PL161070B1

PL161070B1 - cej geny wirusa HIV i/lub do biosyntezy bialka o wlasciwosciach antygenowych otoczkiwirusa HIVUrzad Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej PL

Info

Publication number: PL161070B1
Application number: PL29333488A
Authority: PL
Priority date: 1988-07-14
Filing date: 1988-07-14
Publication date: 1993-05-31

Abstract

Sposób konstruowania zdolnego do replikacji wektora do wytwarzania sondy wykrywaja- cej geny wirusa HIV i/lub do biosyntezy bialka o wlasciwosciach antygenowych otoczki wirusa HIV, znamienny tym, ze zdolny do replikacji wektor laczy sie z syntetycznym DNA o sekwencji: 5' TCGAGCAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGCAACAAT 3' AGCTCGTTATAATGTCCCGACGATAATTGTTCTCTACCACCATTATCGTTGTTA GAGTCCGAAATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGATCTGAA CTCAGGCTTTAGAAGTCTGGACCTCCTCCTCTATACTCCCTGTTAACCTCTAGACTT TTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCA AATATATTTATATTTCATCATTTTTAACTTGGTAATCCTCATCGTGGGTGGTTCCGT AAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGATGATC 3' TTCTCTTCTCACCACGTCTCTCTTTTTTCTACTAG 5' PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania zdolnego do replikacji wektora do wytwarzania sondy wykrywającej geny wirusa HIV i/lub do biosyntezy białka o właściwościach antygenowych otoczki wirusa HIV, odpowiedzialnego za chorobę AIDS.

Rozprzestrzeniająca się ostatnio chroba nabytego niedoboru odporności (AIDS) wywołała potrzebę wytworzenia specyficznych testów wykrywających zakażenie HIV, a także niemniej istotny problem wynalezienia szczepionki.

Infekcję wirusową można wykryć kilkoma metodami. Najczulsze z nich polegają na specyficznej reakcji przeciwciał z białkami zawierającymi determinanty antygenowe. Metody te można podzielić na dwie grupy:

1. Metody wykorzystujące reakcję preparatu diagnostycznego zawierającego antygen z przeciwciałami zawartymi we krwi chorego. Metoda ta pozwala na wykrycie przeciwciał wytworzonych przez organizm w wyniku zakażenia wirusem.

2. Metody wykorzystujące reakcję preparatu diagnostycznego zawierającego przeciwciała swoiste dla wirusa z białkami wyizolowanymi z organizmu chorego. Metoda ta pozwala na wykrycie białek zawierających determinanty antygenowe wirusa, powstałych w wyniku zakażenia i namnażania się wirusa. Przeciwciała stosowane w tej metodzie wytwarza się w organizmach zwierząt laboratoryjnych szczepionych preparatami zawierającymi antygeny wirusowe.

W obu tych przypadkach niezbędne jest zastosowanie znacznych ilości antygenu wirusowego. Antygenem może być cały, kompletny wirus, bądź też jego fragment w postaci peptydu zawierającego wystarczająco immunogenną determinantę antygenową. W przypadku wirusa HIV najdogodniejszym białkiem nadającym się do wykorzystnia jako antygen jest białko otoczki gpl20 -najbardziej zewnętrzny i co za tym idzie najbardziej wystawiony na kontakt z systemem immunologicznym element wirusa.

Znane są sposoby wytwarzania białka o własnościach antygenowych rejonu gp20 otoczki wirusa HIV polegające na wyodrębnieniu naturalnego genu z wirusa, ligowaniu z wektorem ekspresyjnym trawionym endonukleazami restrykcyjnymi, wprowadzaniu zrekombinowanego wektora do komórek gospodarza, hodowaniu komórek i wyodrębnianiu białka [Petteway S. R. i wsp. (1987) Viruses and Humań Cancer, Alan R. Liss, str. 15-28, Putney S. D. i wsp. (1986) Science 234, str. 1392-1395, Kenealy W. i wsp. (1987) AIDS research and human retrovirises 3, str. 95-105, Shoeman R. L. i wsp. (1987) Anal. Biochem. 161, str. 370-379, Gosting L. H. (1987) J. Clin. Microbiol. 25, str. 845-848, Barr P. J. (1987) Yaccine 5, str. 90-101].

161 070 3

Powyższe znane sposoby wymagają manipulacji wysoce patogennym materiałem, co stanowi poważne zagrożenie.

Znanymi dotychczas metodami wytwarzano białka o właściwościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV o łańcuchach aminokwasowych znacznie dłuższych niż określone niżej białko wytwarzane z zastosowaniem otrzymanego sposobem według wynalazku zdolnego do replikacji wektora, lub też w połączeniu z innymi białkami tego wirusa, jak na przykład hybryda zawierająca 45 aminokwasów z rejonu gpl20 połączonych ze 187 aminokwasami z rejonu gp41. Białko zawierające kilka rejonów nie pozwala na rozróżnienie, który rejon jest odpowiedzialny za jego własności.

Sposób według wynalazku umożliwia wytworzenie zdolnego do replikacji wektora pozwalającego na otrzymanie białka o własnościach antygenowych otoczki wirusa HIV bez konieczności posługiwania się patogennym materiałem.

Sposobem według wynalazku wytwarza się wektor dający białko o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV, zawierające aminokwasy 453-518, ewentualnie w połączeniu z polipeptydem nośnikowym. Jako białka nośnikowe stosuje się najczęściej enzymy bakteryjne /3-galaktozydazę, acetylotransferazę chloramfenikolową, białko A i inne.

Stwierdzono, że ten stosunkowo krótki łańcuch z rejonu gp 120 posiada własności antygenowe wystarczające do wykrycia przeciwciał w surowicy chorego.

Sposób konstruowania zdolnego do replikacji wektora do wytwarzania sondy wykrywającej geny wirusa i/lub do biosyntezy białka o własnościach antygenowych wirusa HIV, polega według wynalazku na tym, że zdolny do replikacji wektor łączy się z syntetycznym DNA kodującym białko o sekwencji:

5' TCGAGCAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGCAACAAT 3' AGCTCGTTATAATGTCCCGACGATAATTGTTCTCTACCACCATTATCGTTGTTA

GAGTCCGAAATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGATCTGAA

CTCAGGCTTTAGAAGTCTGGACCTCCTCCTCTATACTCCCTGTTAACCTCTAGACTT

TTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCA AATATATTTATATTrCATCATTTTTAATTTGGTAATCCTCATCGTGGGTGGTTCCGT AAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGATGATC 3'

Z otrzymanego w ten sposób zrekombinowanego wektora wytwarza się białko o właściwościach antygenowych wirusa HIV w ten sposób, że syntetyczną sekwencję DNA kodującą białko o sekwencji;

ser ser asn ile thr gly leu leu leu thr arg asp gly gly asn ser asn asn glu ser glu ile fen arg pro gly gly gly asp met arg asp asn trp arg ser glu leu tyr lys tyr lys val val lys ile glu pro leu gly val ala pro thr lys ala lys arg arg val val gin arg glu lys arg łączy się znanymi metodami z wektorem ekspresyjnym trawionym endonukleazami restrykcyjnymi, wprowadza się zrekombinowany wektor do komórek gospodarza bakteryjnego, komórki hoduje się, wyodrębnia z nich białko o własnościach antygenowych otoczki wirusa HIV i ewentualnie oddziela polipeptyd nośnikowy.

W celu oddzielenia polipeptydu nośnikowego wprowadza się w miejscu połączenia sekwencję aminokwasową umożliwiającą rozerwanie znanym sposobem wiązania polipeptydowego. Można tu zastosować sekwencje rozpoznawane przez enzymy proteolityczne takie jak na przykład: kolageneza, karboksypeptydaza B, aminodipeptydaza IV i inne, lub sekwencje wrażliwe na reakcje chemiczne, na przykład z cjanobromem, hydroksyloaminą, hydrolizę kwasem i inne [Sharma S. K., (1986), Separation Sci. Technol. 21, str. 701-726].

Korzystnie jest zastosować wrażliwą na hydrolizę w środowisku kwaśnym sekwencję aminokwasową asp-pro [Szoka P. R. i wsp., (1986), DNA 5, str. 11-20].

Do wytworzenia białka, korzystnie stosuje się DNA o wzorze (X)n-Y, w którym Y oznacza sekwencję:

5' TAGAGCAATATTAAAGGGCTGATATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGAAACAAT 3' AGATCGTTATAATGTACAGAAGATAATTGTTATATAACACAATTATA·GTTGTTA

161 070

GAGTCCGAAATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGATCTGAA

CTCAGGCTTTAGAAGTCTGGACCTCCTCCTCTATACTCCCTGTTAACCTCTAGACTT

TTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCA

AATATATTTATATTTCATCArTTTTAACTrGGTAATCCTCATCGTGGGTGGTTCCGT AAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGATGATC 3' kodująca białko o własnościach antygenowych rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV, a X sekwencję:

5' GATCCC 3'

3' CTAGGG 5' kodującą aminokwasy asp-pro, przy czym η = 1 lub 0.

Zrekombinowany sposobem według wynalazku wektor jest zdolny do replikacji w połączeniu z syntetycznym DNA o sekwencji kodującej białko rejonu gpl20 otoczki wirusa HIV, zawierające aminokwasy 453-518, korzystnie z syntetycznym DNA o wyżej podanej sekwencji.

Stosowana, w sposobie według wynalazku sekwencja DNA różni się od sekwencji nukleotydowych znanych szczepów wirusa HIV [Gen. Bank Release 44.0,1985]. Jednakże gen ten koduje właściwą sekwencję białka.

Sekwencję DNA otrzymuje się syntetycznie z oligonukleotydowych fragmentów zawierających 5 do 100 nukleotydów, które łączy się enzymatyczne w dwuniciowy łańcuch za pomocą ligazy.

Oligonukleotydowe fragmenty można otrzymać metodą amidofosforynową przez kolejne łączenie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi, przy czym grupy aminowe korzystnie blokuje się grupą izopropoksyacetylową.

Otrzymaną sekwencję DNA liguje się z wektorem plazmidowym, przeciętym odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi. Jako wektor można zastosować na przykład plazmidy: pBR322, pUR222, pUC19 i inne. Korzystnie jest zastosować plazmid pUC19, pozwalający na selekcję genetyczną rekombinowanych klonów przy zastosowaniu bakterii Escherichia coli o genotypie lac”, takie jak na przykład RRI, JM83, JM101 i inne. Korzystnie jest stosować szczep bakterii JM101.

Otrzymany zdolny do replikacji zrekombinowany wektor plazmidowy, korzystnie pABil20 można stosować do wytwarzania preparatów zawierających DNA i RNA wykorzystywanych np. jako sondy diagnostyczne do wykrywania genów wirusa HIV.

Zrekombinowany, zdolny do replikacji wektor, korzystnie plazmid pRA27, może służyć do biosyntezy białka wirusa HIV.

Na załączonym rysunku fig. 1 przedstawia autoradiografię żelu sekwencyjnego z sekwencją wstawki zawierającej syntetyczny DNA.

Przykład A. Synteza oligodezoksyrybonukleotydów.

Fragmenty oligodezoksyrybonukleotydowe zestawione w tabeli otrzymano na drodze syntezy chemicznej metodą amidofosforynową, z wykorzystaniem grup izopropoksyacetylowych, blokujących funkcje egzoaminowe 5-dimetoksytritylonukleozydo-3-03-cyjanoetylo-N-bis-izopropylo)amidofosforynów.

B. Enzymatyczne łączenie (ligacja) oligodezoksyrybonukleotydów w jeden dłuższy odcinek DNA.

Oczyszczone po chemicznej syntezie oligodezoksyrybonukleotydy rozpuszczono w buforze TE o składzie 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH = 7,6 w taki sposób, aby stężenie każdego z fragmentów wynosiło 200/rg/ml. Pierwszym etapem była fosforylacja końców 5' oligodezoksyrybonukleotydów. W tym celu zebrano osobno fragmenty 1-13 stanowiące dolną nić i 14-26 stanowiące górną nić DNA (tabela) w dwóch mieszaninach reakcyjnych biorąc po lpg (5//1) każdego fragmentu. Do obu mieszanin dodano 1/10 objętości buforu o składzie 0,5 M Tris-HCl, pH = 7,6, 50 mM MgCl2, 50 mM /3-merkaptoetanolu, 10 mM ATP, oraz 5 jednostek enzymu -kinazy polinukleotydowej. Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Po fosforylowaniu obie

161 070 5 mieszaniny połączono i ogrzewano przez 5 minut w temperaturze 65°C. Po powolnym schłodzeniu do temperatury pokojowej, dodano i jednostkę enzymu ligazy faga T4 i inkubowano przez noc w temperaturze 10°C. Mieszaninę ligacyjną trawiono endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i Xbal, po czym frakcjonowano elektroforetycznie w 10% żelu poliakryloamidowym.

Tabela

Nić	Fragment	3' 5'	Długość
	1	GGAGCTCGT	9
	2	TATAATGTCCCGACGATAAT	20
	3	TGTTCTCTACCAC	13
	4	CATTATCGTTGTTACTCAGG	20
	5	CTTTAGAAGTCTG	13
	6	GACCTCCTCCTCTATACTCC	20
dolna	7	CTGTTAACCTCTAG	14
	8	ACTTAATATATTTATATTTC	20
	9	ATCATTTTTAACT	13
	10	TGGTAATCCTCATCGTGGG	19
	11	TGGTTCCGTTTCT	13
	12	CTTCTCACCACGTCTCTCT	19
	13	TTTTTCTACTAGATC	15
	14	TAGTAGAAAAAAGA	14
	15	GAGACGTGGTGAG	13
	16	AAGAGAAACGGAACCACCC	19
	17	ACGATGAGGATTA	13
	18	CCAAGTTAAAAATGATGAA	19
	19	ATATAAATATATTA	14
górna	20	AGTCTAGAGGTTAACAGGGA	20
	21	GTATAGAGGAGGAG	14
	22	GTCCAGACTTCTAAAGCCT	19
	23	GAGTAACAACGATA	14
	24	ATGGTGGTAGAGAACAATT	19
	25	ATCGTCGGGACATT	14
	26	ATAACGAGCTCCCTAG	16

Odcinek DNA o żądanej długości ekstrahowano z roztartego żelu buforem zawierającym 50 mM Tris-HCl, pH — 8,0,3 M octanu sodu, 4 mM EDTA, 0,2% SDS. Po wytrąceniu etanolem i odwirowaniu, dNa rozpuszczono w 100μ1 buforu o składzie 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH = 7,6, po ponownym wytrąceniu etanolem próbkę rozpuszczono w 10//1 tego samego buforu.

C. Wytworzenie plazmidu umożliwiającego powielenie matrycy genetycznej.

W etapie tym stosowano technikę klonowania, polegającą na połączeniu fragmentów DNA przeznaczonych do powielenia z DNA wektora i wprowadzeniu do komórek bakterii (transformacji). Odpowiednia selekcja kolonii bakteryjnych pozwala na odnalezienie rekombinowanego DNA. Klonowanie przeprowadzono stosując wektor plazmidowy pUC19 [Yanisch-Perrin C., Vieira J., Messing J. (1985) Gene 33, str. 103-119].

1. Ligacja syntetycznego DNA z wektorem plazmidowym. 100 mg DNA plazmidowego przecięto endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i Xbal, dodano syntetyczny DNA, po czym skład mieszaniny uzupełniono tak, aby zawierała 20 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM MgCle ditiotreitol (odczynnik Clelanda) i 0,01% żelatyny. Dodano jednostkę ligazy T4 i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin.

Bakterie transformowano zmodyfikowaną metodą wykorzystującą chlorek wapnia [Mandel M., Higa A. (1970), J. Mol. Biol. 53, str. 154],

2. Transformacja bakterii.

Bakterie E. coli JM101 (genotyp: supE, Thi, elta[Iac-proAB], [F', traD36, proAB, lacl9, ZdeltaM 15]) hodowano przez noc w pożywce L (1 % Bacto-Trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1 % NaCl). 1 ml zawiesiny bakteryjnej dodano do 100 ml świeżej pożywki L i hodowano do momentu osiągnięcia gęstości 10⁷ komórek na milimetr. Bakterie odwirowano i zawieszono w roztworze o składzie 50 mM CaCU, 10 mM Tris-HCl, pH = 8. Po 10 minutowej inkubacji w lodzie bakterie ponownie odwirowano, po czym zawieszono w 4 ml tego samego roztworu. Po 60 minutowej inkubacji w lodzie, do 0,2 ml zawiesiny bakterii dodano roztwór DNA i inkubowano dalsze 10 minut. Mieszaninę ogrzewano 1 minutę w 42°C, po czym rozcieńczono 1 ml świeżej pożywki L. Po

161 070 minutach inkubacji w 37°C ΙΟΟμΙ zawiesiny bakterii wysiano na płytki z agarem MacConkeya uzupełnione dodatkiem 50pg ampicyliny na 1 ml agaru. Spośród wyhodowanych kolonii bakteryjnych wybrano tę, która zawierała plazmid z wstawionym odcinkiem syntetycznego DNA. Oznaczona metodą Maxama [Maxam A., Gilbert W., (1980) Methods Enzymol. 65, str. 499-560] sekwencja nukleotydowa wstawki wykazała całkowitą zgodność z sekwencją matrycy genetycznej kodującej polipeptyd zawierający determinanty antygenowe białka otoczki wirusa HIV (fig. 1).

3. Namnażanie plazmidu.

DNA plazmidowe izolowano zmodyfikowaną metodą alkaliczną [Maniatis T. i wsp. (1972), Molecular Cloning. A Laboratory Manuał, str. 89-91]. 100 ml 16 godzinnej hodowli bakteryjnej odwirowano i zawieszono w 20 ml roztworu RI (25 mM Tris-HCl, pH = 8,10 mM EDTA, 50 mM glukoza). Po ponownym odwirowaniu, bakterie zawieszono w 10 ml roztworu RI. Dodano 5 mg lizozymu na 1 ml zawiesiny i inkubowano w lodzie przez 5 minut. Dodano 20 ml roztworu RII (0,2 N NaOH, 1% SDS), łagodnie wymieszano i dodano 15 ml roztworu RUI (5M octan potasu, pH = 4,8). Zawiesinę wymieszano i przesączono przez bibułę filtracyjną. Do przesączu dodano 27 ml izopropanolu. Wytrącone kwasy nukleinowe odwirowano i po przepłukaniu etanolem rozpuszczono w 1,6 ml buforu TE. Dodano 0,32 mg RN-azy i inkubowano 1 godzinę w 37°C. Po tym czasie dodano 0,6 ml roztworu 40% glikolu polietylenowego w 2M NaCl. Po całonocnej inkubacji w lodzie osad odwirowano i przepłukano 10%o roztworem glikolu polietylenowego w 0,5 M NaCl. Osad rozpuszczono w 0,8 ml buforu TE. Dodano 40μΐ 1O%o roztworu SDS i ogrzewano w 65°C przez 10 minut. Dodano 80 μΐ 3M roztworu octanu potasu i dwukrotnie usuwano białka przeż wytrząsane z mieszaniną chloroformu z alkoholem izoamylowym (24:1). Z fazy wodnej wytrącono kwasy nukleinowe przez dodanie 2 objętości etanolu. Osad DNA przepłukano 70% etanolem i rozpuszczono w 0,5 ml buforu TE.

Otrzymany w ten sposób plazmid pABil20 można powielać bez ograniczeń wraz z matrycą genetyczną kodującą polipeptyd zawierający determinanty antygenowe białka otoczki wirusa HIV. Plazmid ten może służyć do wytwarzania preparatów zawierających DNA lub RNA o sekwencji odpowiadającej syntetycznej matrycy. Nie nadaje się jednak do wytwarzania białka. W tym celu należy przenieść matrycę genetyczną do wektora ekspresyjnego.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób konstruowania zdolnego do replikacji wektora do wytwarzania sondy wykrywającej geny wirusa HIV i/lub do biosyntezy białka o właściwościach antygenowych otoczki wirusa HIV, znamienny tym, że zdolny do replikacji wektor łączy się z syntetycznym DNA o sekwencji:

5' TCGAGCAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGCAACAAT 3' AGCTCGTTATAATGTCCCGACGATAATTGTTCTCTACCACCATTATCGTTGTTA

GAGTCCGAAATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGATCTGAA

CTCAGGCTTTAGAAGTCTGGACCTCCTCCTCTATACTCCCTGTTAACCTCTAGACTT

TTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGGACCCACCAAGGCA AATATATTTATATTTCATCATTTTTAACTTGGTAATCCTCATCGTGGGTGGTTCCGT AAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGATGATC 3'