HU192579B - Process for preparing orally administrable immunogenic composition - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás vakcinákat tartalmazó ehető kompozíciók előállítására.

A találmány tárgya közelebbről olyan orális úton adagolható immunogén kompozíciók előállítása, amelyek élő, a gasztro-intesztinális rendszerben parazita protozoát, mint pl. coccídiát tartalmaznak. Az ilyen protozoák átmeneti állapotban ciszták, azaz olyan nyugalmi életciklusban vannak, amikor kemény külső burkot képeznek, amely megvédi a parazitákat a gazdaszervezet testén kívül a kedvezőtlen hatásoktól. A parazita a cisztából akkor kerül ki, amikor azt egy új gazdaszervezet lenyeli.

Az az általános felfogás, hogy hatásos orális vakcinálás parazita protozoák ellen csak úgy érhető el, ha a vakcina a protozoát élő állapotban tartalmazza. A gazdaszervezet immunitását a parazitával történő ellenőrzött fertőzéssel hozzák létre. Az elölt parazita orális adagolása nem eredményez hatásos immunitást. Az élő organizmusok legyengíthctők, azaz természetes virulenciájuk módosítható a célból, hogy vakcina formájában történő adagoláshoz jobban megfeleljenek, de a gazdaszervezet fertőzésének szükségessége továbbra is lényeges lépés marad.

Annak ellenére, hogy a protozoa betokozódott formában van, életképességének fenntartása a vakcinában olyan problémát jelent, amely az egyszerűbb organizmusokat, pl. baktériumokat vagy vírusokat tartalmazó tradicionális vakcinák esetében nem vetődik fel. A protozoa például nem liofiíizáíható a jobb tárolhatóság érdekében. Sőt, a betokozódott protozoa általában érzékeny a dehidrálásra.

A lenyelés után a protozoa burokból való természetes kijutása az egyes gazdaszervezetek bélrendszerének emésztő mechanizmusától függ. A fertőzéshez a buroknak fel kell szakadnia, és a benne levő organizmusnak a bélrendszer olyan részébe keli jutnia, ahol az organizmus kielégítően tud fejlődni. Az ilyen természetes, burokból való kijutás bármiféle akadálya azt eredményezheti, hogy a gazdaszervezet normális emésztőfunkciói által a protozoa átjut a bélen és elhagyja a bélcsatornát anélkül, hogy fertőzést okozna.

Az a szükséglet, hogy a betokozódott protozoát hatékonyan megvédjük az adagolás előtt, összeegyeztethetetlennek tűnik azzal a szükséglettel, hogy a lenyelés után a burokból való kijutás könnyen végbemenjen. Az lenne várható, hogy bármilyen kemény, robusztus burkoló anyag, ameiy megfelel az első követelménynek, a vakcinát hatástalanná teszi azáltal, hogy késlelteti vagy megakadályozza a burokból való kijutást.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy olyan javított protozoa vakcinát készítsünk, amely fenntartja az immunogén organizmus életképességét anélkül, hogy a természetes mechanizmusokat megakadályozná, amelyek által a gazdaszervezet a lenyelés után megfertőződik.

A találmány tárgya tehát eljárás immunogén kompozíció előállítására, amelynek során élő, betokozódott parazita protozoa szuszpenzióját készítjük valamely gélképző anyaggal, és a szuszpenziót tömör géllé alakítjuk.

A gélnek elég szilárdnak kell lennie ahhoz, hogy a kezelésnek ellenálljon, azaz lágy vagy pépes gél nem eléggé robusztus ahhoz, hogy a betokozódott protozoát megvédje a fizikai károsodásoktól. A gél az immunogén anyag beágyazása után szárítható. A találmány szerinti megoldás meglepő jellemzője, hogy a gél szárított állapotban vakcina, hordozóanyagául szolgálhat. Egy másik megoldás szerint a gél hordozóanyag nedvesen tartható addig, míg a beágyazott protozoát a gazdaszervezettel megetetjük ' agy a tápanyaghoz hozzákeverjük.

Nedves állapotban a beágyazott protozoa például vizes közegben a gélrészecskék szuszpenzíójaként kezelhető.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen poliszacharid-alapú gélt alkalmazunk. Előnyösen olyan poliszacharido' alkalmazunk, amely gyorsan tömörödik. A tömörödési előnyösen kémiai úton érjük el. Általában metoxipektineket alkalmazunk, de a legelőnyösebb az alginátalap í gél. A különböző alapú gélek keverve is alkalmazhatók.

A poliszacharid gél önmagában történő alkalmazása viszonylag kemény anyagot eredményes dehidrálás után. Ez a keménység bizonyos körülmények között előnyös lehet, mivel fokozza a protozoa fizikai védelmét. Emellett azonban ez a keménység előnytelen is lehet, amenynyil en csökkenti a gélhordozó emészthetőségét, és így megakadályozza a protozoa kiszabadulását a lenyelcs utál . Kívánt esetben a gél kissé lágyabbá tehető úgy, hogy nedvesítő vagy lágyító anyagokat keverünk a poliszacharidhoz. Ilyen szempontból előnyös anyagok a glicerrl vagy a folyékony paraffin. Ilyen anyagok előnyösen legfeljebb 75 tömeg% mennyiségben vannak jelen, a poliszacharid gélre vonatkoztatva (szárazsúlyban kifejezve).

A gél hordozóanyag fizikai tulajdonságai módosíthatók egy vagy több töltőanyag adagolásával. Ilyen anyagok használata a találmány szerinti készítmény nyersanyagárának csökkentését is eredményezi, mivel ezek általában olcsóbbak mint például a tiszta alginát. A töltőanyagnak finom részecskeméretűnek kell lennie azért, hogy az alapgél folyási tulajdonságait ne befolyásolja a tönörödés előtt. A töltőanyag előnyösen ne adjon le fen ionokat, amelyek korai tömörödést okoznának. Az olyan töltőanyagok, mint pl. kréta, fölözött tejporvagy tejsavó-por kalciumot tartalmaznak, amely az alginát tömörödését elősegíti. Előnyös töltőanyagok a különféle lisztek, keményítők, maltodextrinek, dextrinek és a burgonyapép. Szervetlen töltőanyagok, mint pl. kaolin, szintén alkalmas. Szárított baromfi trágya, előnyösen megőrölve, szintén használható.

\ betokozódott protozoa mellett a gél hordozóanyag má.i olyan adalékanyagokat is tartalmazhat, amelyek magát a hordozót módosítják, vagy a kompozíciót alkalmasabbá teszik az orális adagolásra, például állati takarmány adalékanyagává alakítják. A beágyazódott protozor emésztés során bekövetkező kiszabadulását meg lehet gyorsítani úgy, hogy kevert gélt alkalmazunk, vagy a gélhez emulgálószert vagy felületaktív anyagot adunk. Alkalmas takarmány-adalékká történő alakítás céljából hasznos lehet, ha a kompozíció organoleptikus tulajdonságait megváltoztatjuk, éspedig színező és zamatjavító anyagokat keverünk hozzá. Kívánt esetben a protozoát tartalmazó hordozóanyagot más takarrnányadalékok ho dozóanyagaként is használhatjuk, például növekedésszabályozó anyagok vagy karotinoidok is bekeverhetők.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítás; módja szerint a gél hordozóanyag élő, betokozódott pasazita protozoát és egy kemoterápiás szert tartalmaz, amely a protozoa ellen, annak közbenső életciklusában haásos. A kemoterápiás szert olyan mennyiségben alkalmazzuk, amely elegendő a protozoa lenyelés utáni teljes kifejlődésének megakadályozásához a gazdaszervezetben. A parazita protozoa így lenyelés után meg tud telepedni, és így immunválaszt kiváltani a gazdaszervezetben, de a

-2192 579 kemoterápiás szer megakadályozza azt, hogy a protozoa teljes életciklusa végigfejlődjön és fertőző protozoák jussanak ki a környezetbe. Például, ha a protozoa egy coccidia faj, akkor olyan szert adunk a kompozícióhoz,amelynek csúcshatása a coccidiák életciklusának utolsó szakaszában, előnyösen a késői osztódáskor maximális. Alkalmas anti-coccidiás szerek, például nicarbanzin, furaiozidone, nitrofurazone, nihydrazone, sulphaquinoxalene, sulpanitran, dinsed, ormetroprim, sulphadimethoxine és ethopabate. Olyan vakcina adagolása, amely kemoterápiás szert is tartalmaz, megakadályozza azt, hogy a parazita más gazdaszervezetbe is átjusson, anélkül, hogy a szerre rezisztens törzs fejlődne ki. A kemoterápiás szer jelenléte további biztosítékot jelent arra nézve, hogy a fertőző protozoa adagolása a gazdaszervezetben a szokottól eltérő körülmények között valódi fertőzést okozzon. Kívánt esetben teljes élő protozoa és/vagy legyengített protozoa a kemoterápiás szerrel kombinálva alkalmazható.

A találmány szerinti vakcina különbözőképpen adagolható, például:

a) A gazdaállat számára szánt takarmányban, a takarmány készítésekor a takarmány anyagaival összekeverve. A gél hordozórészecskéket tartalmazó premix használható a protozoát tartalmazó gélrészecskék elkeverésének meggyorsítására a takarmány teljes tömegében.

b) A takarmányhoz adagoljuk egyszerűen, a takarmánynak a gazdaállatnak való adagolásával egyidőben, például úgy, hogy a baromfi takarmányt megszóljuk a gél részecskékkel.

c) Egyéni adagolás a gazdaszervezetnek, például újonnan kikelt csirkéknek.

A találmány szerinti vakcina tartalmazhat egyetlen protozoa törzset, de előnyösebben széles gazda-specifikus immunitás érhető el úgy, hogy egyetlen vakcina készítményben több gyakran előforduló protozoa törzset vagy fajt alkalmazunk. Az alkalmazott protozoa lehet teljesen virulens „vad” törzs, legyengített törzs (pl. embrióhoz adaptált törzs vagy korai életszakaszhoz módosított törzs), tenyésztett törzs bizonyos coccidiák esetén, (pl. Eimeria maxima esetén hozzáférhető törzs), vagy olyan törzs, amelyet például genetikai manipulációval módosítottak. Kívánt esetben egyetlen vakcina készítmény ezeknek a különböző típusú törzseknek a kombinációját is tartalmazhatja.

A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a coccidiosisra vonatkozóan mutatjuk be, de szakember számára nyilvánvaló, hogy más, betokozódni képes parazita protozoák elleni immunitást biztosító kompozíció hasonló módon állítható elő.

A találmány szerinti kompozíció bármely olyan gazdaállatnál alkalmazható, amely hajlamos coccidiosisra. A coccidíosist szárnyas fajokkal, különösen baromfival kapcsolatosan régóta ismerték, újabban derült ki, hogy sok más állatfajnál is problémát okoz. Az intenzív tartási módszerek hozták a kitörés lehetőségét és a veszélyét. Nem-szárnyas gazdaállatok, amelyeknél a coccidiosis problémát okoz, például a sertések, kérődzők (különösen a szarvasmarha, birka és kecske) és a nyúl. Felnőtt állatok esetén a betegség nem jelent komoly egészségi veszélyt, az újszülött állatokat azonban, amelyek az anyaállat által erősen szennyezett környezetbe kerülnek, nagymértékben veszélyezteti.

A coccidíosist elsősorban a baromfival kapcsolatban tanulmányozták, és viszonylag kis figyelmet fordítottak más fajokra. Ennek megfelelően például a sertéseket fertőző coccidiákra vonatkozóan nem állnak rendelkezésre széleskörű adatok, bár az irodalom említ néhány coccir'iát. Például a következő coccidiákat figyelték meg sertéseknél: Eimeria debliecki, E. scabra, E. suis, E. spinosa, E.perminuta,E. neodebliecki,E. porti,E. cerdonis,E. porta éslsospora suis. Specifikusan szarvasmarha coccidiák í következők: Eimeria bovis,E. zuernii, E. ellipsoidalis, E. aubumersis, E. cylindrica, E. alabamensis és E. bukidtonensis, A birkákat a következő fajok fertőzik:Eimeria minakohlyakimovae, E. ovina, E. intricate és E. ahsate. A kecskéket E. arloingi fertőzi. Házinyulak esetén a következő coccidiákat azonosították -.Eimeria intestinalis, E. flavesens, E. magna, E. irresidua, E. performis, E. stiedai, E. perforans, E. neoleporis és E. média.

A találmány szerinti megoldást a következőkben a baromfiakkal kapcsolatban ismertetjük. A leírásban a „baromfi” kifejezés alatt olyan szárnyasokat értünk, ímelyek a Galliformes rendbe tartoznak, mint például t házi szárnyasok vagy csirkék (Gallus domesticus), pulykák (Meleagris), fácánok (Phasianus), fogoly (Perdix), fájd (Lagopus), gyöngytyúk (Numida) és a páva (Pavo), valamint olyan madarakat, amelyek az Anseriíormes rendbe tartoznak, mint például a kacsa (Anas) és a liba (Anser).

A háziszárnyasokat (Gallus domesticus) az Eimeria terella, E. necatrix, E. brunetti, E. maxina, E. acervulina és E. praecox coccidiák közül bármelyik fertőzheti. A pulykák (Meleagris) esetén szóba jöhet: Eimeria melagrimitis, E. dispersa, E. meleagridis, E. gallopavonis, E. adenoides, E. innocua és az E. subrotunda. A házi kacsa (Anas) a 'yzzieria perniciosa által okozott fertőzéstől szenvedhet, <s feltehetően az Eimeria anatis által okozott fertőzéstől, Emit a vadkacsától (Anas platyrhyncos) szerezhet meg. A libák (Anser) az Eimeria anserís, E. nocens és azE.parvula által okozott fertőzéstől szenvedhetnek, és feltételezhető, hogy a házi libák megkapják a fertőzést a kanadai ludaktól, amelyeket az Eimeria hermanj, E. striata és ez E. fulva fertőzhet. A többi, előbb említett baromfifaj is jellemző coccidiák által okozott fertőzésektől szenvedhet, és a találmány szerinti megoldás ezek leküzdésére is vonatkozik. A leírásban említett oocíszta színt úgy értendő, mintha coccidia faj lenne jelen.

Coccidiás fertőzéssel minden olyan baromfi fajnál találkozhatunk, amelyet ember nevel. Ilyen fertőzések különösen akkor veszélyesek, ha olyan szárnyas csapatoknál fordul elő, amelyeket modern intenzív gazdasági körülmények között tartanak. A fertőzés nagyon gyorsan terjed a csapatban és legalábbis csekély súlygyarapodást okoznak, erős fertőzés azonban az állatok pusztulásához vezethet. Ezért az utóbbi években jelentős erőfeszítéseket tettek annak érdekében, hogy megbízható profilaktikus módszereket találjanak az ilyen fertőzésekkel szemben, és különösen arra vonatkozóan, hogy megtalálják a módját annak, hogy a madarakat hatékonyan immunizálják az ilyen fertó'zések ellen. A hatékony imniur izálási módszer gyakorlati haszna a baromfiak növekedésének fejlődésében mutatkozik meg, de legalább abban, hogy a coccidiosis következtében a növekedésre ható negatív tényezőket ellensúlyozzuk.

Már megfigyelték azt, hogy az olyan baromfiak, rmelyek coccidiosis fertőzésen estek át, bizonyos immunitással rendelkeznek további fertőzésekkel szemben. A 2 008 404 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás immunizálási módszert ismertet coccidiosis ellen, amely sze3

-3192 579 rint a baromfira nézve fertőző, egy vagy több fajhoz tartozó coccídia spóra állapotban levő oocisztáit adagoljuk a baromfinak a takarmánnyal folyamatosan vagy periodikusan. A 2 008 404 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás a baromfi növekedésének fokozására ismertet módszert, mely szerint a baromfit olyan diétán nevelik, amely a tápanyagokon kívül legalább egy olyan coecidia faj élő spóra állapotban levő oocisztáit tartalmazza, amelyre a baromfi érzékeny, és az oociszták oiyan koncentrációban vannak jelen, amely a baromfinál betegséget nem okozó fertőzést biztosít. Az itt ismertetett megoldás egyik előnyös kiviteli alakja olyan kereskedelembe hozható baromfitáp, amely a tápanyagokon kívül a tápanyag súlyára számítva kilogrammonként 10-10 000 élő spóra állapotban levő oocisztát tartalmaz legalább egy olyan coecidia fajból, amelyre a baromfi érzékeny.

Azzal, hogy a baromfi oocisztához jut a rendszeres tápanyagfelvétel útján, a baromfi maga progresszív önbeoltást folytat. Az oociszták napi bevitelét a madár által fogyasztott tápanyag mennyisége szabja meg, és az oociszták mennyiségét a tápban a táp összekeverésével lehet szabályozni. A tápanyag összekeverője tapasztalat útján tudja biztosítani, hogy túladagolás ne következzen be; Ezenkívül, mivel a csirkék normál étkezéssel jutnak hozzá az oocisztákhoz, könnyű biztosítani azt, hogy a csirkék az oocisztából megfelelő mennyiséget fogyasszanak, amint szilárd éleimet esznek, és így az immunizálási folyamat közvetlenül a kikelés utáni korai időben elkezdődhet.

A 2 008 404 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás szerint az oociszták erősen károsodnak dehidráláskor. Ezért az olyan tápszereket, amelyek ilyen oocisztát tartalmaznak, sosem szabad teljesen kiszáradni hagyni. A tápanyagban a ncdvességszintnek körülbelül 6—12 tömeg% között kell lennie, de ennél magasabb is lehet, amennyiben az a tárolás során penészedés vagy más módon nem okozza a tápanyag kárbameneteiét. Hasonló megfontolások érvényesek az olyan premixekre, amelyek oocisztát tartalmaznak, és amelyeket baromfitápok készítéséhez használnak. Élő betokoződott oocisztákat úgy kaphatunk, hogy gazdaállatokat, pl. donor szárnyascsapatot szándékosan fertőzünk, majd az oocisztákat összegyűjtjük ezek ürülékéből. Élő betokozódott coccidiák kinyerésének technikája önmagában ismert módszert, és a jelen találmánynak nem képezi tárgyát. Egy előnyös módszert ismertet erre a 3 147 186 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

A találmány szerinti kompozícióban alkalmazott betokozódott oociszták száma attól függ, hogy a végső tápanyagban milyen oocisztaszámot kívánunk biztosítani. A találmány szerinti kompozíció általában legalább 1000 betokozódott oocisztát tartalmaz kilogrammonként, előnyösen legalább 5000 darabot kilogrammonként, még előnyösebben 10 000 darabot kilogrammonként. Egy általános célokra alkalmas kompozíció körülbelül 50 000 és 500 000 közötti betokozódott oocisztát tartalmaz kilogrammonként. A maximális érték nem határozható meg pontosan. Az olyan kompozíciók, amelyek 1 milliónál több betokozódott oocisztát tartalmaznak kilogrammonként, olyan célokra használhatók, ahol a végső tápanyag nagy oociszta szintje szükséges.

A végső tápanyag kilogrammonként előnyösen 2500 élő betokozódott oocisztát tartalmaz. Az előnyös hatás elérhető, ha az egyes szárnyasok bármelyik életszakaszában kezdjük el adagolni a betokozódott oocisztákat, elő4 nyösebb azonban, ha a szárnyas kismennyis /,ű betokozódoít oocisztát kap a tápanyagával, amint /.'Kelt a tojásból és elkezd táplálkozni. A szárnyas növekedésével a napi tápanyagszükséglete rohamosan növekszik. Például a háziszárnyas (Gallus domesticus) eseten a kiscsirke naponta legalább két gramm tápanyag?, fogyaszt. 10 nap után ez a mennyiség napi 10 grammra növekszik, míg 30 nap után a szárnyas körüibelii’ 30 gramm vagy ennéi több tápanyagot fogyaszt. A tápanyag minőségi összetétele s változik, ahogy a szárnyas növekszik, és a kereskedelemben kapható baromfi tápokat a szárnyas életkorának megfelelő formában elkészítve árusítják. Ilyen fokozatok például, a „korai”, „növekedésben levő” és „tenyész/tojó”. Ahhoz, hogy biztosítsuk a szárnyas fejlettségi fokának megfelelő számú betokozódott kokcídia oocisztát naponta, előnyös, ha különböző tápanyagok különböző számú oocisztát tartalmaznak kilogrammonként,

Az optimális immunizáláshoz célszerű, hogyha az újonnan kikelt csirkék naponta körülbelül 1—20 élő betokozódott oocisztát fogyasztanak. Az első tíz napban ez a mennyiség körülbelül 2-50 oocisztára emelkedik napenta. A 30. naptól kezdve a naponta fogyasztott oociszták száma körülbelül 5-200 legyen.

A „korai” tápanyag kilogrammonként előnyösen 50 élő betokozódott oocisztát tartalmaz. Az oociszták maxim ílis mennyisége előnyösen 5000 darab kilogrammonként még előnyösebben körülbelül 2000 darab kilogrammonként. A „növekedésben levő” tápanyag minimálisan előryösen 50 darab élő betokozódott oocisztát tartalmaz kilogrammonként. Az oociszták maximális értéke előryösen 2000 darab kilogrammonként, még előnyösebben legfeljebb 500 darab kilogrammonként. A „tenyész/tojó ’ tápanyagban az élő betokozódott oociszták alkr lmas alsó szintje körülbelül 10 db kilogrammonként. Az oociszták számának felső értéke előnyösen nem haladja meg az 1000 darabot kilogrammonként, még előnyösebben nem több, mint 100 db kilogrammonként.

A baromfitól eltérő gazdaszervezetek napi kokcidia oociszta szükséglete eltérő attól függően, hogy a szervezet relatív virulenciája, az állat érzékenysége és mérete milyen. Elválasztott borjú esetén például 1-100 élő betokozódott oociszta napi bevétele gyakorlatilag megfelelő.

Bizonyos parazita protozoák átmeneti állapotban úgynevezett „ciszta a cisztában” állapotban vannak. A cokcidiák például a külső cisztán (oocisztán) belül spcrociszta formában vannak. Bár gyakorlati okokból előnyösebb teljes oocisztát alkalmazni vakcina céljára, lehetséges azonban a kiszabadult sporocisztát beágyazni a 1 ordozógélbe. A találmány tehát kiteljed a sporociszták vakcinában való alkalmazására is.

A találmány szerinti készítmény ana is alkalmas, hogy más esszenciális adalékanyagot keverjünk be a tápanyagba, például ásványi adalékanyagokat, amelyek különösen tojószárnyasok esetén fontosak a tojáshéjképződés elősegítésére, továbbá vitaminokat, aminosavakat, mint például lizint és karotionid festékanyagokat, amelyek általánosan használatosak a tojássárgája színének javítására. Kívánt esetben ezek közül a kismennyiségu ad.dékanyagok közül egyet vagy többet az oocisztával együtt keverhetünk be a kompozícióba.

A találmány szerinti kompozíciót a tápanyaghoz egyszerű keveréssel adagolhatjuk, a kompozíció és a tápanyag súlyarányát a kompozícióban jelenlevő és az elő-41

192 57S ' állítandó tápanyagban megkívánt oociszta száma alapján állítjuk be. A találmány szempontjából egyedül a kompozícióban jelenlevő élő betokozódott oociszták száma lényeges, az alkalmazásra kerülő végső tápanyag összetétele és fizikai formája lényegtelen. A kereskedelemben kapható komplett vagy tápérték szempontjából kiegyensúlyozott tápanyag használható, és a tápanyag tartalmazhatja a szokásos összetevőket, azaz proteint, szénhidrátot és zsírokat. A standard összetevők természete, úgymint a különböző hallisztek, gabonaőrlemények és más növényi anyagok, valamint ásványi adalékanyagok és a tápérték egyéb minőségi követelményei, úgymint a vitaminok, aminosavak és nyomelemek minimális szintje a technika területén jártas szakember számára ismertek.

Abban az esetben, ha kémiailag ülepíthető rendszerként egy alginát alapú gélt használunk, a találmány szerinti készítmény úgy készíthető el, hogy kokcidia oocisztákat szuszpendálunk az alginát vizes oldatában, és az alginátot gélesítjük valamilyen alkalmas kémiai reakció útján. A gélesítést például egy „buborékképződési” rendszerben végezhetjük, ahol egy gélblokk képződik, amelyet azután később az alkalmazásnak megfelelő apróbb részekre darabolunk. A darabolás történhet például vagdalás, szeletelés vagy tördelés útján. Előnyösebb azonban, ha a gélesítést úgy végezzük, hogy viszonylag finom eloszlású termék képződjön, így az utólagos darabolás feleslegessé válik. Eljárhatunk például úgy, hogy az ülepedő gélt egy szűk sajtolónyíláson keresztül extrudáljuk, így tésztaszálszerű, viszonylag kis keresztmetszetű terméket kapunk. Úgy is eljárhatunk, hogy a szuszpenziót egy ülepítő közegbe extrudáljuk.

A találmány szerint előnyösen úgy járunk el, hogy oociszta tartalmú vizes alginát-oldat cseppeket ülepítő közeggel hozunk érintkezésbe. A cseppeket permetezés vagy előnyösebben valamilyen szórófejből történő csepegtetés útján hozzuk létre. Legelőnyösebben úgy járunk el, hogy gélgyöngyöket állítunk elő, oly módon, hogy az oocisztát tartalmazó alginát-oldat cseppjeit az ülepítő közegbe csepegtetjük. Ilyen körülmények között a cseppek nagyon gyorsan gélesednek, és különálló gyöngyök képződnek. Ülepedés után az alginátgyöngyöcskék az ülepítő közegből kinyerhetők. Kívánt esetben a gyöngyök méret szerint elkülöníthetők ismert módszerrel, például szitálással.

Az oocisztát tartalmazó alginátgyöngyök előnyös mérete nedves állapotban 5 mm, amely dehidrált állapotban

1-3 mm átmérőnek felel meg. A dehidratált gyöngyök végső mérete attól függ, hogy a gyöngyök nedves állapotban mennyi szilárd anyagot tartalmaznak.

Az alginát mennyisége a vizes oldatban elégséges kell legyen ahhoz, hogy az oldat egyenletes eloszlását biztosítsuk az ülepítő közegben. Ha például az ülepítő fürdőbe csepegtetjük az oldatot, a cseppeknek azonnal meg kell dermedniük ahhoz, hogy különálló gyöngyök képződjenek. Abban az cselben, ha jelentős mennyiségű töltőanyagot és egyéb komponenst keverünk a termékbe, előnyösen viszonylag magas molekulasúlyú alginátot használunk, ez kis koncentrációnál is szilárd gélt eredményez. Az alginát mennyisége a gél hordozóban nedves állapotban általában 0,25 és 10 tömeg% között van.

A kereskedelemben kapható bármilyen alginát használható, előnyösen olyan alginátot használunk, amelyben a mannuronsav és guluronsav maradékok aránya magas. Mivel a találmány szerinti eljárással előállított vakcinákat állatok orális vakcinálására szánjuk, nem szükséges gyógyszerészeti vagy humán étkezési tisztasági fokozatú alginátot használni, bár ilyen anyagok is használhatók, amennyiben alkalmazásuk nem gazdaságtalan. Az algináttal szembeni elsődleges követelmény az, hogy az abban jelenlevő oldhatatlan anyagok ne gátolják a termékképződést, például azáltal, hogy az alginát folyási tulajdonságait lerontják vagy csökkentik a gél szilárdságát. Viszonylag kevéssé tisztított alginát használható.

Az alginát kémiai ülepedése fémionokkal, különösen k ilciunaionnal érhető el, amelyek az alginátot oldhatatlanná teszik. Legelőnyösebb ülepítőszerek a sók, például kilcium-klorid vagy kálcium-foszfát. Savak ugyanúgy alkalmasak ülepítőszerként. Szabad savak, például sósav vagy ecetsav használható.

Kémiailag ülepíthető rendszerek mellett hőhatásra kert ényedő rendszerek, például proteinek is használhatók. Amennyiben például zselatint használunk, vizes proteino datot készítünk, például 60 °C-on, az oldatot lehűtjük, é·, a kokcidia oocisztákat hozzáadjuk az oldathoz olyan hőmérsékleten, ahol azok még életképesek maradnak. A zselatin gélesedése körülbelül 30 °C-on kezdődik, és ez meggyorsítható, ha a zselatinoldatot hideg olajba csepegtetjük.

Az ülepítőszer koncentrációja az ülepítő fürdőben befolyásolja az alginátoldat ülepedést idejét. Emellett a⁷, ülepítőszer, különösen egy kálciumsó, például kálc'um-klorid koncentrációja magas, akkor az alginátgyöng/ökben is magas lesz a sókoncentráció, A gyöngyök így túlságosan megszilárdulnak, és nem lehet azokat dehidratalni. Emellett a nedves gyöngyökben a magas kálciumsó koncentráció erős ozmózis hatást gyakorol az oocisztára, anit lehetőség szerint el kell kerülni. Az ülepítő fürdőben a kálclum-klorid koncentráció általában legfeljebb 5 tömeg%.

Ha azonban a megszilárdult gyöngyöket néhány óra hosszat, például éjszakán át vízben ázni hagyjuk, a kálc um-klorid fölöslege kidiffundál a gyöngyökből.

Kívánt esetben a gélgyöngyök dehidratálását még levegővel történő szárítással végezhetjük. A végtermékben a nedvességtartalmat előnyösen 20 tömeg%-ra állítjuk be.

Előnyös azonban, ha a gélgyöngyöket nedves állapotban tároljuk, például vizes közeggel érintkezésben tartva, mivel ez biztosítja a legelőnyösebb környezetet azoociszt ík számára. A gyöngyöket nedves állapotban keverhetjiik bele valamilyen tápba, és hagyjuk, hogy elérjen egy egyensúlyi nedvességszintet.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük.

1. Példa

Alapgélként a kereskedelemben kapható nátriumalginátot (Manucol LB, Kelco/AIL International Ltd. gyártmánya) használunk.

ml 11 tömeg% Manucol LB vizes oldatot összekeverünk 5 ml élő betokozódott kokcidia oocisztát (Eimeria tenella) tartalmazó vizes szuszpenzióval, amely körülbelül 600 000 oocisztát tartalmaz. Ezt az elegyet kb. 7,5 cm távolságból 5 tömeg%-os kálcium-klorid-dihidrát vizes eldatba csepegtetjük. A leülepedő gélgyöngyök átmérője kb. 5 mm, súlya kb. 40 mg. 2 perc alatt kb. 2500 gyöngyöt kapunk. A gyöngyöket 15 percig az ülepítő fürdőben hagyjuk, majd leszűijük, majd éjszakán át csapviz5

192 579 ben áztatjuk a kálcium-klorid fölöslegének eltávolítása céljából. A gyöngyöket szívópapíron szobahőmérsékleten megszárítjuk, a végső nedvességtartalom 15—16tömeg%.

2. Példa

Géiképzőany ágként nátrium-alginátot használunk, ezenkívül glicerolt nedvesítőszerként.

ml 11 tömeg%-os Manucol LB nátrium-alginát vizes oldatát összekeverjük 5 ml 1. példa szerinti kokcidia oociszta szuszpenzióval és 50 ml glicerollal. Ezt az elegyet az 1. példa szerint ülepítjük, azzal a különbséggel, hogy a fölösleges kálcium-kioridot a gélgyöngyökből 50-50 %-os víz és glicerol elegyben éjszakán át történő áztatással távolítjuk el. A szárított gyöngyök végső nedvességtartalma ebben az esetben is 15—16 tömeg%.

Az előző két példában kapott alginátgyöngyökben levő kokcidia oociszták életképességét a következő kísérlettel vizsgáltuk.

Az alginátgyöngyöket néhány napig dehidratált formában tároltuk, majd 500 g szokásos csirketáppal kevertük úgy, hogy kb. 2500 gyöngyöt tartalmazzon a kész tápszer. A mintákkal két napig etettünk két 30 napos csirkét kívánság szerinti alapon. Mindkét csirke a kokcidiózis klinikai tüneteit mutatta, az oociszta-tartalmú táplálék fogyasztása után az 5. és 6. napon vér volt az ürülékükben.

Ez a teszt azt mutatja, hogy nagyszámú kokcidia oociszta maradt életképes az eljárás során, és képes maradt arra, hogy kiszabaduljon a cisztából a bélben, annak ellenére,hogy szilárd alginátgélbe volt ágyazva.

járást megismételtük és végül a kapott oociszta pehyheket 2,5 %-os vizes káiium-dikromát-oldattal tettük fel. A kivont oociszták a szuszpenzió 4 napig 28 ³C-on végzett levegőztetése után betokozódtak. Ezt a szuszpen5 ziót 1 °C-on foszfát-puffetben tartottuk.

A z 1. példa szerint gyöngyöket készítettünk azzal a különbséggel, hogy összesen 30 000 betokozódott kokcidía oocisztát használtunk. 240 gyöngyöt adtunk 3 kg csirketáphoz, és ezt újonnan kikelt csirkéknek adtuk 10 3 hétig. A kiválasztott oociszta szintet ellenőriztük minden csoportnál, és az eredményeket az 1. ábrán ábrázoltuk,

Az oociszták életben maradtak a tápban a kísérlet ideje a'att, oociszták ürültek a 8. naptól az immunizálási 15 perióduson keresztül, ahogyan az az 1. ábrán látható. Nyilvánvaló az oociszta ürítés diagramjából (1. ábra A vond), hogy valóságos immunitás kezdődött kialakulni nem sokkal a kéthetes kor elérése után, mivel hirtelen oociszta ürítés növekedés jelentkezett, és a 21. naptól ez lecsökkent.

Az immunizáló oociszták nem okoztak észlelhető patogén hatást. Nem volt megfigyelhető véres ürülék az immunizáló periódus ideje alatt, és ami lényeges, az átlagos súlygyarapodás, a kontroll és az immunizált csoport25 nál látszólag azonos volt a próbafertőzés napjáig.

A z 50 000 oocisztával végzett próbafertőzés (C) a 27. napon súlyos betegséget okozott a kontroll csoportban, ami az ürülékben megjelenő vérből és bőséges oociszta ürítésből volt megítélhető (1. ábra, B vonal). Ez az im3Q murizált csoportot láthatóan nem súlytotta, de elhullás egyik csoportban sem volt megfigyelhető.

3. Példa

Ezt a kísérletet annak igazolására végeztük, hogy nagyon kisszámú életképes betokozódott oociszta a találmány szerinti kompozícióban csirketáphoz keverve ellenőrzött klinikai tüneteket nem okozó fertőzést tud okozni, ha érzékeny állatoknak adjuk. A 27 napig tartó kezelés után keletkezett immunitást 50 000 oocisztával történő próbafertőzéssel teszteltük. Két 12—12 egyedből álló csoportot használtunk. Az egyik csoport oocisztát tartalmazó diétát kapott egynapos korától, míg a másik csoport oo cisztamentes diétát kapott. Az állatokat dróthálón tartottuk, így az oociszta diétából származó oociszta ürítés könnyen ellenőrizhető volt. A helyiséget, ahol az állatokat tartottuk a maradék oocisztától gondosan mentesítettük.

Az oocisztákat úgy nyertük, hogy négyhetes Cobb broiler csirkét egyszeri 50 000 oocisztát tartalmazó orális dózissal fertőztünk. A fertőzés után 6,7 és 8 nappal öszszegyűjtöttük az ürüléküket, összekevertük kb. kétszeres térfogatú 2,5 %-os vizes káiium-dikromát-oldattal, és egyenletes péppé homogenizáltuk. A pépet nylongézen átszűrtük, és a szűrletből a következőképpen végzett sóflotációval nyertük ki az oocisztákat. Először az oocisztákat 1000 g-vel 15 percig végzett centrifugálissal kiülepítettük, majd az üledéket újra szuszpendáltuk telített vizes nátrium-klorid-oldatban. Ezt újra centrifugáltuk 500 g-vel 10 percig, és a maradék oociszta szusz penziót 10-szeres térfogatú desztillált vízzel hígítottuk. 1000 grvel 15 percig végzett centrifugálással az oocisztákat pelyhek formájában kaptuk. Az egész sóflotációs el6

4-7. Példák 35 í zekkel a példákkal a töltőanyagok alkalmazását szemléltetjük az alginátgyöngyök képzésénél.

Gyöngyöket készítünk az 1. példa szerint az alábbi oldatokat használva.

Példa Alginát Töltőanyag

1 % Manucol LM

0,25 % Manucol LM

1 % Manucol LM

0,25 % Manucol LM % kereskedelmi fehér búzaliszt % kereskedelmi fehér búzaliszt % kaolin 10 % kaolin

Az 1. példa szerint végzett ülepítés és szárítás után mir den esetben robusztus gyöngyöket kaptunk.

Manucol LM nagy molekulasúlyú nagy mannuron: guluronsav maradék arányú alginát. Töltőanyag alkalmazása esetén előnyös nagy molekulasúlyú alginátot használgg ni, a gél megfelelő szilárdságának biztosítása érdekében.

Claims (10)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás orálisan adagolható immunogén kompozíció θθ előállítására, azzal jellemezve, hogy élő, betokozódott parazita protozoák szuszpenzióját hozzuk létre valamilyen gélképző anyagban, majd a szuszpenziót tömör géllé ; lakatjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 65 ho;;y a gélesedést kémiai úton idézzük elő.

   192 57S
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gélképző anyagként vízoldható poliszacharidot alkalmazunk, és a gélesedést a poliszacharid vízoldhatatlanná tételével érjük el.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gélképző anyagként vízoldható alginátot alkalmazunk.
5. 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gélesedést ügy érjük el, hogy a gélképző anyagot vízoldhatatlanná tevő fémion-forrással 10 érintkeztetjük a szuszpenziót.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fémion-forrásként kalciumsót használunk.
7. 7. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gélt egy tételben készítjük el.
8. 8. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gélesedést úgy érjük el, hogy a

   5 ízuszpenziót egy gélesítő közegbe extrudáljuk.
9. 9. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gélesedést úgy érjük el, hogy a ízuszpenziót egy gélesítő közegbe csepegtetjük.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élő, betokozódott parazita protozoák szuszpen: ióját hozzuk létre alginát vizes oldatával, és a szuszpen; iót vizes, a cseppek azonnali kémiai gélesedését okozó fémionokat tartalmazó oldatba csepegtetjük?

    1 db rajz 1 ábra