PL159234B1 - Method of obtaining a protein exhibiting antigenic properties in respect to hiv areole - Google Patents
Method of obtaining a protein exhibiting antigenic properties in respect to hiv areoleInfo
- Publication number
- PL159234B1 PL159234B1 PL27372488A PL27372488A PL159234B1 PL 159234 B1 PL159234 B1 PL 159234B1 PL 27372488 A PL27372488 A PL 27372488A PL 27372488 A PL27372488 A PL 27372488A PL 159234 B1 PL159234 B1 PL 159234B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- dna
- hiv
- antigenic properties
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims description 24
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims abstract description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 abstract 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- -1 asp-pro amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101100288418 Staphylococcus xylosus lacP gene Proteins 0.000 description 3
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxyethane Chemical compound CCOS FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- OGUPCHKBOKJFMA-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OGUPCHKBOKJFMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N Arg-Pro-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FLJVGAFLZVBBNG-BPUTZDHNSA-N Asn-Trp-Arg Chemical compound N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(=O)O FLJVGAFLZVBBNG-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- BNEKFJMHPGDVGX-UHFFFAOYSA-N BrN(O)C#N Chemical compound BrN(O)C#N BNEKFJMHPGDVGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical class [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 1
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KMSGYZQRXPUKGI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KMSGYZQRXPUKGI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YBKKLDBBPFIXBQ-MBLNEYKQSA-N Ile-Thr-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)O)N YBKKLDBBPFIXBQ-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- DNDWZFHLZVYOGF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DNDWZFHLZVYOGF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CLBGMWIYPYAZPR-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O CLBGMWIYPYAZPR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QBEPTBMRQALPEV-MNXVOIDGSA-N Lys-Ile-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QBEPTBMRQALPEV-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N Lys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 239000006154 MacConkey agar Substances 0.000 description 1
- CWFYZYQMUDWGTI-GUBZILKMSA-N Met-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CWFYZYQMUDWGTI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101150054880 NASP gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101150096038 PTH1R gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- OOKCGAYXSNJBGQ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OOKCGAYXSNJBGQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WLJPJRGQRNCIQS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WLJPJRGQRNCIQS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GLQFKOVWXPPFTP-VEVYYDQMSA-N Thr-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GLQFKOVWXPPFTP-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N Thr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- CNNVVEPJTFOGHI-ACRUOGEOSA-N Tyr-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CNNVVEPJTFOGHI-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- ZLFHAAGHGQBQQN-AEJSXWLSSA-N Val-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ZLFHAAGHGQBQQN-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Pro Natural products CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010049705 endonuclease R Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010049589 leucyl-leucyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010045397 lysyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108700042769 prolyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- CXVGEDCSTKKODG-UHFFFAOYSA-N sulisobenzone Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C(OC)=CC(O)=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 CXVGEDCSTKKODG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 108010021889 valylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
1 . Sposób w ytw arzania bialka o w lasnosciach anty- genowych rejonu g p 120 otoczki wirusa H IV zaw ieraja- cego am inokw asy 453-518, ew entualnie w polaczeniu z polipeptydem nosnikow ym , znamienny tym; ze syntety- - c zny DNA o wzorze (X )n-Y, w którym Y oznacza sekwencje: 5' T C G A G C A A T A T T A C A G G G C T G C T A T T - A A C A A G A G A T G G T G G T A A T A G C A A C A A T 3' A G C T C G T TA T A A TG T C C C G A C G A TA A TT - G TT C T C T A C C A C C A T T A T C G T T G T T A G A G T C C G A A A T C T T C A G A C C T G G A G G A G - G A G A T A T G A G G G A r A A T T G G A G A T C T G A - A C T C A G G C T T T A G A A G T C T G G A C C T C C T - C CTCTATA C T C C C T G T T A A C C T C T A G A C TT T T A T A T A A A T A T A A A G T A G T A A A A A T T G A - A C C A T T A G G A G T A G C A C C C A C C A A G G C A - A A T A T A T T T A T A T T T C A T C A T T T T T A A C - T T G G T A A T C C T C A T C G T G G G T G G T T C C G T A A G A G A A G A G T G G T G C A G A G A G A A A A A - A G A TG A T C 3' T TC T C T T C T C A C C A C G T C T C T C l TT T T T C T A - C TA G 5' a X sekwencje: 5' G A TC C C 3' 3 C T A G G G 5' przy czym n = 1 lub 0, laczy sie znanym i m etodam i / D NA w ektora ekspresyjnego, w prow adza sie zrekom bi- now any w ektor do kom órek bakteryjnych, k o m órki hoduje sie i w yodrebnia z nich bialko o wlasciw osciach antygenowych rejon u g p 1 2 0 o t o c z k i w i r u s a H I V o r a z ewentualnie odddziela polipeptyd nosnikowy. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV odpowiedzialnego za chorobę AIDS.
Rozprzestrzeniająca się ostatnio choroba nabytego niedoboru odporności (AIDS) wywołała potrzebę wytworzenia specyficznych testów wykrywających zakażenie H1V, a także niemniej istotny problem wynalezienia szczepionki.
Infekcję wirusową można wykryć kilkoma metodami. Najczulsze z nich polegają na specyficznej reakcji przeciwciał z białkami zawierającymi determinanty antygenowe. Metody te można podzielić na dwie grupy:
1. Metody wykorzystujące reakcję preparatu diagnostycznego zawierającego antygen z przeciwciałami zawartymi we krwi chorego. Metoda ta pozwala na wykrycie przeciwciał wytworzonych przez organizm w wyniku zakażenia wirusem.
2. Metody wykorzystujące reakcję preparatu diagnostycznego zawierającego przeciwciała swoiste dla wirusa z białkami wyizolowanymi z organizmu chorego. Metoda ta pozwala na wykrycie białek zawierających determinanty antygenowe wirusa, powstałych w wyniku zakażenia i namnażania się wirusa. Przeciwciała stosowane w tej metodzie wytwarza się w organizmach zwierząt laboratoryjnych szczepionych preparatami zawierającymi antygeny wirusowe.
159 234
W obu tych przypadkach niezbędne jest zastosowanie znacznych ilości antygenu wirusowego. Antygenem może być cały, kompletny wirus, bądź też jego fragment w postaci peptydu zawierającego wystarczająco immunogenną determinantę antygenową. W przypadku wirusa HIV najdogodniejszym białkiem nadającym się do wykorzystania jako antygen jest białko otoczki gpl20 -najbardziej zewnętrzny i co za tym idzie najbardziej wystawiony na kontakt z systemem immunologicznym element wirusa.
Znane są sposoby wytwarzania białka o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV polegające na wyodrębnieniu naturalnego genu z wirusa, ligowaniu z wektorem ekspresyjnym trawionym endonukleazami restrykcyjnymi, wprowadzaniu zrekombinowanego wektora do komórek gospodarza, hodowaniu komórek i wyodrębnianiu białka [Petteway S. R. i wsp. (1987) Viruses and Human Cancer, Alan R. Liss, str. 15-28, Putney S. D. i wsp. (1986) Science 234, str. 1392-1395, Kenealy W. i wsp. (1987) AIDS research and human retroviruses 3, str. 95-105, Shoeman R. L. i wsp. (1987) Anal. Biochem. 161, str. 370-379, Gosting L. H. (1987) J. Clin. Microbiol. 25, str. 845-848, Barr P. J. (1987) Vaccine 5, str. 90-101].
Powyższe znane sposoby wymagają manipulacji wysoce patogennym materiałem, co stanowi poważne zagrożenie.
Znanymi dotychczas metodami wytwarzano białka o właściwościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV o łańcuchach aminokwasowych znacznie dłuższych niż określone niżej białko wytwarzane sposobem według wynalazku, lub też w połączeniu z innymi białkami tego wirusa, jak na przykład hybryda zawierająca 45 aminokwasów z rejonu gpl20 połączonych ze 187 aminokwasami z rejonu gp41. Białko zawierające kilka rejonów nie pozwala na rozróżnienie, który rejon jest odpowiedzialny za jego własności.
Sposób według wynalazku umożliwia wytworzenie białka o własnościach antygenowych otoczki wirusa HIV bez konieczności posługiwania się patogennym materiałem.
Sposobem według wynalazku wytwarza się białko o własnościach antygenowych rejonu gp 120 otoczki wirusa HIV, zawierające aminokwasy 453-518, ewentualnie w połączeniu z polipeptydem nośnikowym. Jako białka nośnikowe stosuje się najczęściej enzymy bakteryjne j3-galaktozydazę, acetylotransferazę chloroamfenikolową, białko A, i inne. Stwierdzono, że ten stosunkowo krótki łańcuch z rejonu gpl20 posiada własności antygenowe wystarczające do wykrycia przeciwciał w surowicy chorego.
Sposób według wynalazku polega na tym, że syntetyczną sekwencję DNA kodującą białko o sekwencji: ser ser asn ile thr gly leu leu leu thr arg asp gly gly asn ser asn asn glu ser glu ile fen arg pro gly gly gly asp met arg asp asn trp arg ser glu leu tyr lys tyr lys val val lys ile glu pro leu gly val ala pro thr lys ała lys arg arg val val gin arg glu lys arg łączy się znanymi metodami z wektorem ekspresyjnym trawionym endonukleazami r^^st^^ykcyjnymi, wprowadza się zrekombinowany wektor do komórek gospodarza bakteryjnego, komórki hoduje się, wyodrębnia z nich białko o własnościach antygenowych otoczki wirusa HIV i ewentualnie oddziela polipeptyd nośnikowy.
W celu oddzielenia polipeptydu nośnikowego wprowadza się w miejscu połączenia sekwencję aminokwasową umożliwiającą rozerwanie znanym sposobem wiązania polipeptydowego. Można tu zastosować sekwencje rozpoznawane przez enzymy proteolityczne takie jak na przykład: kolageneza, karboksypeptydaza B, aminodipeptydaza IV i inne, lub sekwencje wrażliwe na reakcje chemiczne, na przykład z cyjanobromem, hydroksyloaminą, hydrolizę kwasem i inne [Sharma S.
K., (1986), Separation Sci. Technol. 21, str. 701-726].
Korzystnie jest zastosować wrażliwą na hydrolizę w środowisku kwaśnym sekwencję aminokwasową asp-pro [Szoka P. R. i wsp., (1986), DNA 5, str. 11-20].
Zgodnie z wynalazkiem, korzystnie stosuje się DNA o wzorze (X)n - Y, w którym Y oznacza sekwencję:
5' TCGAGCAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGCAACAAT
3' agctcgttataatgtcccgacgataattgttctctaccaccattatcgttgtta gagtccgaaatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagatctgaa ctcaggctttagaagtctggacctcctcctctatactccctgttaacctctagactt ΤΤΑ1 ATAAATATAAAGTAGTAA AyAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCA AATATAnTATATnCATCATrnTACCTrGGTATTCTCCACCGTGGGTGGTTCCGT AAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGATGATC 3'
TTCTTTTCTCACCTCGτCTCTCTTTTTTCTTCTTG 5'
159 234 kodująca białko o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV, a X sekwencję:
5' GATCCC 3'
3' CTAGGG 5' kodującą aminokwasy asp-pro, przy czym η = 1 lub 0.
Stosowana, w sposobie według wynalazku sekwencja DNA różni się od sekwencji nukleotydowych znanych szczepów wirusa HI V [Gen. Bank Release 44.0,1985]. Jednakże gen ten koduje właściwą sekwencję białka.
Sekwencję DNA otrzymuje się syntetyczne z oligonukleotydowych fragmentów zawierających 5 do 100 nukleotydów, które łączy się enzymatycznie w dwuniciowy łańcuch za pomocą ligazy.
Oligonukleotydowe fragmenty można otrzymać metodą amidofosforynową przez kolejne łączenie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi, przy czym grupy aminowe korzystnie blokuje się grupą izopropoksyacetylową.
Otrzymaną sekwencję DNA liguje się z wektorem plazmidowym, przeciętym odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi. Jako wektor można zastosować na przykład plazmidy: pBR322, pUR222, pUC19 i inne. Korzystnie jest zastosować plazmid pUC19, pozwalający na selekcję genetyczną rekombinowanych klonów przy zastosowaniu bakterii Escherichia coli o genotypie lac , takie jak na przykład RRI, JM83, JM101 i inne. Korzystnie jest stosować szczep bakterii JM101.
Otrzymany w trakcie procesu, zdolny do replikacji zrekombinowany wektor plazmidowy, korzystnie pABil20 można stosować do wytwarzania preparatów zawierających DNA i RNA wykorzystywanych np. jako sondy diagnostyczne do wykrywania genów wirusa HIV.
W celu uzyskania biosyntezy białka plazmid ten trawi się odpowiednimi enzymami ressirykcyjnymi i wycięty fragment DNA liguje z wektorem ekspresyjnym trawionym endonukleazami resitrykcyjnymi. Jako wektor ekspresyjny można zastosować: plazmidy, na przykład pKK223, pDR450, pWR590, lub fagi, na przykład lambda gtll i inne. Korzystnie jest stosować wektor zawierający gen kodujący polipeptyd nośnikowy, np. wektor pWR450 zawierający gen kodujący białko będące fragmentem enzymu bakteryjnego J-galaktozydazy o długości 450 aminokwasów. Wektor ten zawiera elementy regulacyjne operonu metabolizmu laktozy (laz UV5, lacO) niewrażliwe na represje kataboliczną glukozą.
Zrekombinowanym wektorem, korzystnie plazmidem pRA27 transformuje się bakterie np. Escherichia coli. Korzystnie jest stosować szczepy o fenotypie dzikiego operonu metabolizmu laktozy, takie jak na przykład MM294, HB101, DH5 i inne. Zastosowanie tych szczepów umożliwia ekspresję genu regulowanego promotorem lacUV5 bez konieczności dodawania induktora do pożywki. Korzystnie jest stosować szczep bakterii MM294.
Otrzymane bakterie namnaża się i z hodowli wyodrębnia białko o własnościach antygenowych rejonu gp 120 otoczki wirusa HIV. Białko tojest nierozpuszczalne w cytoplazmie i ulega wytrąceniu w postaci tzw. ciałek inkluzyjnych.
Komórki bakteryjne lizuje się znanymi metodami, po czym korzystnie jest odwirować osad zawierający białko o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV.
Zaleca się przepłukać osad roztworami zawierającymi detergenty, takie jak na przykład: triton Χ-100, nonidet NR-20, sarkozyl i inne. Otrzymany osad rozpuszcza się w roztworze zawierającym 6M mocznik lub 6M chlorowodorek guanidyny.
Białko o własnościach antygenowych rejonu gp 120 otoczki wirusa HIV można oddzielić od polipeptydu nośnikowego. Białko hybrydowe kodowane przez zrekombinowany wektor plazmidowy pRA 27 zawiera w miejscu dołączenia białka o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV do polipeptydu nośnikowego sekwencję aminokwasową asp-pro wrażliwą na hydrolizę w środowisku kwaśnym. Sekwencja ta nie występuje w białku o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa H1V i może być użyta do oddzielenia tego białka od polipeptydu nośnikowego. Korzystnie jest zastosować trawienie 13% kwasem octowym, lub 70% kwasem mrówkowym w obecności czynnika'denaturującego, takiego jak 6M mocznik lub 6M chlorowodorek guanidyny metodą opisaną przez P. R. Szoka i wsp. [Szoka P. R. i wsp. (1986), DNA 5, str. 11-20].
Otrzymane sposobem według wynalazku białko o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV można związać z materiałem nośnikowym, takim jak na przykład kulki
159 234 5 polistyrenowe, lub bibuła nitrocelulozowa i stosować do wykrywania znanymi metodami obecności w surowicy chorych przeciwciał antywirusowych swoistych dla wirusa HIV.
Otrzymane sposobem według wynalazku białko o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV można też stosować do immunizacji zwierząt laboratoryjnych w celu otrzymania przeciwciał.
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia autoradiografię żelu sekwencyjnego z sekwencją wstawki zawierającej syntetyczny DNA. Fig. 2 przedstawia schemat konstrukcji plazmidu pRA27, przy czym stosowane skróty oznaczają: ABil20 - fragment genu gpl20; bla - gen oporności na ampicylinę; ori - miejsce inicjacji replikacji DNA; Hindlll, Xbal miejsca cięć endonukleaz restrykcyjnych; lacP, lacO - elementy regulujące genu /5-galaktozydazy; /ł-gal - fragment genu βgalaktozydazy; pUC19, pWR50.0 - wektory plazmidowe; pABil20 - plazmid zawierający syntetyczny DNA. Fig. 3 przedstawia elektroforezę białek według Laemmlyego. Kanały 1 do 6 zawierają białka bak terii z plazmidem pRA27, kanał 7 zawiera białka bakterii z plazmidem pWR450.0. Fig. 4 przedstawia sekwencję nukleotydową i kodowaną przez nią sekwencję aminokwasową białka hybrydowego.
Przykład A. Chemiczna synteza oligodezoksyrybonukleotydów.
Fragmenty oligodezoksyrybonukleotydowe zestawione w tabeli otrzymano na drodze syntezy chemicznej metodą amidofosforynową, z wykorzystaniem grup izopropoksyacetylowych, blokujących funkcje egzoaminowe 5-dimetoksytritylonukleozydo-3-(3-cyjanoetylo-N-bis-izopropylo)amidofosforynów.
| Tabela | |||
| Nić | Fragment | 3' | 5' Długość |
| 1 | GGAGCTCGT | 9 | |
| 2 | TATAATGTCCCGACGATAAT | 20 | |
| 3 | TGTTCTCTACCAC | 13 | |
| 4 | CATTATCGTTGTTACTCAGG | 20 | |
| 5 | CTTTAGAAGTCTG | 13 | |
| 6 | GACCTCCTCCTCTATACTCC | 20 | |
| dolna | 7 | CTGTTAACCTCTAG | 14 |
| 8 | ACTTAATATATTTATATTTC | 20 | |
| 9 | ATCATTTTTAACT | 13 | |
| 10 | TGGTAATCCTCATCGTGGG | 19 | |
| li | TGGTTCCGTTTCT | 13 | |
| 12 | CTTCTCACCACGTCTCTCT | 19 | |
| 13 | TTTTTCTACTAGATC | 15 | |
| 14 | TAGTAGAAAAAAGA | 14 | |
| 15 | GAGACGTGGTGAG | 13 | |
| 16 | AAGAGAAACGGAACCACCC | 19 | |
| 17 | ACGATGAGGATTA | 13 | |
| 18 | CCAAGTTAAAAATGATGAA | 19 | |
| 19 | ATATAAATATATTA | 14 | |
| górna | 20 | AGTCTAGAGGTTAACAGGGA | 20 |
| 21 | GTATAGAGGAGGAG | 14 | |
| 22 | GTCCAGACTTCTAAAGCCT | 19 | |
| 23 | GAGTAACAACGATA | 14 | |
| 24 | ATGGTGGTAGAGAACAATT | 19 | |
| 25 | ATCGTCGGGACATT | 14 | |
| 26 | ATAACGAGCTCCCTAG | 16 |
B. Enzymatyczne łączenie (ligacja) oligodezoksyrybonukleotydów w jeden dłuższy odcinek DNA.
Oczyszczone po chmiecznej syntezie oligodezoksyrybonukleotydy rozpuszczono w buforze TE o składzie 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH = 7,6 w taki sposób, aby stężenie każdego z fragmentów wynosiło 200pg/ml. Pierwszym etapem była fosforylacja końców 5' oligodezoksyrybonukleotydów. W tym celu zebrano osobno fragmenty 1-13 stanowiące dolną nić i 14-26 stanowiące górną nić DNA (tabela) w dwóch mieszaninach reakcyjnych biorąc po 1 /Lig (5//1) każdego fragmentu. Do obu mieszanin dodano 1/10 objętości buforu o składzie 0,5 M Tris-HCl, pH — 7,6, 50 mM MgCk, 50 mM /3-merkaptoetanolu, 10 mM ATP, oraz 5 jednostek enzymu -kinazy polinu6
159 234 kleotydowej. Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Po fosforylowaniu obie mieszaniny połączono i ogrzewano przez 5 minut w temperaturze 65°C. Po powolnym schłodzeniu do temperatury pokojowej, dodano 1 jednostkę enzymu ligazy faga T4 i inkubowano przez noc w temperaturze 10°C. Mieszaninę ligacyjną trawiono endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i Xbal, po czym frakcjonowano elektroforetycznie w 10% żelu poliakryloamidowym.
Odcinek DNA o żądanej długości ekstrahowano z roztartego żelu buforem zawierającym 50 mM Tris-HCl, pH = 8, 0,3 M octan sodu, 4 mM EDTA, 0,2% SDS. Po wytrąceniu etanolem i odwirowaniu, DNA rozpuszczono w ΙΟΟμΙ buforu o składzie lOmM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH = 7,6, po ponownym wytrąceniu etanolem próbkę rozpuszczono w 1Ομΐ tego samego buforu.
C. Wytworzenie plazmidu umożliwiającego powielenie matrycy genetycznej.
W etapie tym stosowano technikę klonowania, polegającą na połączeniu fragmentu DNA przeznaczonych do powielenia z DNA wektora i wprowadzeniu do komórek bakterii (transformacji). Odpowiednia selekcja kolonii bakteryjnych pozwala na odnalezienie rekombinowanego DNA. Klonowanie przeprowadzono stosując wektor plazmidowy pUC19 [Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. (1985) Gene 33, str. 103-119].
1. Ligacja syntetycznego DNA z wektorem plazmidowym. 100 mg DNA plazmidowego przecięto endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i Xbal, dodano syntetyczny DNA, po czym skład mieszaniny uzupełniono tak, aby zawierała 20 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM MgCb ditiotreitol (odczynnik Clelanda) i 0,01% żelatyny. Dodano i jednostkę ligazy T4 i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin.
Bakterie transformowano zmodyfikowaną metodą wykorzystującą chlorek wapnia [Mandel M., Higa A. (1970), J. Mol. Biol. 53, str. 154],
2. Transformacja bakterii.
Bakterie E. coli JM101 (genotyp: supE, Thi, elta[lac-proAB], [F', traD36, proAB, lacl9, ZdeltaM 15]) hodowano przez noc w pożywce L (1 % Bacto-Trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1 % NaCl). 1 ml zawiesiny bakteryjnej dodano do 100 ml świeżej pożywki L i hodowano do momentu osiągnięcia gęstości 107 komórek na mililitr. Bakterie odwirowano i zawieszono w roztworze o składzie 50 mM CaCb, 10 mM Tris-HCl, pH = 8. Po 10 minutowej inkubacji w lodzie bakterie ponownie odwirowano, po czym zawieszono w 4 ml tego samego roztworu. Po 60 minutowej inkubacji w lodzie, do 0,2 ml zawiesiny bakterii dodano roztwór DNA i inkubowano dalsze 10 minut. Mieszaninę ogrzewano 1 minutę w 42°C, po czym rozcieńczono 1 ml świeżej pożywki L. Po 30 minutach inkubacji w 37°C 100μ1 zawiesiny bakterii wysiano na płytki z agarem MacConkeya uzupełnione dodatkiem 50^ug ampicyliny na 1 ml agaru. Spośród wyhodowanych kolonii bakteryjnych wybrano tę, która zawierała plazmid z wstawionym odcinkiem syntetycznego DNA. Oznaczona metodą Maxama [Maxam A., Gilbert W., (1980) Methods Enzymol. 65, str. 499-560] sekwencja nukleotydowa wstawki wykazała całkowitą zgodność z sekwencją matrycy genetycznej kodującej polipeptyd zawierający determinanty antygenowe białka otoczki wirusa HIV (fig. 1).
3. Namnażanie plazmidu.
DNA plazmidowe izolowano zmodyfikowaną metodą alkaliczną [Maniatis T. i wsp. (1972), Molecular Cloning. A Laboratory Manuał, str. 89-91]. 100 ml 16 godzinnej hodowli bakteryjnej odwirowano i zawieszono w 20 ml roztworu RI (25 mM Tris-HCl, pH = 8, 10 mM EDTA, 50 mM glukoza). Po ponownym odwirowaniu, bakterie zawieszono w 10ml roztworu RI. Dodano 5 mg lizozymu na 1 ml zawiesiny i inkubowano w lodzie przez 5 minut. Dodano 20 ml roztworu RII (0,2 N NaOH, 1% SDS), łagodnie wymieszano i dodano 15 ml roztworu RUI (5M octan potasu, pH = 4,8). Zawiesinę wymieszano i przesączono przez bibułę filtracyjną. Do przesączu dodano 27 ml izopropanolu. Wytrącone kwasy nukleinowe odwirowano i po przepłukaniu etanolem rozpuszczono w 1,6 ml buforu TE. Dodano 0,32 mg RN-azy i inkubowano 1 godzinę w 37°C. Po tym czasie dodano 0,6 ml roztworu 40% glikolu polietylenowego w 2M NaCl. Po całonocnej inkubacji w lodzie osad odwirowano i przepłukano 10% roztworem glikolu polietylowego w 0,5 M NaCl. Osad rozpuszczono w 0,8 ml buforu TE. Dodano 40μ1 10% roztworu SDS i ogrzewano w 65°C przez 10 minut. Dodano 80μ13M roztworu octanu potasu i dwukrotnie usuwano białka przez wytrząsanie z mieszaniną chloroformu z alkoholem izoamylowym (24:1). Z fazy wodnej wytrącono kwasy nukleinowe przez dodanie 2 objętości etanolu. Osad DNA przepłukano 70% etanolem i rozpuszczono w 0,5 ml buforu TE. Otrzymany w ten sposób plazmid pABi!20 można powielać bez
159 234 ograniczeń wraz z matrycą genetyczną kodującą polipeptyd zawierający determinanty antygenowe białka otoczki wirusa HIV. Plazmid ten może służyć do wytwarzania preparatów zawierających DNA lub RNA o sekwencji odpowiadającej syntetycznej matrycy. Nie nadaje się jednak do uzyskania biosyntezy białka. W tym celu należy przenieść matrycę genetyczną do wektora ekspresyjnego.
D. Konstrukcja plazmidu umożliwiającego biosyntezę białka.
Fragment DNA zawierający matrycę genetyczną wyciętą z plazmidu pABil20 przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych Hindlll i Xbal i ligowano z wektorem ekspresyjnym pWR450.0 [Guo
L. H. i wsp. (1984), Gene 29, str, 251-254] przeciętym tymi samymi enzymami (fig.2). Mieszaninę ligacyjną użyto do transformacji bakterii MM294 (F”, endAl, hsdR17, supE44, thil, lambda”). Białka bakteryjne wyhodowanych kolonii poddano analizie na żelu poliakryloamidowym według Laemmlego [Laemli U. K., (1970), Naturę 227, str. 680-685]. Spośród wyhodowanych kolonii wybrano te, które syntetyzowały białko dłuższe niż fragment j3-galaktozydazy kodowany przez wektor pWR450.0. Analizę sześcm kolonii przedstawiono na fig. 3. Każda z nich zawierała plazmid pRA27, kodujący białko o sekwencji przedstawionej na fig. 4. Plazmid ten może służyć jako matryca genetyczna do wytwarzania na drodze biosyntezy w bakteriach preparatów zawierających DNA, RNA, a także białka.
Schemat konstrukcji plazmidu pRA27 przedstawiono na fig. 2.
E. Wytwarzanie białka kodowanego na matrycy genetycznej zawartej w plazmidzie pRA27.
1. Otrzymywanie ekstraktu białkowego z bakterii.
W celu namnożenia białka 100 ml kultury zawierającej bakterie E. coli MM294 z plazmidem pRA27 odwirowano i zawieszono w 10μ1 buforu o składzie: 10 mM fosforan sodowy, pH = 5,8, 1 mM chlorek magnezu, 5 mM /3-merkaptoetanoI, 1 mM EDTA i 20 mg lizozymu. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po czym doprowadzono do pH — 8, kilkakrotnie zamrażano i rozmrożono i sonikowano przez 1 minutę. Lizat wirowano w 6000 g przez 10 minut. Osad ciałek inkluzyjnych solubilizowano w buforze o składzie: 10 mM Tris-HCl, pH = 8, 1 mM chlorek magnezu, 5mM /}-merkaptoetanol i 6M mocznik. Ekstrakt wirowano w 6000 g przez 10 minut.
Supernatant zawierał surowy ekstrakt białka (do 90% całkowitej zawartości białka) o własnościach antygenowych otoczki wirusa HIV. Roztwór białka poddano testom immunologicznym przy użyciu surowic zawierających przeciwciała do różnych serotypów wirusa HIV. Surowice te wykazały powinowactwo zawartych w nich przeciwciał do białka kodowanego na matrycy genetycznej zawartej w plazmie pRA27.
159 234
M?t ThrMet 11 eThr AspSerLeuAl aValVal LeuGl nAraAr gAspTrpGl uAsnPro ArGAAAATGAYTACGGATYCAGTTT^GGTAGTTTyACAAAGTCTrTACyTTTAAAAAOAT
Gl yVal ThrGl nLeuAsn<AqLeuAl aAl aHi sProProFenAl aSerTrpArgAsnSer GGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGC
61uGluAlaArgThrAspA-gProSerGlnGlnLeuArgSerLeuAsnGlyGluTrpArg GAAGAGGCCCGGACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGC
FenAl aTrpFenProAl aProGl uAl aVal ProGl uier-TPLLeuGl uAysAspLeuPro TTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAWGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCT
GluAlaA3pTThValValValProSerAsnTrpGlnMetHisGlyTyrAspAlaProI1e GAGGCCGGTACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCA&ATGCACGGTTACGATGCGCCCATC T yrThrAsnValThrTyrProI1eThrValAsnProProFenValProThrGluAsnPro TACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACG&AGAATCCG
ThrGlyCysTyrSerLeuThrFenAsnValAspGluSerTrpLeuGlnGluGlyGlnThr acgggttgttactcgctcacatttaatgtggatgaaagctg«:tacaggaaggccagacg
Arg 11 el 1eFenAspGTyValAsnSerAlaFenHi sLeuTrpCysAsnGT yArgTrpVal cgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgttgtgcaacgggcgctgggtc
TlyTyrGlyGlnAspSerArgLeuProSerTluFenAspLeuSsrAlaFenLeuArgAla GTTTACGGCCAGGAAAATCCTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCC
TlyGluAsnArgLeuAlaVa1MetVa1LeuArgTrpSerAspGlySerTyrLeyGluAsp G&AGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGTAGTGACGGCAGTTATCTTTAAGAT
TlnAApPtetTrpPiggetSsrGT y11rFrAA-gAspValSerŁeuŁruHi sLysProThr CAGGATATGTGGCGGATGAGCGTTCATTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCAyAAACCGAAy
ThrTl nilsSeiAspFenHi pValAlaThAAggFenAsnAppAspFenSerArgAlaVal ACACAAATCAGCGAATTCCATGTrGCCACrCGCTTTAArGArGATTTCAGCAGCGArGrA
LeuGl uAl aGl uVal G1 nMetCysGl yGluLeuArgAspPyrLeeAAgVal ThrVal Ser CrGGAGGCTGAAGTTCAGATGTTCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTrCT
LeuTrpGl r^(51 yGl uThhGT iAsI Al aSerGl yTh^Al aProFenGT yGl yGl u 11 e 11 e TrArGGCAGGTTTAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGTCGCCTTCGGCGGTGAAATTATC
AspGl uArgGl yGl yT yr Al aAspArgVal ThrLeuArgLeuAsnVal 61 uAsnProLys 6ATGA.TCGTGG'rGG'rrArGCCGATCGCGrCAAiA^rAC5TCrA:AA.CGTCGAA.AACCCGAAA
LeuTiTTpSi^irAl aTl u 1.1 pProAsnLeuTyrArgAl aVal Val G1 uLeuHi pThr Al «Asp ATTTGGATCGCCGAAATCCeGAATCTCTArCGTGCETTTTTTTGAACTTCACACCGCCTAC
G1yThrLeu ϊ1©61uAl aGluAl©CysAspVs!61yFonArgGluVal Arg11sGluAsn GTCACGCTGATTGAAGCAGAftGCCTGCGATTTCGGTTrCCGAGAGGTTCTGATTGAAAAT yLeuLeuL&uLsuApnGl yLysProLeuLeul 1 ©ArgGl yVal AsnArgHi 361 uHi p GTTCTGCTGCT6CyGAACGGCAASCCGGT6CT6ATyCGA66CGTTAACCGTCACGATCAy
Hi pProLeuHi pGl yGl nValMetAppGl uGl nThrSHst Val 61 nAsp 11 eLeuLeunet AAyCAycyTCAyGGyAA6GyCATGGATGAGCAGACGATTGTGCAGGATATCAyGAyGAyG
LypTl nAsnAsnFenAipAlaValArgCypSerHi 5ryrProApnHi pProLeuTrpTyr AAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATACGAACCATCCGCT6rGTTAA
ThrLeuAysAspAAgTyrGlyLeuTyrValValAspGluAl aAsn11eGluThrHi pGly AAGATGTGAGAAAGATAAGGCATGTATGTGGrTGATGAA6AAAATATTTAAACCCACGGC
MetValProMetAsnArgLeuThrAspAspProAigTrpLeuProAlaMetSerGluArg AyTGTTCCAArTAATCTyCTGAAATATGATCCGCGATTTATACCGGAGATGAGCGAACGC
ValThrArgMetValGl nArgAppArgApnHi pArgAlaSerSerAsnSerSerSerPro TrAAAGAGAArGGyGAAGCGCGAyCGyAAyCAAAGTGAGAGAT CGAATTAGATCrCGCCC
T1 yAspProSerSer A5a 11 eThrll yLeuLeuLeuThr AraAppGl yGl yAsnSer Apn GTGGATAAATATAGAAATATyACATGGCTTAyAyTAAAAAGAGAyGGTGGyAArAGAAAC
AsnTl uSerTl uli ^mA^P^Gl yGl yGl yAsplMee ArgAspAsnTrpArgSerGl u AArTATyAATAAATAyyAAGACCTGTATGAGGAGArArTAGGGACAATTGGAGATCrGAA
LeuT^rLycr ^Lyp^al Val Lye 11 eGl uProŁeuTl yVal Al aProThrLypAl aLyp rrArAyAAATATAAAGYAGTAAAAATTGAACCATAGGGATTAGCACCCACAAAGGCAAAT
ArgArgValValGlnArgGluLysArgSSS
AGAAGAGTTTYGAAGAGAGAAAAAAGAyGA 4
2 3 4 5 6 7
FIG. 3
l/ABiiąóyi bla lacP
U bla >—l on Z pWR45OO lacP| /
—c on pRA 27 jggoł^fcśa^fe?^
159 234
Zakład Wydawnictw UPRP. Nakład90egz.
Cena 10 000 zł
Claims (6)
- Zastrzeżenia patento we1. Sposób wytwarzania białka o własnościach antygenowych rejonu gp 120 otoczki wirusa HIV zawierającego aminokwasy 453-518, ewentualnie w połączeniu z polipeptydem nośnikowym, znamienny tym, że syntetyczny DNA o wzorze (X)n-Y, w którym Y oznacza sekwencję:5' TCGAGCAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGCAACAAT3' AGCTCGTTATAATGTCCCGACGATAATTGTTCTCTACCACCATTATCGTTGTTAGAGTCCGAAATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGATCTGAACTCAGGCTTTAGAAGTCTGGACCTCCTCCTCTATACTCCCTGTTAACCTCTAGACTTTTATATA.AATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAATATATTTATATTTTCATCATrrrTAACTnrGGTAATCCTCATCGTGGGTGGTTCCGTAATAGAATAGTGGTGCATATAGAAAAAAGATGATC3' nncTCTTCTCACCACTTCTCTCTTTTTnCTACTAT 5' a X sekwencję:5' GATCCC 3'3' CTAGGG 5' przy czym η = 1 lub 0, łączy się znanymi metodami z DNA wektora ekspresyjnego, wprowadza się zrekombinowany wektor do komórek bakteryjnych, komórki hoduje się i wyodrębnia z nich białko o właściwościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV, oraz ewentualnie odddziela polipeptyd nośnikowy.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako zrekombinowany wektor stosuje się plazmid pRA27.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresyjny zawierający elementy regulacyjne operonu metabolizmu laktozy.
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że stosuje się szczepy bakteryjne o fenotypie dzikiego operonu laktozy.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kodującą polipeptyd nośnikowy.
- 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kodującą fragment /3-galaktozydazy o długości 450 aminokwasów.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL27372488A PL159234B1 (en) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | Method of obtaining a protein exhibiting antigenic properties in respect to hiv areole |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL27372488A PL159234B1 (en) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | Method of obtaining a protein exhibiting antigenic properties in respect to hiv areole |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL273724A1 PL273724A1 (en) | 1990-01-22 |
| PL159234B1 true PL159234B1 (en) | 1992-11-30 |
Family
ID=20043256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL27372488A PL159234B1 (en) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | Method of obtaining a protein exhibiting antigenic properties in respect to hiv areole |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL159234B1 (pl) |
-
1988
- 1988-07-14 PL PL27372488A patent/PL159234B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL273724A1 (en) | 1990-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0013828B2 (en) | Recombinant DNA, hosts transformed with it and processes for the preparation of polypeptides | |
| US5082776A (en) | Method of producing an adult t cell leukemia virus fused antigen polypeptide | |
| Fleckenstein et al. | Cloning of the complete human cytomegalovirus genome in cosmids | |
| Houman et al. | Transcriptional antitermination in the bgl operon of E. coli is modulated by a specific RNA binding protein | |
| Delling et al. | Conserved nucleotides in the TAR RNA stem of human immunodeficiency virus type 1 are critical for Tat binding and trans activation: model for TAR RNA tertiary structure | |
| US5124255A (en) | CKS method of protein synthesis | |
| JPS6371185A (ja) | ヒト・インターロイキン−１αの合成遺伝子 | |
| O'Callaghan et al. | Immunogenicity of foreign peptide epitopes expressed in bacterial envelope proteins | |
| JP2554459B2 (ja) | β−ウロガストロン遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体 | |
| EP0117767A1 (en) | Production of parvovirus subunit vaccines | |
| AU709415B2 (en) | Construction of nucleoprotein based assemblies comprising addressable components for nanoscale assembly and nanoprocessors | |
| JP2624308B2 (ja) | 高度に抑制しうる発現制御配列 | |
| EP0195303B1 (en) | Plasmid vectors for expression in escherichia coli and/or bacillus subtilis | |
| EP0182442A2 (en) | Recombinant DNA molecules and their method of production | |
| US4735800A (en) | Vaccines against rift valley fever virus | |
| EP0133063B1 (en) | Immunologically reactive non-glycosylated amino acid chains of glycoprotein b of herpes virus types 1 and 2 | |
| JPH01160998A (ja) | ポリペプチド | |
| US5310876A (en) | Expression of HIV1 and HIV2 polypeptides and their use | |
| PL159234B1 (en) | Method of obtaining a protein exhibiting antigenic properties in respect to hiv areole | |
| PL161070B1 (pl) | cej geny wirusa HIV i/lub do biosyntezy bialka o wlasciwosciach antygenowych otoczkiwirusa HIVUrzad Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej PL | |
| US6268122B1 (en) | Recombinant DNA molecules and their method of production | |
| ES2313727T3 (es) | Expresion embebida de proteinas heterologas. | |
| JP2574146B2 (ja) | ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法 | |
| CA1341644C (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
| JPH022353A (ja) | ヒトｂ細胞分化因子の製造法 |