KR100759608B1 - 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘의 제조방법에 관한 것으로, 1-할로라이보퓨라노스를 뉴클레오 염기와 글라이코실화 반응시키면서 반응 중 생성되는 실릴할라이드를 제거시키는 것을 특징으로 하는 본 발명에 의하면 글라이코실화 반응이 입체 선택적으로 진행되어 β-뉴클레오사이드가 고비율로 생성되며, 이를 탈보호하여 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 고수율 및 고순도로 용이하게 제조할 수 있다.
화학식 1
Figure 112005076182126-pat00001

Description

2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘의 제조 방법 {METHOD FOR THE PREPARATION OF 2'-DEOXY-2',2'-DIFLUOROCYTIDINE}
도 1 내지 도 3은 각각 실시예 4, 비교예 1 및 비교예 2에서 합성된 화합물을 고압액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석한 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure 112005076182126-pat00002
상기 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 (상품명: 젬시타빈)은 구조적으로 라이보퓨라노스 골격을 가지며 입체 화학적으로는 라이보퓨라노스의 1-위치에 뉴클레오염기 (nucleobase)인 사이토신 (cytosine)이 β-위치로 배향된 2'-데옥시-2',2'-다이플로오로뉴클레오사이드 화합물로서, 비소세포폐암 (non small cell lung cancer: NSCLC) 뿐만 아니라, 췌장암, 방광암, 유방암 또는 난소암을 치료하는데 널리 사용되고 있는 항암제이다.
상기 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘은 하기 반응식 1에 도시한 바와 같이 통상적으로 락톨 화합물 (I)을 중간체로 하여 제조할 수 있는데, 락톨 화합물 (Ⅰ)의 1-하이드록시기는 화학적으로 뉴클레오염기와 직접적인 글라이코실화 (glycosylation) 반응이 어려우므로, 반응성이 뛰어난 이탈기가 도입된 라이보퓨라노스 중간체 (Ⅱ)로 전환시킨 다음, 활성화된 라이보퓨라노스 중간체 (Ⅱ)를 뉴클레오염기와 반응시켜 뉴클레오사이드를 수득한 후 탈보호하여 제조할 수 있다.
Figure 112005076182126-pat00003
상기 식에서, P1은 하이드록시 보호기이고, L은 이탈기이다.
활성화된 라이보퓨라노스 중간체 (Ⅱ)로는 1-위치에 설포네이트 이탈기가 도입된 1-설포네이트라이보퓨라노스와 할로 이탈기가 도입된 1-할로라이보퓨라노스가 공지되었으며, 특히 설포네이트 이탈기의 일종인 α-메탄설포네이트라이보퓨라노스가 가장 바람직한 것으로 알려져 있다.
일반적으로 뉴클레오염기가 1-위치의 이탈기를 공격하고 치환되는 반응에 있어서, 반응 후 떨어져 나간 이탈기가 뉴클레오염기와 경쟁적으로 1-위치를 공격함으로써 1-위치에 아노머화 (anomerization)가 유도되며 그에 따라 반응 초기와는 다른 α-아노머 대 β-아노머 비율을 보여주게 된다. 즉 α-위치로만 배향된 아노머를 사용하여 글라이코실화 반응을 시키더라도 시간이 지날수록 β-아노머의 양이 증가하게 되며 그에 따라 반응이 비입체 선택적으로 (nonsteroselective) 진행되어 뉴클레오염기가 β-위치로 배향된 소망하는 β-뉴클레오사이드 뿐만이 아니라 α-뉴클레오사이드도 불순물로 상당량 함께 생성된다.
이탈기가 설포네이트인 경우에는 이러한 아노머화가 적게 일어나서 순수한 α-설포네이트 아노머, 예를 들면 α-메탄설포네이트라이보퓨라노스를 사용하면 소망하는 β-뉴클레오사이드를 과량 수득할 수 있다.
반면에 이탈기가 할로인 경우에는 글라이코실화 반응시 순수한 α-할로 아노머만을 사용하더라도 반응 후 유리된 할라이드에 의한 아노머화 정도가 상대적으로 커서 초기에 비하여 반응이 진행될수록 β-할로 아노머가 증가하게 된다. 특히 β-할로 아노머는 α-할로 아노머 보다 글라이코실화 반응이 빨리 진행되며, 또한 할로 이탈기는 설포네이트 이탈기에 비하여 반응성이 떨어져서 반응시간이 길고 높은 반응온도를 필요로하므로 반응이 진행될수록 α-뉴클레오사이드가 증가되는 열등한 입체 선택성을 보여주게 된다.
결국 글라이코실화 반응을 통하여 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로뉴클레오사이드를 제조하는 반응에 있어서, 1-할로라이보퓨라노스를 이용한 방법은 α-메탄설포네이트라이보퓨라노스에 비하여 입체선택성에 한계를 가질 수밖에 없으며, 그러한 이유로 1-할로라이보퓨라노스를 이용한 방법은 현재까지 주목할 만한 연구보고가 없는 실정이며, α-메탄설포네이트라이보퓨라노스를 통한 방법이 기존의 개발된 글라이코실화 방법 중에서 가장 우수한 방법으로 알려져 있다.
이를 보다 더 구체적으로 살펴보면, 우선, α-설포네이트라이보퓨라노스를 사용하여 뉴클레오염기와 글라이코실화시키는 방법으로서 미국 특허 제 5,371,210호, 제 5,401,838호, 제 5,426,183호, 제 5,594,124호, 제 5,606,048호 및 유럽특허 제 577303호에는 하기 반응식 2에 도시한 바와 같이 α-아노머가 풍부한 1-설포네이트라이보퓨라노스 유도체 (Ⅲ)를 뉴클레오염기 (Ⅳ)와 반응시킴으로써 β-뉴클레오사이드 (Ⅴ)가 고비율로 생성된 입체 선택적인 글라이코실화 방법이 공지되어 있다.
Figure 112005076182126-pat00004
상기 식에서, X는 하이드록시 보호기이고, W는 아미노보호기 또는 수소이며, Y는 나이트릴, 할로, 카보알콕시 또는 나이트로 등으로 치환된 설포닐옥시, 치환된 아릴설포닐옥시이다.
이 방법에 의하면 1-설포네이트 이탈기의 양호한 반응성과 낮은 아노머화에 의하여 뉴클레오염기가 주로 β-위치로 배향된 β-뉴클레오사이드 (Ⅴ)가 반대 아노머인 α-뉴클레오사이드 (Ⅵ)에 비하여 5 내지 7배 정도 과량 생성되며, 결과적으로 젬시타빈을 30 내지 75 ％의 고수율로 수득할 수 있다.
한편, 1-할로라이보퓨라노스를 사용한 종래의 방법을 살펴보면, 미국 특허 제 5,744,597호 및 유럽특허 제 577304호에는 하기 반응식 3에 도시한 바와 같이 α-할로 아노머가 풍부한 라이보퓨라노스 유도체 (Ⅶ)를 음이온 뉴클레오염기 (Ⅷ)와 반응시켜 β-위치에 뉴클레오염기가 도입된 β-뉴클레오사이드 (Ⅸ)를 제조하는 입체선택적인 음이온 글라이코실화 방법이 공지되어 있다.
Figure 112005076182126-pat00005
상기 식에서, X는 하이드록시 보호기이고, W는 아미노보호기이며, M+는 양이온이며, Y는 요오도 또는 설포네이트이다.
이 방법에 의하면, 뉴클레오염기를 칼륨 t-부톡사이드, 소듐하이드라이드 등과 같은 강염기와 반응시켜 음이온 뉴클레오염기 (Ⅷ)를 제조하고, 이 음이온 뉴클레오염기 (Ⅷ)를 α-할로 아노머가 풍부한 라이보퓨라노스 유도체 (Ⅶ)와 글라이코실화 반응을 시키면 β-뉴클레오사이드 (Ⅸ) 뿐만이 아니라 α-뉴클레오사이드 (Ⅹ)도 수득되는데, 이 방법은 음이온 뉴클레오염기를 제조하기 위한 별도의 번거로운 공정이 요구되며, 특히 전술한 바와 같이 글라이코실화 반응이 비입체 선택적으로 진행되므로 원하는 β-뉴클레오사이드가 α-뉴클레오사이드와 대등한 비율로 얻어질 뿐만이 아니라, 분리 수율도 매우 낮아서 비효율적이고 비경제적이라는 단점이 있다.
이와 같이 이탈기가 할로인 1-할로라이보퓨라노스를 사용하여 글라이코실화 반응을 시키는 경우에는 α-위치로만 배향된 순수한 α-아노머를 사용하더라도 α-설포네이트 이탈기를 사용하는 경우와 달리 반응이 비입체 선택적으로 진행됨으로써 얻고자 하는 α-뉴클레오사이드가 매우 낮은 수율로 제조되는 열등한 결과를 보여준다.
한편 가장 바람직한 글라이코실화 반응물질로 알려진 α-1-메탄설포네이트라이보퓨라노스의 경우 뉴클레오염기와 입체선택적으로 글라이코실화 되는 장점은 있으나, 미국 특허 제 5,401,861 호에 제시된 바와 같이 -80 ℃ 내외의 극저온에서 반응을 시켜야 α-아노머가 증가된 1-메탄설포네이트라이보퓨라노스를 제조할 수 있다는 문제점이 있다. 예를 들어, 하기 반응식 4에 도시한 바와 같이 락톨 혼합물 (ⅩⅠ)의 α-락톨 아노머 (ⅩⅡ) 대 β-락톨 아노머 (XIII)가 19 ℃ 온도에서는 2 : 1의 비율로 존재하며, 온도를 -83 ℃로 낮추어야만 그 비율이 4.4 : 1까지 증가하게 되며 동일한 온도에서 설포닐화 반응을 진행할 경우 동일한 비율의 설포네이트 아노머가 생성된다. 실례로, 락톨 혼합물 (XI)을 메탄설포닐 클로라이드와 -80 ℃ 내외의 극저온에서 반응시키면 1-메탄설포네이트의 α-아노머 (XIV)가 β-아노머 (XV)에 비하여 4배 정도 더 많은 비율로 생성된다.
Figure 112005076182126-pat00006
상기 식에서, Bz는 벤조일이고, Ms는 메탄설포닐이다.
그러나, -80 ℃ 내외의 극저온을 유지하며 산업적 규모의 대량생산 반응을 수행한다는 것은 반응기나 냉매의 관점에서 볼 때 현실적으로 용이하게 접근할 수 있는 방법이 아니며, 특히 미합중국 특허 제5,256,797호에 기재된 바와 같이 특정의 용매에서 저온을 유지하며 원하는 α-설포네이트 아노머 (XIV)만을 분리하여야 되므로 별도의 분리 공정이 필요하고, 순수하게 수득하는 수율도 떨어지므로, 1-설포네이트라이보퓨라노스를 사용하는 방법도 1-할로라이보퓨라노스를 사용한 경우와 마찬가지로 문제점을 가지고 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 종래 공지된 방법에 있어서 1-설포네이트라이보퓨라노스를 사용하는 방법은 반응이 입체 선택적으로 진행되기는 하지만, 가장 주요한 중간체인 α-설포네이트라이보퓨라노스를 수득하기 위하여 -80 ℃ 내외의 극 저온이 필요하기 때문에 산업적인 대량생산을 위한 방법으로는 적합하지 않으며, 1-할로라이보퓨라노스를 사용하는 방법의 경우 극저온을 요하지 않는 장점은 있으나 뉴클레오염기가 SN2 치환반응을 통해 α-할로 아노머와 글라이코실화 반응을 할 때 1-위치의 아노머화가 동시에 경쟁적으로 일어나서 α-할로 아노머가 β-할로 아노머로 전환됨에 따라 반응이 비입체 선택적으로 진행되며, 그 결과 원하는 β-뉴클레오사이드가 낮은 비율로 얻어지며, 분리 수율도 낮아서 비효율적이며 비경제적인 제법이라는 문제점이 있다.
또한, 미국 특허 제 5,223,608호에 1 대 1의 비율로 혼합된 α-/β-아노머 혼합물로부터 화학식 1의 β-아노머만을 분리하기 위한 공정이 제시되어 있으며, 그 방법에 의하면 하기 반응식 5에 도시한 바와 같이, 1 대 1 비율의 α-/β-아노머 혼합물을 우선 그의 염산염 (XVI 및 XVII)으로 전환시키고, 이 염산염을 50 ℃의 열수에 용해시킨 다음 수산화나트륨으로 pH를 8.2로 조절한 후 냉각시키고 여과함으로써 화학식 1의 β-아노머를 분리하였다.
Figure 112005076182126-pat00007
상기의 방법은 우선 염산염을 만들고, 이 염산염의 pH를 조절하며 결정화 시킨 후 분리하는 두 단계의 공정으로 되어 있으며, 또한 1 대 1 비율의 α-/β-아노머 혼합물 8.4 g을 사용하여 최종 β-아노머, 즉 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 1.7 g을 수득하므로 분리 수율이 20 ％ 정도로 매우 낮다. 특히 두 단계를 거쳐서 얻은 β-아노머의 순도가 97.7 ％에 불과하므로 이러한 순도를 갖는 β-아노머로 염산염을 만드는 다음 단계를 진행하는 경우 미국 약전에 정의된 총불순물 0.3 ％ 이하의 규정에 적합한 품질의 염산염을 얻기가 극히 어렵다. 따라서 97.7 ％의 순도를 갖는 β-아노머는 다음 단계의 반응물로는 부적합하므로 별도의 공정을 거쳐 99.7 ％ 내외의 순도로 정제해야 하는 문제점이 있다.
따라서, 1-설포네이트라이보퓨라노스의 경우와 같이 높은 입체 선택성을 지니면서 동시에 1-할로 라이보퓨라노스와 같은 제조가 용이한 중간체를 통하여 글라이코실화 방법을 극대화시킬 수 있는 제조 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 종래의 제조 방법상의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 1-할로 아노머를 통한 글라이코실화 반응에 있어서 반응 중 생성된 할라이드를 효율적으로 제거하는 것이 아노머화를 억제하고 반응의 입체 선택성을 증가시키는데 매우 중요함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 1-할로 라이보퓨라노스를 사용한 입체 선택적인 글라이코실화 반응을 이용하여 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 고순도 및 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 유기 용매 중에서 염산과 반응시켜 고순도의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 염산염을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는
1) 화학식 3의 1-할로라이보퓨라노스 화합물과 화학식 4의 뉴클레오염기를 반응 용매에 혼합하고, 반응 중 생성되는 화학식 5의 실릴 할라이드를 제거하면서 반응시켜 화학식 2의 뉴클레오사이드를 수득하는 단계; 및
2) 단계 1)에서 얻어진 뉴클레오사이드를 탈보호하는 단계
를 포함하는, 하기 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘의 제조방법을 제공한다:
화학식 1
Figure 112005076182126-pat00008
화학식 2
Figure 112005076182126-pat00009
화학식 3
Figure 112005076182126-pat00010
화학식 4
Figure 112005076182126-pat00011
화학식 5
R3SiX
상기 식에서,
R은 알킬이며, P1은 하이드록시 보호기이며, P2는 아미노 보호기이며, X는 할로겐 원소이다.
본 발명의 방법에서, 단계 1)에서 화학식 5의 실릴할라이드를 제거하기 위해서는 케리어 (carrier)와 열매 (heating medium)의 혼합 용액을 반응 혼합액에 적 가하면서 동시에 증류함으로써 반응 중 생성된 화학식 5의 실릴 할라이드를 증류를 통하여 제거 (distill-off)하거나, 반응기 내에 관을 투입하고 그 관을 통해 불활성 가스를 이송시킴으로써 화학식 5의 실릴할라이드를 관 외부로 배출제거하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서 '아노머가 풍부한'이라는 용어는 특정 아노머가 이외의 아노머에 대해 1배 이상의 비율로 과량 존재하는 것을 의미하며, 실질적으로 순수한 아노머가 98 ％ 이상 함유된 아노머 혼합물을 의미한다. 또한, '아노머화 (anomerization)'는 순수한 아노머가 단독인 상태로 또는 α- 및 β-아노머 혼합물의 상태로 라이보퓨라노스의 C-1 위치에서 에피머화 (epimerization)가 일어나는 것을 의미한다.
본 발명에서 '케리어 (carrier)'는 글라이코실화 반응 중 생성된 실릴할라이드를 제거하기 위한 용매를 의미하며, '열매 (heating medium)'는 증류하면서 소실된 용매의 부족분을 보충하고, 글라이코실화 반응이 원활하게 진행될 수 있도록 반응계에 충분한 열을 공급하여 주는 높은 증류 온도를 갖는 용매를 의미한다.
또한, '치환된'은 수소 또는 시아노, 할로, 카보알콕시, 톨루오일, 나이트로, 알콕시, 알킬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 기가 단독으로 또는 조합되어 치환되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 입체 선택적인 글라이코실화 방법은 하기 반응식 6에 도시한 바와 같다.
Figure 112005076182126-pat00012
상기 반응식 6에 도시한 본 발명의 방법을 개괄적으로 설명하면, 화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스를 화학식 4의 뉴클레오염기와 글라이코실화 반응을 시키면 뉴클레오염기가 1-아노머 위치를 공격함에 따라 할라이드가 이탈되며, 동시에 뉴클레오염기에 결합되어 있던 실릴기도 이탈되어 이탈된 두 이온 간 반응으로 화학식 5의 실릴할라이드가 생성된다. 이렇게 생성된 실릴할라이드는 반응액에 계속 존재하는 경우 α-아노머의 아노머화를 유발하는 할라이드 공급원 (source)으로 작용하게 된다. 따라서, 이러한 실릴할라이드는 반응과정중에 증류 또는 불활성 가스를 이용함으로써 제거되는 것이 바람직하다.
먼저, 증류를 이용하는 실리할라이드 제거는 케리어와 고비점 열매를 혼합한 용액를 반응 혼합액에 서서히 적가하면서 동시에 증류를 수행하는 것이며, 이때 실릴 할라이드가 증류액에 섞여서 함께 증류되어 반응계 밖으로 나오게 된다. 따라서, 혼합 용액을 적가하고 증류하는 작업을 반응이 완결될 때까지 계속해서 진행하게 되면 이탈된 할라이드가 α-아노머를 공격하는 양이 감소하게 되고, 그에 따라 아노머화는 대폭 감소하게 되므로 글라이코실화 반응이 입체 선택적으로 진행된다. 결과적으로 β-위치로 뉴클레오염기가 고비율로 도입된 화학식 2의 β-아노머가 풍부한 뉴클레오사이드를 제조할 수 있게 된다.
한편, 불활성 가스를 이용하는 실릴할라이드 제거는 반응기 내에 별도의 관을 투입하고 그 관을 통하여 반응에 영향을 주지 않는 가스를 통과시키면서 실릴할라이드를 제거하는 것이다. 보다 구체적으로, 관을 반응액에 담그고 불활성 가스를 버블링(bubbling)을 통해 상기 관내로 주입하거나, 관을 반응액 위에 설치하고 불활성 가스를 스위핑(sweeping)을 통해 관내로 주입시키게 되면, 주입된 가스가 반응기 외부로 빠져나가면서 기체화된 실릴할라이드를 함께 끌고나감으로써 반응기로부터 실릴할라이드를 제거할 수 있다.
상기한 제조 공정에 따르는 본 발명은 1-할로라이보퓨라노스와 뉴클레오염기의 글라이코실화 반응 중 이탈된 할라이드를 화학식 5의 실릴할라이드 상태로 연속적으로 제거한다는 점이 기술 구성상의 가장 큰 특징이다.
또한, 본 발명의 방법은 글라이코실화 반응이 입체 선택적으로 진행됨으로써 화학식 2와 같은 β-뉴클레오사이드가 α-뉴클레오사이드에 비하여 4 내지 14배의 높은 비율로 생성된다는데 그 특징이 있다.
따라서, 본 발명의 방법을 사용하면 글라이코실화 반응의 반응물질로서 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스를 사용하더라도 종래 방법에 비하여 월등히 향상된 비율로 β-뉴클레오사이드를 수득할 수 있다는 장점이 있으며, 또한 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스는 산업적으로 극저온 반응용 설비가 요구되던 α-메탄설포네이트라이보퓨라노스의 경우와 달리 상온에서 용이하게 제조할 수 있기 때문에 대량생산에 매우 적합한 제조방법이라는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 글라이코실화 반응 후 화학식 2의 β-아노머가 풍부한 뉴클레오사이드의 보호기를 제거하게 되면 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 용이하게 분리하여 고수율 및 고순도로 수득할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 방법에서 출발 물질로 사용되는 화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스의 제조 방법은 대한민국 특허출원 제 2004-59623호 (발명의 명칭: 1-할로-2-데옥시-2,2-다이플루오로-Ｄ-라이보퓨라노스 유도체의 제조방법)에 자세하게 기술되어 있으며, 그 방법을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스는 하이드록시기가 보호된 화합물로서, 하이드록시 보호기는 포르밀, 아세틸, 치환된 아세틸, 프로피오닐, 부티닐, 피발아미도, 벤조일, 바이페닐카보닐, 치환된 바이페닐카보닐, 에톡시카보닐, t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐, 페녹시카보닐, 벤질, 다이페닐메틸, 트리페닐메틸, t-부틸, 테트라하이드로피라닐, 알릴, N-페닐카바메이트, N-이미다조일 카바메이트, 트리알킬실릴, 아이소프로필다이알킬실릴, 알킬다이아이소프로필실 릴, 트리아이소프로필실릴 및 t-부틸다이알킬실릴로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이 중 벤조일, 바이페닐카보닐 또는 치환된 바이페닐카보닐이 가장 바람직하다.
또한, 화학식 4의 뉴클레오염기는 미국 특허 제 5,371,210호, 제 5,401,838호, 제 5,426,183호, 제 5,594,124호, 제 5,606,048호 및 유럽특허 제 577303호에 기재된 방법을 참조하여 제조할 수 있다.
화학식 4의 뉴클레오염기의 아미노기는 α-아노머 위치에 경쟁 반응이 일어나지 않도록 보호하여야 되며, 보호기로는 트리메틸실릴, 트리아이소프로필실릴, 트리부틸실릴, t-부틸다이메틸실릴 및 t-부틸다이페닐실릴과 같은 실릴기; t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐, 4-메톡시벤질옥시카보닐 및 4-나이트로벤질옥시카보닐과 같은 카바메이트기; 포르밀, 아세틸, 벤조일, 피발로일, 메톡시메틸, t-부틸, 벤질 및 테트라하이드로파이라닐 등으로 이루어진 군 중에서 선택되며 그 중 트리메틸실릴이 가장 바람직하다.
본 발명에서는 상기의 아미노 보호기 자체가 이중으로 보호될 수도 있다. 예를 들면, N-아세틸사이토신을 트리메틸실릴기로 보호하는 경우 모핵의 옥소 산소 원자뿐만이 아니라 보호기인 N-아세틸의 산소 원자도 에놀 형태로 전환되면서 두 에놀의 산소가 트리메틸실릴기로 보호된 비스-트리메틸실릴-N-아세틸사이토신을 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 글라이코실화 반응을 진행함에 있어서 화학식 4의 뉴클레오염기는 화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스에 대하여 과량 으로 사용하여야 반응이 효과적으로 진행된다.
따라서, 화학식 4의 뉴클레오염기는 화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스에 대하여 5 내지 50 몰당량, 바람직하게는 10 내지 30 몰당량으로 사용되는 것이 좋고, 반응 후처리 과정을 고려하면 15 내지 20 몰당량으로 사용하는 것이 가장 바람직하다.
반응 용매는 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 치환된 벤젠, 데카린 (decalin), 다이글라임 (diglyme), 2-에톡시에틸 에테르, 다이페닐에테르, 치환된 다이페닐에테르, 바이페닐 (Biphenyl), 치환된 바이페닐, 6 내지 14개의 탄소수를 갖는 알칸 및 치환된 알칸으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택하여 사용할 수 있고, 이 중 톨루엔, 7 내지 14개의 탄소수를 갖는 알칸, 다이페닐에테르 또는 이들의 2종 이상의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 특히 다이페닐에테르-헵탄의 혼합 용매가 가장 바람직하다.
반응 용매는 화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스 1 g 에 대하여 5 ㎖ 내지 50 ㎖, 바람직하게는 10 ㎖ 내지 20 ㎖으로 사용되는 것이 좋다.
한편, 반응하면서 생성되는 화학식 5의 실릴할라이드를 제거하기 위한 증류 방법에 사용하는 케리어는 화학식 4의 뉴클레오염기와 반응성이 없고 글라이코실화 반응에 영향을 주지 않는 불활성 용매이어야 하며, 특히 증류되면서 실릴할라이드를 효과적으로 반응계 밖으로 제거해야 하므로 이 보다 높은 끓는점 (boiling point)을 갖는 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 케리어로는 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 치환된 벤젠, 6 내지 14개의 탄 소수를 갖는 알칸 (alkane) 및 치환된 알칸으로 이루어진 군에서 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 이 중 톨루엔, 헵탄, 옥탄 또는 노난이 바람직하며, 헵탄이 가장 바람직하다.
케리어는 화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스 1 g 에 대하여 50 ㎖ 내지 1000 ㎖, 바람직하게는 100 ㎖ 내지 300 ㎖으로 사용되는 것이 좋다.
한편, 화학식 5의 실릴할라이드를 제거하기 위하여 높은 온도에서 증류를 진행하게 되면 반응 용매가 증류액과 함께 일부 동반 증류되면서 초기에 비하여 용매의 양이 부족하게 되고, 그에 따라 증류가 원활하게 이뤄지지 않으며 반응을 진행하는데 필요한 충분한 열을 공급하기 어려울 수가 있다. 이와 같이 소실되는 용매의 부족분을 보충하고, 글라이코실화 반응이 원활하게 진행될 수 있도록 반응계에 충분한 열을 공급하여 주고 일정한 반응 부피를 유지하도록 열매를 케리어와 함께 혼합하여 사용할 수 있다.
따라서, 열매는 기본적으로 높은 끓는점을 갖는 물질이어야 한다. 이에 적합한 열매는 데카린 (decalin), 다이페닐에테르, 치환된 다이페닐에테르, 바이페닐 (biphenyl) 및 치환된 바이페닐 또는 이들의 2종 이상의 혼합물로 이루어진 군에서 선택하여 사용할 수 있으며, 특히 다이페닐에테르가 가장 바람직하다.
열매는 케리어에 대하여 0.1 내지 5 부피％, 바람직하게는 0.5 내지 3 부피％가 좋다.
또한, 열매는 상기한 것 이외에 화학식 4의 뉴클레오염기와 반응성이 없고 글라이코실화 반응에 영향을 주지 않는 200 ℃이상의 끓는점을 갖는 불활성 물질을 사용할 수 있으며, 케리어에 비하여 끓는점이 더 높은 물질을 사용하는 것이 바람직하다.
열매로 사용하는 물질이 이미 반응 용매에 존재하는 경우 열매를 사용하지 않고 케리어로만 적가하면서 증류 작업을 진행하여도 글라이코실화 반응의 선택성에 큰 차이는 없다. 예를 들면 반응 용매로 헵탄과 다이페닐에테르의 조합을 사용하는 경우 열매를 케리어로 혼합하여 사용하거나, 또는 별도로 혼합하지 않고 케리어 단독으로만 사용하여도 입체 선택성에 따른 비율에는 별 차이가 없다.
또한, 반응 중 이탈된 할라이드를 보다 빨리 제거하기 위하여 실릴 공급원 (source)을 외부에서 반응 혼합액에 가할 수도 있다. 즉, 케리어나 열매와 함께 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아마이드 (BSA)를 적당량 혼합한 것을 사용할 수 있다. N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아마이드 (BSA)는 케리어에 대하여 0.05 내지 1.5 부피％, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 부피％로 사용되는 것이 좋다.
본 발명에서 균일한 입체 선택성을 얻기 위해서는 케리어와 열매의 혼합 용액을 반응이 완결될 때까지 일정한 적가 속도를 유지하며 가하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 불활성 가스를 이용한 실릴할라이드 제거 방법에 사용가능한 불활성 가스로는 질소, 헬륨, 네온, 아르곤 등이 있으며, 이 중 구입이 손쉽고 가격이 저렴한 질소가 가장 바람직하다. 상기 불활성 가스는 입체선택성을 고려하여 반응 출발물질인 화학식 3의 1-할로라이보퓨라노스 화합물 100g에 대해서 1ℓ/분 이상의 유속으로 관내로 주입되는 것이 바람직하다. 예컨대, 불활성 가스의 주입 량이 1ℓ/분 미만인 경우, α-뉴클레오사이드에 대한 β-뉴클레오사이드의 비율이 3 이하로 떨어지는데 반하여, 주입량이 1ℓ/분 이상인 경우에는 4배 이상의 비율을 보여준다.
본 발명의 글라이코실화 반응은 80 내지 300 ℃의 온도에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 200 ℃, 더욱 바람직하게는 130 내지 150 ℃의 온도가 좋으며, 4 내지 24시간이면 거의 완결된다.
본 발명에 따른 글라이코실화 반응의 진행 상태는 박층크로마토그래피 (TLC)를 통하여 추적할 수 있으며, 수소-핵자기공명 (1H-NMR) 기기를 사용하여 반응 중간 또는 반응 후 α-뉴클레오사이드와 β-뉴클레오사이드의 비율을 분석할 수 있고, 보다 더 정밀하게는 고압액체크로마토그래피 (HPLC) 기기를 사용하여 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 실릴화된 사이토신을 화학식 3의 뉴클레오염기로 사용하여 글라이코실화 반응을 시키는 경우, 반응 후 물 또는 알코올을 사용하여 실릴기를 분해시키면 화학식 2의 β-아노머가 풍부한 뉴클레오사이드 뿐만이 아니라 반응에 참여하지 않고 남은 과량의 사이토신이 함께 얻어진다. 이 혼합물로부터 화학식 2의 β-아노머가 풍부한 뉴클레오사이드를 분리하기 위해서는 두 물질 간의 상이한 용해도를 이용한다. 즉, 화학식 2의 β-아노머가 풍부한 뉴클레오사이드 및 과량의 사이토신을 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합액에 가하고 교반하면 사이토신은 용해되지 않고 고체 상태로 있으며 화학식 2의 β-아노머가 풍부한 뉴클레오사이드는 용 해된 상태로 존재한다. 따라서 교반 후 여과하여 사이토신을 제거하고, 여액을 증류하면 화학식 2의 β-아노머가 풍부한 뉴클레오사이드를 4 대 1 내지 14 대 1의 β- 대 α- 아노머 혼합물로 수득하게 된다.
한편, 본 발명의 글라이코실화 방법을 통하여 수득한 화학식 2의 β-아노머가 풍부한 뉴클레오사이드를 하기 반응식 7에 도시한 바와 같이 보호기를 제거하면 화학식 1-1의 α-뉴클레오사이드가 혼합된 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 수득할 수 있다.
Figure 112005076182126-pat00013
상기 반응식 7에서, 아실-아미노 보호기, 예를 들면 포르밀, 아세틸, 피발로일 또는 벤조일 같은 보호기는 강염기를 사용하여 통상의 방법에 따라 가수분해시켜 제거할 수 있다. 이러한 강염기로는 수산화나트륨, 수산화칼륨과 같은 알칼리금속 수산화물; 소듐 메톡사이드, 소듐 에톡사이드 또는 칼륨 t-부톡사이드와 같은 알칼리금속 알콕사이드; 다이에틸아민, 하이드록실아민, 암모니아, 하이드라진 등이 있으며, 그 중 암모니아를 사용하여 탈보호하는 방법이 가장 바람직하다. 또한, 메탄설폰산, 염산, 브롬화수소산, 황산과 같은 강산을 사용하거나 산성 이온교환 수지를 사용하여 아실 보호기를 제거할 수도 있다.
이와 같은 반응을 통하여 제조된 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘과 화학식 1-1의 α-뉴클레오사이드 혼합물의 아노머 비율은 탈보호하기 전의 비율을 그대로 유지한, 4 대 1 내지 14 대 1의 비율로 얻어진다.
이 혼합물을 물에 가하고 40 내지 60 ℃의 온도로 가열하여 준 다음 별도로 pH 조절을 하지 않고 10 내지 25 ℃로 냉각시키면 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘은 결정으로 석출되고, 화학식 1-1의 α-뉴클레오사이드는 물에 용해된 상태로 있게 된다. 따라서, 간단한 여과 조작만으로도 α-아노머와 더불어 불순물이 함께 여액으로 제거되고 소망하는 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 결정으로 분리할 수 있다. 특히 물 중에 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘이 고비율로 함유된 상태로 재결정하는 것이어서 결정이 순수하게 자라게 되며, 그에 따라 여과 후 99.8％이상의 고순도 품질로 얻을 수 있으며, 특히 70％ 이상의 고수율로 분리 수득할 수 있다는 장점이 있다.
이와 같이 본 발명의 방법은 글라이코실화 반응 후 얻어지는 뉴클레오사이드에 β-아노머가 높은 비율로 함유되어 있고 탈보호반응을 시켜도 그 비율을 그대로 유지하기 때문에 물에 녹였다 냉각시키는 단순한 공정만으로도 99.8 ％ 이상의 고순도로 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 수득할 수 있으며, 이 러한 품질을 원료로 하여 다음 단계의 염산염을 바로 제조하더라도 미국 약전 규정에 적합한 품질의 순도를 얻을 수 있으므로 별도의 정제 공정을 필요로 하지 않는다는 장점이 있다.
구체적으로 본 발명의 방법을 미국특허 제 5,223,608호에 개시된 방법과 비교해 보면 아래 표 1과 같다.
Figure 112005076182126-pat00014
한편, 재결정시 용액을 교반하면서 결정을 석출시키거나, 교반하지 않고 정치 (standing)시키면서 결정을 석출시킬 수 있다. 두 방법 모두 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘이 수화물로 얻어지며 각각 상이한 수화물로 얻어짐을 확인하였다. 즉, 교반을 진행한 후 얻은 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘은 교반 속도에 따라 수분 함량에 약간 차이는 있으나, 3 내지 4 ％의 수분을 갖는 반수화물이 주로 얻어진다. 반면에 교반을 전혀 하지 않고 정치시킨 후 여과하여 얻은 수화물은 11 내지 12 ％의 수분을 갖는 이수화물로 얻어진다. 두 물질을 X-선 회절분석기로 분석한 결과 상이한 회절각 값을 갖는 다른 물질임을 확인할 수 있다.
이렇게 얻어진 반수화물 및 이수화물은 대기 중에 방치하거나 40 ℃, 75 ％ 습도에서 건조하여도 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 모두 수분이 거의 변하지 않고 유지되는 것으로 보아 안정한 수화물임을 확인할 수 있다.
Figure 112005076182126-pat00015
다음의 단계로, 수화물로 얻어진 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 통상의 방법에 따라 유기 용매에 현탁시키고 진한 염산을 가하여 반응시키면 90 ％이상의 고수율 및 99.8 ％ 이상의 고순도로 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 염산염을 용이하게 제조할 수 있다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따른 방법의 가장 큰 장점은 우선 글라이코실화 반응에 있어서 뉴클레오염기와 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스가 반응하면서 생성된 실릴할라이드를 반응이 완결될 때까지 연속적으로 제거함으로써 아노머화가 억제되어 α-뉴클레오사이드의 생성량이 감소되고, 소망하는 β-뉴클레오사이드를 4 내지 14배의 비율로 수득한다는데 있다. 이러한 입체 선택성은 기존의 가장 뛰어난 반응물질인 α-메탄설포네이트라이보퓨라노스를 통해 얻어지는 비율과 비교시 동등하거나 그 이상의 비율로서 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스를 글라이코실화 반응물질로 사용한 것을 고려할 때 매우 놀라운 결과라 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법의 또 다른 장점은 높은 입체 선택성으로 뉴클레오사이드가 얻어짐에 따라 탈보호 후 물 중에서 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 70 ％이상의 수율 및 99.8 ％ 이상의 고순도로 수득할 수 있다는데 있다. 이러한 순도는 다음 단계의 염산염을 제조하는데 원료로 바로 사용할 수 있을 정도의 매우 높은 순도로서, 이를 사용하여 염산염을 제조하면 미국 약전 규정에 적합한 품질로 수득할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 하나, 이는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
이하의 제조예 및 실시예에서, -OCOBiPh, 또는 BiPhOCO-는 구조적으로
Figure 112005076182126-pat00016
을 의미한다.
또한, HPLC의 조작 조건은 화학식 1의 화합물의 경우 Zorbax RX-C8 (4.6×250 mm, 5 ㎛) 컬럼을 사용하였으며, 용출액으로서 인산이수소나트륨 (NaH2PO4·H2O) 13.8 g과 인산 2.5 ㎖을 물 1 ℓ에 녹인 액 (pH 2.4-2.6)을 사용하였다. 또한, 화학식 2의 화합물의 경우 YMC 하이드로스피어 C18 (4.6×150 mm, 5 ㎛) 컬럼을 사용하였으며, 용출액으로서 인산이수소나트륨 (NaH2PO4·H2O) 13.8 g과 인산 2.5 ㎖을 물 1ℓ에 녹인 액 (pH 2.4-2.6) 240 ㎖ 와 메탄올 760 ㎖를 혼합한 액을 사용하였다.
제조예 1: 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트의 제조
제조예 1-1: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트의 제조
Figure 112005076182126-pat00017
리튬 트라이-tert-부톡시알루미노하이드라이드 13.5 g을 테트라하이드로퓨란 160 ㎖에 용해시키고 상온에서 30분 교반시킨 후 -40 ℃로 냉각하였다. 여기에 D-에리트로-2-데옥시-2,2-다이플루오로-펜토퓨라노스-1-울로즈-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 20 g을 테트라하이드로퓨란 80 ㎖에 용해시킨 용액을 적가한 후 서서히 상온으로 승온시킨 다음 약 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완결되면 1N-염산 220 ㎖를 반응액에 가하고 테트라하이드로퓨란 층을 분리하였다. 수층을 에테르 220 ㎖로 추출하고 테트라하이드로퓨란 층과 합한 다음, 물, 포화 중조액 및 소금물 각 220 ㎖로 연속적으로 세척한 다음 마그네슘 설페이트로 건조한 후 여과하였다. 여액을 감압하여 용매를 제거하고 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 담황색 시럽상인 표제화합물 18.3 g (수율: 91 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDC13, δ); 3.89-3.91 (d, 1H), 4.61-4.81 (m, 2H), 5.31-5.92 (m, 2H), 7.26-7.70 (m, 10H), 8.05-8.16 (m, 4H)
제조예 1-2: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조일-1β-다이페닐포스페이트의 제조
Figure 112005076182126-pat00018
상기 제조예 1-1에서 수득한 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 18.3 g을 톨루엔 146 ㎖에 용해시키고 트라이에틸아민 6.7 ㎖를 단번에 가한 다음 다이페닐 클로로포스페이트 12.4 ㎖를 톨루엔 37 ㎖에 희석시켜 적가하였다. 4 시간 후 1N 염산 48 ㎖를 가하여 잔류 트라이에틸아민을 중화하고 톨루엔 층을 분리한 다음 에테르 48 ㎖로 수층을 추출하였다. 추출된 유기층을 톨루엔 층과 합한 후, 물, 포화 중조액 및 소금물로 순차적으로 세척한 다음 유기층을 분리하고 마그네슘 설페이트로 건조 및 여과하였다. 여액의 용매를 감압하에서 제거하여 1-포스페이트 혼합물을 고체로 수득하였다. 이 혼합물을 양자 핵자기공명 (1H-NMR) 기기를 사용하여 분석한 결과, α-포스페이트 아노머 및 β-포스페이트 아노머가 1 : 10.6의 비율로 생성됨을 확인하였다. 혼합물을 아이소프로판올-물 혼합 용매 (혼합비= 3 : 1, v/v) 중에서 재결정하여 백색의 고체로 표제화합물 26. 5 g (수율: 87 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDC13, δ); 4.56-4.25 (m, 3H), 5.80 (m, 1H), 5.95 (t, 1H), 7.44-6.98 (m, 16H), 7.51 (d, 2H), 7.57 (d, 2H), 7.89 (d, 2H), 8.01 (d, 2H)
융점 (m.p): 101-103℃
HPLC 순도 (면적 ％) : α-포스페이트 아노머 1.76 ％, β-포스페이트 아노머 98.24 ％
제조예 1-3: 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트의 제조
Figure 112005076182126-pat00019
30 ％-HBr/초산 80.5 ㎖에 상기 제조예 1-2에서 수득한 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조일-1β-다이페닐포스페이트 22.8 g을 가하고 상온에서 6시간 반응시켰다. 반응 후 반응액에 메틸렌클로라이드 400 ㎖를 가하여 희석시킨 다음 이 희석액을 얼음물 500 ㎖에 서서히 붓고, 수층을 제거한 다음 메틸렌클로라이드 층을 다시 얼음물로 세척하고, 포화 중조액 및 소금물로 연속적으로 세척하였다. 메틸렌클로라이드 층을 마그네슘 설페이트로 건조하고 여과한 후 여액을 감압하에서 농축시켰다. 생성된 고체는 1-브로모 혼합물로서, 이 혼합물을 1H-NMR 기기를 사용하여 분석한 결과, α-브로모 아노머 및 β-브로모 아노머가 10.7 : 1의 비율로 생성되었음을 확인하였다. 혼합물을 아이소프로판올 중에서 재결정하여 백색 고체로 표제화합물 17.0 g (수율: 82 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDC13, δ); 8.19 (d, 2H), 8.06 (d, 2H), 7.73 (d, 2H), 7.63 (d, 2H), 7.64-7.41 (m, 6H), 6.56 (d, 1H), 5.60 (dd, 1H)
융점 (m.p): 111-112 ℃
HPLC 순도 (면적 ％) : α-브로모 아노머 99.74 ％, β-브로모 아노머 0.26 ％
제조예 2 : 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-3,5-다이-(4-페닐)벤조에이트의 제조
제조예 2-1: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-3,5-다이-(4-페닐)벤조에이트의 제조
Figure 112005076182126-pat00020
테트라하이드로퓨란 120 ㎖에 리튬 트라이-tert-부톡시알루미노하이드라이드 8.66 g을 용해시키고 상온에서 30분 교반시킨 후, -40 ℃로 냉각하였다. 테트라하이드로퓨란 100 ㎖에 D-에리트로-2-데옥시-2,2-다이플루오로-펜토퓨라노스-1-울로즈-3,5-다이-(4-페닐)벤조에이트 15 g을 용해시킨 용액을 반응액에 서서히 적가하고 상온으로 승온한 후 1시간 반응시켰다. 1N-염산 142 ㎖를 반응액에 서서히 적가하여 과량의 리튬 트라이-tert-부톡시알루미노하이드라이드를 분해시키고 유기층을 분리하였다. 수층을 에테르 150 ㎖로 추출하고 유기층과 합한 다음, 유기층을 물, 포화 중조액 및 소금물 각 150 ㎖로 연속적으로 세척하고 마그네슘 설페이트로 유기층을 건조한 다음 여과하였다. 여액을 감압하에서 제거하고 생성된 고체를 톨루엔에서 재결정하여 백색의 고체로 표제화합물 13.4 g (수율: 89 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDC13, δ); 3.45 (s, 1H), 4.85-4.50 (m, 3H), 5.8-5.4 (m, 2H), 7.49-7.43 (m, 6H), 7.71-7.61 (m, 8H), 8.18-8.12 (m, 4H)
융점 (m.p): 156-158 ℃
제조예 2-2: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-3,5-다이-(4-페닐)벤조일-1β-다이페닐포스페이트의 제조
Figure 112005076182126-pat00021
톨루엔 130 ㎖ 및 메틸렌클로라이드 100 ㎖의 혼합용매에 상기 제조예 2-1에서 수득한 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-3,5-다이-(4-페닐)벤조에이트 13 g을 가하여 용해시키고 트라이에틸아민 5.1 ㎖를 가한 다음 실온에서 다이페닐 클로로포스페이트 7.6 ㎖를 적가하였다. 5 시간 후 감압하에서 용매를 제거하고 생성된 고체를 메틸렌클로라이드 130 ㎖에 용해시킨 다음 1N 염산 65 ㎖를 가하였다. 유기층을 분리하고, 물, 중조액 및 소금물로 순차적으로 세척한 다음 마그네슘 설페이트로 건조하였다. 여과 후 감압하에서 용매를 제거하여 1-포스페이트 혼합물을 고체로 수득하였다. 이 혼합물을 1H-NMR 기기를 사용하여 분석한 결과, α-포스페이트 아노머 및 β-포스페이트 아노머가 1 : 10.8의 비율로 생성되었다. 혼합물을 아이소프로판올 중에서 재결정하여 백색 고체상으로 표제화합물 15 g (수율: 83 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDC13, δ); 4.70-4.40 (m, 3H), 5.90 (m, 1H), 6.08 (t, 1H), 7.70-7.08 (m, 24H), 8.15-8.04 (dd, 4H)
융점 (m.p): 145-147 ℃
HPLC 순도 (면적 ％): α-포스페이트 아노머 1.29 ％, β-포스페이트 아노머 98.71 ％
제조예 2-3: 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-3,5-다이-(4-페닐)벤조에이트의 제조
Figure 112005076182126-pat00022
상기 제조예 2-2에서 수득한 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-3,5-다이-(4-페닐)벤조일-1β-다이페닐포스페이트 13 g을 30 ％-HBr/초산 83.2㎖에 가하여 용해시키고 상온에서 7시간 동안 반응시킨 다음 반응액에 얼음물 50 ㎖를 붓고 석출된 고체를 여과하였다. 수득한 고체는 1-브로모 혼합물로서, 이 혼합물을 1H-NMR 기기를 사용하여 분석한 결과, α-브로모 아노머 및 β-브로모 아노머가 10.9 : 1의 비율로 생성됨을 확인하였다. 고체를 에탄올 중에서 재결정하여 백색 고체로 표제화합물 8.45 g (수율: 83 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDC13, δ); 4.89-4.22 (m. 3H), 5.62 (dd, 1H), 6.55 (d, 1H), 7.73-7.42 (m, 14H), 8.63-8.11 (dd, 4H)
융점 (m.p): 151-153 ℃
HPLC 순도 (면적 ％): α-브로모 아노머 99.67 ％, β-브로모 아노머 0.33 ％
실시예 1: 1-(2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조일-D-라이보퓨라노실-4-아미노피리미딘-2-온의 합성
Figure 112005076182126-pat00023
실시예 1-1
사이토신 44.5 g, 헥사메틸다이실라잔 252 ㎖, 암모늄설페이트 252 ㎎을 혼합하고 가열환류시켰다. 완전히 용해된 후 1시간 더 가열 환류시켰다. 반응 혼합액에 에틸아세테이트 200 ㎖를 가하고 가열하면서 미반응된 과량의 헥사메틸다이실라잔을 증류하여 제거하였다. 헵탄 160 ㎖ 및 다이페닐에테르 40 ㎖를 가하고 상기 제조예 1에서 수득한 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 10.4 g을 가한 다음 내부온도를 130 내지 140 ℃로 유지하며 다이페닐에테르 40 ㎖/헵탄 4 ℓ 용액을 8시간 동안 점적하고 동시에 단순 증류하면서 반응시켰으며, 이 공정중에 반응혼합물로부터 트리메틸실릴 브로마이드가 제거되었다. 반응완결 후 반응액에 헵탄 140 ㎖를 가하고 내부온도를 100 ℃로 냉각시켰다. 물 12 ㎖를 조심스럽게 점적하여 퀀칭 (quenching)하고, 상온에서 교반한 뒤 석출된 결정을 여과하고 헵탄으로 세척하여 백색 고체의 생성물과 과량의 사이토신 혼합물을 수득하였다. 이 혼합물을 고압액체크로마토그래피로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 8.8 대 1이었다.
생성물과 사이토신의 혼합물을 메틸렌클로라이드 200 ㎖, 메탄올 40 ㎖에 가하고, 한 시간 동안 가열 환류시킨 후 여과하여 과량의 사이토신을 고체상태로 제거하였다. 여액을 감압 증류하고, 이소프로필에테르를 얻어진 고체에 가하여 희석시키고 여과한 다음 훈풍 건조하여 백색의 고체로 표제화합물 10.8 g (수율: 98 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, DMSO, d-6, δ); 8.1 (d, 2H), 7.9 (d, 2H), 7.8 (d, 2H), 7.7 (d, 2H), 7.6 (d, 2H), 7.5-7.4 (m, 7H), 6.3 (t, 1H), 5.8 (m, 1H), 5.7 (d, 1H), 4.7-4.6 (m, 3H)
아노머 비율 (HPLC 분석): β-뉴클레오사이드/α-뉴클레오사이드 = 8.8/1
실시예 1-2
사이토신 11.1 g, 헥사메틸다이실라잔 63 ㎖, 암모늄설페이트 63 ㎎을 혼합하고 2시간 가열환류시켰다. 반응혼합액에 톨루엔 60 ㎖를 가하고 가열하면서 반응하고 남은 헥사메틸다이실라잔을 증류하여 제거하였다. 옥탄 40 ㎖ 및 다이페닐에테르 20 ㎖를 가하고 상기 제조예 1에서 수득한 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 3.5 g을 가한 다음 내부온도를 140 내지 150 ℃로 유지하며 다이페닐에테르 10 ㎖/헵탄 1 ℓ용액을 점적하고 동시에 단순 증류하면서 10시간 동안 반응시켰으며, 이 공정중에 반응혼합물로부터 트리메틸실릴 브로마이드가 제거되었다. 반응 후 반응액에 헵탄 50 ㎖를 가한 다음 온도를 80 내지 100 ℃로 낮추고, 물 4 ㎖를 조심스럽게 점적하였다. 상온에서 1시간 교반한 뒤 석출된 결정을 여과하고 헵탄으로 세척하여 백색 고체의 생성물과 미반응된 사이토신의 혼합물을 수득하였다. 이 혼합물을 고압액체크로마토그래피로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 5.6 대 1이었다. 생성물과 사이토신의 혼합물을 메틸렌클로라이드 70 ㎖, 메탄올 15 ㎖에 가하고, 한 시간 동안 가열 환류시킨 후 여과하고, 여액을 감압 증류하고, 이소프로필에테르를 얻어진 고체에 가하여 희석시키고 여과한 다음 훈풍 건조하여 백색의 고체로 표제화합물 3.45 g (수율: 93 ％)을 수득하였다.
1H-NMR 데이터는 상기 실시예 1-1과 동일하였다.
아노머 비율 (HPLC 분석): β-뉴클레오사이드/α-뉴클레오사이드 = 5.6/1
실시예 1-3
사이토신 2.23 g, 헥사메틸다이실라잔 12.6 ㎖, 암모늄설페이트 12.6 ㎎을 혼합하고 가열환류시켰다. 완전히 용해된 후 1시간 더 가열 환류시켰다. 반응혼합액에 에틸아세테이트 200 ㎖를 가하고 가열하면서 미반응된 과량의 헥사메틸다이실라잔을 증류하여 제거하였다. 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 0.26 g을 가하고 내부온도를 125 내지 140 ℃를 유지하며 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아마이드 2 ㎖/헵탄 200 ㎖ 용액을 6시간 동안 점적하면서 증류하며 반응시켰으며, 이 공정중에 반응혼합물로부터 트리메틸실릴 브로마이드가 제거되었다. 반응완결 후 내부온도를 80 ℃로 냉각시키고 물 1 ㎖를 조심스럽게 점적하고, 상온에서 1시간 교반한 뒤 석출된 결정을 여과하고 헵탄으로 세척하여 미반응된 사이토신이 과량 함유된 혼합물을 수득하였다. 이 혼합물을 HPLC로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 14 대 1이었다.
실시예 1-4
사이토신 340 g, 헥사메틸다이실라잔 1,835 ㎖, 암모늄설페이트 1.84 g을 혼합하고 가열환류시켰다. 완전히 용해된 후 1시간 더 가열 환류시켰다. 반응혼합액에 헵탄 1,200 ㎖를 가하고 연이어 디페닐에테르 500 ㎖를 가하여 온도를 100 ℃로 낮춘 다음 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 100 g을 가하였다. 내부온도를 140 내지 143 ℃를 유지한 상태에서 반응기 내부에 관을 주입하고 스위핑을 통해 질소를 1.0 내지 1.3 ℓ/분의 유량으로 통과시키면서 12시간 동안 반응시켰으며, 이 공정중에 반응혼합물로부터 트리메틸실릴 브로마이드가 제거되었다. 반응완결 후 내부온도를 80 ℃로 냉각시키고 물 100 ㎖를 조심스럽게 점적하고, 상온에서 1시간 교반한 뒤 석출된 결정을 여과하고 헵탄으로 세척하여 미반응된 사이토신이 함유된 혼합물을 수득하였다. 이 혼합물을 HPLC로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 4.9 대 1이었다.
실시예 1-5
질소를 3.0 내지 3.5 ℓ/분의 유량으로 반응기 내에 통과시키는 것을 제외하고는 상기 실시예 1-4의 방법과 동일하게 반응을 수행하였으며, 그 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 6.1 대 1이었다.
실시예 2: 1-(2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-3,5-다이-(4-페닐)벤조일-D-라이보퓨라노실-4-아미노피리미딘-2-온의 합성
Figure 112005076182126-pat00024
반응기에 사이토신 22.2 g, 헥사메틸다이실라잔 126 ㎖, 암모늄 설페이트 126 ㎎을 혼합하고 2시간 가열환류시킨 다음 에틸아세테이트 100 ㎖를 가하여 과량의 헥사메틸다이실라잔을 제거하였다. 헵탄 80 ㎖를 가하고, 이어서 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-3,5-다이-(4-페닐)벤조에이트 5.93 g을 가한 후, 디페닐에테르 20 ㎖를 가하였다. 내부온도를 130 내지 140 ℃를 유지하며 헵탄 1ℓ를 9시간 동안 점적하면서 동시에 증류하며 반응시켰으며, 이 공정중에 반응혼합물로부터 트리메틸실릴 브로마이드가 제거되었다. 반응 완결 후 증류장치를 제거하고 환류콘덴서로 교체한 후 헵탄 160 ㎖를 가해 내부 온도를 100 ℃로 맞추었다. 물 8 ㎖를 조심스럽게 점적하여 주고, 상온에서 교반한 뒤 여과하고, 헵탄으로 고체를 세척하여 생성물과 과량의 시토신 혼합물을 얻었다. 이 혼합물을 고압액체크로마토그래피로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 5.4 대 1이었다. 혼합물을 메틸렌클로라이드 200 ㎖, 메탄올 40 ㎖에 가하고 한 시간 동안 가열 환류시킨 후 여과하여 과량의 시토신을 제거하였다. 여액을 감압증류하여 백색의 고체로 표제화합물 4 g (64 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.74-7.27 (m, 19H), 6.38 (m, 1H), 5.83 (m, 1H), 5.78 (d, 1H), 4.78-4.45 (m, 3H)
융점 (m.p): 250-255 ℃
아노머 비율 (HPLC 분석): β-뉴클레오사이드/α-뉴클레오사이드 = 5.6/1
실시예 3: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 (화학식 1의 화합물; 젬시타빈)의 합성
Figure 112005076182126-pat00025
실시예 3-1:. 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 반수화물
실시예 1-1에서 제조한 1-(2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조일-D-라이보퓨라노실-4-아미노피리미딘-2-온 10.8 g을 7N-암모니아/메탄올 용액 (알드리치사) 86 ㎖에 가하고, 여기에 메탄올 216 ㎖를 더 가하였다. 상온에서 12시간 교반하고 감압하여 용매를 제거하고, 물 120 ㎖와 에틸 아세테이트 80 ㎖를 가하여 교반한 다음 수층을 분리하고, 에틸아세테이트 층은 물 40 ㎖를 가하여 한 번 더 추출하였다. 수층을 합하고, 디에틸에테르 40 ㎖로 수층을 세척하고, 수층을 감압증류하여 물을 제거한 후 잔사에 물 25 ㎖를 재차 가하였다. 45 내지 50 ℃로 가열하여 고체를 완전히 용해시키고 교반하면서 온도를 서서히 낮추었다. 상온에서 2시간 교반하여 결정을 숙성시키고 석출된 결정을 여과하였다. 물과 아세톤으로 세척 후 밤새 훈풍 건조하여 순백색의 표제화합물 반수화물을 3.99 g (수율: 76.9 ％) 수득하였다.
수분 : 3.4 ％
1H-NMR (300 MHz, DMSO d-6, δ); 7.7 (1H, d), 7.39 (1H, d), 6.2 (1H, d), 6.1 (1H, t), 5.8 (1H, t), 4.2 (m, 1H), 3.9-3.8 (m, 2H), 3.7 (m, 1H)
융점 (m.p).= 198-202 ℃
HPLC 순도 (면적 ％): β-아노머 99.97 ％. α-아노머 0.02 ％ 이하, 사이토신 0.01 ％ 이하
실시예 3-2: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 이수화물
실시예 3-1과 동일한 스케일 및 동일한 방법으로 탈보호 반응을 진행한 다음 물 중에서 결정으로 석출시킬 때 교반을 하지 않고 정치시킨 상태에서 결정을 숙성시킨 후 여과하여 순백색의 표제화합물 이수화물을 4.22 g (수율: 81.3 ％) 수득하였다.
수분 : 11.5 ％
융점 (m.p).= 220-224℃
1H-NMR 데이터는 실시예 3-1과 동일하였다.
HPLC 순도 (면적 ％) : β-아노머 99.98 ％. α-아노머 0.01 ％ 이하, 사이토신 0.01 ％ 이하
실시예 4: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 (화학식 1의 화합물; 젬시타빈)의 합성
Figure 112005076182126-pat00026
헥사메틸다이실라잔 184 ㎖에 사이토신 32.2 g 및 암모늄 설페이트 184 ㎎을 가한 후 1시간 동안 환류시켰다. 헵탄 250 ㎖를 첨가하고 내부온도 135 내지 140 ℃를 유지하며 미반응된 과량의 헥사메틸다이실라잔을 증류시켜 제거하였다. 증류된 반응 혼합액에 헵탄 150 ㎖를 가하고, 이어서 상기 제조예 1에서 수득한 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 10.0 g을 가한 다음 다이페닐에테르 38.7 ㎖를 가하였다. 내부온도 135 내지 140 ℃를 유지하며 헵탄 1.5 ℓ를 10시간 동안 균일한 속도로 적가하면서 동시에 증류하며 반응시켰으며, 이 공정중에 반응혼합물로부터 트리메틸실릴 브로마이드가 제거되었다. 반응이 완결되면 헵탄 240 ㎖를 넣고 물 11.6 ㎖를 서서히 가하였다. 생성된 고체를 상온에서 충분히 교반하여 여과하고 헵탄으로 세척하였다. 여과한 고체를 상온에서 건조한 다음 과량의 미반응된 사이토신이 함유된 혼합물을 HPLC로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 6.1 대 1이었다 (도 1). 혼합물에 메틸렌 클로라이드 300 ㎖와 메탄올 60 ㎖를 가하고 2시간 동안 환류시켰다. 반응액을 여과하고 메틸렌 클로라이드 150 ㎖와 메탄올 30 ㎖를 혼합한 용액으로 세척하여 준 후 여액을 감압증류하여 화학식 2의 1-(2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조일-D-라이보퓨라노실-4-아미노피리미딘-2-온의 α-/β-혼합물을 수득하였다. 이 혼합물에 메탄올 200 ㎖와 7N 암모니아/메탄올 용액 83 ㎖를 바로 가하고 상온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완결된 후 감압증류하여 반응액을 제거하고 에틸 아세테이트 80 ㎖를 가하고 물 90 ㎖로 추출한 다음, 다시 물 40 ㎖로 재추출 후 물 층을 합하였다. 합한 물층을 에테르 40 ㎖로 2회 세척하였다. 목적 화합물의 5배가 남을 때까지 물을 감압증류로 제거한 다음 50 내지 55 ℃로 가열하고 교반하면서 온도를 상온으로 낮추었다. 2시간 교반 후 석출된 결정을 여과하고 물, 아세톤으로 세척 후 밤새 훈풍건조하여 순백색의 표제화합물 3.69 g (수율: 72.6 ％)을 수득하였다.
수분 : 3.5 ％
융점 및 1H-NMR 데이터는 실시예 3-1과 동일하였다.
HPLC 순도 (면적 ％) : β-아노머 99.9 ％. α-아노머 0.01 ％ 이하, 사이토신 0.02 ％ 이하
실시예 5: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 (화학식 1의 화합물; 젬시타빈)의 합성
Figure 112005076182126-pat00027
N-아세틸사이토신 24 g, 헥사메틸다이실라잔 126 ㎖, 암모늄설페이트 126 ㎎을 혼합하고 2시간 가열 환류시켰다. 헵탄 100 ㎖를 가하고 과량의 헥사메틸다이실라잔을 고온에서 단순 증류하여 제거하였다. 옥탄 50 ㎖를 가하고, 이어서 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 5 g을 가한 다음 내부온도를 135 내지 140 ℃를 유지하며 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아마이드 1.8 ㎖/헵탄 900 ㎖ 용액을 8시간 동안 점적하면서 증류하며 반응시켰으며, 이 공정중에 반응혼합물로부터 트리메틸실릴 브로마이드가 제거되었다. 반응완결 후 헵탄 60 ㎖를 가하고 내부온도를 100 ℃로 냉각시켰다. 물 12 ㎖를 조심스럽게 점적하고, 상온에서 2시간 교반한 뒤 석출된 결정을 여과하고 헵탄으로 세척하여 백색의 고체를 수득하였다. 이 고체는 표제화합물과 N-아세틸사이토신의 혼합물로서 HPLC로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 4.8 대 1이었다. 이 혼합물에 메탄올 108 ㎖와 7N 암모니아/메탄올 용액 45 ㎖를 바로 가하고 상온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완결된 후 감압증류하여 반응액을 제거하고 에틸 아세테이트 50 ㎖를 가하고 물 60 ㎖로 추출한 다음, 다시 물 20 ㎖로 재추출 후 물 층을 합하였다. 합한 물층을 에테르 40 ㎖로 2회 세척하였다. 물을 감압증류로 제거한 다음 얻어진 고체에 물 15 ㎖를 가하고 50 내지 55 ℃로 가열한 다음 교반하면서 온도를 상온으로 낮추었다. 2시간 교반 후 석출된 결정을 여과하고 물, 아세톤으로 세척 후 밤새 훈풍 건조하여 순백색의 표제화합물 32.2 g (수율: 63 ％)을 수득하였다.
융점 및 1H-NMR 데이터는 실시예 3-1과 동일하였다.
HPLC 순도 (면적 ％) : β-아노머 99.8 ％. α-아노머 0.02 ％ 이하, 사이토신 0.02 ％ 이하
실시예 6: 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘.염산염의 합성
Figure 112005076182126-pat00028
실시예 6-1
아세톤 35 ㎖에 상기 실시예 3에서 합성한 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 반수화물을 3.5 g (수분 3.8 ％) 넣고 진한 염산 1.2 ㎖를 적가하고 상온에서 2시간 교반하였다. 생성된 결정을 여과하고 아세톤으로 세척하여 주고 훈풍 건조하여 순백색의 고체로 표제화합물 3.52 g (91.9 ％)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, DMSO, d6): 9.95 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.05 (d, 1H), 6.15 (d, 1H), 5.96 (m, 1H), 4.14-4.03 (m, 1H), 3.79 (d, 1H), 3.70-3.51 (m, 2H)
융점 (m.p): 287-292 ℃
실시예 6-2
아세톤 35 ㎖에 상기 실시예 3에서 합성한 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 이수화물을 3.5 g (수분 11.5 ％) 넣고 진한 염산 1.2 ㎖를 적가하고 상온에서 2시간 교반하였다. 생성된 결정을 여과하고 아세톤으로 세척하여 주고 훈풍 건조하여 순백색의 고체로 표제화합물 3.23 g (91.5 ％)을 수득하였다.
융점 및 1H-NMR 데이터는 실시예 6-1과 동일하였다.
비교예
한편, 본 발명에 따른 글라이코실화 방법의 우수성을 확인하기 위해 비교예로서 케리어를 사용하지 않고 실릴할라이드가 반응계에 존재한 상태에서 환류시키는 방법 (비교예 1), 또는 기존 방법인 미국 특허 제 5,371,210호, 제 5,401,838호, 제 5,426,183호, 제 5,594,124호, 제 5,606,048호 및 유럽특허 제 577303호에 기재된 방법 (비교예 2)으로 진행하되 α-메탄설포네이트라이보퓨라노스 대신 α-브로모라이보퓨라노스를 사용한 방법을 하기 비교예 1 및 2와 같이 실시하였다.
비교예 1: 화학식 5의 실릴 할라이드를 증류하지 않고 반응계 내에서 환류시키며 반응시키는 방법
헥사메틸다이실라잔 184 ㎖에 사이토신 32.2 g 및 암모늄 설페이트 184 ㎎을 가한 후 1시간 동안 환류시켰다. 헵탄 250 ㎖를 첨가하고 내부온도 135 내지 140 ℃를 유지하며 미반응된 과량의 헥사메틸다이실라잔을 증류시켜 제거하였다. 증류된 반응 혼합액에 헵탄 150 ㎖를 가하고, 이어서 상기 제조예 1에서 수득한 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 10.0 g을 가한 다음 다이페닐에테르 38.7 ㎖를 가하였다. 내부온도 135 내지 140 ℃를 유지하고 10시간 동안 가열환류하며 반응시켰다. 반응이 완결되면 헵탄 240 ㎖를 넣고 물 11.6 ㎖를 서서히 가하였다. 생성된 고체를 상온에서 충분히 교반하여 여과하고 헵탄으로 세척하였다. 여과한 고체를 상온에서 건조한 다음 미반응된 과량의 사이토신이 함유된 혼합물을 HPLC로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 1.4 대 1이었다 (도 2). 혼합물에 메틸렌 클로라이드 300 ㎖와 메탄올 60 ㎖를 가하고 2시간 동안 환류시켰다. 반응액을 여과하고 메틸렌 클로라이드 150 ㎖와 메탄올 30 ㎖를 혼합한 용액으로 세척하여 준 후 여액을 감압증류하여 화학식 2의 1-(2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조일-D-라이보퓨라노실-4-아미노피리미딘-2-온의 α-/β-혼합물을 수득하였다. 이 혼합물에 메탄올 200 ㎖와 7N 암모니아/메탄올 용액 83 ㎖를 바로 가하고 상온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완결된 후 감압증류하여 반응액을 제거하고 에틸 아세테이트 80 ㎖를 가하고 물 90 ㎖로 추출한 다음, 다시 물 40 ㎖로 재추출 후 수층을 합하였다. 합한 수층을 에테르 40 ㎖로 2회 세척하였다. 목적화합물의 5배가 남을 때까지 물을 감압증류로 제거한 다음 50 내지 55 ℃로 가열하고 교반하면서 온도를 상온으로 낮추었다. 2시간 교반 후 석출된 결정을 여과하고 물, 아세톤으로 세척 후 밤새 훈풍 건조하여 순백색으로 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 1.80 g (수율: 35.5 ％)을 수득하였다.
수분 : 3.7 ％
융점 및 1H-NMR 데이터는 실시예 3-1과 동일하였다.
글라이코실화 반응 후 아노머 비율 (HPLC 분석) : β-뉴클레오사이드/α-뉴클레오사이드 = 1.4/1
비교예 2: 미국 특허 제 5,371,210호 및 유럽특허 제 577303호 등에 기재된 방법으로 진행하되 α-메탄설포네이트 라이보퓨라노스 대신 α-브로모 라이보퓨라노스를 사용한 방법
헥사메틸다이실라잔 184 ㎖에 사이토신 32.2 g 및 암모늄 설페이트 184 ㎎을 가한 후 1시간 동안 환류시켰다. 헵탄 250 ㎖를 첨가하고 내부온도 135 내지 140 ℃를 유지하며 미반응된 과량의 헥사메틸다이실라잔을 증류시켜 제거하였다. 증류된 반응 혼합액에 상기 제조예 1에서 수득한 1-α-브로모-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-D-라이보퓨라노실-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조에이트 10.0 g 및 아니솔 36.3 ㎖를 가하고 내부온도 135 내지 140 ℃를 유지하고 10시간 동안 가열환류하며 반응시켰다. 반응이 완결되면 헵탄 240 ㎖를 넣고 물 11.6 ㎖를 서서히 가하였다. 생성된 고체를 상온에서 충분히 교반하여 여과하고 헵탄으로 세척하였다. 여과한 고체를 상온에서 건조한 다음 미반응된 과량의 사이토신이 함유된 혼합물을 HPLC로 분석한 결과 β-뉴클레오사이드 대 α-뉴클레오사이드의 아노머 비율은 1.3 대 1이었다 (도 3). 혼합물에 메틸렌클로라이드 300 ㎖와 메탄올 60 ㎖를 가하고 2시간 동안 환류시켰다. 반응액을 여과하고 메틸렌 클로라이드 150 ㎖와 메탄올 30 ㎖를 혼합한 용액으로 세척하여 준 후 여액을 감압증류하여 화학식 2의 1-(2'-데옥시-2',2'-다이플루오로-5-벤조일-3-(4-페닐)벤조일-D-라이보퓨라노실-4-아미노피리미딘-2-온의 α-/β-혼합물을 수득하였다. 이 혼합물에 메탄올 200 ㎖와 7N 암모니아/메탄올 용액 83 ㎖를 바로 가하고 상온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완결된 후 감압증류하여 반응액을 제거하고 에틸아세테이트 80 ㎖를 가하고 물 90 ㎖로 추출한 다음, 다시 물 40 ㎖로 재추출 후 물 층을 합하였다. 합한 물층을 에테르 40 ㎖로 2회 세척하였다. 목적화합물의 5배가 남을 때까지 물을 감압증류로 제거한 다음 50 내지 55 ℃로 가열하고 교반하면서 온도를 상온으로 낮추었다. 2시간 교반 후 석출된 결정을 여과하고 물과 아세톤으로 세척 후 밤새 훈풍 건조하여 순백색으로 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 16.4 g (수율: 32.3 ％)을 수득하였다.
수분: 3.5 ％
융점 및 1H-NMR 데이터는 실시예 3-1과 동일하였다.
글라이코실화 반응 후 아노머 비율 (HPLC 분석): β-뉴클레오사이드/α-뉴클레오사이드 = 1.3/1
실시예 4, 비교예 1 및 비교예 2에 따른 글라이코실화 반응의 α/β 비율 및 탈보호반응 수율을 비교하여 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112005076182126-pat00029
본 발명의 방법과 동일하게 반응을 진행하되 단지 실릴 할라이드를 제거하지 않고 환류하면서 반응시킨 비교예 1의 경우 원하는 β-뉴클레오사이드가 α-뉴클레오사이드에 비하여 1.4 배 정도로만 생성되었다 (도 2). 또한, 기존 방법과 같이 진행한 비교예 2도 α-뉴클레오사이드에 비하여 1.3배 정도의 β-뉴클레오사이드가 수득되었다 (도 3). 그러나, 본 발명의 방법을 사용한 경우에는 상기 실시예 4에 나타낸 바와 같이 6배 이상의 비율로 β-뉴클레오사이드를 수득할 수 있었다 (도 1).
특히 각각의 방법에 따라 수득한 화학식 2의 뉴클레오사이드를 탈보호하면 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘의 수득량에 현저한 차이를 보여주었다. 즉, 실릴할라이드가 반응계에 존재한 상태에서 환류시키는 방법은 35.5 ％의 수율로, 종래 특허를 이용한 방법은 32.3 ％의 수율로 얻을 수 밖에 없으나 본 발명의 방법의 경우 72.6 ％의 높은 수율로 수득할 수 있었다.
본 발명의 방법에 의하면 α-할로라이보퓨라노스와 뉴클레오염기의 글라이코실화 반응 중 생성되는 실릴할라이드를 효과적으로 제거함으로써 입체선택적으로 반응이 진행되어 종래에 비해 월등히 향상된 4 내지 14배의 고비율로 β-뉴클레오사이드를 수득할 수 있고, 특히 이를 이용하여 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘을 70 ％ 이상의 수율 및 99.8 ％ 이상의 고순도로 생산할 수 있다.

Claims (21)

1) 화학식 3의 1-할로라이보퓨라노스 화합물과 화학식 4의 뉴클레오염기를 유기 용매에 혼합하고, 반응 중 생성되는 화학식 5의 실릴 할라이드를 증류하거나 불활성 가스를 통과시켜 제거하면서 글라이코실화 반응시켜 화학식 2의 뉴클레오사이드를 수득하는 단계; 및
2) 단계 1)에서 얻어진 뉴클레오사이드를 강염기, 강산 또는 산성 이온교환 수지를 이용하여 탈보호하는 단계
를 포함하는, 하기 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘의 제조방법:
화학식 1
Figure 712007001831819-pat00030
화학식 2
Figure 712007001831819-pat00031
화학식 3
Figure 712007001831819-pat00032
화학식 4
Figure 712007001831819-pat00033
화학식 5
R3SiX
상기 식에서,
R은 알킬이며, P1은 하이드록시 보호기이며, P2는 아미노 보호기이며, X는 할로겐 원소이다.
삭제
제 1 항에 있어서,
단계 1)에서 화학식 4의 뉴클레오염기가 화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라 이보퓨라노스에 대하여 5 내지 50 몰당량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 1)에서 유기 용매가 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 치환된 벤젠, 데카린(Decalin), 다이글라임(Dyglyme), 2-에톡시에틸 에테르, 다이페닐에테르, 치환된 다이페닐에테르, 바이페닐(Biphenyl), 치환된 바이페닐, 6 내지 14개의 탄소수를 갖는 알칸 또는 치환된 알칸, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 1)에서 제거되는 화학식 5의 실릴할라이드가 트리메틸브로마이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 1)에서의 증류가 실릴 할라이드 케리어 (carrier)를 반응 혼합액에 적가하면서 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,
실릴 할라이드 케리어가 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 치환된 벤젠, 6 내지 14개의 탄소수를 갖는 알칸(alkane) 또는 치환된 알칸 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서,
실릴 할라이드 케리어가 헵탄인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,
실릴 할라이드 케리어가 화학식 3의 α-아노머가 풍부한 1-할로라이보퓨라노스 1 g 에 대하여 50 ㎖ 내지 1000 ㎖의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,
실릴 할라이드 케리어에 열매 (heating medium) 또는 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아마이드 (BSA)를 추가로 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,
열매가 데카린 (Decalin), 다이페닐에테르, 치환된 다이페닐에테르, 바이페닐(Biphenyl), 치환된 바이페닐 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서,
열매가 다이페닐에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,
열매가 실릴 할라이드 케리어에 대하여 0.1 내지 5 부피％로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,
N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아마이드가 실릴 할라이드 케리어에 대하여 0.05 내지 1.5 부피％로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
불활성 가스가 질소, 헬륨, 네온 및 아르곤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
불활성 가스가 반응액에 담근 관을 통해 버블링(bubbling) 방법으로 주입되거나, 반응액 위에 위치시킨 관을 통해 스위핑(sweeping) 방법으로 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
불활성 가스가 화학식 3의 1-할로라이보퓨라노스 화합물 100g을 기준으로 1ℓ/분 이상의 유속으로 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 1)의 글라이코실화 반응 및 할라이드 제거를 80 내지 300 ℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
1) 수득된 화학식 2의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘의 β/α 아노머 혼합물을 물에 용해시키는 단계;
2) 단계 1)의 용액을 40 내지 60 ℃의 온도로 가열한 후 교반하거나 정치시키면서 별도로 pH 조절을 하지 않고 10 내지 25 ℃의 온도로 냉각시킨 다음 결정을 석출하는 단계;
3) 석출된 결정을 여과함으로써 99.8％ 이상의 순도로 화학식 1의 β-아노머를 선택적으로 분리시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항, 제 3 항 내지 제 14 항, 및 제 16 항 내지 제 20 항 중의 어느 한 항에 따라 제조된 화학식 1의 2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 반수화물 또는 이수화물을 염산과 반응시키는 것을 포함하는, β-2'-데옥시-2',2'-다이플루오로사이티딘 염산염의 제조 방법.
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