******_ Twórcywynalazku: Kalman Szendrei, Emil Minker, Zsuzsanna Rózsa, Lehel Koch, Lajos Wolf Uprawniony zpatentu: Kózponti V4kó-es Hitelbank Rt., Innovaciós Alp, Budapeszt (Wegry) Sposób wytwarzania biologicznie czynnych koncentratów polisacharydów Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biologicznie czynnych koncentratów poli¬ sacharydów. Koncentratypolisacharydów wytwarza sie z surowców roslinnych. Maja one dziala¬ nie lecznicze, zwlaszcza przeciwzapalne i stosowane sa do wytwarzania preparatów farmaceuty¬ cznych i leczniczo-kosmetycznych.Pod pojeciem polisacharydów rozumie sie tu optycznie czynne heteropolisacharydy, które zbudowane sa z monosacharydów o budowie furanozowej lub piranozowej o wiazaniu eterowym lub glikozydowym i których kwasowe lub zasadowe grupy funkcyjne moga byc ewentualnie sprzezone z bialkiem i/lub peptydami (peptydoglikany albo glikoproteiny).Pod pojeciem dzialania przeciwzapalnego rozumie sie tu wszystkie dzialania, które moga byc objete próba obrzeku wywolanego karagenina na lapie szczura, wzglednie nie moga byc wyklu¬ czone. Czynnymi substancjami przeciwzapalnymi w próbie obrzeku na lapie szczura moga byc srodki przeciwreumatyczne, Srodki przeciw wrzodom, odpowiednie do stosowania zewnetrznego masci, zele lub roztwory, a pojedynczo takze lecznicze kosmetyki.Stosowane obecnie w lecznictwie czynne substancje przeciwzapalne nienaturalnego pocho¬ dzenia zawieraja albo steroidy, co stwarza liczne problemy tolerancji, na przyklad wykazuja one czesto dzialanie hormonalne, powiekszaja zatrzymywanie sodu w organizmie albo powoduja zanik. Niesteroidowe substancje przeciwzapalne wykazuja dzialanie uboczne, które ograniczaja ich zastosowanie. Indometacyna i salicylany maja na przyklad dzialanie uboczne, a mianowicie oslabiaja odpornosc organizmu, atakuja przewód pokarmowy, powoduja krwotoki wewnetrzne i wrzody zoladka. Ze wzgledu na toksyczne dzialanie uboczne czyniono coraz wieksze starania, aby wynalezc naturalne substancje przeciwzapalne. Tegorodzaju badania prowadzone sa intensywnie, jako ze ostatnio srodki przeciwzapalne znajduja wiekszy zakres stosowania. Mozna je stosowac takze do leczenia zaburzen zaopatrzenia tkanek w tlen, na przyklad zawalu serca, innych uszko¬ dzen tkanki przez zaburzenie krazenia oraz do leczenia stanów wstrzasu.W dziedzinach, w których wymagane sa substancje przeciwzapalne, stosuje sie w lecznictwie i w kosmetyce wpodobny sposób liczne rosliny lecznicze i wytworzone z nichpreparaty.Teskladniki2 143 397 surowców roslinnych i uzyskanych z nich preparatów, które odpowiedzialne sa za dzialanie, sa po wiekszej czesci jeszcze nieznane. Kwiat rumianku (Chamomillae flos) stosuje sie szeroko do leczenia najrózniejszych schorzen w postaci herbaty, mieszanej herbaty, ekstraktów wodnych lub zawierajacych rozpuszczalniki lub destylatów (eteryczny olejek). Do przypuszczalnych i czesciowo udowodnionych farmakologicznych dzialan surowców roslinnych naleza dzialania przeciwzapalne oraz dzialanie wywierane na miesien sercowy, (A. Auster, J. Schafer: Arzneipflanzen 15. 19. 21.; Lieferungen; W. Spaich: Moderne Phytotherapie, Haug Verlag 1978). Kwiat rumianku stosuje sie w pierwszym rzedzie w lecznictwie,jak tez w kosmetyce do leczenia stanów zapalnych na skórzei blonach sluzowych, a mianowicie w postaci masci, kapieli, inhalacji, pedzlowan, herbat, ewentual¬ nie z wodnymi wyciagami albo z substancja czynna wlaczona do srodka kosmetycznego. Wewnet¬ rznie rumianek stosuje sie najczesciej w postaci herbaty przy niezytach i skurczach ukladu trawien¬ nego, przy wrzodowych schorzeniach blon sluzowych albo ich uszkodzeniach. Wedlug nowszych badan przeciwzapalne dzialanie rumianku tlumaczone jest terpenoidami o charakterze lipoidów j (kamazulen, a-bisabolol, tlenki bisabolola) (O. Isaak: Planta Med. 35, 118 (1979). Przez pomiar dzialania przeciwzapalnego nosników dzialania mozna bylo ustalic, ze ich wartosci ED50 lezaprzy dawce 1465-3164 mg/kg. Pomiedzy rzeczywistym stezeniem substancji czynnej w surowcu roslin¬ nym i preparacie z jednej strony i dzialaniem leczniczym przypisanym substancjom czynnym istnieje widoczna róznica (Verzirne Petri G.; Marczal J.: Herba Hung. 15 (2) 69, (1976).Jezeli dowiedzione jako nosniki dzialania zwiazki typu lipidów zle rozpuszczaja sie w wodzie, powstaje pytanie: dlaczego one moga byc najwazniejszymi skladnikami herbat i preparatów przygotowanych z woda? Jest wiele gatunków roslin stosowanych jako rosliny lecznicze albo nie traktowanych jako rosliny lecznicze, z których nie mozna bylo uzyskac skladników o dzialaniu przeciwzapalnym. Naleza do nich na przyklad gatunki Tilia, Malva, Plantago, Linum usitatissi- mum, Trigonellafoenum-graecum i Cydonia oblongara.Z brytyjskiego opisu patentowego nr 2 008 408 znany jest srodek do zmniejszania zgagi spo¬ wodowanej zawracaniem soków zoladkowych, skladajacy sie z wodnego roztworu sluzu, roslin¬ nych polisacharydów, na przyklad sluzu roslinnego nasion pigwy, w którym chodzi o nadajaca sie do pica substancje, która stanowi ciecz przy wartosci pH wyzszej od pH zawartosci zoladka, a która przy wartosci pH odpowiadajacej zawartosci zoladka ludzkiego tworzy zel, oraz z dopuszczalnej fizjologicznie cieczy o niewielkiej gestosci, takiej jak olej roslinny, która obniza ciezar wlasciwy srodka ponizej ciezaru wlasciwego zawartosci zoladka, tak ze wytworzony w zoladku zel plywa na powierzchni zawartosci zoladka. Wytwarzanie tego srodka polega na ekstrahowaniu sluzu z nasion zapomoca goracej wody i oddzieleniu wodnego sluzu od pozostalosci nasion. Przy czym wszystkie polisacharydy przechodza do sluzu roslinnego, tak ze wieksza czesc zawartych w nim polisachary¬ dów ma tylko niewielki ciezar czasteczkowy lezacy ponizej 75000, podczas gdy im mniejszy jest ciazar czasteczkowy, tym lepsza jest rozpuszczalnosc w wodzie.Z opisu patentowego RFN nr 876 305 jest znany sposób wytwarzania tarapeutycznie czynnych peraparatów roslinnych, które obok rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w wodzie substancji czynnych zawieraja tez olejki eteryczne i substancje zapachowe, w którym surowce roslinne po uprzedniej obróbce mechanicznej, przy zastosowaniu dodatkowych saponin, srodkówsieciujacych i emuglujacych lub podobnie dzialajacych substancji, doprowadza sie do postaci hemogenicznego, koloidalnego roztworu lub emulsji i nastepnie oddziela calkowicie lub w wiekszej czesci nierozpu¬ szczalne substancje stale roslin na przyklad za pomoca zespolu filtrów. Opisane jest tam tez dzialanie przeciwzapalne tak otrzymanychproduktów.Na skutek zastosowania saponin, srodków sieciujacych i emuglujacych lub substancji dzialajacych podobnie do wyciagu przechodza jednak takze substancje nierozpuszczalne w wodzie i niskoczasteczkowe polisacharydy o ciezarze cza¬ steczkowym ponizej 75000, jak tez olejki eteryczne i substancje zapachowe o niskim ciezarze czasteczkowym wynoszacym okolo 700-800. Poniewaz nie jest przewidziane stracanie frakcji, pozostaja one w wyciagu. Ma to ten skutek, ze produkty otrzymane tym sposobem maja tylko niewielkie dzialanie przeciwzapalne o wartosci ED50 wynoszacej 1500 do 3000 mg/kg.Z francuskiego opisu patentowego nr 2 426 M, znane sa wodne lub wodno-glicerynowe wyciagi z roslin prawoslazu (Althaea officinalis) jako srodki lecznicze na przyklad do leczenia zapalen. Poniewaz znów nie nastepuje wytracanie frakcji, wszystkie polisacharydy przechodza do143 397 3 wyciagu tak, ze wieksza czesc polisacharydów sposród nich posiada niskie ciezary czasteczkowe ponizej 75 000. Wynika to bezposrednio z informacjipodanej na str. 2, lewa szpalta, wiersze 14, do 15, gdzie jest powiedziane, ze produkty ulegaja reakcjom charakterystycznym dla cukrów Cs (nie wystepuje to jednak po kwasowej hydrolizie), które maja jednak ciezar czasteczkowy okolo 150.Dlatego dzialanie przeciwzapalne tych produktów jest znów tylko niewielkie i wartosc EDso wynosi 1500 do 3000. Poza tym proste wyciagi wodne lub wodno-glicerynowe otrzymywane tym sposobem maja po roku bardzo róznorodne dzialanie na pozywki i stan wegetatywny roslin, dlatego tez nie byly odpowiednie dla praktycznego sporzadzania leków.Z brytyjskiego opisu patentowego nr 878 430 znany jest material polisacharydowy, który otrzymuje sie z roslin sasafras, toznaczy okreslonego gatunku Lorbeer, orazsposóbjego otrzymy¬ wania. Wedlug tego sposobu material roslinny najpierw ekstrahuje sie woda i wodny wyciag traktuje sie nizszym alkoholem alifatycznym takim jak etanol, przy czym stosowany jest osad otrzymany tylko z roztworu o zawartosci 45-75% rozpuszczalnika, podczas gdy osad wytracony uprzednio z roztworu zawierajacego tylko do 45% rozpuszczalnika jest odrzucony. W zwiazku z tym odrzucany jest material zawierajacy wieksza czesc polisacharydów o wyzszym ciezarze cza¬ steczkowym, podczas gdy material zawierajacy wieksza czesc polisacharydów o niskim ciezarze czasteczkowym odprowadzany jest do stosowania i farmacji. I tak na stronie 1, wiersze 31 do 39 wymienionej publikacji podano, ze polisacharydy z tego materialu polisacharydowego maja cie¬ zary czasteczkowe od 20000 do 400000, przy czym sredni ciezar czasteczkowy wynosi okolo 100000, oraz zawieraja one galaktoze, arabinoze, ramnoze i ksyloze. Zakres ciezarów czasteczko¬ wych od 20000 do 400000 polisacharydów materialu polisacharydowego wedlug wymienionej publikacji wykazuje, ze ten material polisacharydowy zawiera polisacharydy o ciezarze czastecz¬ kowym duzo nizszym od 50000. Wynika to tez z podanego sredniego ciazaru czasteczkowego, wynoszacego 100 000, poniewazjak wynika z doswiadczenia ciezar czasteczkowy polisacharydów w roslinachjest rozdzielony zgodnie z krzywa podzialu wedlug Gausa tak, zeprzy srednim ciezarze czasteczkowym 100 000jest wykluczone, zeby nie wystepowaly polisacharydy o ciezarze czastecz¬ kowym ponizej 75 000. Ponadto uzyskuje sie, bez uprzedniej hydrolizy kwasowej, galakoze, arabi¬ noze, ramnoze i ksylaze, które maja ciezary czasteczkowe okolo 150. Jako dzialanie farmakologi¬ czne produktów wedlug opisanej publikacji podaje sie tylko dzialanie przeciwko wirusom i przeciwko lipemii, a nie mówi sie nic o dzialaniu przeciwzapalnym.W „Chemicaland Pharmacentical Bulletin" tom 25, Nr 6, czerwiec 1977, strony 1357 do 1362, opisane jest wydzielanie i oznaczanie sluzu roslinnego uzyskanego z korzeni Althaea officinalis L, przy czym dojego wytwarzania stosuje sie ekstrakcje zimna woda a nastepnie stracanie etanolem.Jako ciezar czasteczkowy produktu podano na str. 1358, wiersz 14 od dolu tej publikacji niska wartosc wynoszaca tylko 34000. Na temat dzialania farmakologicznego produktów nic sie nie mówi, a tylko dla korzeni wymienionej rosliny jest podane, ze maja one dzialanie zmiekczajace i deemulgujace oraz dzialanie przeciw kaszlowi.Z Chemical Abstracts, tom 91, nr 5,30 lipca 1979, strona 315, nr 35698 q znane sa hydrolizaty z materialu roslinnego Flos chamomillae zawierajace glikoze, fruktoze, arabinoze, ksyloze, ramnoze i kwas galakturonowy. Polisacharydy tego materialu maja jednak niski ciezar czasteczkowy wynoszacy tylko 4350.Celem wynalazku bylo wyodrebnienie z roslin juz zbadanych albo nie stosowanych jako rosliny lecznicze biologicznie czynnej, a przede wszystkim przeciwzapalnej grupy zwiazków, które po stosunkowo prostej obróbce mozna uczynic odpowiednimi do wytwarzania srodkówfarmako¬ logicznych i kosmetycznych, i których dzialanie przeciwzapalne jest porównywalne z dzialaniem przeciwzapalnym obecnie stosowanych srodków,jednak przy znacznie mniejszej toksycznosci.Sposób wytwarzania biologicznie czynnych koncentratów polisacharydów, zwlaszcza o dzia¬ laniu przeciwzapalnym, o ciezarze czasteczkowym zawartym pomiedzy 75 000 i 2000 000, z roslin nalezacych do rodzin: dyniowatych (Cucurbitaceae), motylkowych (Papilionaceae), lipowatych (Tiliaceae), wargowych (Labiatae), slazowych (Malvaceae), zlozonych (Asteraceae), baldaszko- wych (Umbelliferae), rutowatych (Rutaceae), komosowatych (Chenopodiaceae), lnowatych (Lina- ceae), rózowatych (Rosaceae) i babkowatych (Plantaginaceae), a zwlaszcza z kwiatu rumianku (Chamomillae flos), kwiatu lipy (Tiliae flos), korzenia bialego slazu (Altheae radix), liscia i kwiatu4 143 397 slazu (Malvae folium et flos), slazu ogrodowego (Malvae arborease herba), liscia babki (Plantaginis folium), nasionplesznika (Psyllii semen), nasion pigwy (Cydoniae semen), siemienia lnianego (Lini semen), nasion jaskra greckiego (Trigonellafoenigraeci semen), owocu dyni (Cucurbita maximae fructus), ziela Kitaibelle vitifolia lub ich mieszaniny poprzez maceryzacje woda i wytracanie alkholem, znamienny tym, ze suszony lub swiezy, ewentualnie potraktowany uprzednio rozpu¬ szczalnikiem ogranicznym, surowiec roslinny maceruje sie z woda w stosunku 1:5-20 w ciagu 1-24 godzin, w temperaturze 15-40°C, oddziela sie przez wirowanielub filtrowanie faze stala, ewentual¬ nie z czesci cieklej w temperaturze 40-80°C oddziela sie osad bialek, a nastepnie dodaje sie 1:3 objetosci alkoholi zawierajacych 1-3 atomów wegla, aceton lub 1-3 wartosciowe kationy, wytraca¬ jac koncentrat polisacharydów, który oddziela sie od fazy wodnej za pomoca wirowania i/lub filtrowania i ewetualnie otrzymany surowy produkt oczyszcza sie przez wielokrotne wytracanie z alkoholu.Korzystnie swieze rosliny lub nawodnione suszone rosliny miele sie lub rozdrabnia, odciska otrzymana breje, pozostalosc po odcisnieciu ponownie traktuje sie woda i ponownie odciska.Surowy koncentrat polisacharydów rozpuszcza sie korzystnie w 30-40 krotnej ilosci wody, w temperaturze 50-75°C, roztwór oczyszcza sie przez odwirowanie, a nastepnie filtruje sie pod cisnieniem przez filtr membranowy przepuszczajacy substancje o ciezarze czasteczkowym ponizej 75000, a z roztworu pozostalego po wysokoczasteczkowej stronie filtra wytraca sie alkoholem polisacharydy.Szczególnie korzystny pod wzgledem dzialania przeciwzapalnego polisacharyd wytwarzany z dyni (Cucurbita maximae fructus) wykazuje nastepujace cechy: Ciezar czasteczkowy powyzej 300 000, zawartosc azotu najwyzej 3%, zawartosc fosforu (wyra¬ zona jako P2O5) najwyzej 5%, pozostalosc po prazeniu najwyzej 20%, zawartosc redukujacych cukrów co najmniej 30%, calkowita zawartosc cukrów co najmniej 60%, po kwasowej hydrolizie zawiera zasadniczo glukoze, galaktoze i kwas uronowy jako dzialanie przeciwzapalne w próbie obrzeku wywolanego karagenina na lapie szczura przy dawce 10 mg/kg wynosi co najmniej 50%.Podobnie korzystny jest polisacharyd wytworzony z nasion jaskra greckiego (trigonella foeni¬ graeci semen); jego ciezar czasteczkowy wynosi powyzej 100000, zawartosc azotu najwyzej 3%, zawartosc fosforu (wyrazona jako P2O5) najwyzej 4%, pozostalosc po prazeniu najwyzej 5%, zawartosc cukrów redukujacych co najmniej 50%, calkowita zawartosc cukrów co najmniej 70%, po kwasowej hydrolizie zawiera glównie galaktoze i mannoze, dzialanie przeciwzapalne (dawka 10 mg/kg) w wymienionej próbie obrzeku wynosi co najmniej 40%.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku koncentraty polisacharydów moga zawierac ewen¬ tualnie znane, niestereoidowe substancje przeciwzapalne, zwlaszcza indometacyne i kwas acetylo¬ salicylowy wzglednie jego pochodne oraz poza tym zwykle nosniki i srodki ulatwiajace preparowanie.Przeciwzapalne dzialanie wytworzonych sposobem wedlug wynalazku koncentratów polisa¬ charydów badano wedlug metody C. A. Winter i inni (Proc. Soc. Exp. Biol. Meld. 111, 544 /1962) w próbie obrzeku wywolanego karagenina na lapie szczura.Badania farmakologiczne dowiodly poza tym, ze koncentraty polisachyrydów wzglednie ich czynna substancja przeciwzapalna dzialaja przez wplyw na faze chininowa zapalenia. Jak wia¬ domo, w rozwoju obrzeku wywolanego karagenina rozróznia sie trzy fazy: faza aminowa (hista¬ mina, serotonina), faza chininowa (bradychinina) i faza prostaglandynowa/PG). Dla wytworzenia fazy prostaglandynowej, od wstrzykniecia karageniny wywolujacej zapalenie wymagane jest 5 godzin. Koncentraty polisacharydów wytworzone sposobem wedlug wynalazku nie hamuja syn¬ tezy prostaglandyny, poniewaz nie wykazuja one dzialania wrzodotwórczego. Tonalezy szczegól¬ nie podkreslic dlatego, ze niesteroidowe srodki przeciwzapalne oraz srodki przeciwreumatyczne — które przejawiaja swe dzialanie przeciwzapalne przez hamowanie enzymu syntezy prostaglandyn — powoduja w zoladku i jelicie wrzody.Jezeli niesteroidowe srodki przeciwzapalne, w pierwszym rzedzie indometacyne i pochodne kwasu acetylosalicylowego, polaczy sie z polisacharydami wytworzonymi sposobem wedlug wyna¬ lazku, wówczas mozna usunac dzialanie wrzodotwórcze tych substancji czynnych. Toksykologi¬ czne badania wykazaly, ze dla koncentratów polisacharydów wytworzonych sposobem wedlug wynalazku — na szczurach i myszach — charakterystyczna jest nadzwyczaj stroma krzywa143397 5 dzialania dawki. Podawana sródotrzewnowo przez 8 dni trzecia wzglednie dziesiata czesc ostrej dawki LD50 nie prowadzila praktycznie dp smierci ani u szczurów, ani u myszy.Koncentratywytworzone sposobem wedlug wynalazku wykazuja znakomita aktywnosc wlas¬ ciwa i w zwiazku z tym nadzwyczaj korzystne dzialanie przeciwzapalne przy zadziwiajaco niskiej toksycznosci. Stosowanyjako wzorzec fenylobutazon, przy dawce 100 mg/kg powodowal hamo¬ wanie wynoszace 45%, natomiast w przypadku koncentratów wytworzonych sposobem wedlug wynalazku przy takiej samej dawce hamowania wynosilo 70-80%. Podobnie korzystne wartosci uzyskano przy porównaniu z indometacyna.Biologiczne dzialanie mozna przedstawic prosto w ten sposób, az koncentraty wytworzone sposobem wedlug wynalazku przeprowadza sie w roztwór o stezeniu 0,5%. Roztwórten nadaje sie do plukania jamy ustnej i gardla (Pharyngitis, Gingivitis), do plukania oczu (Coniunctivitis), przy schorzeniach zapalnych zewnetrznych dróg sluchowych do plukania wzglednie wprowadzania paska gazy nasyconego roztworemjako kompresu. Kapiel nasiadowa przyrzadzona zpolisachary¬ dów okazala sie skuteczna do leczenia Fissuraani, Nodus hemorrhoidales, Vaginitisi Vulvovagini- tis, a oklady stosuje sie przy peknieciach brodawki sutkowej (Rhagad) i przy zapaleniu skóry.Ponizszeprzyklady wykonania obajsniajablizej wyodrebnianie polisacharydów wedlug wyna¬ lazku oraz ich dzialanie farmakologiczne.Przyklad I. 200g swiezych kwiatów rumianku homogenizuje sie przy jednoczesnym wod¬ nym rozdrabnianiu w 400 ml wody. Mieszanine pozostawia sie do odstania na 20 godzin w temperaturze 20°C. Wodna faze oddziela sie przez odwirowanie, stale substancje pozostale wcieczy usuwa sie przez saczenie. Do tak otrzymanego wodnego wyciagu dodaje sie przy mieszaniu 1000 ml metanolu. Wytracona substancje odsacza sie, przemywa metanolem i potem suszy.Takotrzymuje sie 0,3 g koncentratu polisacharydów. Jezeli do wytracenia zamiast metanolu uzyje sie 1000 ml etanolu, wówczas otrzymuje sie 0,32 g koncentratu polisacharydów.Przyklad II. 200g suchych kwiatów rumianku rozdrabnia sie w 1000ml wody, po czym mieszanine pozostawia sie do odstania przez 2 godziny w temperaturze 20°C. Faze wodna oczy¬ szcza sie przez odwirowanie i przesaczenia, a potem zadaje 2500 ml metanolu. Wytracony osad odsacza sie i przemywa metanolem. Otrzymuje sie 2,12 g koncentratu polisachyrydów.Przyklad III. 200 g swiezych kwiatów rumianku miele sie i przemial odciska. Pozostalosc z odcisniecia moczy sie w 200 ml wody przez godzine w temperaturze 20°C i potem ponownie odciska. Polaczone fazy wodne saczy sie i nastepnie przy mieszaniu zadaje 600 ml metanolu.Wytracony osad odsacza sie, przemywa metanolem i nastepnie suszy. Otrzymuje sie 0,26 gkoncen¬ tratu polisacharydów.Przyklad IV. Postepuje sie w sposób opisany w przykladzie III z ta róznica, ze wyciag wodny zadaje sie 2000 ml acetonu jako srodka stracajacego. Odsaczony osad przemywa sie acetonem i suszy. Otrzymuje sie 2,43 g koncentratu polisacharydów.Przyklad V. 200g suchych kwiatów lipowych rozdrabnia sie na mokro z 1500ml wody.Potem mieszanine pozostawia sie do odstania przez 3 godziny w temperaturze 20°C. Po odsaczeniu wyciag wodny przerabia sie w sposób opisany w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,86 g koncentratu polisacharydów.PrzykladVI. 200 g swiezych kwiatów lipowych przerabia sie w sposób opisany w przykla¬ dzie III. Otrzymuje sie 0,62 g koncentratu polisacharydów.Przyklad VII. Poddaje sie mieleniu 2000g suchych kwiatów lipowych i przemial pozosta¬ wia do odstania przez 24 godziny w 5000 ml 60% metanolu, w temperaturze 20°C. Nastepnie oddziela sie stala substancje przezprasowanie i saczenie, a potem suszy w temperaturze pokojowej.Do wysuszonego materialudodaje sie 28litrówwody, calosc miesza sie wtemperaturze 20°C przez 24 godziny, po czym usuwa sie faze wodna przez odwirowanie. Do fazy wodnej dodaje sie przy mieszaniu 56 litrów etanolu. Wytracony osad odsacza sie, przemywa etanolem i suszy. Tak otrzymuje sie 47,18 g koncentratu polisacharydów. Koncentrat ten rozpuszcza sie w 500 ml wody i oczyszcza przez ponowne wytracenie za pomoca 1000 ml metanolu. Otrzymuje sie 32,64 g oczy¬ szczonego koncentratu polisacharydów.Przyklad VIII. 7,8g swiezych pestek pigwy moczy sie przez 24 godziny w 50ml wody, w temperaturze + 4°C. Potem saczy sie mieszanine i do fazy wodnej dodaje przy mieszaniu 100 ml metanolu. Wytracony osad odsacza sie, przemywa metanolem i potem suszy. Otrzymuje sie 2,4 g koncentratu polisacharydów.6 143 397 Przyklad IX. 200 g suchego siemienia lnianego ekstrahuje sie 500 ml wody przez 2 godziny w temperaturze + 36°C. Po przesaczeniu do fazy wodnej dodaje sie 100 ml metanolu. Wytracony osad oddziela sie, przemywa metanolem i suszy.Otrzymuje sie 6,79 g koncentratu polisacharydów.Przyklad X. 200 g korzeni bialego sluzu rozdrabnia sie w swiezym stanie na kawalki i moczy przez 4 godziny w 400 ml wodyprzy temperaturze 20°C. Fazewodna oddziela sie przez odwirowa¬ nie i przy mieszaniu zadajeja 800 ml etanolu. Wytracony osad odsacza sie, przemywa etanolem i suszy. Otrzymuje sie 0,34g koncentratu polisacharydów.Przyklad XI. 32kg swiezej rosliny Kitaibela vitifolia herba rozdrabnia sie w 32 litrach wody, a nastepnie breje odciska przy nadcisnieniu 22,54 MPa. Otrzymuje sie 50 litrów odcisnietego soku. Sok ten ogrzewa sie do temperatury 75°C, po czym usuwa sie wytracone bialko przez odwirowanie. Ciekla faze zageszcza sie do objetosci 2 litrów pod zmniejszonym cisnieniem. Do pozostalej objetosci dodaje sie przy mieszaniu 14 litrów metanolu. Mieszanine pozostawia sie do odstania na 24 godziny. Osad oddziela sie przez odwirowanie, przemywa go metanolem i suszy w temperaturze 60°C. Otrzymuje sie 87,0 koncentratu polisacharydów.Przyklad XII. 1 kg nasion Trigonella foenum-graecum (jaskier grecki) rozdrabnia sie w mlynku mlotkowym zaopatrzonym we wkladke rusztowa o wymiarze oczka 2 mm. Przemial miesza sie przez 6 godzin z 8,7 litrami wody wodociagowej przy temperaturze 23°C. Nastepnie wyciag wodny oddziela sie w wirówce do oddzielania osadów. Otrzymuje sie 5 litrów wodnego roztworu, który ogrzewa sie do temperatury 72°C, przy czym wytraca sie bialko. Usuwa sieje po ochlodzeniu przez odsaczenie. Do przesaczu dodaje sie przy mieszaniu 5 litrów n-propanolu.Mieszanine pozostawia sie do odstania w temperaturze pokojowej przez 13 godzin, a potem odwirowuje. Osad miesza sie 0,5 litra n-propanolu, rozdrabnia w srodowisku wodnym, a potem ponownie odwirowuje. Oddzielona substancje stala suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 45°C. Otrzymuje sie 50,0 g koncentratu polisacharydów.Przyklad XIII. 1 kg dyni oczyszczonej zlupin i pestek (Cucurbita maximae fructus) traktuje sie w udarowym mlynku tarczowym w temperaturze 20°C 1,5 litrami wody wodociagowej. Otrzy¬ mana breje odciska sie w prasie hydraulicznej przy nadcisnieniu 12,74 MPa. Sok z odcisniecia saczy sie przez plytke filtracyjna Sektz'a K-5. Otrzymuje sie 1500 ml przesaczu, który zageszcza sie w temperaturze 40°C pod zmniejszonym cisnieniem do zawartosci suchej substancji 40%. Do zage¬ szczonego przesaczu dodaje sie przy mieszaniu 300 ml 96% etanolu. Mieszanine zawierajaca osad pozostawia sie do odstania w temperaturze pokojowej 12godzin. Nastepnie odsacza sie substancje stala, rozciera ja ze 100 ml 96% etanolu, saczy i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Otrzymuje sie 3,0 g koncentratu polisacharydów.Przyklad XIV.200g wysuszonych lisci slazu ekstrahuje sie 1 litrem wody.Wodnyekstrakt pozostawia sie do odstania na 2 godziny, a nastepnie przerabia przez odcisniecie fazy wodnej, odwirowania odcisnietego soku i przesaczenia go. Do klarownego ekstraktu wodnego dodaje sie przy mieszaniu 2 litry metanolu. Wytracony osad odsacza sie i przemywa metanolem. Otrzymuje sie 2,0 g koncentratu polisacharydów.Jezeli jako material wyjsciowy uzyje sie nie tylko wysuszone liscie slazu lecz wysuszone i zmielone w takiej samej ilosci, wówczas otrzymuje sie 3,5 g koncentratu polisacharydów.Gdy wyjdzie sie z wysuszonego i zmielonego slazu ogrodowego, otrzymuje sie 1,0 g koncen¬ tratu polisacharydów.Przyklad XV.200 g wysuszonych i zmielonych lisci babki przerabia sie w sposób opisany w przykladzie XIV. Otrzymuje sie 0,5 g koncentratu polisacharydów.Przyklad XVI. 200 g nasion plesznika ekstrahuje sie 500 ml wody.Dalej postepuje sie, jak w przykladzie XIV. Otrzymuje sie 10,0 g koncentratu polisacharydów.Przyklad XVII. 200g wysuszonych kwiatów lipowych ekstrahuje sie w sposób opisany w przykladzie V. Do klarownego ekstraktu wodnego dodaje sie przy mieszaniu 30 g wodorotlenku barowego. Wytracony osad odsacza sie i przemywa najpierw alkoholem, a potem wodnym roztwo¬ rem siarczanu sodowego. Otrzymuje sie 2,5 g koncentratu polisacharydów.Proces opisany w niniejszym przykladzie powtarza sie, stosujac jednak zamiast wodorotlenku barowego siarczan amonowy w ilosci 45 g. Osad odsacza sie i przemywa alkoholem. Otrzymuje sie 2,0 g koncentratu polisacharydów.143397 7 Przyklad XVIII. Mieszanine zlozona z 200 g wysuszonych i zmielonych kwiatów slazu oraz 200g wysuszonych i zmielonych ilosci babki ekstrahuje sie 2 litrami wody.Ekstrakt przerabia sie w sposób opisany w przykladzie XIV. Otrzymuje sie 2,7 g koncentratu polisacharydów.Przyklad XIX. Dynie (Cucurbita maximae fructus) o ciezarze 10kg, która zawiera 15% suchej substancji, 4% redukujacych i 5% nieredukujacych cukrów oraz 3,0% polisacharydów, tnie sie i oczyszcza od pestek. Takprzygotowana dynie przerabia sie w udarowym mlynku tarczowym na breje, która rozciencza sie 10 litrami wody.Otrzymana mieszanine ogrzewa sie przy mieszaniu do temperatury 35°C i przy energicznym mieszaniuutrzymuje sie w tej temperaturze przez godzine.Breje pozostawia sie na 6 godzin celem odstania, a nastepnie odciska sieja. Otrzymuje sie 12 litrów soku z odcisniecia. Pozostalosc z odcisniecia rozpraszasie w 10 litrach wody wodociagowej, miesza przez godzine i ponownie odciska. Znowu otrzymuje sie 12 litrów soku z odcisniecia. Polaczone soki z odcisniecia mieszajac ogrzewa sie do temperatury 60°C. Wytracony osad bialkowy usuwa sie przez odwirowanie. Odwirowany roztwór saczy sie przez bibule filtracyjna Seitz*a K-5 i osad odrzuca. Klarowny roztwór odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 60°C do zawartosci suchej substancji 10-20%. Zageszczony roztwór ochladzasie do temperatury pokojowej i odwirowuje, przy czym osad odrzuca sie. Do roztworu dodaje sie podwójna objetosc metanolu.Roztwór zawierajacy osad pozostawia sie do odstania na 24 godziny w temperaturze pokojowej.Klarowna górna faze dekantuje sie i odlewa. Roztwór zawierajacy osad poddaje sie odwirowaniu.Osad rozdrabnia sie w 500 ml metanolu, apotem odwirowujei przemywajeszcze 2 razy metanolem.Po trzecim rozdrobnieniu osadu roztwór z osadem podaje sie na spieczona plytke szklana i odciaga lug macierzysty.Wilgotny z odciagniecia bialy osad rozdrabnia sie z 10 krotna iloscia destylowanej wody.Otrzymany roztwór ogrzewa sie przy mieszaniu do temperatury 75°C i jeszcze na goraco odwiro¬ wuje. Do oczyszczonego roztworu dodaje sie przy mieszaniu 3-krotna objetosc metanolu. Miesza¬ nine pozostawia sie do odstania w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.Potem odwirowuje sie, osad rozdrabnia w 300 ml metanolu i ponownie odwirowuje. Takie przemycie metanolem powtarza sie jeszcze dwa razy. Po trzecim przemyciu osad przenosi sie na odsysajacy filtr pró¬ zniowy, odsacza i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Otrzymuje sie 21,1 g bialego, sproszkowanego koncentratu polisacharydów.W celu dalszego oczyszczania polisacharyd rozpuszcza sie w temperaturze 50°C w 600 ml destylowanej wody, roztwór odstawia sie na godzine dla odstania, a potem odwirowuje. Klarowny roztwór saczy sie przez filtr membranowyprzy nadcisnieniu 0,49 MPa(Diaflo XM 300, wytwórca: Amicon Co., USA), który zatrzymuje zwiazki o ciezarze czasteczkowym powyzej 75000. Na wysokoczasteczkowej stronie filtra membranowego rozciencza sie roztwór 3-krotna objetoscia destylowanej wody, potem powtarza sie proces saczenia cisnieniowego. Wreszcie roztwór pozo¬ staly na wysokoczasteczkowej stronie filtra poddaje sie odwirowaniu i otrzymany klarowny roztwór zadaje sie przy mieszaniu 3-krotna iloscia metanolu. Mieszanine pozostawia sie do odstania w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Osad odciaga sie na filtrze prózniowym i suszy w temperaturze 40°C pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 13,2g oczyszczonego koncentratu polisacharydów.Przyklad XX. 10 kg nasion jaskra grekiego (Trigonellafoenum graecum) rozdrabnia sie w mlynku mlotkowym z wkladka rusztowa o wymiarze otworu 3 mm. Przemial miesza sie z 40 litrami wody o temperaturze 35°C i calosc dalej miesza przez 6 godzin, po czym oddziela sie w separatorze faze ciekla od fazy stalej. Ekstrakcje powtarza sie 30 litrami wody wodociagowej w temperaturze 35°C w ciagu 3 godzin.Polaczone ekstrakty wodne ogrzewa sie do temperatury 60°C i potem oczyszcza przez odwi¬ rowanie i saczenie. Do fazy cieklej dodaje sie podwójna objetosc 96% etanolu, mieszajac przy tym intensywnie. Przerób prowadzi sie w sposób opisany w przykladzie XIX. Otrzymuje sie 180g koncentratu polisacharydów.Po kwasowej hydrolizie mozna wykazac galakozei mannoze. Wielkokrotna czesc koncentra¬ tów polisacharydów wytworzonych wedlug przykladów I-XX podano na kolumne wypelniona Sephadex G 75 i poddano analizie. Uzyskano nastepujace wyniki: — ciezar czasteczkowy 75 000-2 000 000 — zawartosc azotu najwyzej 5%, a zawartosc fosforu (wyrazona jako P2O5) najwyzej 5%, — pozostalosc po prazeniu najwyzej 25%8 143 397 — zawartosc cukrów co najmniej 60%, w tym co najmniej 30% cukrów redukujacych, — po kwasowej hydrolizie mozna wykazac co najmniej dwa ze skladników takich, jak glikoza, galaktoza, ksyloza, ramnoza, arabinoza, albo kwas uronowy, — dzialanie przeciwzapalne, zmierzone w próbie obrzeku wywolanego karagina na lapie szczurajest porównywalne pod wzgledem rzedu wielkosci z dzialaniem fenylobutazonu lub indo- metacyny, — oznaczone na myszach p.o. wartosci LD50 wynosza powyzej 3000 mg/kg ciezaru ciala.Przyklad XXI. W celu wytworzenia przeciwzapalnych czopków otrzymany wedlug przy¬ kladu XIX koncentrat polisacharydów rozdrabnia sie na czastki o wielkosci 1-5 mm. Czopki na bazie lanoliny (Adeps solidus) Pharmacopes Hungarica VI. Ed. VII. tom 1) zawierajacej 5-30% masla kakaowego (Butirum cacao) wylewa sie w temperaturze 40°C. Kazdy czopek o ciezarze 3 g zawiera 0,5 g mikroczasteczkowego polisacharydu.Przyklad XXII. W celu wytworzenia zelu do stosowania zewnetrznego 3% wodny roztwór Carbopol'u 934 doprowadza sie do pH 7 przy uzyciu 1N lugu sodowego. Do wodnego roztworu dodano uprzednio 3% koncentratu polisacharydów wytworzonego wedlug przykladu XIX. Zel konserwuje sie dodatkiem 0,5% kwasu sorbinowego albo 0,1% nipeginy.Przyklad XXIII. Dla wytworzenia masci rozpuszcza sie w wodzie srodek konserwujacy,jak w przykladzie XXII i 5% koncentratu polisacharydów wytworzonego wedlug przykladu XX.Roztwór ten dodaje sie do 1000 Unguentum emulsificane (sklad: lOOgkarboksyetanostearynianu, 100 g parafiny, 300 g stearynianu cetylowego, 500g Vaselinum album) i homogenizuje.Przyklad XXIV. Dla wytworzenia zawiesiny odpowiedniej do podawania doustnego, w 100 g wody rozpuszcza sie 5 g koncentratu polisacharydów wytworzonego wedlug przykladu XX.Do roztworu dodaje sie 0,12 g kwasu sorbinowego, 2,8 g tlenku magnezowego, 8 g wodorotlenku glinowego, 60 g hydrozelu metylocelulozowego i 20 g sorbitu. Mieszanine uzupelnia sie do 200 ml dwukrotnie destylowana woda.Przyklad XXV. W celu wytworzenia tabletek do podawania doustnego 0,25 g koncentratu polisacharydów otrzymanego wedlug przykladuXIX prasuje sie na tabletki razem z 0,25 g Granu¬ latom simplex o nastepujacym skladzie: 60 czesci wagowych laktozy 16 czesci wagowych sacharozy 20 czesci wagowych skrobii ziemniaczanej 2 czesci wagowe talku 2 czesci wagowe stearynianu magnezowego.Dzialanie przeciwzapalne koncentratów polisacharydów wytworzonych sposobem wedlug wynalazku badano w próbie obrzeku wywolanego karagenina na lapie szczura, po podaniu sródotrzewnowym. Jednoczesnie okreslono takze toksycznosc LD50, po podaniu sródotrzewno- wym.Uzyskane wyniki przedstawione sa w tabeli I.Tabela I Dawka Hamowanie LD50 Koncentratpolisacharydów mg/kg % mg/kg Wytworzony z rumianku (swieze kwiaty) wedlug przykladuI 50 Wytworzony z rumianku (wysuszone kwiaty) wedlug przykladuII 100 Wytworzony z kwiatu lipowego wysuszonego wedlug przykladuXVII 100 Wytworzony z korzeni bialego slazu, swieze, wedlug przykladuX 100 Wytworzony ze swiezych pestek pigwy wedlug przykladuVIII 100 Wytworzony z wysuszonego siemienia lnianego wedlug przykladuIX 100 Fenylobutazon 100 74,1 71,1 80,3 54,2 52,5 43,8 45,0 1500 1500 1000 1500 1000 1000 215143 397 9 Dzialanie przeciwzapalne niektórych koncentratów polisacharydów wytworzonych sposo¬ bem wedlug wynalazku porównywano takze eksperymentalnie z dzialaniem indometacyny. Stoso¬ wano tu taka sama próbke obrzeku, jak wyzej. Badane polisacharydy wstrzykiwano srodotrzew- nowo na godzine przed podaniem karageniny wywolujacej zapalenie. Dla porównania zasto¬ sowano podawana doustnie indometacyne. Podano ja w postaci rozproszonej w 1% metylo- celulozie przez zglebnik zoladkowy szczurom CFY wzglednie myszom CFLP, godzine przed podaniem karageniny.Podobnie postepowano przy badaniach toksycznosci. Dzialanie przeciwza¬ palne, wartosc LD50 oraz wskaznik terapuetyczny niektórych koncentratów polisacharydów przedstawione sa w tabeli II. (szczury i. p.) Tabela II Koncentrat polisacharydów Wytworzony z dyni wedlug przykladu XIX Wytworzony z lipy wedlug przykladu VII Wytworzony z jaskra greckiego wedlug przykladu XX Indometacyna (p. o.) Dzialanie przeciwzapalne ED50 mg/kg 2h 5h 0,51 0,37 2,83 2,20 2,19 1,17 3,14 2,20 LDso mg/kg 112 150 200 32 Wskaznik terapeutyczny LDso 2h 219,6 53,0 91,3 10,2 ED50 5h 302,7 68,2 180,9 14,5 W tabeli III przedstawiona jest sila dzialania koncentratów polisacharydów wytworzonych sposobem wedlug wynalazku w porównaniu z sila dzialania indometacyny. Wzgledna sile dzialania przedstawia iloraz ED50 indometacyny i ED50 polisacharydu.Tabela III Koncentrat polisacharydów Wytworzony z dyni wedlug przykladu XIX Wytworzony z lipy wedlug przykladu VII Wytworzony z jaskra greckiego wedlug przykladu XX Wzgledna po 2h 6,16 1,11 1,43 sila dzialania po 5h 5,95 1,00 1,88 W tabeli IV przedstawione jest porównanie niektórych danych farmaceutycznych koncentra¬ tów polisacharydów wytworzonych sposobem wedlug wynalazku z danymi szeroko stosowanych substancji przeciwzapalnych.Ta Koncentrat polisacharydów Wytworzony z dyni Wytworzony zjaskra greckiego Indometacyna p. o Fenylobutazon p.o.Aspiryna p.o. bela IV Dawka mg/kg 10 10 10 90 400 Dzialanie przeciwza¬ palne, % 54 40 51 40 36 LD50 mgAg 214 250 17 470 1200 Dawka LDso 0,046 0,040 0,580 0,190 0,33010 143 397 Koncentraty polisacharydów wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wykazuja znakomite dzialanie takze w przypadku przewleklych zapalen. TabelaV przedstawia dzialanie trójtygodnio- wego leczenia adjuvanter Arthritis na szczurach.Tabela V Koncentrat Dawka Dzialanie polisacharydów mg/kg przeciw¬ zapalne, % Wytworzony zdyni 50 46 Wytworzony zdyni 10 46 Wytworzony z jaskra greckiego 50 37 Fenylobutazon 50 64 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania biologicznie czynnych koncentratów polisacharydów, zwlaszcza o dzialaniu przeciwzapalnym, o ciezarze czasteczkowym zawartym pomiedzy 75000 i 2000000, z roslin nalezacych do rodzin dyniowatych (Cucurbitaceae), motylkowych (Papilionaceae), lipowa- tych (Tiliaceae), wargowych (Labiatae), slazowatych (Malvaceae), zlozonych (Asteraceae), bal- daszkowatych (Umbelliferae), rutowatych (Rutaceae), komosowatych (Chenopodiaceae), lnowa- tych (Linaceae), rózowatych (Rosaceae) i babkowych (Plantaginaceae), a zwlaszcza kwiatu rumianku (Chamomillae flos), kwiatu lipy (Tiliae flos), korzenia bialego slazu (Altheae radix), lisci i kwiatu slazu (Malvae folium et flos), slazu ogrodowego (Malvae arborease herba), lisci babki (Plantaginis folium), nasion plesznika (Psellii semen), nasion pigwy (Cydoniae semen), siemienia lnianego (lini semen), nasionjaskra greckiego (Trigonellafoeni-graeci semen), owocu dyni (Cucur- bita maximae fructus), ziela Kitaibella witifolia lub ich mieszanin, poprzez maceryzacje woda i wytracanie alkoholem, znamienny tym, ze suszony lub swiezy, ewentualnie potraktowany uprzednio rozpuszczalnikiem organicznym, surowiec roslinny maceruje sie z woda w stosunku 1:5-20 w ciagu 1-24 godzin, w temperaturze 15-40°C, oddziela sie faze stala ewentualnie z czesci cieklej oddziela sie w temperaturze 40-80°C osad bialek, a nastepnie dodaje sie 1:3 objetosci alkoholi zawierajacych 1-3 atomów wegla, aceton lub 1-3 wartosciowe kationy, wytracajac kon¬ centrat polisacharydów, który oddziela sie od fazy wodnej za pomoca wirowania i/lub filtrowania i ewentualnie otrzymany surowy produkt oczyszcza sie przez wielokrotne wytracanie z alkoholu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze swieze rosliny lub nawodnione suszone rosliny miele sie lub rozdrabnia, odciska otrzymana breje, pozostalosc po odcisnieciu ponownie traktuje sie woda i ponownie odciska. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze surowy koncentrat polisacharydów rozpuszcza sie w 30-40 krotnej ilosci wody w temperaturze 50-75, roztwór oczyszcza sie przez odwirowanie, a nastepnie filtruje sie pod cisnieniem przez filtr membranowyprzepuszczajacy substancje o ciezarze czasteczkowym ponizej 75 000, a z roztworu pozostalego po wysokoczasteczkowej stronie filtra wytraca sie alkoholem polisacharydy.\ Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 220 zl PL PL PL