PL149845B1 - Sposób otrzymywania nośnika z reaktywna grupa epoksydowa - Google Patents

Description

POLSKA RZECZPOSPOLITA LUDOWA	OPIS PATENTOWY	149 845
Patent dodatkowy do patentu nr- Zgłoszono: 87 * Οθ 26 /P · 267453/	fę^YTELNlAT
	l^-'1 Imrnl |
	Pierwszeństwo ——	Int.Cl.4 BO1D 15/08
		B01J 20/30
URZĄD PATENTOWY	Zgłoszenie ogłoszono: 89 θ3 θθ	C03C 17/34
PRL	Opis patentowy opublikowano: 90 04 30

Twórcy wynalazku: Jerzy Rogalski, Andrzej L.Dawidowicz

Uprawniony z patentu: Uniwersytet Marii Curie Skłodowskiej, Lublin /Polska/

SPOSÓB OTRZYMYWANIA NOŚNIKA Z REAKTYWNA GRUPA EPOKSYDOWA « f

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nośnika z reaktywną grupą epoksydową mającego szczególnie zastosowanie do immobilizowania ligandów.

Chromatografia powinowactwa /affnity chromatography/ należy do unikalnych metod rozdziału· Jest ona jedyną techniką, która pozwala na oczyszczanie i izolację prawie każdej molekuły pochodzenia biologicznego· Wynika to ze specyficznego, selektywnego i komplementarnego oddziaływania pomiędzy izolowaną substancją a specyficznym do niej ligandem /suostratom, inhibitorem, kofaktorem itp/ zimmobilizowanym na nośniku·

Komplementarnie i specyficznie związaną daną substancją można następnie usunąć z powierzchni nośnika· Usunięcie - desorpcja tej substancji nie powoduje zniszczenia właściwości sorbentu i pozwala na ponowne jego wykorzystanie· Odzysk oczyszczonej substancji jest bardzo wysoki, a stopień oczyszczenia może dochodzić do kilkudziesięciu tysięcy· Jak z powyższego wynika, kluczową rolę w procesie odgrywa sorbent· Poprzez sorbent do chromatografii powinowactwa rozumie się porowaty nośnik, którym jest porowaty polimer naturalny lub sztuczny, żel krzemionkowy, tlenki metali, szkło porowate, węgiel i sadze grafityzowane itp·, do powierzchni którego przyłączony jest ligand·

Najczęściej stosowanym sposobem łączenia ligandu z powierzchnią nośnika jest łączenie poprzez tak zwany łącznik i odstępnik /ramię/, które posiadają dwie grupy funkcyjne.

Jedna z nich pozwala na przyłączenie łącznika do powierzchni nośnika, druga zaś reaguje z odpowiednim ligandem, bezpośrednio lub poprzez odstępnik, dając bardzo stabilne wiązanie· Najczęściej jako substancje łączące ligand z nośnikiem stosuje się odpowiedni silan, posiadający z jednej strony grupy funkcyjne zdolne do reakcji z powierzchnią nośnika, z drugiej natomiast grupę reaktywną w stosunku do ligandu·

149 845

149 845

W przypadku braku na związanym z powierzchnię nośnika silanie* grupy zdolnej do reakcji z ligandem* przed przyłączeniem ligandu* końcową grupę silanu lub samego ligandu* modyfikuje się w reakcji z wymaganym dwufunkcyjnym łącznikiem* pozwalającym związać ligand· Typowym przykładem takiego modyfikatora może być % - aminopropylo-trójetoksysilen lub bardziej ogólnie*Ca>- aminoalkilotrójelkoksy-albo-chlorosilan* które pozwalają bądź bezpośrednio przy użyciu związków podobnych do aldehydu glutarowego* bezwodnika bursztynowego* karbodwuimidu* chlorku kwasu p-nitrobenzoesowego itp·* przyłączyć odpowiedni ligand·

Znane jest także stosowanie jako modyfikatora powierzchni nośnika porowatego polimeru* związków zawierających dwie grupy epoksydowe· Przykładem jest modyfikacje powierzchni nośnika znanego pod nazwę handlową Sepharose* za pomocę eterów dwuglicidobutandiolu 1*3 lub 1*4· Dzięki dwu grupom epoksydowym znajdującym się na końcach łańcucha* możliwe jest przyłączenie tej substancji zarówno do ligandu posiadającego wolne grupy hydroksylowe* aminowe* tiolowe jak i nośnika posiadającego te same grupy· Powstałe połączenia sę stosunkowo stabilne hydrolitycznie· Jednak jak podano* sposób dotyczy porowatych polimerów naturalnych lub sztucznych* stosowanie których jest ograniczone głównie ze względu na ich niską odporność mechaniczną* termiczną i chemiczną oraz brak możliwości sterylizacji· Ponadto tego rodzaju nośniki sę atakowane przez mikroorganizmy* które pozostawiają trudne do usunięcia toksyny·

Stosowanie matryc nieorganicznych* jak żel krzemionkowy* czy szkło porowate modyfikowane związkami zawierającymi dwie grupy epoksydowe* nie posiada wymienionych wad* ale jest bardzo trudne do przeprowadzenia* wymaga ekstremalnych warunków pH i zastosowania trudnodostępnych silanów z grupą epoksydową położoną na przeciwnym końcu łańcucha· Ponadto reakcje powierzchniowych grup hydroksylowych krzemionki lub szkła porowatego z modyfikatorem poprzez grupę epoksydową* prowadzi do powstanie połączenia Si-O-C* bardzo podatnego na hydrolizę* co w konsekwencji powoduje nietrwatość wytworzonych sorbentów·

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie modyfikacji powierzchni nośnika niezależnie od jego charakteru* związkami posiadającymi grupy epoksydowe na obydwu końcach* bez konieczności stosowania drastycznych warunków syntezy oraz bez obawy, że związane ligandy zostaną zmyte z powierzchni nośnika na skutek hydrolizy·

Sposób według wynalazku polega na tym* że nośnik* korzystnie silikażel lub szkło porowate poddaje się najpierw znanej modyfikacji silanem reagującym z powierzchnią nośnika* posiadającym na swoim końcu grupy zdolne do reakcji z grupami epoksydowymi* korzystnie CV aminoalkilosilanem, a następnie tak zmodyfikowaną powierzchnię nośnika poddaje się powtórnej modyfikacji związkiem dwuepoksydowym eterem dwuglicydylowym glikolu dwuetylenowego, tak zwanym eksyranem.

Proces modyfikacji prowadzi się przez ogrzewanie silanu rozpuszczonego w rozpuszczalniku organicznym z zawieszonym w nim nośnikiem* a następnie po odsączeniu z silanizowanego nośnika zadaje się go roztworem oksyranu w buforze o pH 8 - 12* korzystnie pH 9*5, po czym zawiesinę wytrząsa się w temperaturze +4 - 70°C* korzystnie 20 - 70°C przez 2-48 godzin* korzystnie 12 - 24 godzin* a następnie odsącza się* odmywa wodę destylowaną i suszy lub bezpośrednio wykorzystuje do chemicznego wiązania ligandów.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się trwałe, niehydrolizujące wiązania Si - 0 - Si, łączące powierzchnię z odstępnikiem, posiadającym na niezwiązanym końcu grupę epoksydową bez konieczności użycia trudnodostępnego silanu z odpowiednio związaną grupą epoksydową.

Podany sposób umożliwia ponadto zastosowanie dowolnego oksyranu, o dowolnej długości* co pozwala na łatwe regulowanie długości odstępnika·

Przykład I. lOg szkła porowatego o średniej średnicy porów 400 A, powierzchni właściwej 82 m^/g i porowatości 1*26 cni^/g wygrzano w temperaturze 200°C przez 12 godzin *'wykorzystując naczynie przeznaczone do reakcji silanizacji. Po ostudzeniu w warunkach uniemożliwiających dostęp pary wodnej z powietrza, wygrzaną próbkę zalano 200 ml 10% - aminopropylotrójetoksysilanu rozpuszczonego w toluenie· Całość ogrzewano przez 4 godziny w temperaturze wrzącego toluenu przy jednoczesnym mieszaniu zawiesiny. Po tej reakcji zawiesinę

149 845 zmodyfikowanego szkła porowatego odsączono na lejku Schot*ta i przemyto początkowo toluenem, a następnie acetonem· Otrzymany sorbent suszono początkowo w temperaturze 40°C, a następnie podwyższono temperaturę do 1OO°C i szybkością 5°C na godzinę·

W kolejnym etapie lg modyfikowanego - aminopropylotrójetoksysilanem, szkła porowatego mieszano z 5 ml 0,1 K buforu Britten'a Robinsona pH 8 i 1 ml oksyranu - eteru dwuglicydylowego glikolu dwuetylenowego· Całość wytrząsano w termostatowanej wytrząsarce Elp 354 przy 150 rpm w temperaturze 28°C /amplituda 5/ przez 24 godziny. Następnie nośnik odsączono i odmywano wodą destylowaną 100 ml na lejku z porowatym spiekiem·

W celu sprawdzenia efektywności stopnia związania oksyranu z powierzchnią nośnika związano z otrzymanym materiałem /posiadającym wolne grupy epoksydowe/ monosacharyd /glukozę/ znakowany £u - Radioaktywność końcowego sorbentu /ze związaną glukozą/ traktowano jako stopień /miarę/ związania glukozy z powierzchnią nośnika, a tym samym jako stopień związania epoksy-modyfikatora· Kontrolę wykonano w sposób następujący· Odsączony nośnik przenoszono do kolby okrągłodennej, dodawano 5 ml 0,1 M buforu Britten*a - Robinsona pH 10 zawierającego 100 mg zimnej glukozy oraz 850 B g £ U - ^Z - glukozy· Całość wytrząsano w analogicznych jak wyżej warunkach przez 24 godziny. Po odsączeniu i przemyciu 200 ml wody, sorbent przenoszono do naczyńka scyntylacyjnego i mierzono jego radioaktywność w scyntylatorze Agnadol - 2 na liczniku scyntylacyjnym Nuclear Chicago Isocap 300. Ilość zatrzymanego piętra £^ZJ na nośniku była miarą związania oksyranu z powierzchnią·

Pr z y k ł a d II. 1 g nośnika ze związanym - aminopropylotrójetoksysilanem jak w przykładzie 1, zadano 5 ml buforu Brittena - Robinsona pH « 11 i 1 ml oksyranu· Całość o wytrząsano w termostatonowej wytrząsarce Elpo 354 przy 150 rpm w temperaturze 40 C przez 8 godzin· Kolejne czynności były takie same jak w przykładzie I· W tych warunkach uzyskano znacznie wyższy stopień związania oksyranu z powierzchnią nośnika·

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób otrzymywania nośnika z reaktywną grupą epoksydową poprzez podwójną modyfikację powierzchni nośnika, najpierw silanem, a następnie dwufunkcyjnym związkiem stanowiącym łącznik, znamienny tym, że nośnik, korzystnie silikażel lub szkło porowate, modyfikuje się w znany sposób silanem, reagującym z powierzchnią nośnika i posiadającym na końcu grupy zdolne do reakcji z grupami epoksydowymi, korzystnie - aminoalkilosilanem, a następnie tak zmodyfikowaną powierzchnią nośnika poddaje się powtórnej modyfikacji związkiem dwuepoksydowym eteru dwuglicydylowego glikolu dwuetylenowego, tak zwanym okśyranem, przy czym proces powtórnej modyfikacji prowadzi się przez zadanie zsilanizowanego nośnika roztworem oksyranu w buforze o pH 8 - 12, korzystnie pH 9.5, wytrząsanie zawiesiny w temperaturze +4 - +70°C przez 2-48 godzin, odsączanie, odmycie i ewentualnie wysuszenie·