Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego 3', 5' - cyklicznego ditiofosforanu adenozyny o wzorze 1, w którym Ade oznacza reszte adeniny.Zwiazek o wzorze 1 jest ditiofosforanowym analogiem 3', 5' - cyklicznego monofosforanu adenozyny /cAMP/ o wzorze 2, w którym Ade ma wyzej podane znaczenie. cAMP pelniac role tzw. 'posrednika drugiego rzedu", w zaleznosci od rodzaju komórek, wplywa na szereg wewnatrzko¬ mórkowych procesów, takich jak przepuszczalnosc blon biologicznych,stymulacja kinazy protei¬ nowej, fosforylacja syntetazy glikogenowej, mediacja w dzialaniu neutrotransmiterów. Ze wzgledu na taka wszechstronna aktywnosc biologiczna cAMP zsyntetyzowano do tej pory ponad 600 jego analogów, modyfikujac reszte zasady, cukru oraz pierscien 1,3,2, - dioksafosforinanylowy cza¬ steczki. Sposób tych zwiazków jedynie Rp - 3', 5' - cykliczny tiofosforan adenozyny /Rp -cAMPS/ wykazal dzialanie antagonistyczne w stosunku do cAPM, polegajace na kompetycyjnym inhibo- waniu wiazania endogennego cAMP do ho-loenzymu. Powodowalo to zniesienie in vivo zarówno aktywacji kinazy proteinowej zaleznej od cAMP, jak i nastepczej aktywacji kinazy fosforylazy. W rezultacie nastepowalo zahamowanie glikogenolizy czyli wydzielania glukozy.Obecnie stwierdzono, ze lepsze wlasciwosci hamowania wydzielania glukozy wykazuje 3', 5' -cykliczny ditiofosforan adenozyny o wzorze 1. Inkubacja izolowanych z watroby szczura hepato- cytów z 3', 5' - cyklicznym ditiofosforanem o stezeniu 10~7 mol/l do 10~4 mol/l w nieobecnosci antagonistów cAMP takich jak Sp - 3', 5' - cykliczny tiofosforan adenozyny nie powoduje wzrostu szybkosci wytwarzania glukozy.Natomiast inkubacja hepatocytów w obecnosci glukagonu lub Sp - 3', 5' - cyklicznego tiofosforanu adenozyny o stezeniu równym polowie stezenia wywolujacego maksymalny efekt i przy wzrastajacym stezeniu 3', 5' - cyklicznego ditiofosforanu adenozyny, wykazala hamujacy wplyw tego ostatniego zwiazku na proces wydzielania glukozy. Wyniki te wykazaly, ze 3', 5' - cykliczny ditiofosforan adenozyny dziala jako antagonista cAMP i hamuje glikogenolityczny proces, którego aktywatorem jest cAMP. 3', 5' - Cykliczny ditiofosforan adenozyny o wzorze 1 nie zostal do tej pory opisany w literaturze chemicznej.2 144 471 Sposób otrzymywania znanego 3', 5' - cyklicznego tiofosforanu adenozyny /J.Chem. Soc, Chem. Commun., 1979, 940/, którego diastcreoizomer Rp równiez wykazuje antagonistyczne do cAMP dzialanie w stosuku do kinazy proteinowej, polega na stereospecyficznej reakcji diastereo- izomeru Sp 3', 5' - cyklicznego anilidofosforanu trójbenzoiloadenozyny z potasem i disiarczkiem wegla. Synteza zwiazku o wzorze 1, prowadzona sposobem wedlug wynalazku, jest prostsza ze wzgledu na brak asymetrii atomu fosforu w polaczeniu o wzorze 1, co eliminuje koniecznosc koncowego rozdzialu diastereoizomerycznych zwiazków posrednich. Czasteczka 3', 5' - cykli¬ cznego ditiofosforanu adenozyny rózni sie od 3', 5' - cyklicznego tiofosforanu adenozyny tym, ze egzocykliczny atom fosforylowy tlenu tego ostatniego zwiazku zastapiono atomem siarki. Obec¬ nosc dwu atomów siarki powoduje, ze atom fosforu nie jest centrum asymetrii, co stanowi istotne uproszczenie sposobu wytwarzania 3', 5' - cyklicznego ditiofosforanu w porównaniu ze sposobem wytwarzania 3', 5' - cyklicznego tiofosforanu adenozyny. Jakkolwiek powstajacy w procesie syntezy zwiazek posredni 3', 5' - cykliczny anilidotiofosforan adenozyny jest mieszanina diastereoi- zomerów i moze byc rozdzielony na poszczególne izomery to fakt ten nie ma istotnego znaczenia, poniewaz zarówno diastereoizomer Rp,jak i Sp 3', 5' - cyklicznego anilidotiofosforanu adenozyny w reakcji z wodorkiem sodu i disiarczkiem wegla daje P - asymetryczna czasteczke zwiazku o wzorze 1.Sposób wytwarzania nowego 3', 5' - cyklicznego ditiofosforanu adenozyny o wzorze 1, w którym Ade ma wyzej podane znaczenie, polega wedlug wynalazku na tym, ze 2', 3' - blokowana adenozyne o wzorze 3, w którym Ade ma wyzej podane znaczenie, a R1 i R2, oddzielnie lub lacznie, oznaczaja kwasolabilne grupy ochronne, poddaje sie reakcji tiofosforylacji z 0 - /arylo/anilidoch- lorotiofosforanem o wzorze 4, w którym Ar oznacza grupe fenylowa ewentualnie podstawiona w pozycji 2 i/lub 4 jednym albo dwoma podstawnikami takimi jak -NO2, -Cl, -Br, -F. Reakcje tiofosforylacji prowadzi sie wobec amin aromatycznych i III - rzedowych amin alifatycznych.Otrzymany 5' - /O-arylo/anilidotiofosforan 2', 3' - blokowanej adenozyny o wzorze 5, w którym Ade, Ar, R1 i R2 maja wyzej podane znaczenie poddaje sie hydrolizie w srodowisku kwasnym, po czym wytworzony 5 - /O-arylo/anilidotiofosforan adenozyny o wzorze 6, w którym Ade i Ar maja wyzej podane znaczenie, cyklizuje sie w srodowisku silnej zasady do 3', 5' - cyklicznego anilidotio¬ fosforanu adenozyny o wzorze 7, w którm Ade ma wyzej podane znaczenie. Nastepnie zabezpiecza sie grupe 2' - hydroksylowa rybozy w zwiazku owzorze 7, a otrzymany zwiazek o wzorze 8, w którym Ade ma wyzej podane znaczenie i R3 oznacza zasadolabilna grupe ochronna, poddaje sie reakcji z wodorkiem sodowym i disiarczkiem wegla, otrzymujac 3', 5' - cykliczny ditiofosforan adenozyny o wzorze 1, w którym Ade ma wyzej podane znaczenie.Zwiazki o wzorze 5,6,7 i 8 mozna stosowac w postaci czystych diastereoizomerów, przy czym korzystnie stosuje sie je w postaci mieszaniny diastereoizomerów.Korzystnie, symbole R1 i R2 oznaczaja, oddzielnie lub lacznie, takie kwasolabilne grupy ochronne jak np. grupa metoksytetrahydropiranylowa, etoksymetylidenowa, metoksymetylide- nowa, izopropylidenowa i podobne grupy blokujace.W reakcji tiofosforylacji mozna na przyklad stosowac triazol, tetrazol, imidazol, trietylo- amine, /tri-/n-butylo/amine. Korzystnie, reakcje te prowadzi sie wobec trietyloaminy i tetrazolu.W etapie hydrolizy korzystnie stosuje sie takie kwasy jak solny, octowy, p-toluenosulfonowy, najkorzystniej kwas octowy.Cyklizacje zwiazku o wzorze 6 dogodnie prowadzi sie np. za pomoca tert-butanolanu potaso¬ wego.Do zabezpieczania grupy OH w pozycji 2' zwiazku o wzorze 7 mozna stosowac rózne zasadolabilne grupy ochronne, np. grupe acetylowa, izobutyrylowa, benzoilowa i podobne. Grupy te mozna otrzymac np. w reakcji z bezwodnikiem lub chlorkiem odpowiedniego kwasu karboksy- lowego. Zwiazki wyjsciowe o wzorze 3 i 4 sa zwiazkami znanymi. Synteza zwiazku o wzorze 3 jest opisana w "Protective Groups in Organie Synthesis" /Theodora W. Grenne, A. Wiley - Interscience Publication/, a zwiazku o wzorze 4 w Polish Journal Chemistry 53, 2041 /1979/.Nizej podany przyklad ilustruje sposób wedlug wynalazku.Przyklad A.Do roztworu /4-nitrofenylo/anilidochlorotiofosforanu /0,49g, 1,5 mmola/ w acetonitrylu dodano tetrazol /0,22g, 3 mmole/ i trietyloamine/ 0,3g, 3 mmole/,a nastepnie 2', 3' -O-etoksymetylidenoadenozyne /0,32g, 1 mmol/. Calosc mieszano w temperaturze pokojowej w144 471 3 ciagu 4 dni. Nastepnie zatezono do sucha, rozpuszczono w chloroformie i naniesiono na kolumne wypelniona zelem krzemionkowym /G,045 - 0,075 mm/. Produkt eluowano mieszanina chloro- form-metanol /25:1/, a nastepnie chloroform-metanol /9:1/. Otrzymano 0,33 g /53,6%/ 5 -/4 -nitrofenylo/anilidotiofosforanu 2',3' - 0 - etoksy-metylidenoadenozyny w postaci mieszaniny dwu diastereoizomerów: <531p(CHCl3) 60,67 i 60,91 ppm; FD-MS: m/z 615 /M7.B.Roztwór /Rp + Sp/-5-/4 nitrofenylo/anilidotiofosforanu 2', 3' -0-etoksymetylidenoadeno- zyny /0,62 g, 1 mmol/ w 80% kwasie octowym /25 ml/ pozostawiono w temperaturze pokojowej na 2 dni. Powstaly olej po odparowaniu kwasu octowego, rozpuszczono w mieszaninie chloroform- metanol /12:1/ i chromatografowano na kolumnie wypelnionej zelem krzemionkowym /0,045 -0,075 mm/ stosujac jako eluent chloroform-metanol /12:1/. Otrzymano 0,464 g /83%/ 5' -/4- nitrofenylo/ anilidotiofosforanu adenozyny w postaci mieszaniny diastereoizomerów:<53lp(CDCl2)- 61,36 i 61,57 ppm; FD-MS:m/z 559/M7.C.Roztwór /Rp + Sp/-5'-/4-nitrofenylo/anilidotiofosforanu adenozyny /0,25g, 0,45 mmo- la/w DMF /15 ml/ dodano do tert-butanolanu potasowego /l,5 g, 13,5 mmoli/ i mieszanine reakcyjna pozostawiono na 48 godzin w temperaturze pokojowej. Nadmiar tert-butanolanu pota¬ sowego zneutralizowano kwasem octowym /okolo 3 ml/. Nastepnie mieszanine reakcyjna zate¬ zono do sucha i chromatografowano na kolumnie wypelnionej zelem krzemionkowym /0,045- 0,075 mm/ stosujac jako eluent chloroform-metanol /9:1/. Otrzymano 0,047 g /25%/ 3', 5' -cyklicznego anilidotiofosforanu adenozyny: <531p(C2HsN) 64,73 ppm; FD—MS: m/z 420/MV.D.Do roztworu 3', 5' - cyklicznego anilidotiofosforanu adenozyny /0,084 g, 0,2 mmole/ w DMF /2ml/ dodano bezwodnik izobutyrylowy /0,16g, 20 mmoli/. Nastepnie mieszanine reak¬ cyjna pozostawiono na 10 godzin w temperaturze pokojowej. Po tym czasie, w temperaturze 0°C, dodano wode /lml/ i mieszanine reakcyjna zatezono do sucha. Surowy produkt oczyszczono na plytkach preparatywnych pokrytych zelem krzemionkowym stosujac jako eluent chloroform- metanol /9:1/. Otrzymano 0,058 g (60%) 3', 5' - cyklicznego anilidotiofosforanu 02 - izobutyryloa- denozyny: <531p(CHCl3) 66,46 ppm.E.3', 5' - cykliczny anilidotiofosforan O2 - izobutyryloadenozyny /0,035 g, 0,072 mmola/ rozpuszczono w pirydynie, a nastepnie dodano NaH /20 mg, 50% zawiesina w oleju/. Po 30 minutach dodano w atmosferze argonu CS2 /0,5 ml/ i mieszanine reakcyjna pozostawiono na 3 godziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie w temperaturze 0°C, w atmosferze argonu, wkrop- lono powoli wode /2 ml/. Po 10 minutach nadmiar jonów sodowych usunieto przepuszczajac mieszanine reakcyjna przez zywice jonowowymienna Dowex 50 Wx8 w formie pirydyniowej.Przesacz po zatezeniu rozpuszczono w wodzie /2 ml/ i naniesiono na kolumne wypelniona DEAE-Sephadeksem A-25. Produkt eluowano liniowym gradientem weglanu trietyloamoniowego /0,05-0,8M/. Po usunieciu buforu przez zatezenie z etanolem otrzymano 20 mg /61%/ 3', 5' -cyklicznego ditiofosforanu adenozyny: (531 p(H20) 110 ppm; UV/H20/:^max263 nm.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego 3', 5' - cyklicznego ditiofosforanu adenozyny o wzorze 1, w którym Ade oznacza reszte adeniny, znamienny tym, ze 2', 3' - blokowana adenozyne o wzorze 3, w którym Ade ma wyzej podane znaczenie, aR'ir oznaczaja oddzielnie lub lacznie, kwasolabilne grupy ochronne, poddaje sie reakcji z 0-/arylo/ anilidochlorotiofosforanem o wzorze 4, w którym Ar oznacza grupe fenylowa ewentualnie podstawiona w pozycji 2 i/lub 4 jednym albo dwoma podstawnikami takimi jak -NO2, -Cl, -Br, -F wobec amin aromatycznych i III - rzedowych amin alifatycznych i otrzymany 5' - /O-arylo/anilidotiofosforan 2', 3' - blokowanej adenozyny o wzorze 5, w którym Ade, Ar, R1 i R2 maja wyzej podane znaczenie, w postaci czystych diastereoizomerów, lub korzystnie w postaci ich mieszaniny hydrolizuje sie kwasem, a wytworzony 5'-/0-arylo/- anilidotiofosforan adenozyny o wzorze 6, w którym Ade i Ar maja wyzej podane znaczenie, w postaci czystych diastereoizomerów, lub korzystnie w postaci ich mieszaniny cyklizuje sie w srodowisku silnej zasady, po czym w otrzymanym 3', 5' - cyklicznym anilidotiofosforanie adeno¬ zyny o wzorze 7, w którym Ade ma wyzej podane znaczenie, w postaci czystych diastereoizomerów, a korzystnie w postaci ich mieszaniny zabezpiecza sie grupe 2'-hydroksylowa uzyskujac zwiazek o wzorze 8, w którym Ade ma wyzej podane znaczenie, a R3 oznacza zasadolabilna grupe ochronna, który poddaje sie reakcji z wodorkiem sodowym i disiarczkiem wegla.144 471 Ade Ade Wzór 1 Wzór 2 H0i5 . Ade R'0 OR2 S CI-f-NHC6H5 OAr Wzór 3 Wzór i s r* i. . ,k. A ~ Ade C6H5HN-P-On5' ArO R1Ó ÓR2 Wzór 5144 471 s I C6H5HN—P—0-] ArO Ade HO OH Wzór 6 C6H5HN(Sja Ade Wzór 7 C6H5HN(S)Z 'O' y Ade 0R3 Wzór 8 PL