PL164207B1 - Sposób hamowania agregacji zwierzecej somatotropiny rekombinowanej PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. SPOSÓB HAM OW ANIA AGREGACJI ZWIERZECEJ SO M ATO TRO P IN Y REKOM BINOW ANEJ, ZNAMIENNY TYM , ZE ZASTEPUJE SIE CO NAJM NIEJ JED N A DO WSZYSTKICH CZTERECH CYSTERNOWYCH RESZT AM INOKW ASO- WYCH ZWIERZECEJ SO M ATO TRO P IN Y REKOM BINOW ANEJ RESZTAM I AM INOKW ASOW YM I NIE ZALEZNIE W YBRANYM I SPOSRÓD ARGININY, LIZYNY, KWASU ASPARAGINOW EGO, KWASU GLUTAM INOW EGO, ASP ARA- GINY, GLUTAM INY, HISTYDYNY, ALANINY, GLICYNY, IZOLEUCYNY, LEUCYNY, WALINY, FENYLOALANINY, TRY P TO - FAN U , TYROZYNY, M ETIONINY, SERYNY, TREONINY LUB PROLINY. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiby rekombinowazej.

Zgodnie z wynalazkiem w zwierzęcych somatotropinach rekombinowanych, co najmniej jedna z czterech cysteinowych reszt aminokwasowych została zastąpiona innymi resztami aminokwasow/ymi

Aczkolwiek przystąpiono do produkcji i kontynuuje się wytwarzanie somatotropin na drodze rekombinacji, często występują trudności przy formułowaniu tych somatotropin w celu efektywnego podawania zwierzęciu.

W przeciwieństwie do samototropin będących wynikiem ekspresji, zamiana reszt cysteinowych, z których cztery znajdują się w somatotropinach przez podstawienie innym aminokwasem, daje w wyniku związki biologicznie czynne o zwiększonej stabilności do formułowania w dozwolony sposób w celu podawania zwierzętom.

Okazało się, ze możliwe jest zapewnienie nowych somatotropm zwierzęcych, w których co najmniej jedna spośród reszt cysternowych somatotropmy zastąpiona została innym aminokwasem, a także zastępowanie dwu, trzech lub wszystkich czterech spośród tych reszt cysternowych somatotropin zwierzęcych i zapewnienie odpowiadających im nowych związków. Dwie cysteiny znajdują się w małej pętli i dwie w dużej pętli.

Jest możliwe również zapewnienie środków zawierających wspomniane somatotropinę zwierzęce, w których nastąpiło zastąpienie (zmodyfikowanie), które są biologicznie czynne i jeszcze ciągle stabilne pod względem podawania i zapewnienie środków zawierających biologicznie czynne zwierzęce somatotropiny ^kombinowane, odpowiednie do podawania pozajelitowego, obejmujące zwierzęcą somatotropinę ^kombinowaną, zmodyfikowaną lubjej farmaceutycznie i farmakologicznie dozwoloną sól, w ilości sprzyjającej wzrostowi, w farmaceutycznie lub farmakologicznie dozwolonym nośniku stałym lub płynnym, przy czym szybkość wzrostu zwierzęcia zostaje zwiększona w ciągu wydłużonego okresu czasu, pięciu lub więcej dni.

W nowych zmodyfikowanych podstawieniem zwierzęcych somatotropinach ^kombinowanych, jedna do czterech cysteinowych reszt ammokwasowech tych somatotropm zostały zastąpione jedną do czterech reszt ammokwasowech, osobno wybranych spośród aminokwasów takich jak argi^na, lizyna, kwas asparaginowe, kwas glutaminowy, asparagina, glutamina, histyCeba, alanina, glicyna, izoleucyna, leucena, walina, febyloalabiba, tryptofan, tyrozyna, metionina, seryna, ^eonina lub prolina, albo w których wszystkie cztery cysteiny przeprowadzone zostały w kwas cysteinowe, albo w których obie cysteiny w małej pętli lub obie cysteiny w dużej pętli, lub wszystkie cztery cysteiny w obu tych pętlach zostały przeprowadzone z wykorzystaniem podstawników takich jak (CH2COOH), [CH(CO2H) (CH2)xCO2H], (CH2CONR3R4), (R5), [(C^nSOa], (CHCH2CONR3CO), (CH2)mNR3R4, (CH2OCOCH2R5) lub (SRe), w których to wzorach R3 i R4 każdy oznacza H, [(CH2)xCO2H], [CH(CO2H) (CH2)xCO2H], C1-C6-alkil ewentualnie podstawiony 0-2 grupami hydroksylowymi, względnie glikolpolietylenowy, Rs oznacza C1-C6-alkil lub C1-C6-alkil lub C1-C4-alkoksymetyl i R6 oznacza C1-C6-alkil, glikol polietylenowy lub fenyl ewentualnie podstawiony jedną lub dwiema grupami kwasu karboksylowego lub kwasu sulfonowego, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 4, m oznacza liczbę całkowitą od 2 do 4, a x oznacza liczbę całkowitą od l do 3, z tym, że gdy cysteinowe reszty aminokwasowe wspomnianych zwierzęcych somatotropin rekombinowanych zostają przeprowadzone w pochodną, obie reszty cysteinowe w małej pętli, lub obie reszty cysteinowe w dużej pętli danej somatotropiny zostają podstawione tą samą grupą, a również z tym, że podstawniki reszt cysternowych w małej pętli (labilnej i najblizszej C-końca) mogą być takie same lub różniące się od podstawników cystein w dużej pętli (stabilnej i blizszej N-końca) oraz dalej z tym, że gdy jedna cysternowa reszta aminokwasowa jest utleniona do kwasu cysternowego, wszytskie takie reszty cysteinowe w danej somatotropinie są utleniane do kwasu cysteinowego.

Wynalazek dotyczy sposobu hamowania agregacji zwierzęcych somatotropin rekombinowanych polegającego na podstawieniu jednej lub więcej niż jednej cysteinowej reszty amionokwasowej umiejscowionej w pozycji 55, 166, 183 lub 191 zwierzęcej somatotropiny rekombinowanych argininą, lizyną, kwasem asparaginowym, kwasem glutaminowym, asparaginą, glutaminą, histydyną, alaniną, glicyną, izoleucyną, waliną, fenyloalaniną, tryptofanem, tyrozyną, metioniną, seryną, treoniną lub proliną.

Inny sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej polega na utlenianiu wszystkich czterech ze wspomnianych reszt cysternowych do kwasu cysternowego lub na redukcji co najmniej jednego z dwóch mostków disulfidowych między cysteinowymi resztami aminokwasowymi w pozycjach między 55 a 166 oraz 183 a 193 wspomnianych somatotropin zredukowanego mostka lub mostków w pozycjach między 55 a 166 i/lub 183 a 191 wspomnianych somatotropin i przeprowadzeniu dzięki temu w pochodną każdej z cystein zredukowanego mostka lub mostków w pozycjach między 55 a 166 i/lub 183 a 191 z wykorzystaniem tej samej pochodnej, z tym, że pochodne cystein w pozycjach 55 i 166 mogą być utworzone z wykorzystaniem podstawników takich samych lub różniących się od podstawników cystein w pozycjach 183 i 191. Do podstawników stosowanych w otrzymaniu nowych, przeprowadzonych w pochodne zwierzęcych somatotropin rekombinowanych, somatotropin wytwarzanych sposobem według wynalazku należą podstawniki takie, jak (CH3COOH), /CH(CO₂HXCH2)«eO₂H/, (CH 2 CONR 3 R 4), (R5), /(CH3)nSO3/, NR3R4, (SRs), (CHCH₂CONR3CO), (Cfy)™ lub (CH3OCOH3R5), w których to wzorach R 3 i R4 każdy oznacza H, [(CH3)_XCO3H], [CH(CO3H)(CH3)xCO3H], C1-6-alkil ewentualnie podstawiony 0-2 grupami hydroksylowymi lub glikol polietylenowy, R 5 oznacza C1-6-alkil lub C1-4-alkoksymetyl, R6 oznacza C1 -6-alkil, glikol polietylenowy lub fenyl ewentualnie podstawiony jedną lub dwiema grupami kwasu karboksylowego lub kwasu sulfonowego, n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 4, a m oznacza liczbę całkowitą od 2 do 4 i x oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3.

W sposobie według wynalazku korzystnymi nowymi somatotropinami zwierzęcymi są rekombinantowe somatotropiny: świńska, bydlęca, owcza, ludzka i ptasia, w których mostek disulfidowy w małej pętli somatotropiny został zredukowany i cysteiny w pozycjach 183 i 191 przeprowadzone w pochodne z wykorzystaniem podstawników takich jak (C^COOH), [C^^HKC^K^H], (CH2CONR3R4), (Rs), (CH2)nSO3 lub (SRa), w których to wzorach R3, R4, R5, R6, n 1 x mają wyżej podane znaczenie.

Korzystnymi nowymi somatotropinami są także takie, w których cysteiny zostały usunięte (od jednej do wszystkich czterech).

Wszystkie z plazmidów, sekwencje DNA i drobnoustroje zdeponowane w związku w niniejszym zgłoszeniem patentowym, z wyjątkiem tych, które w przeciwieństwie do wspomnianych zostały wyszczególnione, są zdeponowane w muzeum szczepów American Cyanamid Company utrzymywanej w Princeton, New Jersey, oraz w American Type Culture Collection (ATCC) w Rockville, Maryland 20952, USA.

Figura 1. Klonowanie świńskiego genu somatotropiny do M13mpll. RF DNA M 13mpll przecina się enzymami restrykcyjnymi ECoRI i HindIII i poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia. Ekspresyjny plazmid pEFF-902 trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll. Odpowiednie fragmenty oczyszcza się po elektroforezie w 1% żelu agarozowym. Liguje się je i transformuje nimi E. coli JM101. Przedstawiona jest struktura powstałego RF DNA M i 3mpl IpST.

Figura 4 Jest to schematyczne przedstawienie schematu mutagenezy z użyciem oligonukleotvdu AA1 i jednoniciowego DNA M13mpllpST.

Figura 3. Analiza sekwencji DNA dotycząca jednoniciowego DNA M13mpllST i jednoniciowego DNA M13mpllpST34 metodą dideoksy-zakończenia łańcucha Sangera. Porządek ścieżek od lewej do prawej: GATC somatotropiny świńskiej (pST) typu dzikiego, następnie GATC mutanta pSTA34.

Figura 2 Schematyczne przedstawienie schematów mutagenezy z użyciem oligonukleotydów GLU3 i GLU4 oraz jednoniciowego DNA M13mpl IpST.

Figura 5. Schematyczne przedstawienie konstrukcji bakteryjnego wektora ekspresyjnego zawierającego zmutowany gen pST. Plazmidy nadają oporność na antybiotyk ampicylinę (amp^R).

Korzystne zwierzęce somatotropiny rekombinantowe przedstawione są poniżej, ale wytwarza się też somatotropiny bez dodatkowych Asp-Gln dodatkowych podstawień względnie z innymi podstawieniami, otrzymywane na drodze rekombinacji. Dalsze somatotropiny zwierzęce z usunięciami odbijającymi się na długości łańcucha aminokwasów, uzupełnieniami odbijającymi się na długości łańcucha aminokwasów, zastąpieniami aminokwasów (poza cysteinami), fragmenty zawierające część czynną itp. znajdują się w zakresie wynalazku. Numerowanie reszt aminokwasowych w mniejszym opisie odnosi się do analogów Met-Asp-Gln, ale jest zmienione, aby umożliwić fachowcom zidentyfikowanie mostków disulfidowych utworzonych przez cztery reszty cysternowe, świńska eoaaootropina rekombioaatwa H-Met-Asp-Gln-Rie-Pro-Aa-Met-Po-Leu- Ser-SerI<u-Phe-Ala-Asn-Ala-YsaL-Loi-ATS-.Ala~Gln-H. s-LeuHi s-Gln-Leu-Ala-ALa-Ajp- -Eir- lyr-Łye-Glu-Pb e- GluIrg-ALa- Ty-H a-Pro-Glu-Gly- Gln-Ag- lyr- Ser- Ue55

Gln-As n-ALa-Gln- Ala- Ala^-^Ihe-^R2-Hi <e- Ser- Gilu- ThrIl e-Pno-M.a-Pro-IŁr-Gly-Lye-Asp- Glu-Ala- Gln-Gl»Arg-Ser-AIpYal-Glu-le'u-Leu-Ar^,g-Hl«eSeΓ“Ilgu-Le!ULeu-I.le-Glbl-SιM--Tη--L»e^-Gly'-Pxo-VίdL-Gln-Rϊe-Iie^lSer-Arg-Yedl-Ph e- Tli—Asn-S er-Leu-Vaa.-Hie-Hy“Tir“ S er-Asp-Ag-Yaa- Tyrolu-Łys-Leu-Lys-Aep-Xeu- GluGlu-Gly-IlLe-G:i.n-Ala-Leitt-Met-.Arg-Glu-Leu-Glu-A«pHy-Ser^,*-pΓO'-Arg'-ALa-Hy- Gla-ILL^-L^eί^-Iyβ-GLn— SBr3yr-AapLys—Ph e-Asp-ThrAsn-Lett-Arg-Sar-ABjp-JAp—

166

164 207

ALa-Iieu-Łwi-Lye-Aett-Tar-Gly-Leu-Leu-SejR^a-Pk·’’

Ly^Liyi—As^-LLeu—HI s—Lys— A.ia- Glu- Bu—· Tyi—•Leu.—Arg— 183 191

Val-Het-*Iye-Ri-Arg-Aig*nie-Val-GluuSeer-aer-Ii_a···

ALi—Phs-CH.

Bydlęoi somitotropini rekombinintowi H’M^et-A3p-Gla»5he>Pr9-ALi-M©1>*Sei-lQU-Ser“GLLyLeu-She-Ali-Aea- ALi-Yal-Leu- Arg—Ali— Gln-HA s-Leo— His- GŁn-LefU—ALi—ALi-Asp— £hr— Ph e—Lys—GLto^e JŁe—GXe^— Aeg-2hr-IyT-ILLe>-Pxo>-Gla-Gly-Gln«-A?g--Ty*-ee“3ILe55

Gla-Asn-Thr-Gln-Yal-Ala-Ih e-Rg-Ife e-Ser-Gln- ThrII $—PXo—-Ala—-JXo>-Thjr-Gly— Lys—Asn—Glu—Ali—Gin—Gin—

Lys-Ser—Asp—Leu— Glu-Lseu-Lsu-Arg-I L e-“Sβx-Lett-LβuLeu-Ile-Gln-SeΓ-TΓp-Leu—uly-PΓo-Leu-tfln-?he-LeuSer-Arg-Val-Fhe-Thr-Asn-Ser-Leu-Yal-Phe-Gly-ThrSar-Asp-krg - Val- Tyr-Glu-Lye-Leu-lys-A βρ-leu-ll-Glu-Gly-HLe—Leu—Ala-L eu-M et—Axg-Glu-L eu-GL.u-AspGly- IL·x^-?xo>-A.χ·g—All—Gly--G]JQ-Il e-leu-Lye—Gln-Eirtyx—Alp-Lys-flhe-Asp-ΠlX-·Asn-Met-Arg-Sex:—Asp-Aep166

ALi—Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Rgi—PheArg—Lys-Asp—L eu-HLs^Lys— Thr^Glu—Thr— Tyi—L eu—Axg—

183 191

Yal—Me t-Lys-H^-Arg—Axg-Ih e-Gly—Glu·—ALi— ALi-Phe-GH.

(Owsza somiotropini rekombLLnmtowi H-Met-Asp-Gln-ϊhe-Pro-ALl-Met-Ser-Leu— Ser— GlyL6U-Hle-Ala-Aεa-All-Yal-Leu-Arg-ALl-Glln·Hiβ-LetlHi8-Gln“Leu—Ala-Ala-ABp-Tllr-Fhe-Lys—Glu-Phe-GLLu6

164 207

Arg- Thr- Tyr-¹1 e- Pro- Glu- G1 y- Gin- Arg- Tyr- S e r-11 e55

Gln-Asn- Thr- Gln-Y al—Ala-Fh e-Ser-Glu- ThrIle-Pro-Ala-Pro-Bir-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Glnlys-Ser-Asp-Len-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Ieu-IieuLeu-Il o-Gln- Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Ri e—Leu— Ser-Arg- V al-Ph e-Thr—Asn- S er-1eu-V al-Hi e-Gly- ThrS ar-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-L eu-lys- Aap-Leu- GluGlu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu- AspV al- Dir-Pro -Arg-Ala-Gly- Gin- II e-Leu-Iy s- Gin- On— Tyr-Asp-Iy s-Ph β-Asp- Thr- Asn-M e t- Arg-S ex> Asp-Aap166

Ala-leu-Leu-lys-Asn-Tyr-Gly-Lefu-leu-Ser-I^a”^¹· Arg-lya-Aap-Leu-Hi s-ly e-Thr-Glu- Thr-Tyr-leu-Arg183 191

Yal-Met-Iys-Χ^-Arg-Arg-Hi e-Gly-Glu-Al&-Ser-1^ _aAla-Phe-CH.

Kodaka somatotropina rekombinantowa H-Met-Asp-Gln-Ibs-Pro-Ala-Met-Pro-Lea-Ser-SerIau-IŁ®-Ala-Aen-Ala-Yal-leu-Arg-Al&-01n-Hie-leeHia-Gla-Ieu-Ala-Ala-Aep-Thr-Tyr-lya-Glu-ltoe-GluArg-A2a-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Hi e-Rg-Ph a-Sar-Glu- 2hrXle-Pro»Ala-Pro-Thr-Gly-lya-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Aap-Met-Glu-leu-leu-Arg-Phe-Ser-leu-leuleu-Ile-Gla-Sar-Irp-leu-Gly-Pro-Yal-Gln-leu-leuSer-Arg-Yal-Hi^-Thr-Aan-Ser-leu-Val-Hie-Gly-IłxrSer-Asp-Arg-Yal-Tyr-Glu-Lya-Lea-Arg-Asp-Iłsu-GlnGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-leu-Met-Arg-Glu-lett-Glu-Aap164 207

Gly-Sei^-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lye-Olii-ThrTyr- Aap-Łye-Hi ®~Aep-IłLP~Aaii-lea-Arg-SeT“Aap-Aap166

Ala-leu-Leu-Iiye-AaiirTy^Oly-Leł-Łeu-Ser-Bga’'®¹·

Ły8»ly8~Asp~Leu-Hla~Ły8~Ala-£Ln~Ttu> fyr-Lea-Λχφ185 191

Yal-M9t-Iys-Bj-A?g-Affg«\She-Val-Qltt-Ser-5er-Mj_aAla-Hie-GH.

ludzka aomatotropina rekomhinantowa H-Met-Aap-Gln-Phe-Pro-Thjp-Il^Pro-Łeu-Sep-Argleu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leaflie-0lB-I®tt»Ala»rhe-Afip»Eir-Ty2>Gln-Gltt-Hxe-»01oGlu-Ala-Tyr-Ile—Pro-Lye-Giu-G-ln-lye-Tyr-Ser-Ph·56

Ii@a-»GlB-Aajł<-Pro-GliV“Sup-Sei*-Leu-R2“^^le“Ser-GlxłSer“Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Aen-Arg-Glu-Glu-33ir~GlitGln-Lys-Sar-Asn-Leu-Glu-Iiau-Len-Arg-IIe-Ser-LeuLeu-leu-Ile-Gln-Sep-Trp-Leu-Glu-Pro-Yal-Gln-Hi®Łeu-Axg-8ej>V al-The-Ala-Asa-Ser-leu-T al-Tyr-GlyAla-Ser-ABP“Ser-Aen-Val-Tyr-Asp-I»eu-Leu-Łya-AzpLeu-Gln-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-LeuGlu-Aap-Gljp-S er-Pro-Arg-Ihr-Gly-Gln-Il β-Ih e-IyaGln-Bir^-Tyr-Ser-Łye-Hi fr-Asp-Oir-AsB-Ser-Hle-Afla· lap-Aap-Ala-Lett-Leu-LyB-Aan-Tyr-Gly-Iieu-Leu-Tyr167

X2_aHi e-Arg-ly β-A βρ-Mat- Αερ-Lya- V al-Gltt- Sur- Hi e184

Łea-Arg-Ile-Yal-Gla-l^-Arg^Ser^-yal-Gla-Gly^SeT'191

M^_a-Gly-Hxe-Ca.

Ptasia somtotropina ze&ombinantcwa H-Met-Aap-Gn-Ele-Pro- Ala-Met-Pro-Leu-S er-AsnLeu-Phe-Ala-Aan-ALa-Val~I>eu-Axg-ALa-Gluł-Hle-I»ettH.s-Leu-^lieu-Al.a-ALa-- Gin- Tur- Tyr-Iye-Glu-^Ph e-GluApg- Tir- Tyr-U ^loo-Glu-Asp-GlnA Ag-- Ąn-- Du— Asa55 lys-Asrn-S er-Gln-A.a-A.a- Tyi—^-El e-Ser-Glu- TupIl«-”Irro-A&-»Ps?<O“Tlr-Gly-Iys-Asp-Aflp-Ά8P-Glln-G3LnIy©··Sex-Asp-Met-&GLyleullαl-.A[rg-Rl<e-Sαr-I«l8-Yltlleu-Ile-Gln-Ser-Trp-Ietu-Tu—Pro-^al-Gla-Typ-IeuS er-Iys-V al-Ph e- Tir-A sn-Asn-I eu^saL-Phe-Gly- Thr8er-Asp-AΓg-V8l-Phe-GΓl-Iya-Isl-Iyst-Asp-Ieu-Gl^lGl^-Gl.LyIle-Gln-ALa-Ieu-Met-^,Arg-Gll-Ieu-Glu-A8pAeϊgS0XP--Epo-Ag-GlyyP:ro-GGLnIιeu-lel-Aϊ^,lg-PΓO-BlrTnr-Aep-Iye-Ph «e-Aejplle-Hi s- Ieu- Arg-Asn-Glu-As p166

ALa-Ieu-Ieu-IyisAssn-TrrGly-Ijiuuli

Iys-Iys-ABp-Ieu-H-is-Iys-V8.1-Glu-Tlr-ϊyτ-Iel-IyB191

Val-Met-I»ye-RlIArg-Afg-Elle-GlyIGlu-SβIIAsn-8l_aTur-He-CH· przy czym symbole R1, Rn, R 2 i R2b odnoszące się do tych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych każdy, niezależnie, oznacza resztę aminokwasową, taką jak reszta argininy, lizyny, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, asparaginy, glutaminy, histydyny, alaniny, glicyny, izoleucyny, leucyny, waliny, fenyloalaniny, tryptofanu, tyrozyny, metioniny, seryny, treonmy, proliny lub cysteiny, z tym, że co najmniej jedna z tych reszt aminokwasowych przedstawionych symbolami R1, Rn, R2 1 R2b w powyżej zilustrowanych somatotropinach oznacza resztę aminowokwasową inną niż cysteiny.

Specjalnie korzystnymi zmodyfikowanymi zwierzęcymi Bom8totropin8mi rekombinantowymi są te, w których jeden lub oba podstawniki o symbolach R11 Rn w pozycjach somatotropiny 183 i 191, lub w pozycjach 184 i 191 ludzkiej somatotropiny rekombinantowej oznaczają aminokwas inny niż cysteina.

Wytwarzanie wyżej wspomnianych zmodyfikowanych (podstawionych) zwierzęcych somatotropin rekombinantowych przeprowadza się z zastosowaniem mutagenezy ukierunkowanej. Obecnie używane techniki zmieniania sekwencji DNA klonowanego segmentu DNA w specyficznie zdefiniowanym miejscu wymagają wytworzenia jednoniciowej postaci tego DNA. Jednoniciowy DNA łączy się z syntetycznym oligonukleotydem, który jest komplementarny z jego częścią,

164 207 z tym wyjątkiem, że nllgonuklentod zawiera w sobie region błędnego parowania, zazwyczaj umiejscnwingo w środkowej części tego nllgnguklentodu. Połączoną mieszaninę czyni się następnie dwuniciową i kowalencyjnie zamkniętą w wyniku dodania dużego fragmentu pnlimejazy DNA I E. coli i trlfosfnragów denksyguklentydów w obecności ligazy DNA T4 i 5'-tjifnsfnragu adenozyny. Dwunlclnwom DNA transformuje się następnie odpowiedni szczep E. coli, w którym region DNA błędnego sparowania ulega naprawie i replikacji. Otrzymuje się dwie populacje klonów.

W zalezności od tego, która nić zostanie wybrana jako matryca, do syntezy naprawczej, klon zawiera sekwencję albo typu dzikiego, albo zmienioną (zmutowaną). Klony, które zawierają sekwencją zmutowaną, to jest taką, która odpowiada sekwencji nllgngukleotydu, selekcjonuje się na drodze hybrydyzacji z promlenlntwórczn znakowanym nllgnguklentodem. W zalezności od błędnego sparowania między olignguklentodem, a sekwencją typu dzikiego, prnmlegintwórczn znakowany nligogukleotod zostaje bardziej stablinie związany z klonami, które zawierają zmutowaną sekwencję. Tak więc, inkubacja w odpowiedniej temperaturze różnicuje klony typu dzikiego i zmutowane. Zmiany w zidentyfikowanych klonach potwierdza się następnie za pomocą sekwenciogowagla DNA odpowiednich regionów. W następującym dalej omówieniu wybiera się świńską somatotroplgę rekombigagtnwą jako reprezentatywną dla zmodyfikowanych lub przeprowadzogoch w pochodną snmatotjnplg zwierzęcych i metod stosowanych w celu jej otrzymywania.

Klonowanie świńskiego genu tnmatotrnplgy (rpST) do tworzącego pojedynczą nić wektora, bakteriofaga M13mpl 1 (ATCC) osiąga się następującym ogólnym sposobem postępowania przedstawionym na figurze 1.

Fragment DNA zawierający świński gen snmatntjopino (rpST) wyodrębnia się z bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pEFF-902 (ATCC) za pomocą rozszczepienia enzymami restrykcyjnymi EcoRI oraz Hindlll. Fragment zawierający gen rpST oczyszcza się następnie za pomocą elektroforezy w żelu aga^^wym. Replikatywną postać (RF) DNA M13mpl 1 trawi się następnie EcoRI i Hindlll, poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia i oczyszcza duzy fragment za pomocą elektroforezy w zelu agaroznwym Następnie dwa oczyszczone fragmenty miesza się razem i liguje ligazą DNA T4. Mieszaninę transformuje się E. coli JM 101 (ATCC) i kilka utworzonych lysinek poddaje hodowli. Repllkatowną postać (RF) DNA otrzymuje się standardową metodą alkalicznej lizy i ustala strukturę trawieniem odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Wyodrębnia się klon zawierający oczekiwane fragmenty i oznacza go M13mpl IpST (ATCC). Do potwierdzenia identyczności klonu stosuje się analizę sekwencji DNA.

Mutagenezę genu rpST w M13mpl IpST osiąga się następnie tak, jak to npisago poniżej i przedstawiono w zarysie na figurze 2. Celem programu mutagenny jest wytworzenie cząsteczki rpST niezdolnej do utworzenia wiązania dltulfϊdowego małej pętli, wiązania disulfidowego dużej pętli lub obydwóch za pomocą podstawienia odpowiednich reszt costeignwoch innymi aminokwasami. Wiązanie disulfidowe dużej pętli jest umiejscowione między cysteinami w pozycjach 55 i 166 w genie rpST. Wiązanie disulfidowe małej pętli znajduje się między cysteinami umiejscowionymi przy 183 i 191. Sposób numerowania jest taki jak nplsagn. Używa się dwóch zasadniczych protokołów do otrzymywania żądanych mutantów i przykłady każdego z nich są opisane w dalszej części niniejszego opisu.

W pierwszym sposobie, podstawienia cystein w wiązaniu disulfldnwom małej pętli dokonuje się przy użyciu długiego syntetycznego ollgoguklentodu. W sposobie tym stosuje się oligonukleotyd oznaczony AA1 o następującej sekwencji: 5' GCT ATG A AG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'. Zmienia to sekwencję genu pST tak, ze kodon cysteiny w pozycji 183 przeprowadza się zTGT do GCG kodującego alaninę i kodon cysteiny w pozycji 191 przeprowadza się w TGT do GCT, również kodującego alaninę. Tak więc, cysteiny w małej pętli obie zostają przeprowadzone w alaninę. Jedgonlciowo DNA M13mpl IpST otrzymuje się z oczyszczonego faga według standardowego protokołu. Ogólny zarys sposobu mutagenezy jest przedstawiony na figurze 4. 1000ng jedgollcleglowegn DNa M13mpl IpST miesza się z 50ng oligogukleotydu AA1, który uprzednio został 5'-fosfojylnwagy z użyciem 5'-trifnsforanu adenozyny i kinazy poliguklentydnwej. Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 7 minut, a następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut. W ten sposób łączy się oligonukleotyd z jedgoglcinwym DNA.

Następnie połączony DNA przeprowadza się w postać dwumciową, kowalencyjnie zamkniętą, dodaniem ATP, dNTP (mieszanina czterech 5'-trifosforanów deoksyreeobukleotydów), Iigazy DNA T4 i dużego fragmentu polimerazy DNA 1. Mieszaninę inkubuje się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej Następnie transformuje się mą E. coli JM101 standardową metodą z chlorkiem wapniowym Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C, na murawie JM 101 widoczne są łysinki Przenosi się je na filtry nitrocelulozowe i poddaje hybrydyzacji zwykłymi metodami. Drugiego ohgozukleotyCu oznaczonego AA ID używa się do wykrycia mutantów. AA ID ma sekwencję następującą. 5' CATG AAG GCG CGC CGC TT 3'. Znakuje się go promieniotwórczo na końcu 5' z użyciem [y-³²p]-ATP i kinazy polinukleotyCoweJ Hybrydyzację prowadzi się przez całą noc w temperaturze 37°C w 5 X SSC (1 X SSC stanowi 0,15M chlorek sodowy, 0,15M cytrynian sodowy pH 7,0), 1 X roztworze Denhardta (0,02% wag/obj Ficoll, 0,02% wag/obj bydlęca albumina surowicza, 0,02% poliwibelopiroliCon), 150 ml tRNA po hybrydyzacji. Filtry przemywa się stosując kolejno 5XSSC w temperaturze 4°C, TAC (TAC stanowi 3M chlorek tetrametyloamomowy), 50 mM tπs(hydroksymetelo)amizometan pH 8,0, 1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowe), 0,1% wag/obj siarczan doCecelo-soCowy w temperaturze 37°C i ostatecznie TAC w pożądanej temperaturze. To ostatnie przemycie określa specyficzność. Dla AA ID temperatura ta wynosi 52,5°C. Po ekspozycji na błonie fotograficznej czułej na promieniowanie X, obserwuje się tylko te klony, które są całkowicie komplementarne z AA ID. Kilka takich klonów analizuje się przez sekwezcJozogame DNA. Wszystkie z nich zawierają pierwszą mutację, ale żaden nie zawiera drugiej mutacji (przy cysteinie 191).

W celu zmutowania cysterny w pozycji 191 używa się drugiego nukleotydu oznaczonego Al o następującej sekwencji: 5' GAG AGC aGc GCT GCC TTC TAG 3'.

Proces mutagenezy jest identyczny z powyżej opisanym z zastosowaniem AA1, z tą różnicą, że matrycą DNA jest M13mpl lpSTA3 (jest to klon wyodrębniony podczas mutagenezy AA1, który ma cysteinę w pozycji 183 przeprowadzoną w alaninę) i hybrydyzacji dokonuje się z A1. Temperatura końcowego przemycia wynosi 56°C. Sekwezcjonowame DNA ujawnia, że zidentyfikowane klony mają oczekiwaną sekwencję. Zmutowany klon jest oznaczony M13mpl lpSTA34 (ATCC). Sekwencja DNA jest przedstawiona na figurze 3.

W drugim sposobie podstawienie w wiązaniu disulfidowem małej pętli otrzymuje się stosując dwa zukleotyCy w tej samej reakcji, jak przedstawiono na figurze 2. Te dwa bukleotyCy mają następujące sekwencje.

GCT ATG AAG GAA CG CGC TTC Y GLUJ GLU

5' GAG AGC AG GAG GCC TTC TAG 3' GLU4

GLU

Jedboniciogym DNA-matrycą jest M13mpllpST (ATCC). Te dwa bukleotydy i DNAmatrycę łączy się w tej samej reakcji, wydłuża i liguje jak poprzednio. Mieszaninę transformuje się E. coli JM 101. Odmienność tego sposobu polega na tym, ze wykonuje się tu dwa przeniesienia z każdej płytki. Po każdym przeniesieniu następuje oddzielna hybrydyzacja albo ze znakowanym 32p GLU3 albo ze znakowanym ³²pGLU4. Temperatura końcowego przemycia dla każdego oligonukleotydu wynosi 56°C. Pobiera się tylko te łysinki, które są pozytywne wobec obu nukleotydów. Sekgencjozowabie DNA ujawnia, że tak Cys 183 jak i Cys 191 przeprowadzone są w kwas glutaminowy. Klon oznaczone jest M 13mpl lpSTE34 (ATCC). Sposobu tego używa się do otrzymywania mutacji zapobiegających tworzeniu wiązania disulfiCowego dużej pętli w wyniku zastosowania dwóch odpowiednich oligonukleotydów jak opisano powyżej i M13mpl IpST. Wyraźnie w wyniku użycia M 13mpl lpSTA34jako DNA-matrycy i dwóch oligobukleoteCów nadających się do zmiany Cys 55 i Cys 166 na alaninę, otrzymuje się klon, w którym wszystkie reszty cysteinowe przeprowadzone zostały w alaninę.

164 207

Zmienione (zmutowane) klony wbudowuje się ponownie do bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pRO211 (ATCC) jak przedstawiono na figurze 5 (opisano w EP 173 280). Klony M13 przecina się EcoRl i Hindlll i wyodrębnia fragment genu pST. pRO211 trawi się tymi samymi enzymami, poddaje działaniu fosfotazy alkalicznej z jelita cielęcia i wyodrębnia duzy fragment. Te dwie części Iiguje się ze sobą stosując ligazę DNA T4 i używa do transformacji odpowiedniego szczepu bakteryjnego, np. E. coli N99cl (ATCC). W szczepie tym obecny jest represor k typu dzikiego Zapobiega on ekspresji z promotora P_L w pR0211. Gdy zostanie wyodrębniona odpowiednia konstrukcja, przenosi się ją do odpowiednich szczepów bakteryjnych, zawierających represor k wrażliwy na temperaturę, np. E. coli 4200 (ATCC). W tych szczepach ekspresja pST jest zalezna od temperatury. W temperaturze 42°C represor jest nieaktywny i ekspresja zachodzi. W tym stadium pST otrzymuje się sposobami z EP 173 280 (włączonego do niniejszego opisu jako odnośnik), przy czym ekspresja zachodzi. Ekspresja pST nie jest ograniczona do tych szczególnych szczepów E. coli. Zamiast nich stosuje się inne szczepy o odpowiednich właściwościach. Plazmidowe wektory ekspresyjne są zdeponowane w ATCC. Szczepy nakteryjne są zdeponowane oddzielnie.

Podstawienie innymi aminokwasami przeprowadza się powyższymi sposobami przy wykorzystaniu odpowiednich kodonów i oligonukleotydów. Podobnie stosuje się te sposoby do zmodyfikowania somatotropin zwierzęcych (różnych). Wśród tych zmodyfikowanych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych łatwo otrzymywanych powyższymi sposobami są: (Ala 55/166)rpST; (Ser/55/166)rpST; (Ala 183/191 )rpST; (Glu 183/191)rpST; (Glu 183-Ala 191)roST; (Ser 183/191)roST oraz (Glu 183-Ser 191)rpST.

Przeprowadzone w pochodną somatotropiny zwierzęce, korzystnie rekombinantowe, otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia lub zdyspergowama somatotropiny zwierzęcej w wodzie lub wodnym roztworze chlorowodorku guanidyny, wodorowęglanu sodowego itp., którego pH doprowadza się do 8,4 wodnym roztworem zasady, takiejjak wodorotlenek sodowy lub amonowy. Do tego roztworu dodaje się później powoli ditiotreitol, to jest DL-treo-1,4-dimerkapto-2,3-butanodioI. Dodania dokonuje się na ogół w atmosferze azotu w temperaturze pokojowej. Następnie do powstałego roztworu dodaje sięjodoacetamid, kwasjodooctowy, tetrationian sodowy, metanotiosulfonian metylu, sulfon 1,3-propanowy lub jakikolwiek inny związek przeprowadzający w pochodną. Mieszaninę miesza się w ciągu około 1 do 4 godzin, a następnie odsala stosując ultrafiltrację. Roztwór zatęża się, a następnie przeprowadza kilka cykli ponownego rozcieńczenia wodą, wodnym roztworem chlorowodorku guanidyny itp., a potem ultrafiltracji. Następnie liofilizuje się pozostałość z końcowej filtracji w celu uzyskania przeprowadzonej w pochodną rpST.

Korzystnie, nowe somatotropiny zwierzęce są użyteczne w zwiększaniu szybkości wzrostu zwierząt, zwłaszcza zwierząt hodowanych na mięso i zwiększaniu efektywności spożytkowania przez nie paszy. Związki te są również skuteczne w polepszaniu tuszy tych zwierząt, to jest zwiększania stosunku chudego mięsa do tłuszczu u tych zwierząt. Oprócz tego, związki te są skuteczne w zwiększaniu wytwarzania mleka u zwierząt podczas laktacji i polepszaniu tworzenia wełny przez owce i inne zwierzęta hodowane na futro.

Gdy zmodyfikowane (z podstawieniem) lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny są skuteczne w działaniu na zwierzęta w celu osiągnięcia biologicznych korzyści powyżej opisanych, okazuje się, że polepszona skuteczność i użyteczność zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną somatotropin zwierzęcych, jest w części przypisywana zahamowaniu agresji somatotropiny wytworzonej za pomocą zmodyfikowania lub przeprowadzenia w pochodną w przypadku tych somatotropin. Zahamowanie to pozwala na otrzymanie znacznie polepszonych układów zaopatrujących o przedłużonym uwalnianiu, czego nie można łatwo lub skutecznie osiągnąć w przypadku somatotropin natywnych lub rekombinantowych, które nie zostały zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodne, jak to opisano w odniesieniu do niniejszego wynalazku.

Stwierdzono także, ze zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny są w wysokim stopniu stabilne i zasadniczo nie wykazują agregacji zależnej od tworzenia dimerów. Oprócz tego, zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropiny nadają się do otrzymywania znacznie polepszonych środków o przedłużonym uwalnianiu. Podczas gdy stwierdzono, że natywne somatotropiny zwierzęce agregują w jednym dniu, środki pozajelitowe zawiera12 jące zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną somatotropmy kontynuują uwalnianie zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodną somatotropiny w ciągu 10 lub więcej dni.

W praktyce, środki zawierające omawiane związki podaje się na ogół zwierzętom za pomocą wstrzyknięcia, w postaci biologicznie czynnego środka pozajelitowego. Wśród środków pozajelitowych uzytecznych jeśli chodzi o podawanie zwierzęcych somatotropin rekombrnantowych są takie, jak zele, pasty, mikrokuleczki, mikrokapsułki, implanty itp. Co do nich, istnieje zainteresowanie dostarczaniem postaci do dawkowania biologicznie czynnych substancji, które uwalniają substancję w sposób kontrolowany i zmniejszają przez to częstotliwość podawania.

Postęp dotyczący środków o przedłużonym uwalnianiu biologicznie czynnych makrocząsteczek przedstawia specjalne problemy w zależności od ich skomplikowanego sposobu działania i zawiłej budowy makrocząsteczek. Tak więc, ciągle wymagany jest postęp dotyczący skutecznych środków o przedłużonym uwalnianiu zawierających biologicznie czynną somatotropinę.

Środki uzyteczne przy tym typie podawania otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodną somatotropme zwierzęcej w rozcieńczonym wodorotlenku amonowym, a następnie dodanie do roztworu benzoesanu metalu alkalicznego, laurymanu metalu alkalicznego, węglanu metalu alkalicznego itp. Do roztworu dodaje się domieszkę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i otrzymaną mieszaninę suszy metodą rozpyłową. Tak utworzone ciało stałe miesza się ze stopionym tłuszczem lub woskiem, albo ich mieszaniną i otrzymaną stopioną mieszaninę rozpyla się przez dyszę rozpylającą powietrze/ciecz wyposażoną w płaszcz grzejny w celu utrzymania dochodzącego powietrza i stopionej fazy w temperaturze powyżej temperatury topnienia. Gdy stopione kropelki ochłodzą się, tworzą się mikrc^k^u^^t^^ki. Zbiera się je na zestawie sit o żądanym zakresie wielkości otworów, około 45 do 180//m i zachowuje do użycia. Mikrokuleczki o wielkości nie mieszczącej się w pożądanym zakresie zawraca się do procesu. Alternatywnie, homogeniczną mieszaninę zawraca się na wirującą tarczę i tak utworzone mikrc^k^u^^^zki zbiera jak wyżej, lub też stopioną mieszaninę chłodzi i miele do cząstek o średniej wielkości w pożądanym zakresie.

Następnie biologicznie czynne mikrokuleczki dysperguje się w nośniku ciekłym, farmaceutycznie i farmakologicznie dozwolonym do wstrzykiwania zwierzęciu. Środek mikrokuleczki-płyn wstrzykuje się na ogól zwierzęciu podskórnie, zazwyczaj w okolicę głowy, karku lub uszu.

Zmodyfikowane lub przeprowadzone w pochodną scmatotropiny przygotowuje się także jako biologicznie zgodne implanty, które wstrzykuje się pod skórę zwierzęcia za pomocą zwykłego urządzenia do tabletek wszczepianych podskórnie. Te środki otrzymuje się przez zmieszanie sproszkowanej, zmodyfikowanej lub przeprowadzonej w pochodną somatotropibe z woskiem, takim jak wosk rącznikowy, lub z mieszaniną kopolimeru glikolidu z laktydem, wodorotlenku magnezowego i kondensatu tlenku etylenu, otrzymanego z zasadą hydrofobową utworzoną na drodze kozCensaji tlenku propylenu z glikolem propylenowym. Tak utworzone mieszaniny wprowadza się do tabletkarki i formuje cylindryczne tabletki o średnice około 3,2 mm. Tak utworzone tabletki podaje się za pomocą zwykłego urządzenia do tabletek wszczepianych podskórnie.

Wynalazek objaśniają dalej przykłady zamieszczone w dalszej części bibieąszego opisu.

Przykład 1. Podstawienia cystein wiązania disulfidowego małej pętli z zastosowaniem długiego oligonuklectydu syntetycznego.

OligczukleotyC oznaczony AA1 ma sekwencję następującą: 5'GCT ATG AAG GCG CGC CGC TTG GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'. Zmienia to sekwencję genu rpST tak, że kodon cysteiny w pozycji 183 zostaje przeprowadzony z TGT do GCG, który koduje alaninę i kodon cysteiny w pozycji 191 zostaje przeprowadzony z TGT do GCT, który także koduje alaninę. Tak więc, obydwie cysteiny w małej pętli zostają przeprowadzone w alaniny. Jedboniciowy DNA M13mp 1 IpST otrzymuje się z oczyszczonego faga na zasadzie standardowych protokołów. 1000 ng ąeCbonlciogego DNA M13mpl IpST miesza się z 50 ng oligonukleotedu A Al, który został uprzednio 5'-fosforylowy 5'-trifosforabem adenozyny z wykorzystaniem kinazy polinukleotedowej, w końcowej objętości 10/ul z zawartością I X buforu do łączenia (1 X bufor do łączenia stanowi 75 mM KC1, 5 mM Tris pH 8,0). Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 7 minut, a następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Według tego protokołu łączy się oligobuklectyC z jednoniciowym DNA. Połączone DNA przeprowadza się następnie w postać

164 207 dwuniciową kowalencyjnie zamkniętą przez dodanie 20//1 H 2 O, 4/ul 10 X buforu uzupełniającego (10 X bufor uzupełniający stanowi 27 5 m MgCl pH 7,5 2 mM DTT), 1 yl 20 mM ATP, 2μ\ dNTP (mieszanina czterech 5'-tnlofosfor8nów deoksyrybonukleotydów, każdy w stężeniu 2 mM), 2 jednostek dużego fragmentu polimerazy DNA 1, co do definicji jednostki patrz katalog New England Biolabs, 1986). Mieszaninę inkubuje się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie mieszaniną tą transformuje się E- coli JM 101 z zastosowaniem zwykłego sposobu postępowania przy użyciu chlorku wapniowego. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C na murawie JM 101 widoczne mogą być łysinki. Łysinki przenosi się na filtry nitrocelulozowe i przygotowuje do hybrydyzacji na zasadzie standardowych protokołów. Do wykrycia mutantów używa się drugiego ollgonlkleotydl oznaczonego AA 1D, o następującej sekwencji. 5' C ATG AAG GCG CGC CGC TT 3'. Jest on promieniotwórczo znakowany na końcu 5' z użyciem [y- P]-ATP 1 kinazy polinukleotydowej Hybrydyzacja trwa przez noc w temperaturze 37°C w 5 X SSC, 1X roztworze Denhardta 150 /ml tRNA. Filtry przemywa się kolejno 5 X SSC w temperaturze 37°C, TAC w temperaturze 37°C 1 w końcu TAC w pożądanej temperaturze. To ostatnie przemycie określa specyficzność. Dla AA 1D temperatura ta wynosi 52,5°C. Po ekspozycji na błonie fotograficznej czułej na promieniowanie X obserwuje się tylko te klony, które są całkowicie komplementarne a AA1D. Kilka takich klonów analizuje się przez Bekwencjonow8nle DNA. Wszystkie z nich analizuje się przez Bekwencjonow8nle DNA. Wszystkie z nich zawierają pierwszą mutację, ale żaden nie zawiera drugiej mutacji, przy cysteinie 191. W celu zmutowania cysteiny w pozycji 191 używa się drugiego nukleotydu oznaczonego Al, o następującej sekwencji: 5' GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'.

Proces mutagenezy jest identyczny z opisanym w przykładzie I (powyżej), z tą różnicą, że matrycą jest M13mpllpST3 (jest to klon wyodrębniony podczas mutagenezy AA1, który ma cysteinę w pozycji 183 przeprowadzoną w alaninę) 1 hybrydyzacji dokonuje się z A1. Temperatura końcowego przemycia wynosi 62°C. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, ze zidentyfikowane klony mają oczekiwaną sekwencję. Zmutowany klon oznaczony jest M13mpl lpSTA34.

Przykład II Podstawienia cystein w małej pętli świńskiej somatotropiny rekombinantowej.

Podstawienia w wiązaniu disulfidowym małej pętli otrzymuje się stosując dwa oligonukleotydy w tej samej reakcji Te dwa oligonukleotydy mają następujące sekwencje:

5' 9TC ATG AAG GAA CGC CGC TTC 3* GIU 3 GLU

5' GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAG 5' GIU 4 GIU

Jednomciowym DNA-matrycą jest M13mpl IpST. Te dwa oligonukleotydy i DNA-matrycę łączy się w tej samej reakcji, wydłuża i ligujejak poprzednio. Mieszaniną transformuje się E. coli JM 101. Różnica w tym sposobie polega na tym, ze wykonuje się dwa przeniesienia z każdej płytki. Po każdym przeniesieniu przeprowadza się oddzielną hybrydyzację albo ze znakowanym PGIU3 albo GLU4. Temperatura końcowego przemycia dla każdego oligonukleotydu wynosi 56°C. Pobiera się tylko te łysinki, które są pozytywne wobec obu oligonukleotydów. Sekwencjonowanie DNA ujawnia, ze tak Cys 183 jak 1 Cys 191 są przeprowadzone w kwas glutaminowy. Tego sposobu używa się do otrzymania mutacji zapobiegających tworzeniu wiązania disllfidowego dużej pętli w wyniku zastosowania dwóch odpowiednich oligonukleotydów jak opisano powyżej i M13mpl IpST. Wyraźnie przez użycie M 13mpl lpSTA34jako DNA-matrycy i dwóch oligonukleotydów odpowiednich do zmiany Cys 55 i Cys 166 na alaninę, otrzymuje się klon, w którym wszystkie reszty cysteinowe zostały przeprowadzone w alaninę.

Przykład III. Ponowne wbudowanie do bakteryjnych plazmidów ekspresyjnych.

Zmienione (mutantowe) klony wbudowuje się ponownie do bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pR0211, opisanego w EP 173 280 włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik. Klony M13 przecina się EcoRI i Hindlll i wyodrębnia fragment genu pST. pR0211 klonuje się z użyciem tych samych enzymów, poddaje działaniu fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcia i wyodrębnia duży frament Te dwie części liguje się ze sobą z wykorzystaniem ligazy DNA T41 używa do transformacji odpowiedniego szczepu bakteryjnego, np. N99cl+. W szczepie tym obecny jest represor λ typu dzikiego. Zapobiega on ekspresji z promotora P2 w pRO211. Gdy zostanie wyodrębniona odpowiednia konstrukcja, przenosi się ją do odpowiednich szczepów bakteryjnych, które zawierają repres^ λ wrażliwy na temperaturę, np. 4200. W tych szczepach ekspresja pST jest zalezna od temperatury. W temperaturze 42°C represor jest nieaktywny 1 ekspresja zachodzi. W tym stadium, rpST otrzymuje się sposobami z EP 173 280 (włączonego do niniejszego opisu jako odnośnik). Szczepy E coli, które stosuje się do ekspresji produktu genu pST, nie są ograniczone do E. coli 4200. Można uzyć jakiegokolwiek szczepu E. coli.

Powtarzając sposoby postępowania z przykładów I, II i III (powyżej) lecz podstawiając odpowiednie kodony alaniny, seryny, kwasu glutaminowego, argi^ny, tryptofanu lub asparaginy zamiast cysteiny w pozycjach 183 i 191, przeprowadza sięTGT odpowiadający cysteinie w TCN, AGC lub AGT odpowiadające sednie, GAG lub GAA odpowiadające kwasowi glutaminowemu, CGN, AGA lub AGG odpowiadające argrglnle, AAT lub AAC odpowiadające asparag^^, GCN odpowiadający alaninie, względnie TGG odpowiadający tryptnfannwi, we wspomnianej pozycji.

Przykład IV. Otrzymywanie (Cam-Cys 55, 166, 183, 191) rPST.

Otrzymuje się roztwór 100 mg świńskiej snmatotrnpino reknmblgantowej (rpST) w 33 ml 7M chlorowodorku guanidyny i pH doprowadza się do 8,4 za pomocą NaOH. Do tego roztworu dodaje się 18 mg(20równowazgików)ditlntreitnlu i miesza mieszaninę reakcyjną wciągu godziny w temperaturze pnknjnwej w atmosferze N 2. Do tego roztworu dodaje się 84 mg (100 równoważników) jodeacetamidu i miesza mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się 35 ml H 2 O i chlorowodorku guanidyny i usuwa nadmiar odczynników na drodze ultrafiltracji przez membranę Ancon UM2 (odcięcie przy masie cząsteczkowej około 1000 daltngów1 w komorze z mieszaniem Amicon model 8400. Po kilku cyklach powtórnego rozcieńczania i powtórnej filtracji, pozostały roztwór wodny liofilizuje się do stałej wagi z uzyskaniem 100 mg puszystego proszku o barwie białej. Ruchliwość eletrofnretoczna produktu w zelu SDS-PAGE w warunkach meredukujących różni się od wykazywanej przez rpST. Produkt jest to przeprowadzona w pochodną świńska tamotntroplna rekomblgantowa wskazana w powyzszej części niniejszego opisu.

Przykład V. Otrzymywanie (Cam-Cys 183, 191) rpST.

Do 225 ml odgaznwanego 0,02 M roztworu NaCl dodaje się 3,375 g świńskiej somatntroplny rekombigagtnwej (rpST), pH doprowadza rozcieńczonym HCl do 8,1 i przy utrzymywaniu pH na tym poziomie dodaje się do roztworu rpST 15 mg/ml 0,9463 g ditiotreitolu rozpuszczonego w 31,5 ml wody. Mieszaninę odstawia się na godzinę w temperaturze pokojowej, po czym pH podnosi się do 8,41 przy utrzymywaniu na tym poziomie, do roztworu rpST wkrapla się 5,7 g jodoacetamidu rozpuszczonego w 40,5 ml wody. Podczas tego wkraplania następuje tworzenie się drobnego osadu, który usuwa się za pomocą odwirowania. Sklarowany płyn stanowiący supernatagt usuwa się i przeprowadza przez kolumnę Sephadex G-25 w celu usunięcia nadmiaru materiałów o niskiej masie cząsteczkowej. Zbiera się 342,8 g frakcji o wysokiej masie cząsteczkowej (rpST) i liofilizuje, w wyniku czego otrzymuje się 2,2 g (Cam-Cys 183 191) rpST.

Przykład VI. Otrzymywanie (Cm-Cys 183, 191)rpST.

Do roztworu 200 mg świńskiej somatotroplgo rekombigagtnwej (rpST) w 100 ml 0,5 N NaHC O3 o pH doprowadzonym do około 8,4 wodnym roztworem wodorotlenku amonowego dodaje się 15 mg ditiotreitolu i mieszaninę reakcyjną poddaje się mieszaniu w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Dodaje się 50 mg kwasu jndnoctowego 1 mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 2 godzin, a następnie odsala na drodze ultrafiltracji przez membranę Amicon UM2 w komorze z mieszaniem Amicon model 8400. Po kilku cyklach powtórnego mieszania i powtórnej filtracji pozostały roztwór wodny liofilizuje się do stałej wagi. Otrzymuje się około 200 mg puszystego ciała stałego o barwie białej. Otrzymany produkt jest świńską snmatotrnpiną reknmblnantową jak wskazano w niniejszym przykładzie.

Powtarza się powyższy sposób postępowania, z tą różnicą, że zamiast świńskiej somatntropigy reknmblnagtnwej stosuje się bydlęcą snmatntrnplnę reknmbigagtnwą, owczą snmatntrnpigę rekombinantową, końską somatotropinę rekombinantową, ludzką somatotropinę rekombinantową lub ptasią somatotropinę rekombinantową, w wyniku czego otrzymuje się, odpowiednio:

1) (Cm-Cys 183, ^^L^r^^ST

2) (Cm-Cys 183, 19I)roST

3) (Cm-Cys 183, 191)rhoST

4) (Cm-Cys 184, 191)rhST

5) (Cm-Cys 183, 191)raST

Przykład VII. Otrzymywanie (OaS-Cys 55, 166, 183, 191)rpST.

Otrzymuje się roztwór 200 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej (rpST) w 50 ml 7 N chlorowodorku guanidyny i pH doprowadza się do około 8,4 przy użyciu wodorotlenku sodowego. Do tego roztworu dodaje się 33 mg ditiotreitolu i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu godziny Do tego roztworu dodaje się 200 mg tetrationianu sodowego. pH natychmiast obniża się do około 6 i doprowadza się je z powrotem do 8,4 przy użyciu NaOH. Mieszaninę poddaje się następnie mieszaniu w ciągu 2 godzin. Roztwór poddaje się ultrafiltracji przez membranę Amicon UM2. Mieszaninę reakcyjną zatęża się do około 20 ml, rozcieńcza ponownie około 40 ml 3 N chlorowodorku guanidyny i znów filtruje. Po zatężeniu do około 20 ml roztwór rozcieńcza się wodą i ponownie zatęza. Proces ten powtarza się dodatkowo dwa razy i pozostałość liofilizuje do stałej wagi. Otrzymuje się około 200 mg ciała stałego o barwie białej jako produkt. Stanowi on przeprowadzoną w pochodną świńską somatotropinę rekombinantową opisaną powyżej.

Przykład VIII. Otrzymywanie (O3S-Cys 183, 191)rpST.

Do roztworu 250 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej (rpST) w 100 ml H 2O, której pH doprowadzono do około 8,4 za pomocą NaOH, dodaje się 70 mg ditiotreitolu. Roztwór miesza się w ciągu godziny w temperaturze pokojowej. Do roztworu zredukowanej rpST dodaje się 400 mg tetrationianu sodowego i miesza się go w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Mieszaninę reakcyjną filtruje się przez membranę Amicon UM2 i zatęza do około 20 ml. Rozcieńcza się pozostałość do około 200 ml wodą i ponownie zatęza. Ten sposób postępowania powtarza się jeszcze dwa razy. Końcowy roztwór liofilizuje się do stałej wagi, w wyniku czego otrzymuje się około 240 mg proszku o barwie białej. Jest on przeprowadzoną w pochodną świńską somatotropiną rekombinantową opisaną powyżej.

Przykład IX. Otrzymywania (MeS-Cys 183, 191)rpST.

200 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej (rpST) rozpuszcza się w 100 ml H2O. pH tego roztworu doprowadza się do około 8,4 wodnym roztworem NaOH. Do tego roztworu dodaje się 15 mg ditiotreitolu (DTT) i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu godziny. Po zakończeniu redukcji dodaje się 24/ul metanotiosulfonianu metylu i mieszaninę reakcyjną miesza w temperaturze pokojowej w ciągu 4 godzin. Podczas prowadzenia reakcji pH jest utrzymywane na poziomie 8,4 przez dodanie 1% NaOH w miarę potrzeby. Roztwór poddaje się ultrafiltracji przez membranę UM2 i zatęza do około 20 ml. Pozostałość rozcieńcza się 200 ml H 2 O i zatęża ponownie. Następnie liofilizuje się roztwór, w wyniku czego otrzymuje się 210 mg wyżej opisanego produktu, to jest przeprowadzonej w pochodną świńskiej somatotropiny rekombinantowej opisanej w mniejszym przykładzie powyżej.

Powtarzając powyzszy sposób postępowania, z tą różnicą, że zamiast świńskiej somatotropiny rekombinantowej stosuje się bydlęcą somatotropinę rekombinantową, owczą somatotropinę rekombinantową, końską somatotropinę rekombinantową, ludzką somatotropinę rekombinantową lub ptasią somatotropinę rekombinantową, w wyniku czego otrzymuje się następujące produkty:

1) (Mes-Cys 183, 191) bydlęca somatotropina rekombinantowa

2) (Mes-Cys 183, 191) owcza somatotropina rekombinantowa

3) (Mes-Cys 183, 191) końska somatotropina rekombinantowa

4) (Mes-Cys 184, 191) ludzka somatotropina rekombinantowa

5) (Mes-Cys 183, 191) ptasia somatotropina rekombinantowa.

Przykład X. Otrzymywanie (HO3SCH 2CH2CH 2-Cys 183, 191)-rpST.

Do roztworu 200 mg świńskiej somatotropiny rekombinantowej (rpST) w 100 ml H 2 O, której pH doprowadzono do 8,4, dodaje się 15 mg ditiotreitolu i mieszaninę reakcyjną miesza się w ciągu w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu. Do tego roztworu dodaje się 50 mg sulfonu 1,3-propanowego i miesza się go w temperaturze pokojowej w ciągu 6 godzin. pH utrzymuje się na poziomie 8,4 dodawaniem 1% NaOH. Surowy produkt zatęża się na drodze lltr8fϊltr8cji przez membranę UM2 do objętości około 20 ml. Dwukrotnie rozcieńcza się go do 200 ml i zatęża ponownie. Iiofilizuje się roztwór końcowy, w wyniku czego otrzymuje się 200 mg powyżej opisanego produktu w postaci ciała stałego o barwie białej, to jest przeprowadzonej w pochodną świńskiej somatotropiny rekombinantowej.

Korzystnie, zastępując w powyzszym sposobie postępowania świńską somatotropinę rekombinantową odpowiednią zwierzęcą somatotropiną rekombinantową, otrzymuje się następujące somatotropiny.

1) (HOaSC^C^C^-Cys 183, 191) bydlęca somatotropina rekombinantowa

2) (HO3SCH 2 CH 2 CH 2-Cys 183, 191) owcza somatotropina rekombinantowa

3) (H O3 SCH2 CH 2 CH 2-Cys 183, 191) końska somatotropina rekombinantowa

4) (H O3 SCH2 CH 2 CH 2-Cys 184, 191) ludzka somatotropina rekombinantowa

5) (H O3 SCH2 CH2CH 2-Cys 183, 191) ptasia somatotropina rekombinantowa.

Przykład XI. Profile stabilności zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną zwierzęcych somatotropin rekombinantowych.

Otrzymuje się stężony roztwór pochodnej zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej (do 100 mg/ml) w roztworze soli buforowanym fosforanami o pH 7,4 (3,45 g Na^PO^ H2O, 3,55 g Na3HP04, 9,50g NaCl, rozpuszczone w wodzie destylowanej, do łącznej objętości 1000ml). Roztwór ten poddaje się filtracji przez miliporową jałową jednostkę filtracyjną Millex 0,22 ym i 0,1 ml próbki umieszcza się w probówkach, które z kolei umieszcza się w piecu o temperaturze 45°C i pobiera w pożądanych odstępach czasu. Następnie zawartość rozcieńcza się buforowanym roztworem soli. Supernatant bada się za pomocą HPIC pod względem zawartości monomeru i dimeru, przeprowadza się zbilansowanie mas i rejestruje każdy wytrącony materiał. Wyniki porównuje się z wyjściowymi stężeniami i udokumentow^e profil stabilności.

Alternatywnie, pochodną somatotropiny wykazującą słabą rozpuszczalność w pH 7,4 rozpuszcza się w mniej korzystnym pH (4-10) lub ocenia się jako zawiesinę.

Próbka	2 dni Roztwór frakcji (Dimer)	5 dni Roztwór frakcji (Dimer)	6 dni Roztwór frakcji (Dimer)	7 dni Roztwór frakcji (Dimer)
1	2	3	4	5
rpST techn	93,1 (17,2)	92,4 (27,6)	92,0 (34,9)	“85,9 (29,4) 89,5 (31,0)
rpST tech	—	79,8 (20,7)	—	—
rpST tech	—	81,5(18,6)	—	—
(Cam-Cys 183-191)rpST	—	75,2 (2,0)	—	—
(Cam-Cys 183. 191)rpST	—	72,8(1.0)	—	—
(Cam-Cys 183. 191)rpST	—	—	57.8 (2,0)	—
(Cam-Cys 183, 191)rpST	—	—	—	73,0 (3,0)
(Mes-Cys 183. 191)rpST	79,7 (2,2)	—	—	73,4 (3,9)
DiSllΓigowa rpST	83,2(1,0)			“73,9 (1,5) 85,0(1,6)

'Wyekstrahowane do buforu PBS Pozostałe w całości ekstrahowane do CBS

Frakcja rozpuszczalna (Dimer)

Opis	2 dni	7 dni
Karboksymetylowa pochodna rpST	92,8(5,3)	85,6 (5,9)
Pochodna rpST z Bllfidem dimetylowym	77,6 (2,4)	63,5 (3,0)
Pochodna rpST z kwasem hydroksybursztynowym	91,5 (7,8)	69,9 (5,6)
K8rbokByamldometylowana (CAM) pochodna rpST	78,0(1,0)	57,4(1,0)
rpST techniczna seria produkcyjna	89,5(16,6)	75,5 (30,9)

Przykład XII. Otrzymywanie nadających się do wstrzykiwania mikrokuleczek do pozajelitowego podawania pochodnych zwierzęcych somatotropin rekombinantowych.

Otrzymywanie nowych zwierzęcych somatotiOpin rekomeibantowych w zakresie wielkości odpowiednim do włączenia w mikrokuleczki drogą suszenia rozpyłowego przeprowadza się za pomocą rozpuszczenia pochodnej zwierzęcej somatotropiny rekomeibabtowej w rozcieńczonym roztworze wodorotlenku amonowego, a następnie dodanie roztworów pożądanych soli, takich jak benzoesan sodowy. Dodaje się niejonowy środek powierzchniowo czynny, taki jak blokowy kopolimer tlenku etylenu z tlenkiem propylenu i rozpuszcza przy stałym łagodnym mieszaniu. Następnie roztwór suszy się rozpyłowo. Można do tego celu uzyć mmisuszarki rozpełowej Buchi model nr 190. Otrzymuje się homogeniczną mieszaninę przygotowanego tak składnika czynnego i dodatków w stopionym tłuszczu, wosku lub ich mieszaninie i tak otrzymaną mieszaninę rozpyla się przez dyszę rozpylającą powietrze-ciecz wyposażoną w płaszcz grzejny w celu utrzymania dochodzącego powietrza i stopionej fazy w temperaturze powyżej temperatury topnienia. Gdy stopione kropelki ochłodzą się, tworzą się mikrokuleczki, które się zbiera na zestawie sit o żądanym zakresie wielkości otworów około 45 do 180//m i zachowuje do użycia. Mikrokuleczki o wielkości nie mieszczącej się w pożądanym zakresie zawraca się do procesu.

Alternatywnie, homogeniczną mieszaninę podaje się na wirującą tarczę i tak utworzone mikrokuleczki zbiera jak wyżej, lub też stopioną mieszaninę chłodzi i miele do cząstek o średniej wielkości w pożądanym zakresie.

Woski i tłuszcze, które nadają się do użycia mają na ogół temperaturę topnienia wyzszą od 40°C. *Woski te zdefiniowane są jako nieskotopliwa organiczna mieszanina lub związek o wysokiej masie cząsteczkowej, stały w temperaturze pokojowej i na ogół podobny w składzie do tłuszczów i olejów, z tym wyjątkiem, ze nie zawierają one glicerydów. Niektóre są węglowodorami, inne estrami kwasów tłuszczowych z alkoholami. Zaliczone są one do lipidów. Woski są termoplastyczne, ale ponieważ nie są polimerami o dużej masie cząsteczkowej, nie uważa się ich za przyzalezze do grupy tworzyw sztucznych. Wspólnymi właściwościami są: heCrofoeowość, wyrównywana tekstura, nletcksyczbość, brak nieprzyjemnego zapachu i barwy. Są one palne i mają dobre właściowości dielektryczne. Rozpuszczalne są w większości rozpuszczalników organicznych, nierozpuszczalne w wodzie. Główne typy są następujące:

I. Naturalne

1. Zwierzęce (wosk pszczeli, lanolina, szelak, wosk chiński z owadów).

2. Roślinne (wosk karzauba, wosk kandella, wosk mirtowy, wosk otrzymywany z trzciny cukrowej przy produkcji cukru).

3. Mineralne (a) woski kopalne czyli ziemne (ozokeryt, cerezyza, wosk moztaza) (b) woski pochodzące z ropy naftowej (parafina, mikrokrystaliczne) (gacz parafinowy lub parafina w łuskach).

II. Syntetyczne

1. Polimery etylenowe i etery - estry polioli („Carbowax“, sorbit).

2. Chlorowane naftaleny („Halowax“)

3. Typu węglowodoru via synteza Fischera-Tropscha.

Tłuszcz można zdefiniować jako ester gliceryny i wyższego kwasu tłuszczowego, takiego jak stearynowy lub palmitynowy. Estry te i ich mieszaniny są stałe w temperaturze pokojowej i wykazują strukturę krystaliczną. Przykładowo można wymienić smalec i łój. Nie istnieje chemiczna różnica między tłuszczem a olejem, jedynym rozróżnieniem jest to, że tłuszcze są stałe w temperaturze pokojowej, a oleje płynne. Termin „tłuszcz odnosi się specyficznie do triglicerydów, podczas gdy „lipid jest terminem ogólnym, obejmującym je.

Korzystnie, tłuszczem jest Cługołańcuchowy C10-24-kwas tłuszczowy, alkohol, ester, sól, eter i ich mieszanina z mono-, di- lub trigliceryCami złożonymi głównie ze stearynianów, palmityniabów, Iauryniabów, Iinoleinianów, liboleinlabów, oleizianów, ich produktów lub mieszanin, przy czym najkorzystniejsze są spośród nich te, których temperatura topnienia wynosi powyżej 50°C. Tristearynian gliceryny jest najkorzystniejszym tłuszczem. Oprócz tego, nadają się tu lipofilowe sole kwasów tłuszczowych, takie jak stearynian magnezowy itp.

Mikrokuleczki dysperguje się w farmaceutycznie i farmakologicznie dozwolonym płynie w celu otrzymania środków do podawania pozajelitowego o przedłużonym uwalnianiu. Nośnik jest

The ConCenseC Chemical Dictionary, wyC 110, str. 1094 Van NostrazC Reinhold Publisher

164 207 buforowanym układem wodnym lub olejowym. Olej jest to olej roślinny lub zwierzęcy. Korzystnym olejem jest obojętny triglicerydowy tłuszcz płynny. Olejem obojętnym jest taki olej, który nie zawiera resztkowego kwasu. Do nośników odpowiednich do użycia w środkach należą układy wodne, takie jak buforowane roztwory soli, rozpuszczalniki organiczne, takie jak glikole i alkohole, oraz ciecze niemieszające się z wodą, takie jak oleje, w zależności od rozpuszczalności składnika czynnego, który ma być podawany. Otrzymane dane zamieszczone są w tabeli 1.

Tabela I

Środki w postaci mikrokuleczek

Środek nr	Dodatki (%)
Podłoże	Pochodne rpST
Bufor/środek konserwujący	Środek powierzchniowo czynny
1	2	3 4	5

1	CMS	2,5	—	—
2		20	—	—
3	GMS/olej sojowy	30	—	—
4	GDS	10	—	—
5		10	Laurynian Na (1,4)	—
6		25	Benzoesan Na (1,6)	Środek powierzchniowo czynny
				B (0,12)
7		25	Węglan/wodorowęglan Na (1,3)	Środek powierzchniowo czynny
				A (0,18)
8	GTS/GDS (19 1)	15	—	—
9		10	Benzoesan Na (0,6)	Środek powierzchniowo czynny
				B (0.05)
10	GTS/GDS (9 1)	10	—	Środek powierzchniowo czynny
				B (0.1)
11	GTS/wosk pszczeli (9 1)	7,5	—	—
12	GTS/GMS (19 1)	15	Benzoesan Na (1.4)	—
13	GTS/olej sojowy (19 1)		7.5	—
14	GMS/wosk karnauba (1 2)	20	—	—
15		10	Benzoesan Na (0,8)	—
16		10	—	Środek powierzchniowo czynny
				B (0,05)
17		25	Benzoesan Na (0,75)	Środek powierzchniowo czynny
				B (0,12)
18		25	Benzoesan Na (3.2)	Środek powierzchniowo czynny
				B (0,12)
19		25	—	Środek powierzchniowo czynny
				B (0,12)
20		25	—	Środek powierzchniowo czynny
				A (0,48)
21		25	Węglan/wodorowęglan Na (1,2)	—
22	GTL	33	Benzoesan Na (2,1)	Środek powierzchniowo czynny
				A (0,17)
23	GTS/GDS (12 1)	15	Benzoesan Ca (1,1)	Środek powierzchniowo czynny
				A (0,17)
24	Wosk ps7czeli/olej sojowy (2 1)	30	—	—
25	GTS	7,5	—	—
26	GMS/Olej sojowy (47.25/24)	25	—	Sorbitan
27		15	—	Monooleinian (3,75)
28	GMS	10	—	POE(23) (stearynian) (9,0)
29	GMS	20	—	PEG 6000 (9,0)
30	GMS	20	—	PEG 6000 (4,0)
31	GMS	20	—	PEG 6000 (0,8)
32	GMS	20	—	PEG 400 (distearynian) (8,0)
33	GMS	20	—	PEG 400 (distearynian) (1,57)
34	GMS	20	—	PEG 1540 (diastearyman) (16,0)
35	Monostearyman glikolu etylenowego	25

164 207

Tabela 2

Preparaty zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej w postaci mikrokuleczek

Pochodna zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej Tf	Kwas cholowy %	Rdzeń Kwas deoksycholowy %	Cholesterol %	Cholesterol %	Powłoka Tnsiearynian gliceryny %	PVP %	Wosk pszczeli	Fosfatydylo- cholma <T
50	50	_	_	42 5	42.5	5	—	—
20	80	—	—	42.5	42.5	5	—	—
7S	2 S	—	-	42 5	42.5	5	—	—
50		<0		40	_		40	5
20		80	—	40	—		40	5
75	-		-	40	—	5	40	5
50	_	_	sn	42 >	42 5			—
2d	_	—	20	42 5	42 5	5	—	—
75	-	-	75	42 5	42 5	5	—	—

Przykład XIII. Mikrokuleczki z kwasem żółciowym.

Buforowany roztwór pochodnej rpST i kwasu żółciowego rozpyla się w suszarce rozpyłowej Buchi Model 190. 10 części tego drobnocząsteczkowego proszku zawiesza się w roztworze 1 części materiałów powłokowych, w chlorku metylenu. Zawiesinę tę suszy się metodą rozpyłową. Powleczone mikrokuleczki zawiesza się przed wstrzyknięciem w odpowiednim nośniku do zawieszania. Te środki opisane są w tabeli 2. Zgodnie z opisem w tabeli 2 otrzymuje się w postaci mikrokuleczek inne przeprowadzone w pochodne lub zmodyfikowane zwierzęce somatotropiny rekombinantowe, w tym zmodyfikowane świńskie, bydlęce, owcze, końskie, ludzkie i ptasie somatotropiny rekombinantowe, w których cysteiny w małej pętli w pozycjach 183 i 191 (184 i 191 w przypadku ludzkich) zwierzęcych somatotropin rekombinantowych zostały zastąpione alaniną, seryną, kwasem glutaminowym, argininą, lizyną itp.

Przykład XIV. Otrzymywanie implantów zawierających zwierzęcą somatotropinę rekombinantową.

Implanty otrzymuje się za pomocą odważania wystarczającej ilości rozdrobnionej homogenicznej mieszaniny pożądanej pochodnej zwierzęcej somatotropiny rekombinantowej i pożądanych rozcieńczalników. Następnie mieszaninę ściska się w prasie wykrawającej pod ciśnieniem od 6,9- 10³kPa do 34,5- 10³kPa w cylindrycznej matrycy o średnicy 4,76 lub 3,17 mm, względnie tabletkarce obrotowej stosując wymagany stempel i matrycę. Tak otrzymane implanty powleka się następnie albo ulegającymi metabolizmowi, albo nie ulegającymi metabolizmowi powłokami, z wykorzystaniem sposobów postępowania A i B.

Sposób postępowania A. Nie ulegający metabolizmowi polimer silikonowy.

części elastomeru silikonowego, czystego, miesza się szpatułką z 1 częścią utwardzacza na szkle wodnym i następnie odpowietrza się w eksykatorze w ciągu 30 minut. Implanty chwyta się za końce pincetą, obtacza w polimerze silikonowym, umieszcza końcem na folii aluminiowej i utwardza w temperaturze 40°C w ciągu 5 godzin. Jeden, lub obydwa końce obcina się żyletką pozostawiając „trzonek powleczonego cylindra.

Alternatywnie, implanty powleka się, przez maczanie, 20 do 40% spoiwem medycznym, sprzedawanym pod znakiem towarowym SILASTIC® przez firmę Dow Corninig, które zostało zdyspergowane w heksanie, oraz suszy i utwardza w temperaturze 40 do 50°C przez noc przed usunięciem powłoki z jednego lub obydwu końców stanowiących podstawy.

Sposób postępowania B. Powłoki ulegające metabolizmowi.

część polimeru lub kopolimeru rozpuszcza się w 3 do 8 części chloroformu. Każdy implant chwyta się za końce pincetą, zanurza w roztworze polimeru, a następnie odparowuje chloroformem w temperaturze pokojowej. Każdy implant powleka się dwukrotnie. Po wysuszeniu powłok przez noc w temperaturze pokojowej, końce z polimerem usuwa się przez obcięcie żyletką, pozostawiając długi cylindryczny „trzonek powlekany.

164 207

Otrzymywanie implantów

Pochodna świńskiej somatotropiny rekombinantowej %	Stearynian magnezowy % '	Etyloceluloza %	Wosk rącznikowy %
50	_	5.0	45
40	—	5.0	50
20	—	5.0	75
50	0,5	3,5	46
20	0.5	3.5	76
		Środek
Pochodna rpST	Cholesterol	powierzchniowo czynny	Trislearyman gliceryny
%	%	%	%
30	68	2	_
15	41,5	2	41,5

Pochodna rpST	Kwas stearynowy
%	%
50	50
20	80

Alternatywnie, rpST lub inne zwierzęce somatotropiny rekombinantowe miesza się ze środkami powierzchniowo czynnymi, buforowanymi roztworami soli i/lub środkami konserwującymi w roztworze wodnym. Roztwór ten następnie suszy się metodą rozpyłową w suszarce rozpyłowej Buchi Model 190, w wyniku czego otrzymuje się proszek o małej wielkości porów. Proszek ten miesza się następnie z tłuszczem lub woskiem w stanie stopionym i formuje w cylindryczne implanty. Implanty otrzymane jak wyżej powleka się następnie albo ulegającym metabolizmowi, albo me ulegającym metabolizmowi polimerem z zastosowaniem sposobu postępowania A lub B.

Preparaty implantów

Pochodna rpST %	Tnstearyman gliceryny %	Benzoesan sodowy %	Środek powierzchniowo czynny %
28	69,9	2,0	0,15
15	82,9	2,0	0,15
50	48,5	1,5	0

Przykład XV. Otrzymywanie implantów przy zastosowaniu (Cam-Cys 183, 191) rpST i ocena tych implantów na podstawie rozpuszczalności in vitro.

Do 1,3 ml CH2CI2 dodaje się 92,4 mg kopolimeru glikolidl z laktydem, 5,3 g niejonowego blokowego kopolimeru tlenku etylenu z tlenkiem propylenu sprzedawanego przez firmę BASF Wyandottee Corp. jako pluromc 127 o średniej masie cząsteczkowej 12500, temperaturze topnienia 56°C, lepkości metodą Brookfielda 3100 (cps)³⁵,5,3 mg/200 mesh mg (OH)2174,6 mg sproszkowanej (Cam-Cys 183, 191)rpST. Mieszaninę miesza się, wylewa na płytkę Petri'ego o dużej powierzchni i dopuszcza do odparowania C^Ch w temperaturze pokojowej, a następnie suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Zbiera się wysuszoną pozostałość 1 formuje w implanty o średnicy 3,17 mm stosując prasę wykrawającą przy około 6,9 · I0³kPa. Tak utworzone implanty o wadze 60 do 70 mg każdy oznacza się 1-1.

Drugi zestaw implantów otrzymuje się przez zmieszanie ze sobą w mikserze 128 g sproszkowanego wosku rączmkowego (-270 mesh) 1 32 mg sproszkowanej (Cam-CYs 183, 191)rpST. Tak otrzymaną mieszaninę formuje się następnie w cylindryczne implanty o średnicy 3,17 mm w sposób powyżej opisany. Tabletki ważą 60 do 70 mg każda i oznacza się je 1-2.

Trzeci zestaw implantów otrzymuje się także powyzszymi sposobami postępowania stosując 96 mg (-270 mesh) wosku rącznikowego i 64 mg sproszkowanej (Cam-Cys 183,191)rpST. Cylindryczne implanty o średnicy 3,17 mm otrzymane jak powyżej opisano ważą 60 do 70 mg i oznacza się je 1-3. Tak otrzymane implanty poddaje się następnie ocenie rozpuszczalności in yitro. Każdy z

164 207 implantów umieszcza się w oddzielnej probówce z tworzywa sztucznego zawierającej 10 ml buforu fosforanwoego o pH 7,4 (z 0,05% azydkiem sodowym) i probówki umieszcza w stojaku wstrząsanym w wodzie, gdzie probówki są wstrząsane, podczas gdy temperaturę wody w urządzeniu utrzymuje się na poziomie 39°C. Probówki wstrząsa się w ciągu jednego dnia, a następnie z każdej pobiera się roztwór i analizuje pod względem rpST za pomocą HPLC, a następnie roztwór odrzuca. Dodaje się nowy bufor fosforanowy do każdej probówki i wstrząsa je po tym w ciągu trzech dodatkowych dni. Roztwór z każdej probówki znowu analizuje się pod względem rpST za pomocą HPLC i znów odrzuca. Nowy bufor fosforanowy znowu dodaje się do każdej probówki i ponownie je wstrząsa w ciągu trzech dni, po czym znowu analizuje pod względem rpST.

Implanty użyte w tych oznaczeniach są opisane poniżej wraz z otrzymanymi wynikami. Bufor fosforanowy stanowi 3,45 g NaH2PO 4 · H 20, 3,55 g Na2 HPO4,9,5 g NaCl, rozpuszczone w wodzie destylowanej do łącznej objętości 1000 ml.

Otrzymywanie i oznaczenia implantów

rpST w implancie	Teoretycznie
Pochodzenie implantu	Waga implantu	mg
I-I	69.6 mg	29,23 mg
1-2	68,7 mg	28,85 mg
1-3	62.8 mg	12,56 mg
1-4	63,3mg	12,66 mg
1-5	66.8 mg	26,72 mg
1-6	66,2 mg	26,48 mg

Wyniki rozpuszczania in yitro

Objęiosc tjodeuitka do ktorcso następowało uwalnianie 1 ml 1	Dzień	1-1 Dimer 7	1-2 Dimer 7	1 1 Dimer	I-I Dimer r	1-5 Dimer 7	1-6 Dimer ς
10		Początek	Początek	Począiek	Poc^iek	Poc^iek	Począiek
'0	1	1 59	1 184	0 485	0 499	l.605	1 570
			(1 Yti	^^1	(niski		(mski!
				niemierzalny)	0^101^^ )
10	4	041'	0 459	0 063	0 068	0 136	0 140
		Iniski)	II Τ', l	(niski)	(niski)		imsku
«0		0 044	0 0-<	0 00 7	0 007	0 019	0019
		(niski	(niski	(niski	(niski	1 gltkι.	(niski
		niemierzalny )	niemierzalny)	niemierzalny i	niemierzalny)	niemierzalny)	niemierzalny)

Kumulatywne uwalnianie rpST

1-1 + 1-2

Dzień	Kumulatywnie Uwalnianie (mg)	Kumulatywnie % początkowo uwalnianej
1	11,72	40,40%;
4	16,10	55,40%
7	16,51 1-3 +1-4	56,90%
1	4,92	39,02%
4	5,58	44,25%
7	5,65 1-5 +1-6	44,81%
1	15,88	59,70%
4	17,26	64,89%
7	17,45	65.60%

Przykład XVI. Otrzymywanie zwierzęcej tnmatotrnpigy reknmblgagtowej w postaci mlkrnkapsułek.

0,85 g kopolimeru glikolidu z laktydem rozpuszcza się w 29,8g chloroformu i zawirowuje w ciągu 2 minut. Następnie do roztworu polimeru w chloroformie dodaje się 0,150 g pochodnej świńskiej snmatotrnpigo reknmbigantowej (Cam—Cys 183, 191)rpST, która została przesiana na sucho przez 25pm sito ze stali nierdzewne! i zawirowuje w ciągu 3 minut. Powstałą zawiesinę

164 207 bLiłkową wprowidzi się nistępnie do 50 mL koLby okrągłodennej wyposiżonej w mieszidło mechiniczne. Szybkość mieszinii nistiwii się ni 700obx/mLn w temperiturze otoczenii. Dodit* kowych 3,2 g chLorformu używi się do przemycii wyjściowego niczynii. Ciłkowiti iLość chLoro— formu wynosi po tym 32,95 g. Nistępnie dodije się 350 oLeju silikonowego (13,1 g w okresie 8 minut) w ceLu wytrącenii kopoLimeru gLikoLidu z Liktydem. Nistępnie ziwirtość koLby przenosi się do 1720 g heptinu przy mechinicznym miesziniu w 4 Litrowej koLbie. Po upływie 3 godzin utwirdzone mikrokuleczki sączy się przez zestiw sit ze stiLi nierdzewnej i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem.

Inne poLimery i rozpuszcziLniki, użyteczne przy otrzymywiniu w postici mikrokipsułek zmodyfikowinych zwierzęcych somitotropin rekombinintowych, w których cysteinowe reszty iminokwisowe w pozycjich 55, 166, 183 Lub 191 zostiły zistąpione resztą innego iminokwisu, iLbo somitotropin rekombinintowych przeprowidzonych w pochodną, w których jeden Lub obydwi mostki disuLfidowe między cysteinimi w pozycjich 55 i 166 Lub w pozycjich 183 i 191 zostiły zredukowine i przeprowidzone w pochodną, zostiły wyLiczone poniżej.

Przy wyLiczeniu miteriiłów zimieszczonych poniżej użyto nistępujących skrótów: A = jiko próbki spoLimeryzowiną; B = próbki ponownie wytrąconi; gLy = gLikoLid; Lict = Liktyd;cipro = kiproLikton; TMC = węgLin trimetyLenu; PHB = poLihydroksymiśLin; PHV = poLihydro· ksywiLeriin; PEO = poLioksyetyLen.

PoLimery użyteczne przy otrzymywaniu w postici mikrokipsułek zmodyfikowinych i przeprowidzonych w pochodną zwierzęcych somitotropin rekombinintowych.

PoLimer	Ninh (RozpuszcziLnik)	Środki (% wig)
GLy/dL—Likiyd	0,36* (HFIP)	43,6/56,4*
Gly/dL-llkιyd	0.52* (HFIP)	42,4/57,4*
GLy/dL—Liktyd	0.63b (HFIP)	43,3/56^
Gly/dL-Llkιyd	0,66°(HFIP)	41,2/58^
GLy/dL’Liktyd	0,61* (HFIP)	41,6/58,4*
GLy/dL—Liktyd	0,22° (HFIP)	41,5/58,5°
GLy/dLdikiyd	0,26° (HFIP)	40,6/59,4°
GLy/dL'Liktyd	0,27°(HFIP)	40,7/59,3°
GLy/L-Llcl	0,2° (CHCU)	48/52°
dL—Lict	0,46b (HFIP)	100°
di—Lict	0,27°(HFIP)	103°
PHB	2,92* (HFAS)	100*
PHB/HV	3,27* (HFAS)	70/30*
Cipro/l-lact	0,45* (CHCIa)	84,6/15,4*
Cipro/l-lact	0,46* (CHCIa)	84,0/16,0*
Cipro/l-lict	0,51* (CHCIa)	85,2/14,8*
Capro/l-lact	0,50* (CHCIa)	84,4/15,6*
Cipro/l-lact	0,39* (CHCIa)	85,1/14,9*
Cipro/l-lact	0,36* (CHCIa)	86,1/13,9*
Capro/l-lact	0,31° (CHCIa)	11.,^^88,6°
Cipro/gly	0,34* (CHCIa)	84.0/16,0*
gLy/PEO 8000/TMC	0,33a (CHCIa)	50,3,/8,4/41,3°
gLy/PEO 8000/TMC	0,388 (CHCIa)	58,2/4,8/37,0°
gLy/dL—aklyd/ PEO 8000 '	0.35B (CHCIa)	35,8/54.4/9,8°
l-lact/TMC	0,26b (CHCIi) 0,23b (CHCIa)	85,4/14,6° 69/31°

A) = jiko próbki spoLimeryzowiną

B) = próbki ponownie wytrąconi

P r z y k 11 d XVII. Test ni szczurich pozbiwionych przysidki w ceLu okreśLenii przyspiesze— nii wzrostu zwierząt otrzymujących zmodyfikowine Lub przeprowidzone w pochodną zwierzęce somitotropiny rekombinintowe.

Efektywność różnych zmoydfikowinych (z podstiwieniem) Lub przeprowidzonych w pochodne zwierzęcych somitotropin rekombinintowych w zmieniiniu szybkości wzrostu zwierząt okreśLi się wykorzystując test ni szczurich pozbiwionych przysidki (hvpox). Szczur pozbiwiony

164 207 przysadki nie wytwarza swego własnego hormonu wzrostu i jest wrażliwy na wstrzykiwany bydlęcy hormon wzrostu. Mierzoną odpowiedzią jest wzrost w ciągu okresu czasu takiego jak 10 dni.

Każdemu z pozbawionych przysadki szczurów albinosów (otrzymanych z Taconic Farms, Sprague Dawley) wstrzykuje się wystarczającą ilość środków otrzymanych jak w przykładzie XX w celu zapewnienia 10 dniowej dawki 800 jg (80//g/dzień) świńskiego hormonu wzrostu w 0,2 ml preparatu, jak wyszczególniono. Alternatywnie, każdemu z pozbawionych przysadki szczurowi albinosowi wstrzykuje się codziennie 80//g pochodnej świńskiego hormonu wzrostu.

Przed przeprowadzeniem testu zwierzęta waży się i wybiera na podstawie wagi takie zwierzęta, których ma się uzyć. Wybiera się tylko te zwierzęta, których waga ciała mieści się w jednym odchyleniu standardowym od średniej wagi ciała w grupie. Następnie utworzoną grupę losowo dzieli się na grupy, na które się działa, składające się z 8 szczurów/grupę na podstawie tworzonego za pomocą komputera sposobu postępowania losowego. Następnie zwierzęta przenosi się do czystej klatki utrzymując cztery szczury/klatkę. Pierwszego dnia badań zwierzęta testowe waży się i wszystkie, które wykazują nadmiar lub niedobór wagi (±5g) odstawia się. Zwierzęta następnie przydziela się do grup testowych i poddaje działaniu.

Na koniec 10 dniowego okresu badań rejestruje się całkowity przyrost wagi każdego zwierzęcia i dla każdego działania określa średni przyrost wagi na szczura. Wyniki tych eksperymentów, które podsumowano w ponizszej tabeli, wykazują aktywność użytych pochodnych.

Dane dotyczące szczurów pozbawionych przysadki

Pochodna			Wzrost (g)
0-2 dni	2-4 dni	4-7 dni	7-10 dni	Całkowity
1	2	3	4	5	6
rpST	7,5	5,6	6.8	10 1	30
(Cam-Cys 183, 191)rpST(Sulfido-Cys 183. 191)	7,6	5.3	8,4	8.4	29,7
rpST	8,9	4,8	11.1	8,1	32,9
(Ala 183 191 )rpST	7,1	6,3	9,3	6,5	29,2
(SCH3-Cys 183, 191)rpST (S-CH2COO'-Cys 183	7,0	6,4	6,9	9,5	29,8
191 )rpST (S-CH2CH2SO3-Cys	5,9	5,6	9,1	7,9	28,5
183, 191)rpST	6,9	5,3	6,8	9,0	28,0

Z powyższych danych staje się widoczne, że każda ze zmodyfikowanych lub przeprowadzonych w pochodną świńskich somatotropin rekombinantowych jest biologicznie aktywna i zapewnia doskonały wzrost zwierząt.

Przykład XVIII. Ocena świń otrzymujących przeprowadzoną w pochodną świńską somatotropinę rekombinantową pod względem tuszy.

Świnie hoduje się w indywidualnych przegrodach. Początkowa waga świń około 60 kg. Świnie przeznacza się do uboju przy średniej żywej wadze 100 kg. Wstrzykiwanie środków testowych przy podstawie ucha rozpoczyna się po upływie 4 dniowego okresu przygotowawczego. Świnie karmi się standardową „Cy Hog ration“ do woli, wodę także dostarcza się do woli.

Osiągi wzrostu określa się przyjmując tydzień jako podstawę. Zbiera się następujące dane: średni wzrost przyrost dzienny, średnie dzienne pobranie paszy i wydajność paszy.

Po przyroście około 40 kg świnie poddaje się ubojowi i ocenia tusze. Przy uboju zbiera się następujące dane: waga ciepłej tuszy, waga mięśnia półścięgnistego, waga narządów (wątroba, nerki, serce) i waga tłuszczu otaczającego wnętrzności. Po upływie 24 godzin schładzania rejestruje się wyniki następujących pomiarów: długość tuszy, głębokość tłuszczu grzbietowego (pierwsze żebro, ostatnie żebro, ostatni krąg lędźwiowy, trzyćwierciowa przy dziesiątym żebrze, P-2), grubość boczku, powierzchnia oczka polędwicy, barwa, jędrność, marmurkowatość i nacięcie mięśnia.

W tych ocenach kontrolna negatywna otrzymuje codziennie wstrzyknięcia roztworu soli, CAM-rpST stanowi (Cam-Cys 183, 191)rpST opisaną w przykładzie VII powyżej i kontrola pozytywna otrzymuje codzienne wstrzyknięcia natywnej PST. Ocena tuszy (Cam—Cys 183, 191)rpST.

164 207

Sześć świń (na jedno działanie) hoduje się indywidualnie i poddaje odpowiedniemu działaniu od 44 do 94 kg żywej wagi. Wzrost i wybrane dane dotyczące tuszy przedstawione są poniżej wraz z obliczeniem względnej efektywności. Wpływ karboamidometylowanej-rpST (Cam-rpST) na osiągi wzrostu i wybrane cechy charakterystyczne tuszy świni po obróbce wykańczającej (średnie liczone metodą najmniejszych kwadratów).

Kryterium	Kontrola negatywna	CAM-rpST	Kontrola pozytywna
1	2	3	4
Średni przyrost dzienny (kg)	0.99	1,07	1,09
Średnie dzienne pobranie paszy (kg)	3,11	3,03	2,75
Przyrost/pasza	0,32	0,35	0,40
Wątroba, (g)	1726,1	1892,8	2085,5
Tłuszcz otaczający wnętrzności	762,4	765,5	563,3
Tłuszcz grzbietowy przy dziesiątym zebrze (cm)	2,22	2,00	1,88
Tłuszcz grzbietowy P-2 (cm)	1,80	1,50	1,45
Waga mięśnia półścięmstego (g)	359,5	353,1	387,9
Powierzchnia oczka polędwicy (cm3)	38,6	39,0	39,6

Przykład XIX. Eksperymenty dotyczące bilansu azotowego prowadzone z (Cam-Cys 183, 191 )rpST.

Świnie hoduje się w indywidualnych klatkach ze stali nierdzewnej do pomiaru metabolizmu. Wstrzykiwanie przy podstawie ucha zaczyna się wtedy, gdy świnie wprowadza się do klatek. Świniom pozwala się na pięciodniowy okres czasu przystosowania się do nowego otoczenia. Podczas tego okresu rejestruje się pobranie paszy i doprowadza do tego, ze wszystkie świnie konsumują tę samą ilość przy każdego dnia (Cy Hog ration, 18% surowego białka). Zbieranie kału i moczu zaczyna się po upływie co najmniej trzech dni stałego przyjmowania. Świnie karmi się równymi ilościami paszy dwa razy dziennie, a wodę dostarcza się do woli.

Całkowity kał i mocz zbiera się dla pięciu dni (zbieranie przeprowadza się każdorazowo rano). W celu zmniejszenia utraty azotu dodaje się 35 ml 6 N HCl do waider z tworzywa sztucznego do zbierania moczu na początku fazy eksperymentu polegającej na zbieraniu i po każdorazowym dziennym zbieraniu. Zwraca się uwagę na uniknięcie każdej możliwej straty moczu. Zebrany mocz rozcieńcza się do stałej, rejestrowanej objętości, następnie dzieli na 50 ml próbki zaopatruje w oznaczeniu i zamraża aż do analizy. Kał zbiera się codziennie, umieszcza w woreczkach ze sztucznego tworzywa z oznaczeniami i zamraża aż do analizy. Zbiera się też resztk^waży i zamraża. Małe próbki paszy pobiera się codziennie, zamraża i puluje przed analizą.

Próbki paszy i kału suszy się przez noc w temperaturze 100°C, albo dłużej w temperaturze niższej. Wysuszone próbki paszy i kału rozdrabnia się za pomocą młynka Wiley i pozostawia na 2 dni do zrównoważenia powietrzem. Oznacza się suchą masę i zawartość N w paszy i kale. Wszystkie próbki analizuje się pod względem zawartości azotu stosując zautomatyzowaną metodę Kjeldahla. Mocz analizuje się i określa całkowite dzienne wydalanie azotu w moczu. Z wyjątkiem moczu, wszystkie wartości N wyrażane są w oparciu o suchą masę.

Wagę świni rejestruje się pierwszego dnia przystosowywania się, pierwszego dnia zbierania i przy zakończeniu fazy zbierania. Zapewnia to, ze świnie mają dodatni bilans nergetyczny.

Bilans azotowy.

Ocena CAM-rpST w badaniu bilansu azotowego dotyczy ogółem 12 rosnących świń przy trzech sposobach działania: 1) kontrola negatywna (codziennie wstrzykiwanie roztworu soli), 2) CAM-rpST, 3 mg/dzień, oraz 3) kontrola pozytywna, 3 mg natywnej pST. Kał i mocz zbiera się w ciągu 7 dni po upływie 2 tygodniowego okresu przystosowywania się. Wyniki i obliczenia aktywności względnej są następujące: Wpływ karbamidometylowanej rpST (CAM-rpST) i natywnej pST na bilans azotowy rosnących świń.

164 207

Kryterium	Kontrola negatywna	CAM-rpST	Kontrola pozytywna
Pobierazie azotu (g/dzień)	41,86	41,36	41,83
Wydalanie azotu (g/dzień)
kał	5,25	5,21	4,65
mocz	23,06	16,74	15,12
Azot zaabsorbowany (g/dzień)	36,61	6,15	37,18
Strawzost azotu (%)	87,46	87,43	88,88
Retencja azotu (g/dzień)	13,56	19,41	22,06
Średni przyrost dzienny (g)	328,6	383.9	401,8

CAM-pST = (Cam-Cys 183, l91)rpST

Przykład XX. Otrzymywanie pasty przy zastosowaniu (Cam-Cys 183, 191)rpST.

Otrzymuje się mieszaninę (Cam-Cys 183, 191)rpST zawierającą 7% wag/wag benzoesanu sodowego i 0,5% wag/wag kopolimeru blokowego tlenku etylenu z tlenkiem propylenu stosując sposób postępowania z suszeniem rozpyłowym opisane w przykładzie XIII. Tak otrzymaną mieszaninę, w ilości 7,28 g, dodaje się przy mieszaniu Co roztworu 19,5 g tristearyziazu gliceryny w 71 ml 4/1 wag/wag mieszaliby trigliceredów kwasów: oktanowego, Cekazowego, Codekazowego i heksazowego (Miglyol® 813)³ (olej sojowe, w temperaturze 75-80°C). Mieszaninę miesza się w temperaturze 75-80°C aż stazie się oza homogeniczna, a następnie chłodzi. Utworzony w wyniku tego środek składa się (wagowo) z: 6,96% (Cam-Cys 183, 191)prST, 0,51% benzoesanu sodowego, 0,03% środka powierzchziowo czynnego (kopolimer blokowy) i 73,0% zośzika. Podaje się go za ogół zwierzętom przez wstrzyknięcie podskórze, pod skórę tych zwierząt w regionie głowy lub karku.

Przykład XXI. Otrzymywanie lepkiego środka żelowego zadającego się Co wstrzykiwania, zawierającego (Ala-Cys 183, 191)rpST.

Do 140 g wysoko oczyszczonego oleju sojowego w zlewce CoCaje się 12 g mozostearyziazu glinowego. Mieszaninę miesza się do jeCborodzości i ogrzewa w ciągu 30 mizut do około 140°C, gdy zachodzi oczywiste rozpuszczezie się mczosteareziazu w oleju sojowym. Zlewkę usuwa się z grzejnika i pozwala ochłodzić Co temperatury około 60°C. Następnie dodaje się przy mieszaniu 2,66 g (Ala-Cys 183,191)rpST wysuszonej metodą rozpyłową w celu otrzymania jednolicie rozdzielonej zawiesiny. Lepką mieszaniną zapełnia się 30 ml strzykawki jednorazowego użytku. Objętością wykorzystaną Co napełziezia każdej strzykawki jest 20 ml i objętość ta zawiera 350 mg (Ala-Cys 183, 191)rpST. Po zapełzieziu strzykawek żelową mieszaniną ściza się oza w kremowy, sztywny, ale dający się wycisnąć żel. Zapakowane strzykawki przechowuje się następnie w lodówce przed użyciem.

Przykład XXII. Otrzymywanie pasty z użyciem (Ala-Cys 183, 191)rpST.

4,18 g oleju seju mowe^ i Gdlucire 46/07 (Catt(efosse o 0ed4 g) mieszm siz w p ojw moj^ szklanym za pomocą bagietki. Następnie, przy mieszaniu, ogrzewa się Co temperatury 65°C aż Co jednorodności. Bagietkę wyjmuje się i dodaje 0,052 g (Ala-Cys 183, 191)rpST, w celu utworzenia środka.

Przykład XXIII. Otrzymywanie (Ala-Cys 183,191)rpST w połączeniu z cynkiem i zawierającej ją pasty.

(Ala-Cys 183,191 )rpST rozpuszcza się w 0,09 M Tris w stężeniu 21,5 mg rpST/ml, w temperaturze 40°C, pH 9,5. Przeprowadza się ją w sól cynkową za pomocą CoCazia, przy mieszaniu, 1 M ZzCU- Wytrąca się sól cynkowa. Odzyskuje się ją za pomocą odwirowania przy 100(M0Xg w ciągu 30 mizut przy utrzymywaniu temperatury roztworu 40°C. Liofilizuje się ją z uzyskaniem proszku. Do 140g oleju sezamowego w zlewce dodaje się 12 g mozosteareziazu glizowego. Zawartość ogrzewa się przy mieszaniu w temperaturze 153°C aż do rozpuszczenia się mozootearyziazu. Zlewkę usuwa się z grzejnika i pozwala się ochłodzić. W trakcie chłodzenia roztwór przechodzi w żel. Żel ten wprowadza się Co młyza kulowego wyposażonego w wysoko ścinający mieszalnik i kule ze stali zierdzewzej. W młynie obniża się ciśniezie i powoli CoCaje cyzk w proszku aż Co uzyskania jego zawartości w środku wynoszącej 40%. Mieszanie konten^e się aż do zmzioąozozia przeciętnej

164 207 średnicy cząstek cynku do wielkości poniżej ΙΟμπι. Kule ze stali nierdzewnej usuwa się z żelu, a ten wprowadza się do strzykawek.

Szczepy DNA przytaczane w poprzedniej części niniejszego opisu zostały zdeponowane w ATCC 23 sierpnia 1988. Były to: mp 11 pSTE34 (ATCC nr 40 482), pR0211 (ATCC nr 40 483) i pig24 (ATCC nr 40484). Fachowcy zdadzą sobie sprawę z tego, że te DNA można wprowadzić do każdego odpowiedniego układu ekspresyjnego w celu otrzymania somatotropin lub ich postaci zmutowanych

Bakteryjne szczepy E. coli K12 wykazujące ekspresję pewnych nowych somatotropin zwierzęcych wytwarzanych sposobem według wynalazku również zostały zdeponowane w ATCC 23 sierpnia 1988. Te bakteryjne szczepy obejmują szczep E. coli 1655 (ATCC nr 67 762), 1655/pROpSTA34 (ATCC nr 67 763), 1655/pROpSTE34 (ATCC nr 67 764), 4200 (ATCC nr 67 766), 4200/pROpSTA34 (ATCC nr 67 767), 4200/pROpSTE34 (ATCC nr 67 768), 420/pROpST (ATCC nr 67 769), 4255 (ATCC nr 67 770), 4255/pROpSTA34 (ATCC nr 67 771), 4255/pROpSTE34 (ATCC nr 67 772), 4255/pROpST (ATCC nr 67 773), 4300 (ATCC nr 67 774), 1655/pROpST (ATCC nr 67 765).

pROpST-SXAK182UAG (ATCC 68 056) zdeponowano 14 lipca 1989. pROpST-SXC183 191 del (ATCC 68 057) zdeponowano 14 lipca 1989.

Przykład XXIV. Usunięcie cystein z wiązania disulfidowego małej pętli z zastosowaniem 2 syntetycznych oligonukleotydów.

Syntetyczny oligonukleotyd oznaczony C183del ma sekwencję następującą:

5' CGG GTC ATG AAG AGA CGC TTC GTG GAG 3'

Oligonukleotyd ten różni się od analogicznej sekwencji DNA genu rpST pod dwoma względami. Po pierwsze, DNA kodujący kodon cysteiny w pozycji 183 jest w oligonukleotydzie usunięty. Po drugie, DNA kodujący kodon argimny w pozycji 184 jest zmieniony z CGC w AGA w oligonukleotydzie, przy czym ten ostatni także koduje argminę. Tak więc, cysteina obecna w pozycji 183 zostaje usunięta.

Jednoniciowy DNA pGEM.3z(f+)pST-SX jest substratem mutagenezy. Ten DNA jest złożony ze zmodyfikowanego genu rpST, zawartego w handlowo dostępnym fagemidzie, pGEM3z(f +). Modyfikacja genu rpST powoduje zmianę sekwencji DNA pozwalającą na wprowadzenie miejsca rozszczepiania endonukleazy restrykcyjnej SacI w pozycjach 225-230 regionu kodującego i wprowadzenie miejsca rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej Xbal w pozycjach 285-290. Te zmiany w sekwencji DNA nie zmieniają sekwencji aminokwasów białka rpST. Fragment EcoRI/Hindlll rozszczepiony tymi endonukleazami restrykcyjnymi przy zastosowaniu stadardowych sposobów postępowania daje w rezultacie fagemid pGEM-3z(f+)pST-SX. Jednoniciowy DNA pGEM 3z(f +) otrzymuje się z oczyszczonego faga zgodnie ze zwykłymi protokołami. 2000 ng tego DNA miesza się ze 10 ng oligonukleotydu C183del, przy czym ten ostatni został uprzednio fosforylowany na swoim końcu 5'z użyciem 5'-trifosforanu adenozyny i kinazy polinukleotydowej. Mieszanina zawartajest w całkowitej objętości 10//11 X buforu dołączenia (1 X bufor do łączenia stanowi 75 mM KC1 i 5 mM Tris-Cl, pH 8,0). Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 65°C w ciągu 7 minut, z następującą następnie 10 minutową inkubacją w temperaturze pokojowej. Ten sposób postępowania pozwala na połączenie oligonukleotydu z jednoniciowym DNA stanowiącym substrat. Połączone cząsteczki przeprowadza się w kowalencyjnie zamknięty, dwuniciowy DNA dodatkiem 22μ\ ΗίΟ, μ\ 20 mM ATP, 2 jednostek ligazy DNA T4 i dużego fragmentu polimerazy DNA I (co do definicji jednostki patrz katalog New England Biolabs, 1986), 2μΙ 20 X dNTP (mieszanina czterech 5'-trifosforanów deoksyrybonukleotydów, każdy w stężeniu 2mM) i 4μ1 10 X buforu uzupełniającego (1 X bufor uzupełniający stanowi 27,5 mM Tris-Cl, pH 7,5,15 mM, MgCfe, 2 mM DDT).

Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, połowę mieszaniny reakcyjnej wprowadza się do kompetentnych komórek HB101 zgodnie ze zwykłym protokołem transformacji. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C kolonie przenosi się na filtry nitrocelulozowe i przeprowadza hybrydyzację przez wykrycie pożądanej mutacji z wykorzystaniem promieniotwórczego znakowania odpowiedniego końca 5' za pomocą [y-³²P]-ATP i kinazy oligonukleotydowej. Po upływie 3 godzin prehybrydyzacji w 37°C w 5 X SSC, 1 X roztworze Denhardta i 15(^g/ml

164 207 drożdzowym tRNA, dodaje się promieniotwórczo znakowany oligonukleotyd i dopuszcza się do jego hybrydyzacji z DNA na filtrach przez noc w temperaturze 37°C w 5 X SSC, z następującym potem 30-minutowym przemyciem w TAC w temperaturze 61,5°C. Podczas tego ostatniego przemycie tylko te kolonie, których plazmidowy DNA zawiera pożądaną mutację, będą kontynuować hybrydyzację z promieniotwórczo znakowaną sondą oligonukleotydową. Kolonie te wykrywa się po ekspozycji przemytych filtrów na błonie fotograficznej czułej na promieniowanie X. Plazmidowy DNA otrzymuje się z kilku spośród tych kolonu z wyjściowej płytki Petri'ego, wprowadzonych do kompetentnych komórek HB101, jak uprzednio opisano, i poddanych ponownemu screeningowi z promieniotwórczo znakowaną sondą oligonukleotydową, jak powyżej. Plazmidowy DNA otrzymuje się z kolonii, których DNA hybrydyzuje z sondą i analizuje pod względem pożądanej sekwencji DNA. Wszystkie analizowane klony zawierają mutację C183del. Plazmidowy DNA z jednego klonu oznaczonego pGEM-3z(f + )pST-SXC 183del wprowadza się do kompetentnych komórek JM101 na drodze transformacji i jednoniciowy DNA otrzymuje się z oczyszczonego faga pochodzącego z pojedynczego tranformanta.

W celu usunięcia DNA kodującego cysteinę w pozycji 191, syntetyzuje się następujący oligonukleotyd oznaczony cl91del:

5' TTC GTG GAG AGC TCG TTC TAG TTG 3'.

Ten oligonukleotyd różni się od analogicznego DNA genu rpST pod dwoma względami. Po pierwsze, DNA kodujący kodon cysteiny w pozycji 191 jest usunięty z oligonlkleotydl. Po drugie, DNA kodujący serynę w pozycji 190 jest zmieniony z TCG w oligonukleotydzie, przy czym ten ostatni także koduje serynę.

DNA-matrycę z jednoniciowego DNA z pGEM-3z(f+)pST-SXC 183del i oligonukleotyd C191 del łączy się, wydłuża i liguje jak uprzednio. Mieszaninę wprowadza się do kompetentnych komórek HA 101 i transformanty analizuje pod względem obecności mutacji dokładnie tak, jak to opisano w przypadku C183del. Oligonukleotydu C191 del używa się jako promieniotwórczo znakowanej sondy wykrywającej. Warunki hybrydyzacji i przemywania są dokładnie takie, jak opisano dla C183del. Kilka klonów zawierających mutację C183del identyfikuje się na podstawie analizy sekwencji DNA. Plazmidowy DNA z usunięciem C183 i C191 jest oznaczony pGEM-3z(f+--pST-SXC183, 191del.

164 207

FtG.1

ECoRl

M 13mpllpSTA 34-RFDNA

Hind lii

pRO 211

ECoRI przeciąć ECoRI i Hind III oczyścić fragment zawierający gen pST przeciąć ECoRl i Hind 1Π fosfataza alkaliczna z jelita cielęcia

3-oczyścic duzy fragment transformować E.ColiN99cl 3. wyselekcjonować ampR ligować

Hindlll

ECoRI pROpSlA 3Λ

164 207 :1

ECoRI /oR+YHindlD

GLU 3

M13 mil pST-jednoniciowy DNA potączyc z o&gonukleotydami

5¹ GTC ATG AAG GAA OGC CGC TTC . 3¹ GLU 3

5' GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAC 31 GLU 4

65°C,7min temperatura pokojowa 10 min

GAA

3¹ δ!

5' GTC ATG AAG CGC CGC TTC GAG Al ĆAG TAC T TĆ ACAGCG GĆG AAGCACC t C T(

r. GLU 4

CAG GCC TTC TAG 3¹ oligonukleotydy

ACAĆGG AAG AT ‘

AG(

TCC

ECoRl z^rK/Hindlll

5⁷łaqowy

DNA dNTP ATP

ECOLI DNA polimerąza DNOI E Coli, duży fragment ligaza DNA T4

FIG. 2 (1

164 207

transformować EColi JM 101 poddać screenmgowi (ysinki przez hybrydyzację albo z GLU 3 znakowanym ^p albo z GLU4 znakowanym 32_p

3. przeprowadzić sekwencjono wame DNA tysinek hybrydy zujących z obydwoma oligonukleotydami

GLU

GTC ATG AAG GAA CGC OGC TTC GTG GAG AGC AGC

FIG 2 (2)

Sekwencja DNA pST i warianta p STA 34 pST PSTA34

FIG. 3

164 207

ECoR! in

Τ'- <

M 13mpllpST-jednoniciowy DNA lpotączyc z ęligonukleotydem 5¹ GTC ATGAAG GCG CGC CGC HC GTG GAG AGC AGC C<T GCC TTC TAG 2 65°C ,7min 3I

3.temperatura pokojowa 10 min i¹ GCG GC

GTC ATG AAG CGC CGC TTC GTC GAQ AGC AGę ĆA3TAĆ TTĆ ACAGĆGGOG AZGĆŻĆCTC TĆG TĆG AG T GCC TTC TAG 3¹

A ĆGG AAG AtĆ ,__,___

5’fagowy~ DNA oligonukleotydy

3'

ECoRl /oSTA/HincI ΠΙ dNTP, ATP

ECoh pohmeraza DNA E.Coli duzy fragment; Iiga2a

ECoRI

Hind 111

DNA TA il transformować E.C0I1 JM 101 2.poddać screemngcwi tysmki przez hybrydyzację z AA1 D znakowanym 32 _ sekwencjonować DNA ^μ

FIG. 4(<j

164 207

ALA

GTC ATG AAG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC CYS

AGC TGT GCC TTC TAG

ECoRl

Hmd ID

M 13 mp 11 p STA 3

FIG 4 (i)

Hind 111 Hind Dl

Hmd 111

ECoRl pEFF-902

M13mpl1-RFDNA

ECoRl

ΗιηόΠΙ

Oczyścić fragment zawierający gen pST

ECoRl Hind III fosfataza alkaliczna z jelita cielęcia oczyścić duży fragment

Hmd 111

M 13 mp 11 pST - RFDNA

FIG 5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1 Sposób hamowania agregacji zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej, znamienny tym, ze zastępuje się co najmniej jedną do wszystkich czterech cysteinowych reszt aminokwasowych zwierzęcej somatotropiny rekombinowanej resztami aminokwasowymi nie zaleznie wybranymi spośród argininy, lizyny, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, asparaginy, glutaminy, histydyny, alaniny, glicyny, izoleucyny, leucyny, waliny, fenyloalaniny, tryptofanu, tyrozyny, metioniny, seryny, treoniny lub prohny.
2. 2. Sposób wedł ug zastrz 1 ,zn amienmy tym, zejedną ldb d v^ie cyste my te labilnaj mniejszej pętli samototropiny, położone w pozycjach 183 i 191 C-końca somatotropiny, zastępuje się aminokwasami wybranymi spośród alaniny, se^ny, kwasu glutaminowego, argi^ny, tryptofanu lub asparagine, a cysteiny w pozycjach 55 i 166 w stabilnej dużej pętli nie ulegają zastąpieniu.