliwymi bakteriami gramdodatnimi i gramujemnymi odnosi się do szerokiego zakresu zakażeń bakteriami gramdodatnimi takimi jak na przykład gronkowce oporne na metycylinę i wrażliwe na metycylinę, różne szczepy paciorkowców i enterokoków, a także do niektórych zakażeń bakteriami gramujemnymi, takimi jak na przykład E. coli, Klebsiella, Salmonella Ipseudomonas. Związek o wzorze III przejawia doskonałą aktywność (10-krotnie silniejszą niż aktywność wankomycyny) skierowana zarówno przeciw gronkowcom opornym na metycylinę (GMM, 0,1 μ g/ml), jak i przeciw gronkowcom wrażliwym na metycylinę (GMM, 0,5 μ g/ml). Związek o wzorze III wykazuje także dobrą aktywność (2-krotnie silniejszą od aktywności wankomycyny) skierowana przeciw Enterococcus faecalie (GMM, 0,49 μ g/ml), jak również dobrą aktywność (MIC, < 0,5 μ g/ml) skierowaną przeciw różnym szczepom paciorkowców i enterokoków opornych na wankomycynę (MIC, < 128 μ g/ml). Związek o wzorze III okazał się bardzo aktywny w działaniu przeciw Borrelia burgdorferi (MIC, < 0,49 μ g/ml) (oraz Legionella pneumophila i L longbeachese (MIB, 2,5 μ g/ml), ale wykazał jedynie słabą aktywność przeciw bakteriom gramujemnym (GMM, > 760/zg/ml),Trichomonas vaginalis. (MIC, > 192iig/ml) i Mycoplasma sp. (MIC, 200 μ g/ml). Nie zaobserwowano oporności krzyżowej z innymi antybiotykami.

Związek o wzorze III wykazywał umiarkowaną aktywność bakteriobójczą w stosunku do rozmaitych klinicznych i laboratoryjnych szczepów gronkowców. Aktywność

170 591 bakteriobójcza związku o wzorze III skierowana przeciw gronkowcom i enterokokom była podobna do aktywności przejawianej przez wankomycynę. Związek o wzorze III wykazywał dobrą aktywność skierowaną przeciw gronkowcom u myszy (PD50 w zakresie 0,5 do 25,0 mg/kg), podobną do aktywności przejawianej przez wankomycynę (0,7 do

28,5 mg/kg).

W następstwie podania (30 mg/kg, IV) związku o wzorze III z 2 cząsteczkami NMG, obserwowano wysoki poziom w surowicy szczurów ( wartość zzczyoowa około 90 /zg/nd) przy długim okresie półtrwania w surowicy β).

Przewiduje się, że farmaceutycznie dopuszczalne kompozycje wytwarzane sposobem według niniejszego wynalazku wykażą aktywność skierowaną przeciw powyżej wyszczególnionym wrażliwym bakteriom, jak również przeciw krętkom, włączając w to Treponema pallaidum, beztlenowcom, włączając w to Clostridium difficile, a także przeciw Pneumocystis, Texoplasma, pierwotniakom i robakom.

W oparciu o fakt wykazywania przez związek o wzorze III aktywności skierowanej przeciw Borralia burgdorferi i Legionella pneumophila oraz L. longbeacheae, oczekuje się, że kompozycje zawierające związek o wzorze III będą wykazywać aktywność w modelu ludzkim skierowaną przeciw chorobie Lyme'a i chorobie legionistów.

Stosowanie kompozycji wytworzonych sposobem według wynalazku zapewnia sposób leczenia lub zapobiegania zakażeniom wrażliwymi bakteriami gramdodatoimi lub gramujemnymi u zwierząt, polegający na podawaniu zwierzętom, włączając w to, zwłaszcza człowieka dotkniętym tego rodzaju zakażeniami, określonej ilości preparatu farmaceutycznego zawierającego kompozycję wytwarzaną sposobem według niniejszego wynalazku i jej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Kompozycje wytwarzane sposobem według niniejszego wynalazku można łączyć z dowolnym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak na przykład woda jałowa, wodny roztwór etanolu, oleje roślinne lub poliole, takie jak glikole polietylenowe i glikol propylenowy. Można je podawać doustnie, pozajelitowo lub miejscowo w postaci rozmaitych preparatów. Korzystnie jako nośnik stosuje się wodę jałową. Woda jałowa może ewentualnie zwierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje, takie jak na przykład chlorek sodowy, azotan potasowy, glukoza, mannitol, dekstroza, sorbitol, ksylitol lub bufory takie jak bufor fosforanowy, octanowy lub cytrynianowy, jak również środki konserwujące.

Dzięki opracowaniu sposobu według wynalazku uzyskano efekt absolutnie nie dający się przewidzieć na podstawie znanego stanu techniki. Mianowicie fakt, że preparaty farmaceutyczne nadające się do bezpiecznego i skutecznego uwalniania lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych do surowicy zwierząt dotkniętych zakażeniami wrażliwymi bakteriami, a zwłaszcza zakażeniami wrażliwymi bakteriami gramododatnimi i gramoujemnymi, można wytwarzać przy użyciu mniej niż 20% wag. hydroksypropylo-β-cyklodekstryny, jest szczególnie zadziwiający z punktu widzenia wskazówek Bodora w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4983586 dotyczących użycia 20-50% wag hydroksypropylo-β-cyklodekstryny w celu uniknięcia żelowania lub wytrącania się leku, oraz wskazówki Pithy w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4727064 odnoszącej się do użycia 40-60% wag hydroksypropylo-β-cyklodekstryny dla solubilizowania rozmaitych leków, włączając w to sole kwasu retinojowego.

Dla podawania drogą doustną, kompozycje wytwarzane sposobem według wynalazku formułować można w postać tabletek, kapsułek, eliksirów itp. Tabletki i kapsułki mogą zawierać takie zarobki jak skrobia czy laktoza. Postacie płynne mogą zawierać środki barwiące lub aromatyzujące. Preparaty do stosowania miejscowego mogą mieć postać kremów, maści hydrofobowych i hydrofilowych albo wodnych, niewodnych i typu emulsji lotionów, jak również krążków macicznych i kapturków oraz proszków. Do typowych nośników w tego rodzaju preparatach należą woda, oleje, tłuszcze, poliestry i poliole. Preparaty do podawania drogą pozajelitową, takie jak na przykład postacie dawek do wstrzykiwań, są to zazwyczaj preparaty płynne, takie jak roztwory lub zawiesiny, przy czym typowymi nośnikami są w tym przypadku woda i roztwór soli w wodzie. Korzystne są preparaty do podawania drogą pozajelitową. Korzystniejsze są preparaty do podawania dożylnego.

Wielkość dawki, w jakiej stosuje się te kompozycje w którejkolwiek postaci, zależeć będzie od rozmaitych czynników, takich jak masa ciała, wiek i płeć zwierzęcia, włączając w to, zwłaszcza ssaka, takiego jak człowiek, poddawanego leczeniu, wrażliwości organizmu zakażającego na działanie lipofilowego antybiotyku oligosacharydowego, stopień i ciężkość zakażenia. Ogólnie dawkowanie poddawanych lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych o wzorze III mieści się w zakresie od około 1 mg na kg masy ciała na dzień do około 15 mg na kg masy ciała na dzień, korzystnie około 5 mg na kg masy ciała na dzień przy podawaniu w dawkach podzielonych, przy czym konkretną wielkość i sposób dawkowania pozostawia się uznaniu lekarza-praktyka. Korzystne jest podawanie drogą dożylną.

W leczeniu niektórych pacjentów kompozycjami wytwarzanymi według wynalazku zachodzi możliwość włączenia do tej samej dawki jednostkowej także innych składników farmaceutycznie aktywnych.

Przykład I. Przeprowadzono w skali 100-litrowej fermentację z udziałem szczepu SCC 2146 Micromonospora carbonacea var. africana NRRL 15099, ATCC 39149, polepszonego sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu, zgodnie ze sposobami postępowania podanymi w przykładzie IB opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 4597968, z tą różnicą, że zastosowano podłoże produkcyjne (41 + 1/2 Ni) o składzie podanym poniżej, oraz, że fermentację prowadzono w temperaturze 34°C w ciągu 24 godzin, po czym temperaturę obniżono do 30°C na cały dalszy czas prowadzenia fermentacji, to znaczy na dalsze 72 godziny (całkowity czas trwania fermentacji wynosił więc 96 godzin). Przyjęto napowietrzanie na poziomie 0,35 obj/obj/min oraz mieszanie przy 350 obr/min.

Glukoza

Dekstryna PDP 650 Ekstrakt drożdżowy Pepton mięsny Namok kukurydziany Chlorek niklu Węglan wapniowy Woda wodociągowa q.s.

2,2% (wagowo)

4,0% (wagowo))

0,5% (wagowo)

065% (wagowo)

0,5% (objęoościowo)

2,5 x WM 0,4% (wagowo) do 1000 ml

B. W y o d r ę b nianie. Brzeczkę fermentacyjną z Przykładu 1A poddaje się ekstrakcji 2 razy po 200 litrów octanu etylu. Ekstrakty octanowe łączy się i zatęża, w wyniku czego otrzymuje się zatężony kompleks antybiotyczny zawierający mieszaninę związku o wzorze III i jego analogu nitrozowego ( według oznaczenia meoodą HPLC).

Przykład II. (A) Do 919 g kompleksu antybiotycz.nego wytworzonego sposobem opisanym w Przykładzie 1 i zawierającego 294 g (32%) mieszaniny 3,4 mola analogu nitrozowego na 1 mol związku o wzorze III, rozpuszczonego w 4,6 litra octanu etylu, 68,8 g NaHCOa i 2,98 g acetyloacetonianu wanadylu (3 M) w 2,2,4-trimetylopentanie dostępnym z firma Aldrich (0,06 równoważnika) dodano, po upływie 1/2 godziny od utworzenia tej mieszaniny, 394 ml 3M wodoronadtlenku tert-butylu. Następnie do utworzonej mieszaniny dodano w porcjach po 1,45 g (0,03 równoważnika), w godzinach: 0, 1 1/2, 2 1/2, 3 1/2, i 4, acetyloacetonian wanadylu, tak, że w ciągu 4 godzin dodano łącznie 0,15 równoważnika acetyloacetonianu wanadylu. Mieszaninę reakcyną zanurzono w łaźni lodowej, po czym dodano 203 ml (0,5 równoważnika) fosforynu trietylu (C^Hs^P. Tak utworzoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono taką samą objętością octanu etylu, utrzymując temperaturę mieszaniny reakcyjnej na poziomie < 30°C. Rozcieńczoną octanem etylu mieszaninę reakcyjną przemyto dwukrotnie wodą. Do warstwy wodnej dodano sól i poddano ją ekstrakcji octanem etylu. Połączone ekstrakty organiczne osuszono MgSO4, przesączono i zatężono. Tak utworzoną pozostałość rozcieńczono w minimalnej

170 591 ilości acetonu, po czym dokonano wytrącenia w 7 litrach mieszaniny octanu etylu i heksanu 1 : 9 (obj/obj). Po odsączeniu i przemyciu pozostałości heksanem, osuszeniu z zastosowaniem podciśnienia i ogrzaniu, otrzymano 928 g produktu zawierającego 30% (278 g) nitro - związku o wzorze III.

(B) Pozostałość z Przykładu II A poddano oczyszczaniu na S kg żelu krzemionkowego umieszczonego w kolumnie. Kolumnę eluowano 12 litrami CHzCb zawierającego stopniowo wzrastającą (10%, 20%, 2δ%, 30%, 3ó% obj/obj) ilość acetonu. Odpowiednie frakcje połączono i zatężono w temperaturze < 3Ó°C. Tak utworzoną pozostałość rozpuszczono w acetonie i wytrącono w 10 częściach 10% eteru dietylowego/heksanu. Produkt odsączono i osuszono z zastosowaniem podciśnienia, bez ogrzewania. Frakcja główna zawierała 147,0 g związku o wzorze III (o czystości 98,7%). Inne frakcje zawierały produkt surowy i poddano je powtarzanej chromatografii na żelu krzemionkowym aż do uzyskania produktu o czystości co najmniej 96-98%. Budowę produktu określono z wykorzystaniem NMR i MS i stwierdzono, że jest ona zgodna z budową związku o wzorze III.

Przykład III A. W S ml wody sporządzono roztwór zawierający 23,97 mg N-metyloglukaminy (NMG) i 070,90 mg 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryny (HP/6CD) zawierającej 7,4 grup hydroksypropylowych na cząsteczkę HP^CD.

Do roztworu tego dodano 100 mg związku o wzorze III. Po łagodnym mieszaniu utworzył się jednorodny kompleks zawierający 20 mg/ml związku o wzorze III. Stosunek molowy trzech składników był następujący: 1 mol związku o wzorze III na 2 mole NMG na 6 moli HP/1CD. Tak utworzony roztwór przesączono przez błonę 0,4S μ m, po czym zliofilizowano i przechowywano w otoczeniu nie zawierającym wilgoci. W celu wytworzenia preparatu farmaceutycznego dodano farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, taki jak woda. Podobne wyniki otrzymano przy użyciu HPβ CD zawierającej 3,9 do 7,S grup hydroksylowych na mol β-cyklodekstryny.

Utworzenie klarownego wodnego roztworu jednorodnego kompleksu, wytworzonego zgodnie z tym sposobem postępowania z niniejszego Przykładu, potwierdzono z zastosowaniem metod standardowych, takich jak, na przykład, nefelometria i pomiary szerokości linii widmowej w protonowym NMR. Bezpieczne i skuteczne podawanie preparatu farmaceutycznego w postaci klarownych wodnych roztworów jednorodnego kompleksu, wytworzonych zgodnie ze sposobami postępowania według niniejszego wynalazku, przebadano in vivo na różnych modelach zwierzęcych, tak, jak to przedstawiono w Tabelach 1-4.

Przykład III B. Powtórzono sposób postępowania z Przykładu 3 A, z tą różnicą, że do wodnego roztworu 126 mg NMG i 3S0 mg związku o wzorze III dodano 17S0 mg PIP/ICD zawierającej 7,4 grup hydroksypropylowych w cząsteczce. Stosunek molowy trzech składników w tak utworzonym jednorodnym roztworze był następujący: 1 mol x^iiązl^^i o wzorze III na 3 mole NMG na 5 moli HP/ICD. Do roztworu tego dodano S00 mg ziarnistego mannitolu, według USP, i 10 mg Polysorbate-80 (Tween-80) NF. Tween-80 dodano w ilości 2,8S% wag w przeliczeniu na związek o wzorze III. Tak utworzony roztwór przesączono i zliofilizowano sposobem opisanym w Przykładzie III A.

Zliofilizowaną kompozycję przechowuje się we fiolkach w otoczeniu nie zawierającym wilgoci. W celu sporządzenia preparatu farmaceutycznego nadającego się do podawania drogą dożylną, dodaje się 20ml wody jałowej.

Przykład IV. Następujące przykłady przedstawiają wykorzystanie metody NMR-mikromiareczkowania do oznaczania stałej równowagi kompleksowania pierścienia 2,4-dihyyro.kss-6-meeylofenylowego (niechloroaromatycznego) i pierścienia

3,S-dichloro-2-met^ks^y-4-hydroksy-6-metylofenylowego (pierścienia dichloroaromatycznego) soli NMG związku o wzorze III z 2-yydroksypropylc>-β-cyllko^^^ksti;yną (ΙΙΕβCD) zawierającą

7,4 i 3,4 grup hydroksypropylowych na mol HP/1 Cd oraz z 2-yydroksypropylo-y-cyklodekstryną (HPyCD) zawierającą 4,4 grup hydroksylowych na mol HPyCD. Pomiary wykonano przy użyciu spektrometru Varian XL 400 przy 400 mHz, w temperaturze 20°C.

170 591

A. Sporządzono roztwór zawierający 10 mg związku o wzorze III na ml D2O i 3 równoważniki N-metyloglukaminy (NMG). Do roztworu tego dodano w mg porcjach HP/I CD zawierającą 7,4 grupy hydroksypropylowe na cząsteczkę lIP/iCD. Zmianę w przesunieciach chemicznych grupy metylowej 68 we wzorze III i protonów 54 we wzorze III mierzono w miarę dodawania zwiększających się ilości HP/iCD. Stałe równowagi dla 50% skompleksowania obliczono w zwykły sposób. Określono także ilość moli HP/ CD potrzebną do uzyskania 90% skompleksowania lub związania przy obu pierścieniach aromatycznych. Ilość moli HP^CD konieczna do uzyskania 90% skompleksowania przy obu miejscach aromatycznych wynosiła 6,2. Dla uzyskania 50% skompleksowania potrzebne były 2 mole HP/CD. Stałe równowagi podano w następującej tabeli 8.

B. Powtórzono sposób postępowania z Przykładu IV A, z tą różnicą, że zastosowano HP/CD zawierającą 3,4 grupy hydroksypropylowe na mol HP/CD. Wyniki podano w następującej tabeli 8. Dla uzyskania 90% skompleksowania przy obu miejscach aromatycznych potrzeba było 6,6 mola HP^CD.

C. Powtórzono sposoby postępowania z Przykładu IV C, z tą różnicą, że zastosowano HPyCD zawierającą 4,4 grupy hydroksypropylowe na mol HPyCD. Dla uzyskania 90% skompleksowania przy obu miejscach potrzebna była ilość moli HPyCD wynosząca 4,0. Dla uzyskania 50% skompleksowania potrzebna ilość moli wynosiła 1,4. Wyniki podano w następującej tabeli 8 poniżej.

Tabela 8

Stałe równowagi (litry/mol) dla kompleksów 1 mol związku III: 3 mole NMG z HP/CD i HPyCD

Miejsce kompleksowa^a w związku III	HP^CD n¹ = 7,4	HP/5CD n1 = 3,4	HPyCD n²=4,2
Pierścień nlechlyryaromatyyzny	183 ± 5	188 ± 5	355 ± 9
Pierścień ³diyhlyroaromatycz.ny⁴	953 ± 18	983 ± 34	315 ± 28

n = liczba grpp yddroksppropylowychaa cąąsteckkę HPCCD (śrennio). n = liczba grup CydryksyprypylyoyeC na cząsteczkę HPyCD (średnio) Pierścień nieeClyryarymatyyzny w III =

Pierścień dieClyryarymatyecny w III

Z wykorzystaniem metody NM^-chemicznego miareczkowania oznaczono kompleksującą ilość HP/1CD zawierającej 7,4 grup CydryksypropykioyeC na cząsteczkę HP^CD potrzebną dla 1 mola soli NMG 3 : 1 antybiotyku o wzorze III, wynoszącą 6,6 mola dla uzyskania 90% skympleksyoanib (przy obu grupach brymatyccnycC we wzorze III) i wynoszącą 2 mole dla uzyskania 50% skympleksoobnia przy obu aromatycznych grupach we wzorze III.

170 591

100

4.0 <* _ '— -cT

LU c O o ζ;

+ί ° ch >i u i c >

O r’4 N O U co N 92 w o α CL N O « •m Φ £ 5 E M '— SO LU e ^s

S 3 >,§ W 1 fd · e

o xn o o

Q

LU

O <

CU

2.0

1.0

Czas, godziny fermentacji

E >- e

-pco iE o|

E=^q

IU fxj

Oznaczenie antybiotyku (Średnica strefy w mm)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, zawierającej lipofilowy antybiotyk oligosacharydowy o wzorze III do leczenia lub zapobiegania zakażeniom bakteriami gramododatnimi lub gramoujemnymi u zwierząt, znamienny tym, że dodaje się związek o wzorze III:

do wodnego roztworu N-metyloglukaminy i 2-hydroksypropyloX-cyklodekstryny (HPe CD), zawierający 2-15 grup hydroksypropylowych na mol HP/iCD, w stosunku molowym 1:3:5, do otrzymania pierwszego homogenicznego roztworu, następnie do tak otrzymanego homogenicznego roztworu dodaje się mannitol i mono-9-oktadekanian poli(oksy-1,2-etyleno)sorbitanu (Tween) tak, aby wytworzyć drugi homogeniczny roztwór o zawartości 18,1% wagowych mannitolu i 0,36% wagowych Tweenu, w odniesieniu do ciężaru podstawowej kompozycji, po czym drugi homogeniczny roztwór poddaje się filtrowaniu do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowej kompozycji zawierającej lipofilowy antybiotyk oligosacharydowy do leczenia i/lub zapobiegania zakażeniom bakteiyjnym u zwierząt, a zwłaszcza u ssaków, włączając w to człowieka.

Lipofilowe antybiotyki oligosacharydowe obejmujące, na przykład, eweminomycyny, kuramycyny, awilamycyny i flambamycyny, należą do rodziny antybiotyków ortosomocynowych, które zawierają co najmniej jeden kwasowy wodór fenolowy i dwa wiązania ortoestrowe przyłączone do reszt węglowodanowych. Patrz, na przykład: A.K. Ganguly w Kirk-Othmer, Encyklopedia of Chemical Technology, (1978), tom 2, strony 205-209, wyd, trzecie, John Wiley and Sons, oraz W.D. Ollis i in., Tetrahedron (1979), tom 35, strony 105-127. Te lipofilowe antybiotyki oligosacharydowe wykazują szeroki zakres aktywności biologicznej skierowanej przeciw bakteriom gramododatnim i pewnym bakteriom gramoujemnym w rozmaitych badaniach in vitro, oraz aktywność in vivo w badaniach na modelach zwierzęcych, takich jak myszy, ale jak dotychczas nie był dostępny żaden farmaceutycznie dopuszczalny preparat tego rodzaju antybiotyków przydatnych do stosowania in vivo. Obserwuje się, że wstrzyknięcie tych lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych powoduje wystąpienie zespołu szkodliwej reakcji ubocznej. Termin zespół szkodliwej reakcji ubocznej stosowany w niniejszym opisie oznacza zaistnienie objawów następującego typu, zaobserwowanych u zwierząt takich jak myszy w następstwie pozajelitowego podania lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych: brak koordynacji ruchów, ataksja, układanie się na boku, moczenie, sztywność tylnych nóg, oddychanie mozolne i zatrzymanie akcji serca. Tak więc, podsumowując, nie są znane żadne farmaceutycznie dopuszczalne kompozycje tych lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych nadające się do bezpiecznego i skutecznego stosowania tych silnie działających antybiotyków u zwierząt, włączając w to ssaki, w tym także człowieka.

Cyklodekstryny są to modyfikowane skrobie utworzone z jednostek glukopiranozy. Obejmują one α-cyklodekstrynę złożoną z sześciu jednostek glukopiranozy, β-cyklodekstrynę złożoną z siedmiu jednostek glukopiranozy i y-cyklodekstrynę, złożoną z ośmiu jednostek glukopiranozy. Te α-, β- i y-cyktodekstryny oraz ich pochodne mają wewnętrzną. powierzchnię lub wnękę o charakterze lipofilowym i powierzchnię zewnętrzną, która jest hydrofilowa. Ta kombinacja hydrofobowej wnęki z hydrofitową powierzchnią zewnętrzną doprowadziła do wykorzystania cyklodekstryn i ich pochodnych do cząsteczkowego skompleksowania lub otorbienia licznych hydrofobowych i/lub nietrwałych leków o stosownych rozmiarach cząsteczki, dzięki czemu zostaje polepszona rozpuszczalność, stabilność i dostępność biologiczna leków tego rodzaju. Pochodne α-, β - i y-cyktodekstryn, na przykład hydroksypropylo-β-cyklodekstryny ujawnił Jozsef Szejtli w Pharmaceutical Technology, czerwiec 1991, 36-40.

Kompleksy α-, β - i y-cyklodekstryn, ich mieszaniny i pochodne, ujawnił, na przykład N. Bodor w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4983586. Bodor w opisie tym ujawnia sposób ograniczenia zachodzenia wytrącania się lipofilowego, lub nietrwałego w środowisku wodnym, leku, zdarzającego się w miejscu wstrzyknięcia lub w jego pobliżu i/lub w płucach w następstwie podania pozajelitowego. Sposób ten polega na pozajelitowym podaniu wspomnianego leku w roztworze wodnym zawierającym dużą ilość, to znaczy 20 do około 50% wg hydroksypropylo-β-cyklodekstryny.

Jozsef Pitha w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4727064 i The International J. of Pharmaceutics (1986) 22, 73-82 ujawnia użycie skoncentrowanego, to znaczy 40-60% wag, wodnego roztworu hydroksypropylo-β-cyklodekstryny do roztwarzania rozmaitych leków, takich jak paracetamol, steroidy płciowe, glikozydy nasercowe, takie jak digoksyna, jak również kwasu retinowego i jego kwaśnych soli. Patrz także: Pitha w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4596795, który ujawnia podawanie hormonów płciowych, testosteronu, progesteronu i estradiolu, w postaci kompleksów z poli-β-cyklodekstryną lub hydroksypropylo-β-cyklodekstryną.

W opisach Bodora i Pithy brak jest jakichkolwiek odniesień do fenoli lub lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych.

Janssen Pharmaceutica N.V. International Patent Application No. PCT/EP84/00417, opublikowane pod International Publication No. WO 85/02767 dnia 4 lipca 1985, ujawnia kompozycje farmaceutyczne zawierające kompleksy leków, które są nietrwałe

170 591 lub jedynie trudno rozpuszczalne w wodzie z częściowo zeterowaną β-cyklodekstryną (β-CD) o wzorze (S-CD)-OR, w którym R oznacza grupę hydroksyetylową, hydroksypropylową, dihydroksypropylową, a część ugrupowania o symbolu R mogą ewentualnie stanowić grupy alkilowe, zwłaszcza grupa metylowa lub etylowa.

W przypadku, gdy cząsteczka leku zawiera grupy zasadowe lub kwasowe, które można by ewentualnie wykorzystać do zwiększenia rozpuszczalności w wodzie za pomocą utworzenia soli, Janssen International Publication No. wo 85/02767 wskazuje, że utworzenie soli prowadzi w rezultacie do obniżenia skuteczności lub naruszenia stabilności chemicznej. Otrzymywanie soli w celu roztworzenia słabo rozpuszczalnych w wodzie związków o charakterze kwaśnym i zasadowym jest więc w tym przypadku niekorzystne. Nie ma tam ujawnienia dotyczącego lipofilowych antybiotyków oligosacharydowych lub kompozycji otrzymanych sposobem według niniejszego wynalazku.

W publikacji WO 8702366 ujawniono pewne antybiotyki oligosacharyciowe o strukturze zbliżonej do oligosacharydów o wzorze III, stosowanych w sposobie według wynalazku. Jednakże ogólne wzory I i II przedstawione na stronach 2 i 3 powyższej publikacji WO 8702366 dotyczą związkowi, w których Ri oznacza grupę nitrozową lub aminową, a nie grupę nitrową, obecną w poniższym wzorze III. W związku z tym w publikacji tej nie ujawniono związków stosowanych w sposobie według wynalazku.

Rozmaite szczepy bakterii, takie jak gramododatnie ziarniaki, na przykład paciorkowce i enterokoki, jak również gronkowce oporne na metycylinę i wrażliwe na metycylinę, stały się oporne na antybiotyki dostępne w handlu, takie jak na przykład wankomycyna.

Tak więc, istnieje zapotrzebowanie na farmaceutycznie dopuszczalne kompozycje przeznaczone do leczenia zakażeń bakteryjnych, włączając w to gronkowce oporne na metycylinę i wrażliwe na metycylinę oraz bakterie oporne na wankomycynę. Istnieje także zapotrzebowanie na farmaceutycznie dopuszczalne kompozycje zawierające lipofilowy antybiotyk oligosacharydowy wykazujący aktywność skierowaną przeciw zakażeniom wrażliwymi bakteriami gramdodatnimi i gramujemnymi w szerokim zakresie, a zwłaszcza na preparaty farmaceutyczne przystosowane do podawania pozajelitowego z uniknięciem wystąpienia zespołu szkodliwej reakcji ubocznej.