Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania doustnej kompozycji immunogennej dla zwierzat, takich jak drób.Bardziej szczególowo wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kompozycji immunogennej do podawania doustnego, które zawieraja zywe pierwotniaki, takie jak ziarniaki (Coccidia), pasozytujace w ukladzie zoladkowo-jelitowym, lub poprzez ten uklad. Pierwotniaki te przy swoim przemieszczeniu sie znajduja sie w stadium cysty, to jest w stadium zycia nieczynnego w otoczce zewnetrznej, chroniacej pasozyta przed niekorzystnymi warunkami na zewnatrz ciala gospodarza.Pasozyt opuszcza cyste gdy zostanie polkniety przez nowego gospodarza.Ogólnie uwaza sie, ze skuteczne uodpornienie droga doustna przeciw pasozytniczym pierwot¬ niakom mozna osiagnac tylko wtedy, gdy szczepionka zawiera pierwotniaki zywe. Odpornosc gospodarza ustala sie przy kontrolowanym zakazeniu pasozytem. Doustne podanie zabitych pierwotniaków pasozytniczych nie prowadzi do skutecznej odpornosci. Natomiast zywe orga¬ nizmy moga byc oslabiane, to znaczy moze zostac zmodyfikowana charakterystyka naturalnej zlosliwosci, w celu ich przystosowania do podawania jako szczepionki wywolujacej odpowiedni poziom zakazenia w organizmie gospodarza.Pomimo stanu incystacji, niezbednosc utrzymania zywotnosci pierwotniaków w szczepionce nasuwa problemy nie spotykane zwykle w przypadku tradycyjnych szczepionek zawierajacych organizmy mniej skomplikowane, takie jak bakterie lub wirusy. Pierwotniaków nie mozna liofili¬ zowac, np. w celu przechowywania. Tym niemniej, zamkniete w cystach pierwotniaki sa ogólnie podatne na odwodnienie.Naturalna ekscystacja pierwotniaków po polknieciu nastepuje na zasadzie mechanizmu tra¬ wiennego w jelicie okreslonego gospodarza. Dla wywolania zakazenia cysta musi byc zniszczona, a zamkniety w niej organizm uwolniony do swiatla jelita w regionie, w którym organizm moze zadowalajaco sie rozwijac. Jakiekolwiek opóznienie naturalnej oksycystacji doprowadza do tego, ze pierwotniaki zostaja przeprowadzone przez jelito gospodarza na zasadzie normalnych funkcji trawiennych i wydalone przez niego zanim stana sie zdolne do wywolania ustabilizowanego zakazenia.2 146 426 Z drugiej strony, koniecznosc skutecznej ochrony zamknietych w cystach pasozytów zanim zostana wprowadzone do organizmu gospodarza, wydaje sie nie do pogodzenia z zabezpieczeniem procesu ekscystacji po polknieciu przez gospodarza by nie byl on uposledzony w znacznym stopniu. Moznaby zatem oczekiwac, ze kazda trwala, wytrzymala ochrona spelniajaca to pierwsze wymaganie, uczynilaby szczepionke nieskuteczna przez opóznienie ekscystacji.Wiadomo, ze drób, który przezyl zakazenie ziarniakami, zachowuje pewien stopien odpor¬ nosci na dalsze zakazenie. W opisie patentowym Wielkiej Brytanii nr 2008404 podano sposób skutecznego uodpornienia drobiu przeciw kokcydiozie polegajacy na dodawania do karmy dla drobiu, w sposób ciagly lub co najmniej czesto, niewielkich ilosci zywotnych oocyst z utworzonymi zarodnikami jendnego, lub wiecej niz jednego, gatunku ziarniaków zakaznych dla tego gatunku drobiu. W opisie tym przedstawiono sposób polepszania wzrostu drobiu, polegajacy na prowadze¬ niu hodowli drobiu na diecie zawierajacej materialy odzywcze z dodanymi zywotnymi oocystami, co najmniej jednego gatunku ziarniaków, zawierajacymi wytworzone zarodniki pasozyta, na którego drób jest podatny, przy czym oocysty wystepuja w stezeniu wystarczajacym do wywolania tylko subklinicznego zakazenia drobiu.Waznym zastosowaniem tego wczesniejszego wynalazku jest handlowa karma dla drobiu zawierajaca material odzywczy i od okolo 10 do okolo 10.000 zywotnych oocyst, z wytworzonymi zarodnikami, na kg karmy, przy czym chodzi tu o co najmniej jeden gatunek ziarniaków, na które drób jest podatny.Dostarczenie drobiowi oocyst w regularnie otrzymywanej karmie umozliwia prowadzenie kontrolowanej postepujacej samo-inokulacji. Dzienne pobieranie oocyst okreslane jest iloscia karmy spozywanej przez kazdego ptaka, a poziom oocyst w karmie moze byc regulowany przez wytwórce karmy, któremu nowoczesne udogodnienia kontrolijakosci pozwola zapewnic uniknie¬ cie powstania ryzyka przedawkowania. Oprócz tego, zapewniajac obecnosc oocyst w normalnej karmie, umozliwia sie kurczetom pobieranie oocyst na odpowiednim poziomie, jak tylko zaczynaja one spozywac karme stala, dzieki czemu zaczynaja one uodparniac sie w bardzo wczesnym okresie ich zycia po wyledu.W opisie patentowym Wielkiej Brytanii nr 2008404 wspomniano, ze oocysty moga ulec powaznemu uszkodzeniu pod wplywem odwodnienia i z tego powodu karma zawierajaca je nigdy nie moze byc wysuszona w stopniu calkowitym. Korzystnie poziom wilgotnosci w karmie powinno znajdowac sie w zakresie od okolo 6 do okolo 12% wag, aczkolwiek mozliwe jest przyjecie wyzszego poziomu wilgotnosci, nie doprowadzajacego do narazenia karmy na splesnienie itd. w trakcie przechowywania. Ta sama uwaga powinna ogólnie stosowac sie do podmieszek zawierajacych oocysty, u których mozna wytwarzac karme dla drobiu.Zywotne oocysty z wytworzonymi zarodnikami mozna otrzymac za pomoca rozmyslnego zakazenia zwierzat-gospodarzy, takich jak stado ptaków-dawców i zebranie oocyst z ich odcho¬ dów. Technika otrzymywania zywotnych oocyst ziarniaków z wytworzonymi zarodnikami jest znana z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3147186.W opisie tym przedstawiono równiez sposób doustnego immunizowania drobiu przez poda¬ wanie oocyst w wodzie pitnej dla ptaków lub w karmie.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania kompozycji zabezpieczajacej szcze¬ pionki, która pomaga w utrzymywaniu zasadniczej zywotnosci organizmów immunogennych bez znaczeniejszego uszkodzenia naturalnego mechanizmu, na zasadzie którego zakazaja one gospo¬ darza po polknieciu.Sposób wytwarzania doustnej kompozycji immunogennej dla zwierzat takich jak drób, dla ich uodpornienia na infekcje wywolane przez pasozytnicze pierwotniaki, takie jak ziarniaki, wedlug wynalazku polega na tym, ze wytwarza sie zawiesine zywych zamknietych w cystach pierwotnia¬ ków w wodnym roztworze materialu weglowodanowego tworzacego zel takiego jak alginiany o stezeniu 0,25-11% wagowych, przy czym stosuje sie co najmniej 1000 cyst na kg oraz ewentualnie dodatek wypelniaczy w ilosci 0,25-10% wagowych zawiesiny, a nastepnie w celu zzelowania zawiesine wkrapla sie do roztworu chlorku wapnia o stezeniu okolo 5% wagowych w czasie okolo 15 minut i ewentualnie osusza.14*42* 3 Najpierw wytwarza sie zawiesine zywych zamknietych w cystach pierwotniaków w wodnym roztworze alginianu sodowego, po czym wkrapla sie wytworzona zawiesine do roztworu zawieraja¬ cego chlorek wapnia, korzystnie w ilosci okolo 5% wagowych ilosci alginianu, utrzymujac integral¬ nosc roztworu podczas wkraplania.Podloze zelowe powinno byc wystarczajaco sztywne, aby wytrzymac manipulowanie. Zbyt miekkie lub gabczaste zele nie beda dostatecznie silne, by chronic zamkniete w cystach pierwotniaki przed uszkodzeniem fizycznym. Podloze zelowe, po inkorporacji materialu immunigennego, mozna wysuszyc. Zaskakujaca cecha znamienna wynalazkujest to, ze stosowane podloze w postaci wysuszonej moze funkcjonowac jako skuteczny uklad uwalniajacy szczepionke. Alternatywnie, podloze zelowe mozna utrzymywac w stanie wilgotnym az do doustnego przyjecia przez gospoda¬ rza osadzonych w nim pierwotniaków, albo wlaczenie go do karmy.W stanie wilgotnym, osadzo¬ nymi pierwotniakami mozna manipulowac jako zawiesina czastek zelu np. w podlozu wodnym.Najkorzystniej stosuje sie zel na podstawie alginianów. Mozna stosowac mieszaniny podstaw zelowych.Zastosowanie zelu polisacharydowego prowadzi przy odwodnieniu do wzglednie twardych podlozy.Tatwardosc moze byc w pewnych okolicznosciach korzystna dzieki wzmaganiu fizycznej ochrony pierwotniaków.Tymniemniej, twardosc ta moze okazac sie niekorzystna wskutek zmniej¬ szenia latwosci trawieniapodloza zelowego, a przez to zahamowanie uwalniania pierwotniaków po polknieciu. Jezeli jest to pozadane, podlozem zelowym mozna nadac miekkosc przez dodanie srodka utrzymujacego wilgoc albo plastyfikatora. W tym kontekscie idealnym materialem jest gliceryna i parafina ciekla. Korzystnie materialy takie stosuje sie w ilosci ponizej 75% wagowych w odniesieniu do materialu zelowego (wartosc wyrazona w stosunku do suchej wagi).Wlasciwosci fizyczne podloza zelowego mozna zmodyfikowac za pomoca wlaczenia jednego, lub wiecej nizjednego, wypelniacza. Materialy tego rodzaju moga takze przyczynic sie do obnizenia kosztów surowcowych kompozycji, gdyz na ogól sa one tansze od alginianów. Wypelniacze powinny miec drobne czasteczki by nie wplywac w znaczniejszym stopniu na plyniecie podstawy zelowej przed zestaleniem. Korzystnie wypelniacz nie powinien byc zródlem jonów metalicznych, które moglyby spowodowac przedwczesne zestalenie sie zelu. Problem ten mozna obejsc przez dodanie odczynnika maskujacego. Wypelniacze takie jak kreda, sproszkowane mleko odtlu¬ szczone i sproszkowana serwatka, zawieraja wapn i beda wykazywac tendencje do zestalenia alginianu. Korzystnymi wypelniaczami sa: maki, skrobie, maltodekstryny, dekstryny i miazga ziemniaczana. Bardzo odpowiednie sa takze wypelniacze nieorganiczne, takie jak glinka biala.Mozna równiez zastosowac suszony nawóz ptasi, odpowiednio zmielony i wyjalowiony.W uzupelnieniu do zamknietych w cystach pierwotniaków, do podstawy zelowej mozna wlaczyc rózne inne skladniki przeznaczone do modyfikowania zachowania sie samej podstawy zelowej, albo do uczynienia kompozycji bardziej odpowiednia do podawania doustnego, np. jako skladnika karmy zwierzat. Uwolnienie osadzonych pierwotniaków podczas trawienia mozna ulat¬ wic przez zastosowanie mieszanego ukladu zelowego lub wlaczenie w sklad kompozycji zelowej emulgatorów lub substancji powierzchniowo czynnych. Dla uczynienia kompozycji, jako sklad¬ nika pozywienia, bardziej odpowiednia, moze okazac sie korzystne dokonanie zmiany wlasciwosci organoleptycznych, za pomoca wlaczenia materialów takich jak aromaty i barwiniki. Jezeli jest to pozadane, mozna takze uzyc podloza zawierajacego pierwotniakijako nosnika innych skladników stosowanych w mniejszej ilosci, takich jak promotory wzrostu i pigmenty karotenoidowe.W jednym z zastosowan wynalazku, podloze zelowe moze zawierac zywe pierwotniaki paso¬ zytnicze i czynnik chemoterapeutyczny skuteczny w dzialaniu przeciw pierwotniakom w posred¬ nim stadium ich cyklu zyciowego, w ilosci wystarczajacej do zapobiezenia pelnemu rozwojowi pierwotniaków w organizmie gospodarza po polknieciu. Pierwotniaki pasozytnicze sa wiec zdolne do usadowienia sie na krótko w organizmie gospodarza po polknieciu, co prowadzi do odpowiedzi immunologicznej gospodarza, ale czynnik chemoterapeutyczny zapobiega ich pelnemu cyklowi rozwojowemu prowadzacemu do wydalenia do otoczenia zakaznych pierwotniaków. I tak np., jezeli pierwotniakami sa ziarniaki, w tym zastosowaniu idealnie nadaje sie lek przeciw ziarniakom, co do którego uwaza sie, ze szczyt jego dzialania nastepuje w póznym stadium cyklu zyciowego ziarniaków, korzystnie w póznym stadium schizogonii. Przykladowymi odpowiednimi lekami4 14(426 przeciw ziarniakom sa: nicarbazin, furazolidone, nitrofurazone, nihydrazone, sulphaquinaxalene, sulpanitran, dinsed, ormetroprim, sulphadimethoxinei ethopabate. Podawanie szczepionki zawie¬ rajacej czynnik chemoterapeutyczny zapobiega przeniesieniu sie pasozytów na innych gospodarzy, nie pozwalajac na rozwiniecie sie szczepów opornych na leki. Obecnosc czynnika chemoterapeuty- cznego zapewnia dalsze zabezpieczenie przed mozliwoscia doprowadzenia, w rezultacie podania zakaznych pierwotniaków, w niezwyklych okolicznosciach, do klinicznego zakazenia gospodarza.W kombinacji z czynnikiem chemoterapeutycznym mozna uzyc, jezeli jest to pozadane, pierwot¬ niaków w pelni wirulentnych i/lub pierwotniaków atenuowanych.Szczepionke mozna podac w rozmaity sposób, a mianowicie przez: a) Wlaczenie do karmy gospodarza lub zmieszanie z materialami odzywczymi podczas spo¬ rzadzania karmy. Mozna uzyc przedmieszki zawierajacej podloze zelowe, w postaci czastek, tak, aby ulatwic rozprowadzenie czastek zelu zawierajacych pierwotniaki w calosci karmy. b) Zwykle dodanie do karmy w tym samym czasie, gdy podaje sie ja gospodarzowi, np. posypanie czastkami zelu karmy drobiu. c) Indywidualne podanie zwierzetom-gospodarzom, takim jak nowowylegle kurczeta, gdy chodzi o drób.Szczepionke wedlug wynalazku mozna oprzec na pojedynczym szczepie lub gatunku pierwot¬ niaków, jednakze korzystniejszym celem powinno byc rozszerzenie odpornosci swoistej przez wlaczenie wyboru pospolitych szczepów lub gatunków pierwotniaków, w pojedynczym preparacie szczepionkowym. Zastosowanymi pierwotniakami moga byc w pelni wirulentne szczepy „dzikie", szczepy atenuowane (np. szczepy zaadaptowane do embrionów lub szczepy przedwczesnie rozwija¬ jace sie), szczepy wyprowadzone przez krzyzowanie (obecnie dostepne dla niektórych ziarników, takich jak Eimeria maxima), lub szczepy zmodyfikowane, np. za pomoca manipulacji genety¬ cznych. Jezeli jest to pozadane, pojedynczy preparat szczepionki moze zawierac kombinacje tych róznych typów szczepów.Wynalazek bedzie dalej opisany w odniesieniu do zwalczania kokcydiozy, lecz dla znawcy bedzie rzecza latwo zrozumiala, ze sposobem wedlug wynalazku mozna wytwarzac kompozycje wywolujace odpornosc przeciw innym pasozytniczym pierwotniakom tworzacym cysty.Szczepionek wytworzonych sposobem wedlug wynalazku mozna uzyc do zwalczania kokcy¬ diozy u gospodarzy jakiegokolwiek gatunku wykazujacego sklonnosc do tej choroby. Aczkolwiek dlugo kojarzona z gatunkami ptasimi, w szczególnosci drobiem, kokcydioza jest obecnie rozpo¬ znawana jako wazna dla szerszego zakresu gatunków. Intensywne metody hodowli powoduja zwielokrotnienie ilosci przypadków choroby i ciezkosci jej przebiegu. Przykladowymi nieptasimi gospodarzami zwierzecymi, u których rozpoznaje sie obecnie kokcydioze sa swinie, przezuwacze (a zwlaszcza bydlo, owce i kozy) oraz króliki. Aczkolwiek choroba ta zazwyczaj nie jest waznym czynnikiem jesli chodzi o zdrowie zwierzat doroslych, moze ona spowodowac wiele szkód u zwierzat nowonarodzonych w otoczeniu znacznie zanieczyszczonym przez matke.Kokcydioze badano ekstensywnie u drobiu, zwracajac na nia wzglednie mniejsza uwage w przypadku innych gatunków. Toteznie sa dostepne szczególowe dane porównawcze jesli chodzi o ziarniki zakazajace np. swinie, aczkolwiek w pismiennictwie zidentyfikowano kilka gatunków ziarniaków.Np. u swin zaobserwowano nastepujace ziarniaki: Eimeria debliecki, E. scabra, E. suis, E. spinosa, E. perminuta, E.neodebliecki, E. porci, E. cerdonis, E. polka i Isospora suis. Specyfi¬ cznymi, zidentyfikowanymi ziarniakami bydlecymi sa: Eimeria bovis, E.zuernii, E. ellipsoidalis, E. auburnersis, E. cylindrica, E. alabamensis i E. bukidnonensis. Owce zakazane sa przez: Eimeria minakohlyakimovae, E. ovina, E. intricate i E. ahsate, a kozy przez: E. arloingi. U królików zarejestrowano wystepowanie nastepujacych ziarniaków: Eimeria intestinalis, E. flavesenes, E. magna, E. irresidua, E. periformis, E. stiedai, E. perforans, E. neoleporis iJE. media.Tym niemniej jednak, wynalazek bedzie szczególowo opisany w odniesieniu do drobiu. W niniejszym opisie terminu „drób" uzywa sie w odniesieniu do ptaków rzedu Galliformes, takichjak zwykle ptactwo domowe lub kurczeta (Gallus domesticus), indyki (Meleagris), bazanty (Phasia- nus), kuropatwy (perdix), pardwy (Lagopus), perlice (Numida) i pawie (Pavo), a takze ptaków rzedu Anseriformes, takich jak kaczki (Anas) i gesi (Anser).Ptactwo domowe (Gallus domesticus) moze zarazic sie jakimkolwiek z ziarników takich jak Eimeria tenella, E. necatix, E. brunetti, E. maxima, E. acervulina i E. praecox. Nastepujace14(426 5 ziarniaki kojarzy sie z zakazeniami u indyków (Mcleagris): Eimeria melagrimitis, E. dispersa, E. meleagridis, E. gallopavonis, E. adenoides, E. innocua i E. subrotunda. Kaczki domowe (Anas) cierpia na zakazenie spowodowane Tyzzeriaperniciosa, a równiez, jak sie uwaza, przez Eimeria anatis, które moga byc nabyte od kaczek dzikich (Anas platyrhyncos). Gesi (Anser) moga cierpiec z powodu zakazen spowodowach przez Eineria anseris, E. nocens i E. parvula, a w dodatku uwaza sie, ze ges domowa moze zarazic sie Eimeria hermani, E. striata i E. fulva od gesi kanadyjskiej.Drób innych gatuków, przytoczonych powyzej, cierpi na zakazenia spowodowane przez charakte¬ rystyczne ziarniaki i dlatego kompozycje wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa szczególnie odpowiednie i skuteczne w zwalczaniu zakazen spowodowanych ziarniaki charakterystyczny dla tych innych gatunków drobiu. Nalezy rozumiec, ze wszystkie poziomy oocyst wspomniane w niniejszym opisie odnosza sie wystepujacych gatunków ziarniaków.Zakazenia ziarniakami wystepuja u wszystkich gatunków drobiu hodowanych przez czlo¬ wieka. Zakazenia te sa szczególnie klopotliwe, gdy wystepuja w duzym stadzie ptaków hodowa¬ nych w warunkach nowoczesnego intensywnego rolnictwa. Zakazenia moga rozprzestrzeniac sie w stadzie szybko i spowodowac co najmniej spowolnienie wzrostu. Ciezkie zakazenia moga prowa¬ dzic do smierci ptaków. Tak wiec od wielu lat czyniono znaczne wysilki starajac sie znalesc niezawodne srodki profilaktyczne przeciw tym zakazeniom, a w szczególnosci znalezc drogi skutecznego uodpornienia ptaków przeciw tym zakazeniom. Praktyczna korzyscia odnoszona z kazdej skutecznej metody uodpornienia bedzie sprzyjanie wzrostowi drobiu, który nabyl odpor¬ nosc, co najmniej w tym sensie, ze bedzie sie przeciwdzialac negatywnymu wplywowi na wzrost powodowanemu przez zakazenie ziarniakowi.Ilosc oocyst z wytworzonymi zarodnikami wlaczonych do kompozycji wedlug wynalazku bedzie nalezec do ilosci wymaganej na jednostke wagi koncowej karmy. Typowo, kompozycja wedlug wynalazku powinna zawierac co najmniej 1000 do 1 miliona oocyst z wytworzonymi zarodnikami/kg. Korzystnie ten minimalny poziom powinien wynosic okolo 5000/kg, a najlepiej co najmniej 10000/kg. Typowakompozycja do ogólnego zastosowania moze zawierac od okolo 50000 do okolo 500000 oocyst z wytworzonymi zarodnikami/kg. Poziom maksymalny nie daje sie latwo zdefiniowac. Kompozycjazawierajaca w nadmiarze 1000000 oocyst z wytworzonymi zarod¬ nikami/kg moze byc uzyteczna, jezeli jest niezbedny wysoki poziom oocyst w karmie.Jesli chodzi o poziom oocyst w karmie koncowej, korzystnie karma zawierac powinna nie wiecej niz okolo 2500 zywotnych oocyst z wytworzonymi zarodnikami/kg. Aczkolwiek z wprowa¬ dzenia oocyst z wytworzonymi zarodnikami do karmy podawanej indywidualnemu ptakowi w kazdym stadium jego zycia, zostanie odniesiona korzysc, korzystne jest dostarczanie karmy zawierajacej oocysty z wytworzonymi zarodnikami na niskim poziomie, jak tylko zaczyna on byc karmiony po wylegu. Gdy ptak rosnie, jego wymagania co do dziennej karmy znacznie wzrastaja.Bioi4C na przyklad ptactwo domowe (Gallus domesticus), w stadium „pierwszego karmienia" kurcze zjada co najmniej 2g karmy /dzien. Po uplywie 10 dni ilosc ta wzrasta do co najmniej 10 g/dzien, a po uplywie 30 dni ptak bedzie zjadac okolo 80 g, lub wiecej/dzien. Zapotrzebowanie ptaka na pozywienie zmienia sie wraz zjego rozwojem, a handlowo dostepne karmy dla drobiu sa sprzedawane jako pewien asortyment preparatów przeznaczonych dla ptaków w róznych stadiach ich rozwoju. Zasadniczo w asortymencie tym znajduja sie karmy specjalne formulowane dla ptaków znajdujacych sie na poziomie „Poczatkujacych", „Rosnacych" i „Hodowlanych". W celu zapewnienia przyjmowania przez ptaka, w kazdym stadium jego rozwoju, odpowiedniej ilosci oocyst ziarniaków z wytworzonymi zarodnikami/dzien, moze okazac sie odpowiednie, ze rózne karmy zawierac beda rozmaite ilosci oocyst/kg.Uwazamy, ze dla optymalnego uodpornienia nowowyklute krucze powinno przyjmowac 1-20 zywotnych oocyst z wytworzonymi zarodnikami/dzien. Podczas pierwszych 10 dni wzrostu poziom ten powinien podniesc sie do okolo 2-50 occyst/dzien. Trzydziestegodnia poziom przyj¬ mowanych oocyst powinien wynosic okolo 5-200/dzien.Korzystnie karma dla „Poczatkujacych" bedzie zawierac co najmniej 50 zywotnych oocyst z wytworzonymi zarodnikami/kg. Korzystnie maksymalny poziom oocyst bedzie wynosic okolao 5000 kg, a najlepszy nie wiecej niz 2000/kg. W karmie dta „Rosnacych" minimalny poziom * zywotnych oocyst z wytworzonymi zarodnikami wynosi korzystnie okolo 50/kg. Górny poziom oocyst wynosi korzystnie okolo 2000/kg, a najlepszy nie wiecej niz okolo 500/kg. W karmie dla6 14*42* „Hodowlanych" odpowiedni poziom minimalny zywotnych oocyst z wytworzonymi zarodnikami wynosi okolo 10/kg. Korzystnie górny poziom ilosci oocyst nie przekracza okolo 1000/kg, a najlepszy wynosi nie wiecej niz 100/kg.Dla gospodarzy z gatunków innych niz drób, dzienne pobieranie oocyst moze wymagac zróznicowania w zaleznosci od czynników takichjak wzgledna wirulencja organizmu oraz wielkosc i podatnosc zwierzecia. Np. u odstawionego cielecia dzienne pobieranie 1-100 zywotnych oocyst z wytworzonymi zarodnikami prawdopodobnie jest wystarczajaca.Pewne pierwotniaki pasozytnicze wytwarzaja w swoim stadium przemieszczania sie „cysty wewnatrz cyst", Np. ziarniaki istnieja jako sporocysty w cyscie zewnetrznej (oocysta). Aczkolwiek dla celów praktycznych dogodniej jest uzyc pelnej oocysty jako skladnika szczepionki, mozliwe bedzie osadzenie w sztywnym podlozu zelowym uwolnionych sporocyst.Kompozycjiwytworzonej sposobem wedlug wynalazku mozna uzyc takze w celu wlaczenia do karmy innych zasadniczych skladników sladowych, np. dodatków mineralnych, które sa szczegól¬ nie wazne sprzyjajac tworzeniu skorupyjaja u niosek, witamin i aminokwasów, takich jak lizyna, pigmentów karotenoidowych uzywanych zwykle w celu wplyniecia na barwe zóltekjaj. Jezelijest to pozadane, skladniki te uzywane w mniejszej ilosci mozna wlaczyc z oocystami w jednej zlozonej kompozycji.Kompozycjewytworzona sposobem wedlug wynalazku mozna wlaczyc do karmy za pomoca zwyklego domieszania, przy czym ilosc kompozycji na jednostke wagi karmy wybiera sie biorac pod uwage stezenie oocyst obecnych w kompozycji i stezenie oocyst pozadane w karmie. Oprócz wlaczenia do karmy kompozycji zawierajacej zywotne oocysty z wytworzonymi zarodnikami, nie jest dla kompozycji, albo dla fizycznej formy karmy istotne dokonania jej zmiany przy wprowa¬ dzaniu wynalazku do uzytku. Mozna uzyc któregokolwiekz istniejacych standardowych „pelnych" albo „odzywczo zrównowazonych" handlowo dostepnych preparatów karmy. Material odzywczy w karmie moze wiec zawierac jakiekolwiek skladniki bialkowe, weglowodanowe lub tluszczowe normalnie znajdowane w tego rodzaju karmach. Charatker tych standardowych skladników, takich jak rózne maczki rybne, mielone zboze i inne materialy roslinne oraz dodatki mineralne, a takze wymagania odzywcze, takie jak minimalny poziom witamin, aminokwasów i pierwiastków sladowych sa dobrze znane w tej dziedzinie wiedzy i udokumentowane w pismiennictwie techni¬ cznym. Szczególy te nie wchodza w zakres niniejszego wynalazku.W przypadku przyjecia za przyklad zelu na podstawie alginianówjako ukladu zestalanego na drodze chemicznej, produkt wytwarzany sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymac za pomoca zanurzenia oocyst ziarników w wodnym roztworze alginianu i doprowadzenia do utworzenia przez alginian zelu na drodze odpowiedniej reakcji inicjowanej chemicznie. Zelowania mozna dokonac za pomoca „zestalania w calosci", kiedy to tworzy sie blok zelu wymagajacy nastepnie podzielenia go na mniejsze czastki gotowe do uzycia. Podzialu takiego mozna dokonac za pomoca siekania, krajania, sztakowania itp. Tym niemniej jednak, korzystnie zelowanie przeprowadza sie podczas wytwarzania produktu w postaci wzglednie drobnych czastek, w wyniku czego dalsze rozdrabnia¬ nie staje sie niekonieczne. I tak np. zestalany zel mozna wytlaczac przez waska dysze z utworzeniem struktury podobnej do makaronu o wzglednie malym przekroju poprzecznym. Zawiesine mozna wytlaczac do podloza zestalajacego.Korzystne wykonanie sposobu polega na kontaktowaniu kropelek wodnego roztworu algi¬ nianu z podlozem zestalajacym. Kropelki mozna wytworzyc przez natryskiwanie, albo, korzyst¬ niej, przez pozwolenie roztworowi na wplywanie z jednej, lub wiecej niz jednej, dyszy. Najkorzyst¬ niejszym sposobem jest tworzenie kuleczek zelu za pomoca dopuszczenia do spadania do podloza zestalajacego, takiego jak kapiel zawierajaca czynnik zestalajacy, kropelek roztworu alginianu zawierajacego oocysty. W tych warunkach kropelki zeluja bardzo szybko i pozostaja oddzielnymi kuleczkami. Po zestaleniu mozna z podloza zestalajacego odzyskac kuleczki alginianu. Jezelijest to niezbedne, calosc kuleczek mozna podzielic pod wzgledem wielkosci na frakcje, z wykorzysatniem zwyklych metod, takich jak przesiewanie.Typowawielkosc kuleczek alginianu zawierajacych oocysty odpowiada w stanie wilgotnym srednicy okolo 5 mm,-co oznacza srednice okolo 1-3 mm w przypadku kuleczek odwodnionych.Ostateczne rozmiary odwodnionych kuleczek zaleza od zawartosci w nich cial stalych, gdy znajduja sie one jeszcze w stanie wilgotnym.14<«2* 7 Ilosc alginianu w roztworze wodnym powinna byc taka co najmnej, aby utrzymac integracje roztworu, gdy jest on kontaktowany z czynnikiem zestalajacym. I tak npM gdy krople roztworu spadaja do czynnika zestalajacego, powinny one zelowac natychmiast z utworzeniem sztywnego zelu, pozostajac przez to oddzielnymi, mocnymi kuleczkami. Korzystne sa alginiany o wzglednie wysokiej masie czasteczkowej, gdyz umozliwia to uzyskanie sztywnego zelu przy niskim stezeniu, gdy do produktu zostanie wlaczona znaczna ilosc wypelniaczy lub innych skladników. Ogólnie, ilosc alginianu w podlozu zelowym w stanie wilgotnym powinna wynosic 0,25-10% wagowych.Mozna zastosowac dostepne handlowo alginiany w szerokim zakresie, aczkolwiek korzystne sa alginiany o wysokim stosunku reszt kwasu mannurowego do reszt kwasu glukuronowego. Z powodu zamierzonego stosowania szczepionki wytworzonej sposobem wedlug wynalazku do doustnego uodpornienia zwierzat, nie jest niezbedne uzycie alginianów o czystosci farmaceutycznej lub o czystosci odpowiadajacej normom zywieniowym dla ludzi, aczkolwiek mozna uzyc takich surowców, jezelijest to uzasadnione ze wzgledów ekonomicznych. Najwazniejszym wymaganiem jest, aby poziom substancji nierozpuszczalnych zawartych w alginianie nie szkodzil, np. w wyniku interferencji z wlasciwosciami plyniecia roztworu alginianu albo zmniejszenia sily zelowania, tworzeniu zadawalajacego produktu. Mozna uzyc alginianów nie calkowicie oczyszczonych.Zestalenia alginianu na drodze chemicznej mozna dokonac przy uzyciujonów metali, nadaja¬ cych alginianowi nierozpuszczalnosc zwlaszcza przy uzyciu jonów wapnia. Idealnymi czynnikami zestalajacymi sa sole takie jak chlorek wapniowy lub fosforan wapniowy. Alternatywnie uzyc mozna kwasowego czynnika zestalajacego. Mozna uzyc wolnych kwasów, takich jak kwas solny lub kwas octowy.Mozliwe jest takze uzycie, alternatywnie do ukladów zestalania na drodze chemicznej, mate¬ rialów zelujacych zestalanych termicznie, w szczególnosci bialek. I tak, w przypadku, przykla¬ dowo, zelatyny, nalezy utworzyc roztwór bialka w wodzie, w temperaturze np. 60°C, po czym roztwór ten ochlodzic, a nastepnie dodac do niego oocysty ziarniaków w temperaturze, w której pozostana one zywotne. Zelowanie zelatyny rozpoczyna sie w temperaturze okolo 30°C i moznaje ulatwic za pomoca pozwolenia kropelkom roztworu zelatyny na spadanie do zimnego oleju.Stezenie czynnika zestalajacego w kapieli zastalajacej wplywa na czas zestalenia sie roztworu alginianu. Ponadto, jezeli stezenie czynnika zestalajacego, a w szczególnosci soli wapniowej, takiej jak chlorek wapniowy, bedzie wysokie, poziom soli w kuleczkachalginianu moze byc takze wysoki.Nastepnie kuleczki rozplywaja sie i mozna nie odwodnic ich w stopniu wystarczajacym. Ponadto, w wilgotnych kuleczkach obecnosc soli wapniowych w wysokim stezeniu wywoluje silny wplyw osmotyczny na oocysty, a zjawiska tego, jezeli tylkojest to mozliwe, powinno sie uniknac. Ogólnie, wymagany jest maksymalny poziom zawartosci chlorku wapniowego w kapieli zestalajacej nie wyzszy niz 5% wagowych.Jednakze, gdy zzelowane kuleczki pozostawia sie w kontakcie z woda przez okreslona ilosc godzin, np. przez noc, nadmiar chlorku wapniowego zostanie z kuleczek oddyfundowany.Jezeli jest to pozadane, odwodnienia kuleczek zelu mozna dokonac za pomoca suszenia na powietrzu i na ogól powinno sie dazyc do uzyskania poziomu zawartosci wilgoci ponizej 20% wagowych.Tymniemniej, kuleczki zelu korzystnie przechowuja sie w stanie wilgotnym, np. w kontakcie z podlozem wodnym, które zapewnia najlepsze srodowiskodla oocyst. Kuleczki mozna wlaczyc do karmy w stanie wilgotnym, pozwalajace im osiagnac poziom wilgotnosci stanowiacy wynik równowagi.Przedmiot wynalazku objasniaja bardziej szczególowo nastepujace przyklady.Przyklad I. W przykladzie tym, jako podloze zelowe stosuje sie handlowo dostepny algi- nian sodowy (Manucol LB). Alginian ten wykazuje wysoki stosunek reszt kwasu mannurowego do reszt kwasu guluronowego oraz niska mase czasteczkowa. „Manucol" jest to nazwa fabryczna produktu firmy Kelco/AIL International Ltd. 95 ml 11% wagowych wodnego roztworu Manucol LB miesza sie z 5 ml wodnej zawiesiny zywotnych oocyst ziarniaków z wytworzonymi zarodnikami (Eimeria tenella) zawierajacej okolo 600000 oocyst. Mieszanine te wkrapla sie z odleglosci okolo 7,62 cm do 5% wagowych wodnego * roztworu dwuwodzianu chlorku wapniowego. Tak wytworzone zestalone kuleczki zelu maja w8 14i 426 przyblizeniu srednice okolo 5 mm i wage okolo 40 mg. W czasie 2-minutowej szarzy otrzymuje sie okolo 2500 kuleczek. Pozwala sie im pozostawac w kapieli zestalajacej w ciagu 15 minut odsiewa sie je od czynnika zestalajacego i namacza przez noc w wodzie wodociagowej w celu usuniecia chlorku wapniowego. Kuleczki pozostawia sie do wyschniecia na papierze chlonnym w temperaturze otoczenia. Ich koncowa wilgotnosc wynosi 15-16% wagowych.Przyklad II.W przykladzie tym, jako podloze zelowe, stosuje sie alginian sodowy z glice¬ ryna jako srodkiem utrzymujacym wilgoc. 45 ml 11% wagowych wodnego roztworu alginianu sodowego w postaci Manucol LB miesza sie z 5 ml zawiesiny oocyst ziarniaków, tak jak to wyzej opisano w przykladzie I, i 50 ml gliceryny.Mieszanine te poddaje sie takiej samej obróbce, prowadzacej do wytworzenia kuleczek, jak wyzej opisano w przykladzie I, z tym wyjatkiem, ze nadmiar chlorku wapniowego usuwa sie z zzelowa- nych kuleczek przez namoczenie na noc w mieszaninie wody i glicerynie 50:50. Koncowa zawar¬ tosc wilgoci w wysuszonych kuleczek wynosi i w tym przypadku 15-16% wagowych.Zywotnosc oocyst ziarniakóww kuleczkach alginianowych wytworzonych sposobem wedlug dwóch poprzednich przykladów wykazano w nastepujacym badaniu.Po przechowywaniu w stanie odwodnionym w ciagu kilku dalszych dni, próbke kuleczek alginianowych miesza sie z 500 g zwyklej karmy dla drobiu, tak, ze 500 g próbka karmy zawiera 2500 kuleczek. Kazda próbka karmy karmi sie 2 30-dniowe kurczeta ad libitum w ciagu 2 dni.Wszystkie ptaki wykazuja kliniczne objawy kokcydiozy, z krwia w odchodach 5-go i 6-go dnia po podaniu karmy zawierajacej oocysty.Test ten wykazuje, ze duza ilosc oocyst ziarniaków pozostaje w stanie zywotnym wbrew procesom, którym zostaly one poddane, oraz ze sa one ciagle zdolne do zadowalajacej ekscystacji w jelicie, pomimo tego, ze sa one osadzone w algoinianowym podlozu zelowym.Przyklad III. Eksperyment ten jest przeznaczony do tego, aby potwierdzic, ze bardzo niewielka ilosc zywotnych oocyst z wytworzonymi zarodnikami, dodana do karmy dla drobiu, moze przezyc i powodowac subkliniczne, kontrolowane zakazenia po zjedzeniu przez podatne ptaki. Odpornosc powstala w rezultacie tego rodzaju traktowania, kontynuowanego w ciagu 27 dni, sprawdza sie dawka prowokujacaw postaci 50000 oocyst. Uzywa sie dwóch grup ptaków po 12 ptaków w kazdej grupie. Pierwsza grupa otrzymuje diete zawierajaca oocyst juz od wieku 1 dnia, druga diete normalna, nie zawierajaca oocyst. Ptaki byly trzymane na siatce drucianej, tak, ze mozliwa byla kontrolaich dziennego wydalania oocyst (wynikajacego z obecnosci oocyst w diecie).Pomieszczenie, w którym przetrzymywano ptaki, utrzymywano starannie w takim stanie, aby zapewnic, ze nie pozostaja w nim zadne oocysty.Oocysty wytwarza sie za pomoca zakazenia 4-tygodniowych kurczat-brojlerów Cobb dawka doustna 50000 oocyst na ptaka, a nastepnie zebrania ptasich odchodów 6-go, 7-go i 8-go dnia po zakazeniu, wymieszania z mniej wiecej dwukrotna objetoscia 2,5% wodnego roztworu dwuchro¬ mianu potasowego i zhomogenizowania az do uzyskania gladkiej papki. Nastepnie papke te przeciska sie przez nylonowa gaze i z przesaczu odzyskuje sie oocysty za pomoca flotacji solnej w nastepujacy sposób. Najpierw oocysty osadza sie za pomoca wirowania przy 100 Xg w ciagu 15 minut, po czym osad zawiesza sie w nasyconym wodnym roztworze chlorku sodowego. Nastepnie zawiesine te wiruje sie przy 50 Xg w ciagu 10 minut. Pozostala zawiesine oocyst odciaga sie i rozciencza 10 objetosciami wody destylowanej. Za pomoca wirowania przy 1000Xg w ciagu 15 minut osadza sie oocysty w postaci peletu. Calkowity proces flotacji solnej powtarza sie i powstaly pelet rozprowadza 2,5% wodnym roztworem dwuchromianu potasowego. Doprowadza sie do wytworzenia w ekstrahowanych oocystach zarodników za pomoca ciaglego napowietrzania tej zawiesiny w ciagu 4 dni w temperaturze 28°C. Oocysty te przechowuje sie jako zawiesine macierzy¬ sta w tempoeraturze 4°C w buforowanym fosforanami roztworze soli.Kuleczkiwytwarza sie sposobem opisanym w powyzszym przykladzie I, z ta róznica, ze uzywa sie ogólem 30000 oocyst ziarniaków z wytworzonymi zarodnikami. Do 3 kg karmy dla drobiu dodaje sie 240 kuleczek i karmi nia nowowyklute kurczeta w ciagu 3 tygodni. W obu grupach kontroluje sie poziom wydalanych oocyst. Uzyskane wyniki przedstawione sa na figurze 1.Oocysty, które przezyly w karmie czas trwania eksperymentu przeszly, jako oocysty, od 8-go dnia w prawo, w ciagu okresu uodporniania sie, jak przedstawiono na figurze 1. Na podstawie146 426 9 rozkladu wydalania oocyst (linia A) przedstawionego na figurze 1, jest oczywiste, ze zasadnicza odpornosc zaczyna sie rozwijac wkrótce po tym, gdy ptaki osiegaja wiek zaledwie 2 tygodni, gdyz zwiekszone wydalanie oocyst szybko ustaje i 2I-go dnia staje sie kontrolowane.Oocysty uodporniajace nie wywoluja wykrywalnych efektów patogennych. W ciagu calego okresu uodpornienia nie zauwaza sie krwawych odchodów, co wazniejsze, sredni przyrost wagi w grupie kontrolnej i uodparnianej sa w istocie identyczne az do dnia prowokacji.Prowokacja (C) 50000 oocyst 27-go dnia powoduje ciezka chorobe u grupy kontrolonej, jak mozna sadzic na podstawie obecnosci krwi w odchodach i obfitego wydalania oocyst (linia B, figura 1). Grupa uodparniana zupelnie nie zostala zaatakowana, przy tym w obydwu grupach nie stwierdzono smiertlenosci.Przyklad IV-VII. Przyklady te objasniaja uzycie wypelniaczy przy wytwarzaniu kuleczek alginianowych.Kuleczki wytwarza sie sposobem opisanym w powyzszym przykladzie I z zastosowaniem „roztworu" przedstawionego ponizej: Przyklad IV V VI VII Alginian 1% Manucol LM 0,25% Manucol LM 1% Manucol LM 0,25% Manucol LM Wypelniacz 10% handlowej bialej maki pszennej 10% handlowej bialej maki pszennej 10% glinki bialej 10% glinki bialej W kazdym przypadku, po zestaleniu i wysuszeniu sposobem opisanym w powyzszym przykla¬ dzie I, otrzymuje sie mocne kuleczki. Manucol LM jest to alginian wykazujacy wysoki stosunek ilosci reszt kwasu mannurowego do ilosci reszt kwasu guluronowego oraz wysoka mase czastecz¬ kowa, korzystna przy uzyciu wypelniaczy dla zapewniania odpowiedniej sily zelu.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania doustnej kompozycji immunogennej dla zwierzat takichjak drób, dla ich uodpornienia na infekcje wywolane przez pasozytnicze pierowtniaki, takie jak ziarniaki, znamienny tym, ze wytwarza sie zawisine zywych zamknietych w cystach pierwotniaków w wodnym roztworze materialu weglowodanowego tworzacego zel takiegojak alginiany, o stezeniu 0,25-11% wagowych przy czym stosuje sie co najmniej 1000 do 1 miliona cyst na kg oraz ewentualnie dodatek wypelniaczy w ilosci 0,25-10% wagowych zawiesiny, a nastepnie w celu zzelowania zawiesine wkrapla sie do roztworu chlorku wapnia o stezeniu okolo 5% wagowych, w czasie okolo 15 minut i ewentualnie osusza.146426 Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 400 zl PL