PL161591B1

PL161591B1 - acetamidów i- benzamidów PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL161591B1
Application number: PL89283603A
Authority: PL
Inventors: Eric Cossement; Jean Gobert; Roland Boydens; Jacques Mathieu
Original assignee: Ucb Sa
Priority date: 1988-08-16
Filing date: 1989-08-11
Publication date: 1993-07-30
Also published as: GR3004267T3; IL91243A; PL161161B1; NO893279L; ATE72241T1; KR900003165A; PT91438A; EP0356413A1; EP0356413B1; PT91438B; DK398189D0; FI102065B; DK398189A; KR0136108B1; AU614247B2; FI893714A0; ZA896222B; NZ230290A; AU3991789A; RU1838312C

Abstract

Sposób wytwarzania now ych pochodnych N- /4-m orfolino-6-propylo-1,3,5-triazyn-2-ylo/-aceta- m idów i -benzam idów o wzorze ogólnym 1, w któ- rym R 1 oznacza atom w odoru, rodnik alkilow y lub aryloalkilow y, a R 2 oznacza rodnik alkilow y, ary- low y, chlorowcoarylowy, alkiloarylow y, alkoksya- rylowy lub aryloalkilow y, przy czym rodniki alki- low e i alkoksylowe zawieraja od 1 do 4 atom ów wegla, oraz ich soli addycyjnych z kwasam i nie- toksycznymi dopuszczalnymi farm aceutycznie, zna- mienny tym, ze poddaje sie reakcji, w stosunku rów nom olowym , 2-am ino-4-m orfolino-6-propvlo- 1,3,5-triazyne o wzorze 2, w którym R 1 ma znacze- nie podane wyzej, z halogenkiem R 2-karbonylu o wzorze HalCOR2, w którym R2 ma znaczenie podanej powyzej a Hal oznacza ch lorow ca, i ewen- tualnie otrzymane N -/4-m orfolin o-6-p rop ylo-1,3,5- triazyn-2-ylo/-acetam idy i -benzam idy przeprowa- dza sie w ich sole addycyjne z kwasam i nietoksycz- nymi dopuszczalnym i farm aceutycznie. Wzó r 1 PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych N-/4-morfolino-6propylo-1,3,5-triazyn-ylo/~acetamidów i -benzamidów oraz ich soli addycyjnych z kwasami nietoksycznymi, dopuszczalnymi farmaceutycznie. Związki te mogą być stosowane w lecznictwie.

Z japońskiego opisu patentowego nr 69688/74 znane są już 2-amino-l,3,5-triazyny podstawione w pozycji 4 grupą aminową, grupą aminową jedno- lub dwupodstawioną rodnikiem alkilowym, alkenylowym, cykloalkilowym, arylowym lub aryloalkilowym albo rodnikiem heter^^^j^lklicznym zawierającym azot oraz w pozycji 6 rodnikiem alkilowym, arylowym lub aryloalkilowym. W szczególności opisano tam wytwarzanie 2-amino-4-morfoIino-6-propylo-l,3,5-tnazyny. Według tego opisu patentowego ujawnione związki mają właściwość zwiększania wydzielania kortykoidów a w szczególności glukokortykoidów.

Ponadto K. Wakabayashi Ko i inni /Yuki Gosei Kagaku Kyokai, 28, (1970), 252-260; Chem. Attslr. ⁷² (¹⁹⁷⁰), ^06537/ zsyntetyzowali ²-alki^lo-⁴,⁶-bis-/alkiloamⁱno/-l/^,55-trbazyny, w ^których rodnik w pozycji 2 zawiera od 1 do 17 atomów węgla i może również stanowić rodnik trójchlorometylowyl trójbromometylowy lub 2-chloroetylowy, podczas gdy rodniki w pozycjach 4 i 6 są identyczne i mogą być podstawione grupą hydroksylową lub też stanowią zawierający azot układ heterocykliczny, taki jak rodnik piperydynowy lub morfolinowy. Związkiem reprezentatywnym dla tej rodziny jest 2-metylo-4,6-dwumorfollno-l-3-5-triazyna. Związki te zbadano pod względem ich działania chwastobójczego oraz ich właściwości hamowania przemiany amoniaku w azotan. Jednakże nie ma tam wzmianki o właściwościach farmakologicznych.

Obecnie stwierdzono, że nowe pochodne N-/-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyn-2-ylo-/-acetamidów i -benzamidów mają wartościowe właściwości farmakologiczne a w szczególności właściwości wzmagania centralnych i obwodowych efektów cholinergicznych wywoływanych środkiem cholinomimetycznym, takim jak na przykład oksotremoryna, podczas gdy same te związki nie wykazują właściwego efektu cholinergicznego. Ponadto stwierdzono, również, że związki te wykazują korzystną właściwość łagodzenia skutków wynikających z niedoczynności cholinergicznej wywołanej przeciwdziałającym środkiem cholinergicznym, takim jak na przykład skopolamina. Układ cholinergiczny jest mocno powiązany ze zjawiskami utrwalania pamięci oraz uczenia się.

Tak więc, na przykład podawanie młodym osobnikom środka antycholinergćcznego, takiego jak skopolamina, wywołuje braki w pamięci podobne do obserwowanych u osobników starszych. I na odwrót, środki cholinergiczne, jak fizostygmina, są zdolne zwalczać amnezję wynikłą z podawania środków antycholinergicznych (S.D.Glick i inni; Behavioral Biology, 7 (1972), 245-254; U.Schindler i inni, Drug Develop, Res.4, (1984), 567-576). Ponadto udowodniono, że jedną z cech charakterystycznych, najczęściej związanych z otępieniem jest właśnie degradacja układu cholinę161 591 rgicznego (Celluar and molecular baris of cholinergic function. Ed.M.J.Dowdall i I.N.Hawthorne 1987, rozdział 99; artykuł A.Nordberga i innych). Dlatego też związki te można stosować do leczenia zaburzeń poznawczych i zachowań związanych z wiekiem i syndromami otępienia. W szczególności znajdują one zastosowanie w leczeniu zaburzeń związanych z chorobą Alzheimera, w otępieniach starczych typu choroby Alzheimera oraz we wszelkiej rozwijającej się patologii zdolności poznawczych (C.G.Gottfries, Psychopharmacology, 86, (1985), 245-252; C.G.Gottfries, Neurobiology of Ageing, 4 (1983), 261-271).

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych N-/4-morfolino6-propylo-l,3,5-triazyn-2-ylo/-acetamidów i -benzamidów o wzorze ogólnym 1, w którym Ri oznacza atom wodoru, rodnik alkilowy lub aryloalkilowy a R2 oznacza rodnik alkilowy, arylowy, chlorowcoarylowy, alkiloarylowy, alkoksyarylowy lub aryloalkilowy, przy czym rodniki alkilowe i alkoksylowe zawierają od 1 do 4 atomów węgla, jak również ich soli addycyjnych z kwasami nietoksycznymi, dopuszczalnymi farmaceutycznie.

Sposób według wynalazku polega na reakcji, w stosunku równomolowym, 2-amino-4morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyny o wzorze 2, w którym Ri ma znaczenie podane powyżej, z halogenkiem Ri-karbonylu o wzorze HalCORi, w którym R2 ma znaczenie podane powyżej a Hal oznacza atom chlorowca, korzystnie atom chloru. Tę znaną reakcję prowadzi się zazwyczaj w rozpuszczalniku organicznym, na przykład dichlorometanie lub pirydynie, w temperaturze pomiędzy temperaturą pokojową a temperaturą wrzenia rozpuszczalnika i w obecności akceptora kwasu, takiego jak trzeciorzędowa zasada organiczna, na przykład trietyloamina lub pirydyna, bądź zasada nieorganiczna. Tak otrzymane N-/4-morfoIino-6-propylo-I,3,5-triazyn-2-ylo/-acetamidy i -benzamidy mogą być ewentualnie przeprowadzone znanymi metodami w sole addycyjne z kwasami nietoksycznymi, dopuszczalnymi farmaceutycznie. Jako przykłady kwasów dopuszczalnych farmaceutycznie można wymienić kwasy mineralne, takie jak kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, fosforowy, itp., oraz kwasy organiczne, takie jak kwas octowy, cytrynowy, winowy, benzoesowy, salicylowy, maleinowy itp.

Wyjście 2-amino-4-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyny o wzorze 2 mogą być otrzymane przez reakcję 2-amino-4-chIoro-6-propylo-l,3,5-triazyny o wzorze 3 z morfoliną, według schematu na rysunku, przy czym we wzorach 2 i 3 R1 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy zawierający od 1 do 4 atomów węgla. Reakcję tę prowadzi się w temperaturze podwyższonej, zwykle w temperaturze wrzenia użytego rozpuszczalnika i w obecności zasady. Rozpuszczalnikiem, w którym prowadzi się reakcję, jest albo użyta w nadmiarze sama amina, albo obojętny rozpuszczalnik organiczny, korzystnie dioksan, przy czym w tym przypadku używa się zasadę organiczną lub nieorganiczną inną niż amina zastosowana w reakcji, na przykład trójetyloamina.

2-Amino-4-chloro-6-propyIo-l,3,5-triazyny o wzorze 3 stosowane jako surowce mogą być otrzymane znanymi metodami przez reakcję 2,4-0^140 ro-ó-propyyo-lj^-triazyny z odpowiednią aminą.

Sposób według wynalazku ilustrują następujące przykłady.

Przykład I. Wytwarzanie 2-amino-4-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyn o wzorze 2.

1. Chlorowodorek 2-amino-4-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyny.

Produkt ten opisał S.Murai i inni w japońskim zgłoszeniu patentowym 69 688/74/Chem.Abstr.81, (1974), 13688Χ/. Można go otrzymać poniższą metodą.

87g/l mol/ morfoliny miesza się z 8,6g/0,05 mola/ 2-amino-4-chloro-6-propylo-1,3,5triazyny. Temperatura mieszaniny wzrasta samorzutnie do 54°C. Następnie ogrzewa się tę mieszaninę we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną w ciągu 5 godzin i odparowuje mieszaninę reakcyjną pod zmniejszonym ciśnieniem a otrzymaną pozostałość rozpuszcza się ponownie w octanie etylu. Roztwór przemywa się trzy razy wodą a potem suszy nad siarczanem sodu. Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem a pozostałość przekrystalizowuje się z heksanu. Otrzymuje się 9,1 g 2-amino-4-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyny. Wydajność: 82%. Temperatura topnienia 127-128°C. Chlorowodorek: temperatura topnienia 210-211°C /alkohol izopropylowy-eter/.

Analiza C10H17N5O · HC1 w % obliczono: C 46,24 H 6,94 N 26,97 Cl' 13,68 znaleziono: C 46,21 H 6,90 N 26,77 Cl' 13,61

161 591

Użyta jako produkt wyjściowy w tym etapie 2-amino-4-chloro-6-propylo-l ,3,5-triazyna została wytworzona według metody S.Murai i inni /japońskie zgłoszenie patentowe 69688-/74/.

2. Chlorowodorek 2-/metyloamino/-4-morfolino-6-propylo-l ,3,5-triazyny.

Do roztworu zawierającego 5,6 g /0,03 mola-/ 2-chloro-4-/metyloamino/-6-propylo-l,3,5triazyny w 50 ml dioksanu dodaje się roztworu zawierającego 8,7 g /0,1 mola/ morfoliny w 50 ml dioksanu. Mieszaninę ogrzewa się we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną w ciągu 5 godzin. Następnie schładza się i sączy utworzony chlorowodorek morfoliny. Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem a pozostałość traktuje się chloroformem. Przemywa się wodą i fazę organiczną suszy nad siarczanem sodu. Odparowuje się rozpuszczalnik a pozostałość przekrystalizowuje się z octanu etylu. Otrzymuje się 5,3 g 2-/metyloamino/-4-morfolino-6-propylo-1,3,5-triazyny. Wydajność: 74%. Temperatura topnienia: 131-133°C.

Uzyskany produkt rozpuszcza się na gorąco w alkoholu izopropylowym. Do tego roztworu dodaje się równoważną ilość roztworu kwasu solnego w eterze etylowym. Chlorowodorek krystalizuje po ochłodzeniu. Odsącza się go, przemywa eterem etylowym i suszy. Wydajność: 75%. Temperatura topnienia: 177-178°C.

Analiza Ci,HigN₅O · HC1 w % obliczono: C 48,26 H -7331 N 25^9 Cl' 12,97 znaleziono: C 4838 H 7,40 N Cl 12,64

Zastosowano w tym etapie jako produkt wyjściowy 2-chloro-4-/metyloamino/-6-propylo1,3,5-triazynę otrzymuje się według metody T.Tsujikawa i inni /Yakugaku Zasshi, 95, (1975), 512-520/

Przykład II. Wytwarzanie N-/4-morfoiino-6-propylo-l,3,5-tΓiazyn-2-ylo/-acetamidów i benzamidów o wzorze 1. N-/4-morfollno-6-propylo-l,3,5-triazyn-2-ylo/-acetamid (związek 1).

Do roztworu 11,2 g /0,05 mola/ 2-amino-4-morfoIino-6-propylo-l ,3,5-triazyny w 100ml bezwodnej pirydyny wkrapla się w temperaturze pokojowej 4g /0,05 mola/ chlorku acetylu. Mieszaninę miesza się w ciągu 6 godzin a potem pozostawia ria przeciąg 48 godzin. Odsącza się chlorowodorek pirydyna a przesącz odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość traktuje się jednorazowo toluenem, który się ponownie odparowuje. Następnie pozostałość rozpuszcza się w dwuchlorometanie, przemywa roztwór wodą i suszy nad siarczanem sodu. Pozostałość otrzymaną po odparowaniu rozpuszczalnika oczyszcza się chromatografią na krzemionce (cluent:dwuchlorometan - etanol 90:10 /v/v/ i produkt ostatecznie przekrystalizowuje z octanu etylu. Otrzymuje się 5,75g N-/4-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyn-2-ylo/-acetamidu. Wydajność: 43,4%. Temperatura topnienia: 141-142°C /związek la/. Chlorowodorek: temperatura topnienia: 145-146°C /alkohol izopropylowy-eter/ /związek lb/.

Analiza C12H19N5O2 · HC1 w % obliczono: C 47,76 H 6,63 N 23,22 Cl' 11,77 znaleziono: C 47,78 H 6773 N 22,80 Cl' 11,62

2. Chlorowodorek N-/4-morfoiino-6-pIΌpylo-],3,5-triazyn-2-yIo/-benzamidu /zwąązek 2/.

Do roztworu 11,2g /0.05 mola-/ 2-amino-4-morfolino-6-propylo-l ,3,5-triazyny w 200 ml dwuchloroetanu dodaje się w temperaturze pokojowej kolejno roztworu 7,7 g /0,055 mola-/ chlorku benzoilu w 50 ml dwuchloroetanu oraz roztworu 5,5 g /0,055 mola-/ trójetyloaminy w 50 ml dwuchloroetanu. Mieszaninę ogrzewa się we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną w ciągu 6 godzin a następnie schładza do temperatury pokojowej. Przemywa się ją kolejno wodą, wodnym roztworem wodorowęglanu sodu a potem jeszcze jeden raz wodą. Fazę organiczną suszy się nad siarczanem sodu i odparowuje rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymałą pozostałość chromatografuje się na krzemionce /eluent: dwuchlorometan-etanol 95:5 /v/v/ a następnie ostatecznie przekrystalizowuje z mieszaniny 50:50 /v/v/eteru i heksanu. Produkt tworzy chlorowodorek w eterze. Tak otrzymuje się 12,1 g chlorowodorku N-^-morfolino-ó-propylo-fS^-triazynD-ylo/benzamidu. Wydajność: 66,5%. Temperatura topnienia: 197-198°C.

Analiza C17H21N5O2 · HCl w % obliczono: C 56,12 H. 6,05 N 1926 Cl' 9,77 znaleziono: C 5630 H 620 N 19J6 Cl' 9,54

161 591

Związki zestawione w tabeli 1 otrzymano albo według sposobu z przykładu II. 1 albo według sposobu z przykładu II. 2.

Tabela I

2-R-4-Morfolino-6-propylo- 1,3,5-triazyny

Związek	Podstawnik n/r,/cor₂	Sposób z przykładu	Wydajność /%/	Temperatura topnienia /°C/	Analiza
obliczono /%/	znaleziono /%/
3	NHCOCH_aCeH_s	II.1	51,3	113^113	C	63,34	63,18
					H	6,74	6,85
					N	20,52	20,55
4	NHCOCH/CH3/2	II.l	34,3	141	C	57,34	56,84
					H	7,85	7,84
					N	23,89	23,70
5a	N/CH3/COCH3	II. 1	34,8	60-61	C	55,91	56,02
					H	7,53	7,57
					N	25,09	25,05
5b	N/CHji/COCHs	II. 1	75,5	104-105	C	49,44	48,78
/1/					H	6,97	7,01
					N	22,19	22,43
6	N/CH^COCH/CHa/i	II.l	38,5	36-37	C	58,62	58,78
					H	8,16	8,33
					N	22,80	22,62
7	N/CHa/COCeHs	II.2	46,5	122	C	57,22	56,78
/1/					H	6,36	6,40
					N	18,54	18,28
8	NH-COCeH.-pCI	II.2	66	205-206	C	51,27	51,19
/1/					H	5,31	5,34
					N	17,58	17,49
9	N/CHa/COCeHł-pCl	II.2	72	96-97	C	57,52	58,07
/1/					H	5,90	6,17
					N	18,63	18,65
10	NHCOC_eH,-pOCH3	II.2	33	199	C	54,89	54,83
/1/					H	6,14	6,17
					N	17,78	17,e0
11	N/CHa/COCeH.-pOCHa	11.2	56	120	C	55,94	53,4
/1/					H	6,42	6,48
					N	17,17	17,22
12	NHCOCoH.-pCHa	II.2	53	188	C	57,21	57,45
/1/					H	6,40	6,42
					N	18,53	18,73
13	N/CHa/COCeH.-pCHa	11.2	74	99	C	58,23	58,08
/1/					H	6.69	6,73
					N	17,87	18,11
14	N/CH3/COCeH^-/3,4-di-OCHa/	II.2	70	73	C	59,84	60,12
					H	6,78	7,09
					N	17,44	17,45
15	NHCOCeH₃-/3,4-di-CH₃/	II.2	45	232	C	58,23	58,42
					H	6,69	6,65
					N	17,87	17,72

/1/ chlorowodorek

Jak wspomniano powyżej N-/4-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyn-2-ylo/-acetamidy i -benzamidy o wzorze 1, jak też ich sole addycyjne z farmaceutycznie dopuszczalnymi, nietoksycznymi kwasami wykazują właściwość korygowania skutków niedoczynności układu cholinergicznego. Ta korzystna właściwość uwydatniona jest poprzez serię prób farmakologicznych za pomocą których okazuje się, że związki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują niektóre działania podobne do wywieranych przez dobrze znane związki cholinergiczne, takie jak oksotremoryna, arekolina lub fizostygmina lub też przeciwstawiają się działaniu antagonisty cholinergicznego, skopolaminy.

Związki otrzymane sposobem według wynalazku poddano próbom farmakologicznym, których wyniki przedstawiono poniżej.

161 591

1. Wymaganie działań cholinergicznych oksotremozy.

Celem tego testu /RLC.Rathbun i inni Psychopharmacologia 4 /1963/ 11*4125/jest wykazanie, że związki otrzymane sposobem według wynalazku wzmagają centralne i obwodowe działania cholinergiczne wywołane przez podawanie myszom małej dawki oksotremoryny.

Stopień obwodowego pobudzenia chollnergicznego mierzono efektem ślinopędnym, określanym za pomocą następującego układu notowania.' wynik 0. ślina nie przewyższa śliny wydzielanej przez normalną mysz wynik 1: wokół zębów znajduje się nieco śliny wynik 2: ślina rysuje wąski pasek wokół pyszczka wynik 4: ślina zwilża powierzchnię pod brodą wynik 6: ślina cieknie z pyszczka, na przykład na kończyny przednie.

Wyniki pośrednie nie są stosowane i ślinę usuwa się po każdej obserwacji.

Stopień centralnego pobudzenia chollnergicznego mierzono efektem wywoływania drgawek, określanych za pomocą następującego układu notowania: wynik 0: brak drgawek, wynik 1: lekkie i okresowe drgawki przypadkowe, wynik 2: drgawki umiarkowane i lekkie, często powtarzające się, wynik 4: drgawki uwydatnione lecz przeplatane okresami spokoju, wynik 6: drgawki bardzo wydatne i prawie ciągłe.

Samce myszy NMRI /20 do 25 g/ rozdzielono na cztery grupy po pięć zwierząt, to znaczy na jedną grupę kontrolną i trzy grupy poddawane badaniu. Testowany związek podawano drogą dootrzewnową (trzem grupom poddawanym badaniu) na 20 minut przed podaniem oksotremoryny, przy czym dawka była różna dla każdej z traktowanych grup. Oksotremorynę poddawano dootrzewnowo grupom traktowanym oraz grupie kontrolnej w dawce 0,05 mg/kg w roztworze w 10 ml/kg roztworu fizjologicznego soli.

Dawka ta odpowiada mniej więcej minimalnej dawce oksotremoryny wywołującej drgawki i ślinotok. ^po podamu okso^tremoryn^y zwierzęta umieszcza si^ę poje^dynczo w mał^ych klatkach ⁱobserwuje się w regularnych odstępach 5-minutowych aż do całkowitego zaniku efektów cholinergmznych. Dla ka^żdej z ^grup ^dodaje s^ię w^yni^ki md^ywiclualne uzyskane w ka^żdym okresie otiserwacp, co pozwata na sporz^ądzenie krzywej przedstawiającej sum^ę wynikhw w za^nośd od czasu, charakterystycznej dla każdej grupy.

Wartości średnie powierzchni pod krzywymi, otrzymanymi dla każdej z traktowanych grup, porównuje sⁱę ze średmą wartośrią powierzani po^{d k}rzywą opowiadającą grupie ^kontrolnej ⁱ są one przedmiotem analizy statystycznej według metody Mann-Whitneya. Wychodząc z tego porównania można określić „minimalną dawkę czynną. Ta „minimalna dawka czynna jest na^jmniejszą dawką związlcu, konieczn^{ą dl}a zauważema jeszcze wzmożema s^ię efektu ślmopędnego lub wywołuj ącego drgawki oksotremoryny albo inaczej mówiąc, dla otrzymania powierzchni większej niż powierzchnia pod krzywą, uzyskaną dla grupy kontrolnej.

Wyniki otrzymane w tym tekście wykazały, że związki otrzymane według wynalazku wzmagają efekt ślinopędny oksotremoryny w dawce minimalnej pomiędzy 7,7 i 107 mg/kg oraz wzmagają efekt wywołujący drgawki w dawce minimalnej między 8 i 112 mg/kg. Ponadto minimalne dawki czynne nie wykazują właściwych efektów cholinergicznych i są bardzo dalekie od dawek śmiertelnych określonych za pomocą testu Irwina. Poza tym, test ten wykazuje, że niektóre z tych związków podawane w minimalnej dawce czynnej dają efekty o dłuższym czasie trwania niż dobrze znany związek cholinergiczny jakim jest ester metylowy kwasu 1-metylo-1,2,5,6-czterowodoropirydynokarboksylowego-3 /arekolina/. Tak więc związki otrzymane sposobem według wynalazku wykazują wzmaganie się efektów ślinopędnych i wywołujących drgawki oksotremoryny w 20 minut po podaniu ich w minimalnej dawce czynnej, natomiast w tych samych warunkach arekolina nie daje żadnego wzmożenia tych efektów.

2. Hamowanie nadczynności wywołanej skopolaminą.

Zwierzę umieszczone po raz pierwszy w nowym otoczeniu objawia intensywną działalność w celu zbadania tego nowego środowiska. Stopniowe zmniejszanie się i wreszcie zanik tej działalności badawczej, czyli innymi słowy przyzwyczajenie się do nowego środowiska można uważać jako prostą formę przyuczania się. Ta prosta forma przyuczania się jest wrażliwa na wpływ leków, które

161 591 ułatwiają lub hamują przyuczanie się /A.Platel i inni, Psychopharmacology, 78, /1982 346-352. Tak więc na przykład skopolamina, związek powodujący zaburzenia pamięci wywołuje nadczynność poszukiwawczą u szczura umieszczonego w nowym otoczeniu. Zjawisko to związane jest z centralną aktywnością cholinergiczną tego związku /W.J.Stewart i inni, Psychopharmacologia, 44, /1975/, 291-295/. Natomiast antagonista cholinergiczny taki jak fizostygmina przeciwstawia się nadczynności wywołanej skopolaminą.

W teście opisanym poniżej otrzymane związki w zależności od ich rozpuszczalności są podawane albo w fizjologicznym roztworze soli albo w odpowiednim nośniku /poważnie w roztworze buforowym cytrynianu o pH 5/. Test ten pozwala stworzyć dla związków otrzymanych według wynalazku aktywność porównywalną z aktywnością fizostygminy. Oparty onjest zjednej strony na oryginalnej technice opisanej przez A.Platela /lOO.cii/, a z drugiej strony na metodzie zautomatyzowania rejestracji pomiarów opisanej przez H.J.Taugera i innych /J.Neuroscience Methods, 10 /1984/, 237-245/. W teście tym użyto samców szczurów Spraque-Dawlej SPF /Specific Pathogen Free, 160 do 200 g/. W ciągu tygodnia poprzedzającego próbę zwierzęta te w grupach po 15 sztuk są przechowywane w warunkach normalnych w standardowych klatkach z siatki a pokarm oraz napój są dowolnie dostępne. Na początku próby szczury rozdziela się na 4 jednorodne grupy po 10 zwierząt i przyzwyczaja w ciągu godziny do pomieszczenia doświadczalnego.

Następnie każdą grupę zwierząt poddaje się określonemu traktowaniu:

- grupa 1 otrzymuje dwa jednoczesne zastrzyki dootrzewnowe fizjologicznego roztworu soli lub użytego nośnika, grupa 2 otrzymuje jeden zastrzyk doostrzewnowy fizjologicznego roztworu soli lub użytego nośnika oraz jeden zastrzyk dootrzewnowy roztworu skopolaminy 0,5 mg/kg,

- grupa 3 otrzymuje jeden zastrzyk dootrzewnowy roztworu testowanego związku w odpowiednim nośniku oraz jeden zastrzyk dootrzewnowy roztworu fizjologicznego soli lub użytego nośnika.

- grupa 4 otrzymuje jeden zastrzyk dootrzewnowy testowanego związku oraz jeden zastrzyk dootrzewnowy skopolaminy 0,5 mg/kg.

Po trzydziestu minutach od powyższego traktowania równocześnie testuje się cztery grupy zwierząt. W tym celu każdą grupę umieszcza się w kwadratowym ogrodzeniu /100X100 cm/ utworzonym z zakratowanej podłogi i pionowej ścianki o wysokości 50 cm. Każde z tych ogrodzeń zawiera 16 stref, obejmujących 4 strefy narożne, 4 strefy centralne i 8 stref obwodowych. Oprócz tego każde ogrodzenie jest wyposażone w 2 rzędy komórek na podczerwień umieszczonych 2 cm powyżej podłogi dla rejestrowania poziomych przemieszczeń zwierząt oraz w 2 inne rzędy komórek na podczerwień umieszczonych na wysokości 10 cm od podłogi dla rejestrowania przemieszczeń pionowych. Komórki na podczerwień są połączone z mikroprocesorem, który umożliwia określenie wartości średniej z odległości /w cm/ przebytych przez grupę zwierząt, określenie średniej liczby dokonanych wyprostowań, jak też rozkładu przemieszczeń poziomych w różnych strefach centralnych, obwodowych i narożnych wyrażonych przez średni czas przebywania w tych różnych strefach. Każdy testowany związek jest badany za pomocą co najmniej trzech różnych dawek, wychodząc z których określa się minimalną dawkę czynną, hamującą nadczynność wywołaną dootrzewnowym podawaniem 0,5 mg/kg skopolaminy. Następnie porównuje się albo wartości otrzymanych w grupie 2 /trakto wanej jedynie skopolaminą/ z wartościami uzyskanymi w grupie 4, traktowanej równocześnie skopolaminą i testowanym związkiem albo wartości otrzymane w grupie 4 z wartościami uzyskanymi w grupie 3 traktowanej jedynie testowanym związkiem. Grupa kontrolna 1 służy do kontroli działania skopolaminy podawanej grupie 2. Zauważone różnice ocenia się statystycznie we wszystkich przypadkach metodą Mann-Whitneya.

Wyniki otrzymane w tym teście wykazały iż związki otrzymane według wynalazku mają dobre działanie hamujące nadczynność wywołaną skopolaminą. Określone dla tych związków minimalne dawki czynne wynoszą od 1 do 89 mg/kg. Ale w przeciwieństwie do fizostygminy, która jest nieaktywna jeśli zostanie podana na więcej niż 15 minut przed przeprowadzeniem pomiarów, związki otrzymane według wynalazku wykazują jeszcze działanie hamujące gdy są podawane na 30 minut przed wykonaniem pomiarów. Działanie ich ma więc dłuższy okres trwania niż w przypadku fizostygminy.

3. Hamowanie działania skopolaminy na elektroencefalogramie /EEG/

161 591

Podawanie skopolaminy człowiekowi lub zwierzęciu wywołuje zaburzenia pamięci porównywalne z zaburzeniami pojawiającymi się w trakcie normalnego lub patologicznego starzenia się. U pacjentów cierpiących na otępienie starcze typu Alzheimera uzyskano poprawę zaburzeń pamięci poprzez podawanie fizystygminy, związku hamującego acetylocholinesterazę. Skopolamina podawana dootrzewnowo szczurom w dawce 0,5 mg/kg wywołuje zmiany widma EEG przejawiające się we wzroście natężenia pasma 8 Hz, zmniejszeniu natężenia pasm od 20,8 do 40 Hzjak też we wzroście całkowitego natężenia widma EEG. Fizostygmina przeciwstawia się tym zmianom. Zadaniem tego testu jest wykazanie za pomocą metody analizy ilościowej elektroencefalogramu, że związki otrzymane według wynalazku mają właściwość neutralizowania działanie jakie skopolamina wywiera na widmo EEG /T.Etevenon - Electroencephalographie sur ordinateur. Analiza ilościowa i statystyczna Copedith, Paryż, 1978/. W tym teście używa się samców szczurów Albinos Spraque-Dawley SPF /160 do 200 g/.

Gdy zwierzęta mają trzy miesiące wówczas aseptycznie i pod narkozą wszczepia się im na stałe 5 elektrod korowych: jedną elektrodę obojętną, jedną elektrodę czołową lewą i jedną prawą oraz jedną elektrodę potyliczną lewą i jedną prawą /P.Etevenon loc.cit./.

Test przeprowadza się gdy zwierzęta osiągną wiek około 15 miesięcy. W międzyczasie zwierzęta trzyma się w pojedynczych klatkach, gdzie dostają do woli wody i pożywienia oraz poddawane są regularnemu cyklowi dziennemu obejmującemu okres ciemności między 18 godziną wieczorem a 6 godziną rano. Jednocześnie zwierzęta przyzwyczajają się do klatek w izolowanej od dźwięku kabinie, które będą później zajmowane dla zarejestrowania elektroencefalogramów jak też do warunków doświadczalnych poprzez podawanie placebo drogą dootrzewnową. Produkty podaje się bezpośrednio przed zarejestrowaniem EEG. Szczury rozdziela się na grupy po 8 zwierząt i rejestruje 16 próbek widm EEG w ciągu 5 sekund /dwa widma EEG na każde zwierzę/. Otrzymane widma analizuje się następnie za pomocą komputera /szybkie przekształcenie Fouriera/, co pozwala określić dla każdej grupy średnią z przeprowadzonych 16 pomiarów i wyprowadzić z tego dla jednego zwierzęcia całkowite natężenie widma EEG jak też rozkład tego natężenia /w %/ w różnych pasmach częstotliwości. Operację tę /rejestrację widm/ powterza się 9 razy /całkowity czas trwania: 121 minut/.

Działanie badanego związku wyprowadza się ze statystycznego porównania wyników otrzymanych dla różnych grup zwierząt, którym podawano kolejno: testowany związek, skopolaminę i placebo.

W poniższej tabeli 2 przedstawiono dla kilku związków według wynalazku, podawanych dootrzewnowo w dawce wyrażonej w mg/kg, procent zmniejszenia wzrostu natężenia pasma

6,4-9,6 Hz /średnio 8 Hz/, to znaczy wzrostu wywołanego dootrzewnowym podawaniem 0,5 mg/kg skopolaminy.

Tabela 2

Zahamowanie działania skopolaminy w paśmie od 6,4 do 9,6 Hz EEG

Związek nr	Dawka mg/kg	Zahamowanie /w %/
la	2,7	100
7	3,6	66,7
Sa	0,88	46,7
6	3,1	55,6
7	12	93,8
Fizostygmina	0,4	76,8

Wyniki, wykazują, że związki otrzymane sposobem według wynalazku tak jak fizostygmina hamują działanie wywierane przez skopolaminę na elektroencefalogram. Widoczne jest, że zahomowanie to osiąga i przekracza nawet 50% przy dawkach dość niskich, bardzo odległych od dawek toksycznych, co nie ma miejsca w przypadku fizostygminy.

4. Unikanie bierne w próbach wielokrotnych.

Związki otrzymane sposobem według wynalazku zbadano w celu ukazania zjednej strony ich właściwości wspomagania przyuczania się wyrażonej poprzez zmniejszenie ilości prób koniecznych do osiągnięcia określonego z góry kryterium a z drugiej strony ich właściwości przeciwstawiania się

161 591 amnezji wywołanej podawaniem skopolaminy. W tym celu użyto metody unikania biernego w próbach wielokrotnych. Metoda ta jest dobrze znana przy ocenianiu efektów jakie produkt wywiera na pamięć i przyuczenie się /A.Fine i inni, Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 82 /1985/,

5227-5230?/.

Test przeprowadza się na samcach szczurów Spraque-Dawley /160-200 g/, które podczas badania trzymane są w standardowych klatkach. Stosowanym przyrządem jest przezroczysta klatka kwadratowa, mająca blok o długości 35 cm i wysokości 25 cm, wyposażone w dającą się elektryzować podłogę z siatki. W jednym z rogów klatki na podłodze umieszczony jest izolujący dywanik /10 X 17 cm// z kauczuku.

Celem oszacowania czy związek jest podatny do wspomagania przyuczenia się przeprowadza się następującą próbę.

Każde zwierzę umieszcza się na kauczukowym dywaniku i notuje się czas jaki zwierzę zużywa dla zdecydowania się na opuszczenie tego dogodnego miejsca w ' celu zbadania klatki. Po 20 sekundach przeszukiwania zwierzę otrzymuje wstrząs elektryczny /czas trwania 3 sekundy/ w łapy wywołujący reakcję ucieczki. Szczur zostaje natychmiast wyjęty z przyrządu i umieszczony z powrotem w swej klatce pierwotnej. Próbę tę powtarza się aż do chwili gdy zwierzę pozostaje co najmniej 180 sekund na kauczukowym dywaniku dla uniknięcia wstrząsu elektrycznego. Przyuczanie się wyraża się za pomocą średniej ilości prób koniecznych dla osiągnięcia czasu przebywania na dywaniku wynoszącego 180 sekund. Czas przebywania 180 sekund na dywaniku kauczukowym jest uważany za maksymalny wynik osiągany przez zwierzę dla uniknięcia wstrząsu elektrycznego. Szczury przebywające podczas tego czasu na dywaniku nabyły odruchu unikania i są one umieszczane z powrotem w swej klatce pierwotnej bez otrzymywania wstrząsu elektrycznego. Dla oszacowania czy związek jest podatny do wspomagania zatrzymania pamięciowego w czasie przeprowadza się następującą próbę. Każde zwierzę poddaje się czterem próbom w czasie 0,4,24 i 28 godzin. W pierwszej próbie /czas 0/ zwierzę umieszcza się na kauczukowym dywaniku i notuje czas jaki potrzebuje aby zdecydować się na opuszczenie tego miejsca celem przeszukania klatki. Po 20 sekundach przeszukiwania szczur dostaje wstrząs elektryczny /czas trwania 3 sekundy/ w łapy, wywołujący reakcję ucieczki. Natychmiast wyciąga się szczura z przyrządu i umieszcza z powrotemw jego klatce pierwotnej. Podczas trzech prób następnych /czas: 4, 24 i 28 godzin/ zwierzę umieszcza się ponownie na kauczukowym dywaniku i notuje czas użyty na opuszczenie tego miejsca. W chwili gdy cztery łapy zwierzęcia znajdą się na siatce dostaje ono wstrząs elektryczny i zostaje natychmiast wyciągnięte z przyrządu.

Na początku doświadczenia szczury rozdziela się na 4 jednorodne grupy po 15 zwierząt. Na trzydzieści minut przed każdą próbą każda grupa zwierząt poddawana jest określonemu traktowaniu:

- grupa 1 dostaje dootrzewnowy zastrzyk roztworu fizjologicznego soli,

- grupa 2 dostaje dootrzewnowy zastrzyk testowanego związku,

- grupa 3 dostaje dootrzewnowy zastrzyk 0,5 mg skopolaminy,

- grupa 4 dostaje dootrzewnowy zastrzyk 0,5 mg skopolaminy i jednocześnie dootrzewnowy zastrzyk testowane^go związku. Gru^py ¹ i 2 uż^ywa si^ę w pierwszym doświafozemu a ^gru^py ^{3 i 4} w doświadczeniu drugim.

Wyniki otrzymane w tym teście ze związkami otrzymanymi sposobem według wynalazku są przedstawione w tabeli 3. W tabeli tej związek poddawany próbie wskazuje kolumna 1 a dawkę podawaną dootrzewnowo wyrażoną w mg/kg kolumna 2.

W kolumnach 3 i 4 przedstawione są wyniki otrzymane w próbie zastosowanej dla oszacowania przyuczania się. Liczby wskazują średnią ilość prób koniecznych, żeby zwierzę kontrolne /grupa \/ lub traktowane /grupa 2/ związkiem nauczyło się przebywać w ciągu 180 sekund na kauczukowym dywaniku celem uniknięcia wstrząsu elektrycznego. Wyniki analizowano za pomocą testu Studenta. W kolumnach 5-12 podane sę wyniki otrzymane w doświadczeniu zastosowanym dla oszacowania zatrzymania pamięciowego. W kolumnach 5-8 liczby przedstawiają średni czas pobytu, zaobserwowany kolejno dla czasu 0, 4, 24 i 28 godzin dla zwierząt z grupy 3, traktowanych jedynie skopolaminą a w kolumnach 9-12 znajdują się odpowiednie liczby dla zwierząt z grupy 4, traktowanych jednocześnie skopolaminą i badanym związkiem /w dawce

161 591 podanej w kolumnie drugiej/. Korzystny wpływ związku dla przeciwstawienia się amnezji wywołanej skopolaminą przedstawiony jest za pomocą zwiększenia się czasu pobytu na dywaniku w każdej próbie. Zaobserwowane różnice zanalizowano statystycznie metodą Mann-Whitne/a.

Tabela 3

Przyuczenie się

Zatrzymanie pamięciowe

Związek

Dawka mg/kg —

ilość prób

grupa 3

grupa 4

średnia Czas przebywania /w sekundach/

	grupa 1	grupa 2	0	4	24	28	0	4	24	28
la	2.65	1,60	1,53	2,4	9,7	9,1	33,9	3,4	60,4	74,6	102,4
2	3,64	2,20	1,0	1,7	11,1	20,3	12,8	2,8	70,9	82,8	137,6
5a	0,89	2,07	2,07	2,1	3,0	7,7	3,3	1,7	8.1	34,7	44,5
7	3,78	2,20	1,13	1,9	8,9	31,6	54,1	11,3	88,6	111,6	133,5
Fizostygmina	0,4	2,60	2,30	1,7	1,4	6,9	21,3	1,9	17,8	56,2	53,4

Z tabeli tej wynika, że:

- związki otrzymane sposobem według wynalazku sprzyjają nauczeniu się odruchu unikania: średna ilość prób koniecznych dla osiągnięcia określonego z góry kryterium /czasu pobytu maksimum 180 sekund na dywaniku/ jest mniejsza dla zwierząt traktowanych /kloumna 4/ niż dla zwierząt kontrolnych /kolumna 3/;

- działanie amnezyjne skopolaminy jest bardzo uwydatnione: widoczne jest, że czasy pobytu dla zwierząt z grupy 3 /kolumna 5-8/ są wyraźnie mniejsze niż 180 sekund, zrealizowanych przez zwierzęta kontrolne po średniej ilości prób/ kolumna 3/ i w tych warunkach korzystny wpływ związków otrzymanych sposobem według wynalazku na przeciwstawienie się działaniu amnezyjnemu skopolaminy jest bardzo wyraźny; zwierzęta z grupy 4, traktowane jednocześnie skopolaminą i związkiem otrzymanym według wynalazku mają czasy pobytu w każdej próbie znacznie wyższe niż zwierzęta z grupy 3 traktowane jedynie skopolaminą /porównać wyniki z kolumny 5 z wynikami z kolumny 9, 6 z 10 itd./.

Fizostygmina wywiera korzystne działanie przeciw amnezyjnemu działaniu skopolaminy, podobne do działania związków wytwarzanych sposobem według wynalazku ale w dawce wykazującej oddziaływania wtórne i bardzo bliskiej dawce toksycznej czego nie ma w przypadku związków według wynalazku.

5. Toksyczność.

Toksyczność związków wytwarzanych sposobem według wynalazku oznaczono na samcach myszy NMRI za pomocą testu Irwina/S.Irwin, Psychopharmacologia, 13. /1968/, 222-257/.

Wzrastające dawki testowanego związku podawano dootrzewnowo grupom, składającym się z trzech myszy aż do osiągnięcia dawki śmiertelnej /dawka powodująca śmierć dwóch zwierząt z trzech w ciągu 48 godzin/. W poniższej tabeli 4 podano zaobserwowaną dawkę śmiertelną dla związków wytwarzanych sposobem według wynalazku. Z tabeli tej wynika, że w przeciwieństwie do fizostygminy związki wytwarzane sposobem według wynalazku są bardzo toksyczne.

Tabela 4

Związek	Dawka śmiertelna (mg/kg)	Związek	Dawka śmiertelna (mg/kg)
1	2	1	2
la	996	8	398
Ib	905	9	1125
2	1091	10	511
3	>1024	11	1222
4	880	12	1132
5a	838	13	1174
5b	947	14	401
6	922	15	1174
7	1133	fizostygmina	0,82

161 591

6. Dawkowanie i podawanie.

Preparaty farmaceutyczne zawierające związki otrzymane sposobem według wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowo lub doodbytniczo. Preparaty farmaceutyczne nadające się do podawania doustnego mogą być ciałami stałymi lub cieczami, na przykład w postaci tabletek /powlekanych lub niepowlekanych/, pigułek, drażetek, kapsułek żelatynowych, roztworów syropów itd. Tak samo preparaty nadające się do podawania pozajelitowego są postaciami farmaceutycznie znanymi dla tego rodzaju podawania, na przykład roztworami, wodnymi lub oleistymi zawiesinami albo emulsjami. W przypadku podawania drogą doodbytniczą preparaty zawierające związki otrzymane według wynalazku mają przeważnie postać czopków.

Postaci farmaceutyczne, takie jak roztwory do wstrzykiwań, zawiesiny do wstrzykiwań, tabletki, krople, czopki itd., otrzymuje się metodami zwykle stosowanymi przez farmaceutów. Postaci farmaceutyczne obejmują również preparaty pozwalające na stopniowe uwalnianie substancji aktywnej.

Związki otrzymane sposobem według wynalazku miesza się ze stałym lub ciekłym, nietoksycznym, farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i ewentualnie ze środkiem dyspergującym, rozdrabniającym, stabilizującym itd. Można też w razie potrzeby dodać środków słodzących, barwników itd. Procent substancji aktywnej w preparatach farmaceutycznych może zmieniać się w bardzo szerokich granicach w zależności od pacjenta i trybu podawania, a w szczególności od częstości podawania. Jeśli chodzi o dawkowanie codzienne, to może ono zmieniać się w obrębie szerokiego zakresu dawek jednostkowych, na przykład od 0,1 do 2g substancji aktywnej według sposobu podawania. Tak więc, na przykład może ono wynosić od 0,25 do 0,75 g, korzystnie 0,5 g od jednego do trzech razy dziennie, jeśli związek podaje się w postaci tabletki.

Jako przykład nieobowiązujący preparatu zawierającego związek o wzorze 1, który można podawać doustnie, podano poniżej skład tabletek:

Związek 2 250 210

Metyloceluloza /Methocel K4M/ 200 mg

Laktoza sucha 154 mg

Aerosil 5 mg

Kwas cytrynowy bezwodny 60 m0

Talk 11 mg

Stearynian magnezu 20 m0

161 591

+ HCHgCHJCJ ΐ(ΐ<' chphPH,

Wzór 3

Wzór 2

Schemat y^N“JI, V ^N\_pnpΝγΝ C0^r2

ΟΗ£Η£Η₃

Wzór 1 n:

N^Ń CH2CH2CH₃

Wzór 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania nowych pochodnych N-/4-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyn-2-ylo/^acetamidów ⁱ -t>enzami^dów o wzorze ogó^lnym 1, w którym Rj oznacza atom wotioru, rodnik alkilowy lub aryloalkilowy, a R2 oznacza rodnik alkilowy, arylowy, chlorowcoarylowy, alkiloarylowy, alkoksyarylowy lub aryloalkilowy, przy czym rodniki alkilowe i alkoksylowe zawierają od 1 do 4 atomów węgla, oraz ich soli addycyjnych z kwasami nietoksycznymi dopuszczalnymi farmaceutycznie, znamienny tym, że poddaje się reakcji, w stosunku równomolowym, 2-amino-4^mor^folino-6-^pro^pylo-l,3,5-triazynę o wzorze ², w którym ^Ri ma znaczenie ^po^dane wy^ z halogenkiem R2-karbonylu o wzorze HalCOR2, w którym R2 ma znaczenie podanej powyżej a Hal oznacza chlorowca, i ewentualnie otrzymane N-/4-morfolino-6-propylo-l,3,5-triazyn-2-ylo/acetamidy i -benzamidy przeprowadza się w ich sole addycyjne z kwasami nietoksycznymi dopuszczalnymi farmaceutycznie.