FI72735B - Foerfarande foer framstaellning av anti-inflammatoriska polysackarider. - Google Patents

Description

72735

MENETELMÄ TULEHDUSTA ESTÄVIEN POLYSAKKARIDIEN VALMISTAMISEKSI

FÖRFARANDE FÖR FRAMSTÄLLNING AV ANTI-INFLAMMATORISKA POLY-SACKARIDER

Keksintö koskee biologisesti aktiivisia, erityisesti tulehdusta estäviä polysakkaridikonsentraatteja samoin kuin mainittujen konsentraattien valmistusta. Polysakkaridikonsen-traatit valmistetaan kasvilähtöaineista.

Polysakkarideilla tarkoitetaan tässä yhteydessä optisesti aktiivisia heteropolysakkarideja, Jotka koostuvat monosakka-rideista, joilla on furanoosi- tai pyranoosirakenne, jossa on eetteri- tai glykosidisidos ja Joiden happamet tai emäksiset ryhmät voivat mahdollisesti olla sitoutuneet valkuaisaineen Ja/tai peptidin kanssa (peptidoglykaaneJa tai glyko-proteiineJa).

Tulehdusta estävällä vaikutuksella tarkoitetaan tässä kaikkia vaikutuksia, Jotka voidaan todeta karrageeni-ödeema-testin avulla tai Joita ei voida Jättää lukuunottamatta.

Rotan käpälällä suoritetussa ödeematestissä aktiiviset, tulehdusta estävät aineet voivat olla reumalääkkeitä, haavauma-lääkkeitä, ulkonaisesti käytettäviä voiteita, hyytelöitä tai liuoksia, mahdollisesti myös ulkonäköä parantavia aineita. Lääketieteessä nykyisin käytetyt, tulehdusta estävät aineet sisältävät ei-luonnosta peräisin olevia steroideja, mikä aiheuttaa lukuisia sieto-ongelmia: esimerkiksi niillä on usein hormonivalkutusta, ne lisäävät organismin natriumin pidättymistä tai aiheuttavat surkastumista. Ei-steroidityyppisillä, tulehdusta estävillä aineilla on myös sivuvaikutuksia, Jotka rajoittavat niiden käyttöä. Indometaeilnilla Ja salisylaa-tilla on esimerkiksi sivuvaikutus, Joka heikentää organismin vastustuskykyä, vahingoittaa maha-suolisto-seutua, aiheuttaa sisäisiä verenvuotoja Ja mahahaavoja. Toksisten sivuvaikutusten vuoksi pyrkimykset kohdistuvat yhä enemmän luonnollisten, tulehdusta estävien aineiden löytämiseen. Senlaatuisia 2 72735 tutkimuksia harjoitetaan sitä voimakkaammin, mitä suuremman käyttöalueen tulehdusta estävät aineet ovat viimeaikoina saavuttaneet, niitähän voidaan käyttää myös kudosten hapen saannin häiriöiden, esim. sydänveritulpan hoitoon, verenkiertohäiriöiden aiheuttamiin muihin kudosvaurioiden ja esimerkiksi shokkitilojen hoitoon.

Alueilla, joilla tarvitaan tulehdusta estäviä aineita, lääketieteessä sekä kosmetiikassa, käytetään lääkekasveja ja niistä valmistettuja valmisteita. Kasvisrohtojen sekä niistä valmistettujen valmisteiden aineosat, jotka vastaavat vaikutuksesta, ovat suurimmaksi osaksi vielä tuntemattomia. Kamomillankukkaa (chamomillae flos) käytetään teen, teeseos-ten, vesi- ja liuoti opitoisten uutteiden, tisleiden (eteerinen öljy) muodossa laajalti erilaisten sairauksien parantamiseen. Otaksuttuihin ja osittain osoitettuihin rohdoksen farmakologisiin vaikutuksiin kuuluu tulehdusta estävä ja sydänlihakseen kohdistuva vaikutus (F. Auster, J. Schäfer: Arzr.eipflanzen 15*19.21; Liefe ~unger.; W. Spaich: Moderne Phytotherapie, Haug Verlag 1973). Kamomillankukkaa käytetään ensisijaisesti lääketieteessä samoin kuin kosmetiikassa ihon ja limakalvojen tulehdusilmiöiden hoitoon, nimittäin voiteisiin, kylpyihin, sisäänhengitettäviin valmisteisiin, sivel-timiin, teejuomiin, mahdollisesti vesipitoisiin lääkehau-teisiir. ja kosmetiikkaan liitettynä, vaikuttavana aineena. Kamomillaa käytetään sisäisesti katarreissa ja ruoansulatuskanavan kouristuksissa, limakalvojen, haavauman kaltaisissa sairauksissa tai niiden haavaumissa, enimmäkseen teen. muodossa. Uusien tutkimusten, mukaisesti on kamomillan. tulehdusta estävä vaikutus johdettavissa lipidi-tyyppisiin terpenoidehin (kanatsuleeni, alfa-bisabolodi, bisabololi-oksidi) (0. Isaak: Planta Med. 35» 118/ 1979)· Mittaamalla vaikuttavien aineiden tulehdusta estävä vaikutus voitiin todeta, että niiden ED^q -arvot ovat 1465-3164 Qg/kg. Rohdon ja valmisteiden tosiasiallisten vaikutuskonsentraatioiden toisaalta ja vaikuttavien aineiden hyväksi luettavan 3 72735 parantavan vaikutuksen välillä on ilmeinen ero (Verzarne Petri Q.; Marczal J,: Herba Hung. 15. (2) 69,/1976). Kun vaikutuksen kantajiksi osoitetut lipidi-tyyppiset yhdisteet liukenevat huonosti veteen, niin tulee ilmi kysymys: kuinka ne voivat olla veden kanssa valmistettavan teen ja valmisteiden tärkeimmät aineosat? On olemassa lukuisia lääkekasveina käytettyjä sekä ei-lääkekasveiksi katsottuja kasvi-laatuja, joista ei voitu saada tulehdusta estäviä komponentteja. Näihin kuuluivat esimerkiksi lajit Tiliä, Malva, Plantage, Llnum usitatissimum, Trigonella foenum - graecum, Cydonia oblongara.

Keksinnön kohteena oli eristää jo tutkituista tai lääkekasveina el-käytetyistä kasveista biologisesti vaikuttava, ennen kaikkea tulehdusta estävä yhdisteryhmä, joka suhteellisen yksinkertaisin viimeistelytoimenpitein voitiin tehdä farmakologisten ja kosmeettisten aineiden valmistukseen sopivaksi ja jonka tulehdusta estävä vaikutus on verrattavissa nykyisten, tavanomaisten aineiden vaikutukseen, kuitenkin myrkyllisyyden ollessa olennaisesti vähäisempää. Biologisesti vaikuttavat aineet voidaan keksinnön mukaisessa tarkoituksessa saada seuraavien helmojen kasveista: Cucurbi-taceae, Papilionaceae, Tillaceae, Lablatae, Malvaceae, Aster-aceae, Umbelliferae, Rutaceae, Chenopodiaceae, Linaceae, Rosaceae Ja Plantaginaceae. Esitetyistä kasveista mainittakoon erityisesti: kamomillankukka (Chamomillae flos), lehmuksenkukka (Tiliae flos), valkoisen malvan juuri (Althaeae radix), malvan lehdet ja kukat (Malvae folium et flos), värlmalva (Malvae arboreae herba), ratamo (Plantaglnis folium), kallioisen siemenet (Psyllii semen), kvitteninsiemenet (Cydomlae semen), pellavansiemenet (Lini semen), sarviapilansiemenet (Trigonella foeni-graeci semen), kurpitsa (Cucurbita maximae fructus), Kitaibela vitifoliae herba tai niiden seokset.

11 72735

Luetelluista kasviraaka-aineista Ja tuoreista samoin kuin kuivatuista, kuitenkin uudelleen vedellä käsitellyistä rohdoksista voidaan tavanomaisista uuttamismenetelmistä poikkeavalla tavalla, nimittäin ympäristön lämpötilassa ja vähäistä vesimäärää käyttäen, eristää polysakkaridi-jae, jolla on merkittävä tulehdusta estävä vaikutus. Tästä polysakkaridi- jakeesta voidaan haluttaessa saostusten Ja muiden puhdistusmenetelmien avulla valmistaa väkevöite, Joka voidaan sisällyttää lääkeainevalmisteisiin ja kosmeettisiin valmisteisiin.

Keksinnön mukaisia kasvipolysakkarideja voidaan lähemmin luonnehtia siten, että a) niiden molekyylipaino on 75 000-2 000 000, b) ne sisältävät korkeintaan 5 % typpeä (Mikrokjeldahl-menetelmä Wagner-Parnassin mukaan; unkarilainen standardi no 6830-66) ja c) fosforipentoksidina ilmaistuna korkeintaan 5 % fosforia (molybdenaatti-eikonogeenl-reagenssilla; Peae-Tracey: Moderne Methoden der Pflanzenanalyse, osa IV, s. 308, Springer-Verlag 1955, Berlin), d) niistä Jää jäljelle hehkutusjäännöstä korkeintaan 25 %, e) ne sisältävät vähintään 30 % pelkistäviä sokereita (o-toluidiinilla määritettyinä happamen hydrolyysin jälkeen; R. Richterich; Klinische Chemie, 1968, s. 233» Cargea Julk. Basel-New York), f) niiden sokerisisältö on vähintään 60 % (määritetty fenoli-rikkihappo -menetelmällä; M. Dubois; Anal. Chem. 28, s. 35, 1956), 5 72735 g) eivät sisällä käytännöllisesti katsoen yhtään aineita, joiden molekyylipaino on alle 75 000 (tutkittu molekyylisiivilä/Sephadex G 75/:llä), h) ne sisältävät happamen hydrolyysin jälkeen vähintään kaksi seuraavista komponenteista: glukoosi, galak-toosi, ksyloosi, ramnoosi, arabinoosi, uronihappo, i) rotankäpälän karrageeni-ödeema -kokeessa niillä on fenyylibutatsor.in ja indometasiinin vaikutukseen verrattavissa oleva tulehdusta estävä vaikutus, k) niiden hii-illä p.o. määritetty -arvo on suurempi kuin 3 000 mg/kg ruumiinpainoa (rotilla suurempi kuin 2 000 mg/kg ruumiinpainoa).

Tulehdusta estävän vaikutuksen suhteen erityisen suotuisalla, kurpitsasta (Cucurbita maxiraae fructus) valmistettavalla polysakkaridilla on seuraavat tuntomerkit: Molekyylipaino on yli 300 000, typpipitoisuus korkeintaan 3 fosforipitoisuus (P205:na ilmaistuna) korkeintaan 5 hehkutusjäännös korkeintaan 20 pelkistävien sokereiden määrä vähintään 30 %, kokonaissokeripitoisuus vähintään 60 happamen hydrolyysin jälkeen se sisältää pääasiallisesti glukoosia, galak-toosia ja uronihappoa, sen tulehdusta estävä vaikutus 10 mg/kg:lla karrageeni-ödeema -testissä, joka on suoritettu rotankäpälällä, nousee vähintään 50 #:iin. Yhtä suotuisa on sarviapilan siemenistä (Trigonella foeni-graeci semen) valmistettava polysakkaridi, jonka molekyylipaino on 100 000:n yläpuolella, typpipitoisuus on korkeintaan 3 fosforipitoisuus (Ρ2θ^:η^ ilmaistuna) on korkeintaan 4 hehkutusjäännös on korkeintaan 5 pelkistävien sokereiden määrä on vähintään 50 #, kokonaissokeripitoisuus on vähintään 70 #, happamen hydrolyysin jälkeen se sisältää pääasiallisesti galaktoosia ja mannoosia, tulehdusta estävä vaikutus 6 72735 (annos 10 mg/kg) mainitussa ödeematestissä on vähintään HO %.

Keksinnönmukaisten polysakkaridikonsentraattien, jotka ovat kasvialkuperää, valmistusmenetelmä perustuu siihen, että tuoreina koottuja tai kuivattuja, mahdollisesti edeltäkäsin, jollain orgaanisella liuottimena käsiteltyjä rohdoksia, joko pilkkomisen jälkeen tai sen aikana, käsitellään 0-M0 °C:ssa 1-21¾ tunnin ajan vedellä, kiinteät aineet erotetaan ja vesiosasta, siinä olevien valkuaisaineiden saostumisen jälkeen, lisäämällä alkoholeja, joissa on 3-3 hiiliatomia, asetonia tai 1-3 -arvoisia kationeja, saostetaan polysakkari-dikonsentraatti, tämä erotetaan vesijakeesta ja mahdollisesti puhdistetaan edelleen. Vedellä suoritettavaan käsittelyyn käytetään vettä rohdoksen painon suhteen 1-20-kertainen määrä. Tuoreet tai kuivatut rohdokset monissa tapauksissa Jauhetaan tai pilkotaan, saatu puuro puristetaan ja puristejään-nös uutetaan uudelleen vedellä ja sitten puristetaan uudelleen. Polysakkaridikonsentraatti saostetaan vesiliuoksesta etupäässä lisäämällä metanolia tai etanolia, sitten se liuotetaan veteen Ja saostetaan uudelleen ja puhdistetaan tällä tavalla toistetun liuottamisen Ja saostamisen Ja/tal Jollain Ci_3-alkoholilla suoritetun uuttamisen avulla. Vesiuutteessa olevan valkuaisaineJakeen poistamiseksi suoritetaan lämmitys if0—80 °C:een. Erään edullisen suoritustavan mukaan rohdos hajotetaan vettä sisältävässä väliaineessa. Kuivattu rohdos voidaan pilkkoa kuivana tai märkänä. Vesluutto voidaan myös suorittaa ilman pilkkomista, esimerkiksi kun kysymyksessä ovat siemenet tai karheasti pilkotut juurenpalaset. Vesl-uuton lämpötila voidaan jäähdyttämällä pitää noin +4 °C:ssa, kuitenkin tietyissä tapauksissa ovat lämpötilat, Jotka ovat noin + 30 °C, osoittautuneet edullisiksi.

Keskeytymätön työn loppuun suorittaminen on edullista. Tällöin lähtöaine pilkotaan märkänä, puristetaan alhaisessa 7 72735 tai korkeassa paineessa useita kertoja ja puristettu massa käsitellään mahdollisesti uudelleen vedellä. Puristettu tai uutettu ja puristamalla erotettu neste sisältää polysakka-ridijakeen. Tämä saostetaan vettä sisältävästä väliaineesta c1-3 -alkoholien tai asetonin, tai mahdollisesti 1-5 -arvoisten kationien, avulla. Yksittäisiä saostusmenetelmiä voidaan myös yhdistää. Käyttökelpoisen konsentraatin paino nousee lähtöaineen kuiva-ainepitoisuuden suhteen 0,1-10 painoprosenttiin.

Keksinnönmukaisesti valmistetut, tulehdusta estävät tuotteet sisältävät kuvatulla tavalla eristetyn polysakkaridl-väkevöitteen ja mahdollisesti tunnettuja, ei-steroidityyppi-siä, tulehdusta estäviä aineita, erityisesti indometasiinia tai asetyylisalisyylihappoa tai niiden johdannaisia sekä edelleen tavanomaisia kantaja-aineita ja formuloinnin apuaineita. Keksintömenetelmässä lääkevalmisteet voivat olla suun kautta tai parenteraalisesti annettavassa muodossa, kuten tabletteina, rakelna, kapseleina, infuusioina, emulsioina, injektioina, liuoksina, edelleen peräpuikkoina, implantablet-teina tai ulkonaisesti käytettävinä liuoksina, voiteina, salvoina tai hyytelöinä. Tulehdusta estävät valmisteet ovat käyttökelpoisia sekä lääkkeinä että kosmeettisiin tarkoituksiin, Ja ne valmistetaan sekoittamalla polysakkaridi-väkevöi-te farmaseuttisten Ja kosmeettisten valmisteiden valmistukseen tavanomaisten kantaja- Ja/tai apuaineiden kanssa ja täten tunnetulla tavalla valmistetaan tulehdusta estävä valmiste.

Keksinnönmukaisesti valmistettujen polysakkaridi-väkevöit-teiden tulehdusta estävä vaikutus tutkittiin C.A. Winter et al:n menetelmän mukaisesti (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 111, 5M/1962) karrageeni-ödeemä-testillä, rotankäpälällä. Väkevöitteet osoittivat merkittävää, spesifistä aktiivisuutta Ja siihen liittyvää, erittäin suotuisaa, tulehdusta estävää vaikutusta sekä huomiota herättävän alhaista toksisuutta. Standardina käytetty fenyylibutatsoni sai aikaan 100 rag/kg annoksena M5 %:n eston, samalla kun kekslnnönmukalset väkevöitteet samalla annoksella aiheuttivat 70-80 %:n eston. Myös indometasiiniin verrattuina arvot ovat yhtä suotuisat.

8 72735

Biologinen vaikutus voidaan osoittaa yksinkertaisesti siten, että keksinnönmukaisesti valmistetuista polysakkaridikonsent-raateista valmistetaan liuos, jonka konsentraatlo on 0,5 %· Tämä liuos soveltuu suu- ja nieluontelon huuhteluun (Pharyngitis, Gingivitis), silmien huuhteluun (Conjunctivitis), ulkoisten kuulotiehyeiden tulehduksissa huuhteluun tai käsittelyyn, jossa tiehyeeseen viedään liuokseen kastettu sideharsokaistale, joka toimii hauteena. Tämä polysakkaridien kanssa valmistettu istumakylpy on osoittautunut hyväksi fissura anin, nodus hemorrhoidalesin, vaginitiksen, vulvovaginitiksen hoidossa, kääreitä on asettu nännin revähdyksien (Rhagad) ja ihotulehdusten yhteydessä.

Keksintömenetelmän polysakkaridien eristämistä ja niiden farmakologista vaikutusta valaistaan lähemmin seuraavissa toimeenpanoesimerke issä.

Esimerkki 1 200 g tuoreita kamomillankukkia homogenoidaan 400 ml:n kanssa vettä pilkkomalla ne sananmukaisesti veden kanssa.

Seos jätetään seisomaan 20 °C:een 20 tunniksi. Vettä käsittävä osa poistetaan sentrifugoimalla, nesteeseen jääneet kiinteät aineet poistetaan suodattamalla. Samalla sekoittaen lisätään vesiuutteeseen 1 000 ml raetanolia. Saostunut aine poistetaan suodattamalla, pestään metanolilla ja sitten kuivataan. Saadaan 0,3 g polysakkaridia. Jos metanolilla suoritetun saostamisen sijaan käytetään 1 000 ml etanolia, niin saadaan 0,32 g konsentraattia.

Esimerkki 2 200 g kuivattuja kamomillankukkia pilkotaan märkinä 1 000 ml:n kanssa vettä. Sitten seos jätetään 20 °C:een seisomaan 2 tunnin ajaksi. Vettä sisältävä osa puhdistetaan sentri-fugoimalla ja suodattamalla ja sekoitetaan 2 500 ml:aan metanolia. Laskeutunut saostuma poistetaan suodattamalla ja pestään metanolilla. Saadaan 2,12 g polysakkaridi-konsent-raattia.

Esimerkki 3 9 72735 200 g tuoreita kamomillankukkia jauhetaan, sitten jauhatus-aines puristetaan. Puristejäännöstä liuotetaan 200 ml:ssa vettä, 20 °C:ssa, yhden tunnin ajan, ja se puristetaan sitten uudelleen. Yhdistetyt vesijakeet suodatetaan ja samalla sekoittaen laimennetaan 600 ml:11a metanolia. Laskeutunut saostuma poistetaan suodattamalla, pestään metanolilla ja sitten kuivataan. Saadaan 0,26 g polysakkaridi-väkevöi-tettä.

Esimerkki 4

Työskennellään esimerkissä 3 kuvatulla tavalla paitsi, että vesiuute sekoitetaan saostimena käytetyn 2 000 ml:n kanssa asetonia. Suodattamalla erotettu saostuma pestään asetonilla ja sitten kuivakaan. Saadaan 2,45 g polysakkaridi-väkevöi-tettä.

Esimerkki 5 200 g kuivattuja lehmuksenkukkia pilkotaan märkinä 1 500 ml:n kanssa vettä. Sitten seos jätetään 20 °C:een seisomaan 5 tunnin ajaksi. Suodatuksen jälkeen vesiuutetta käsitellään esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Saadaan 1,86 g polysakka-ridi-väkevöitettä.

Esimerkki 6 200 g tuoreita lehmuksenkukkia käsitellään esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Saadaan 0,62 g polysakkaridi-väkevöi-t e t tä.

Esimerkki 7

Jauhetaan 2 000 g kuivattuja lehmuksenkukkia. Jauhatusaines 10 72735 jätetään seisomaan 5 000 ml:aan 60 £:ista metanolia, 20 °C:een, 24 tunniksi. Sitten kiinteä aine erotetaan puristamalla ja suodattamalla ja kuivataan huoneenlämpötilassa. Kuivattuun materiaaliin lisätään 28 litraa vettä, seosta sekoitetaan 20 °C:ssa 24 tunnin ajan ja sitten vesijae erotetaan sentrifugoimalla. Vesijakeeseen lisätään samalla sekoittaen 56 litraa etanolia. Laskeutunut saostuma poistetaan suodattamalla, pestään etanolilla ja sitten se kuivataan. Saadaan 47,18 g polysakkaridikonsentraattia. Konsent-raatti liuotetaan 500 ml:aan vettä ja puhdistetaan saosta-malla uudelleen 1 000 ml:11a metanolia. Saadaan 32,64 g puhdistettua polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 8 7,8 g tuoreita kvitteninsiemeniä liotetaan + 4 °C:ssa, 24 tunnin ajan, 50 mlrssa vettä. Sitten seos suodatetaan ja vesijakeeseen lisätään 100 ml metanolia samalla sekoittaen. Laskeutunut saostuma poistetaan suodattamalla, pestään metanolilla ja sitten se kuivataan. Saadaan 2,4 g polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 9 200 g kuivia pellavansiemeniä uutetaan 500 ml:n kanssa vettä + 36 °C:ssa, 2 tunnin ajan. Suodatuksen jälkeen vesiosaan lisätään 1 000 ml metanolia. Laskeutunut saostuma erotetaan, pestään metanolilla ja sitten kuivataan. Saadaan 6,79 g polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 10 200 g valkoisen malvan juuria pilkotaan tuoreina ja liotetaan 20 °C:ssa, 4 tunnin ajan, 400 ml:ssa vettä.

Veeiosa erotetaan sentrifugoimalla ja laimennetaan 800 ml:11a etanolia, samalla sekoittaen. Laskeutunut saostuma 11 ' 72 735 poistetaan suodattamalla, pestään etanolilla ja sitten kuivataan. Saadaan 0,34 g polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 11 32 kg tuoretta Kitaibela vitifolia herbaa pilkotaan 30 litraan vettä, sitten liete puristetaan 230 ilmakehän ylipaineessa. Saadaan 50 litraa puristemehua. Puristemehu lämmitetään 75 °C:een, sitten laskeutunut valkuaisaine poistetaan sentrifugoimalla. Nestemäinen jae väkevöidään vähennetyssä paineessa 2 litran tilavuuteen. Tähän jäännös-tilavuuteen lisätään 14 litraa raetanolia samalla sekoittaen. Seos jätetään seisomaan 24 tunnin ajaksi. Saostuma erotetaan sentrifugoimalla, pestään metanolilla ja kuivataan 60 °C:ssa. Saadaan 87,0 g polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 12 : 1 kg Trigonella foenum-graecumin (sarviapila) siemeniä pilko taan vasaramyllyssä 2 mm:n arinaseulan lävitse. Jauhatus-ainetta sekoitetaan 8,7 litrassa vesijohtovettä 23 °C:ssa, 6 tunnin ajan. Vesiuute erotetaan tämän jälkeen vedenpoistolin-gossa. Saadaan 5 litraa vesiliuosta, tämä lämmitetään 72 °C:een, jolloin valkuaisaine saostuu; jäähdyttämisen jälkeen tämä erotetaan suodattamalla. Suodokseen lisätään 5 litraa n-propanolia samalla sekoittaen. Seos jätetään seisomaan huoneen lämpötilaan 13 tunnin ajaksi, ja sitten se sentrifu-goidaan. Saostuma sekoitetaan 0,5 litran kanssa propyylialko-holia, pilkotaan vesiväliaineessa, ja sitten se sentrifugoi-daan uudelleen. Erotettu kiinteä aine kuivataan vähennetyssä paineessa, 45 °C:ssa. Saadaan 50,0 g polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 13 - * 1 kg puhdistetun kurpitsan kuorta ja ydintä (Cucurbita 15 72735 maximae fructus) käsitelläär 20 °C:ssa 1,5 litralla vesijohtovettä. Saatu liete puristetaan hydraulisessa puristimessa, 130 ilmakehän ylipaineessa. Puristemehu suodatetaan suodatinlevyn Seitz K-5 lävitse. Saadaan 1 500 ml suodosta. Tämä väkevöidään 40 °C:n vähennetyssä paineessa 40 n kuiva-ainepitoisuuteen saakka. 140 ml:n suuruiseen jäännös-tilavuuteen lisätään samalla sekoittaen 300 ml 96 #:sta etyylialkoholia. Saostuman sisältämä seos jätetään seisomaan huoneenlämpötilaan 12 tunniksi. Kiinteä aine erotetaan suodattamalla, jauhetaan hienoksi 100 ml:n kanssa 96 Arista etyylialkoholia, suodatetaan ja väkevöidään vähennetyssä paineessa. Saadaan 3,0 g polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 14 200 g kuivattuja malvanlehtiä uutetaan 1 litralla vettä. Vesiuute jätetään seisomaan 2 tunniksi ja sitten se viimeistellään puristamalla siitä vesijae, sentrifugoimalla puriste-mehu sekä suodattamalla. Kirkkaaseen vesiuutteeseen lisätään 2 litraa metyylialkoholia samalla, sekoittaen. Laskeutunut saostuma poistetaan suodattamalla ja pestään metanolilla. Saadaan 2,0 g polysakkaridikonsentraattia.

Jos lähtöaineena ei käytetä kuivattuja malvanlehtiä, vaan kuivattuja ja jauhettuja malvankukkia käytetään sama määrä, niin saadaan 3,5 g polysakkaridikonsentraattia.

Jos lähtöaineena käytetään 200 g kuivattua ja jauhettua väri-malvaa, niin saadaan 1,0 g polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 15 200 g kuivattuja ja jauhettuja ratamonlehtiä käsitellään esimerkissä 14 kuvatulla tavalla. Saadaan 0,5 g polysakkaridikonsentraattia.

72735 13

Esimerkki 16 200 g kallioisen siemeniä uutetaan 500 ml:n kanssa vettä. Jatketaan esimerkin 14 mukaisesti. Saadaan 10,0 g polysakkaridiko nsentraattia.

Esimerkki 17 200 g kuivattuja lehmuksenkukkia uutetaan esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Kirkkaaseen vesiuutteeseen lisätään 30 g bariumhydroksidia samalla sekoittaen. Laskeutunut saostuma poistetaan suodattamalla, pestään ensin alkoholilla, sitten natriumsulfaatin vesiliuoksella. Saadaan 2,5 g polysakkaridi-konsentraattia.

Esimerkki toistetaan, kuitenkin käytetään bariumhydroksidin tilalla 45 g ammoniumsulfaattia. Saostuma poistetaan suodattamalla ja pestään alkoholilla. Saadaan 2,0 g polysakkaridi-konsentraattia.

Esimerkki 18

Seosta, jossa on 200 g kuivattuja ja jauhettuja malvanlehtiä ja 200 g kuivattuja sekä jauhettuja ratamonlehtiä, uutetaan 2 litralla vettä. Uute viimeistellään esimerkin 14 mukaisesti. Saadaan 2,7 g polysakkaridikonsentraattia.

Esimerkki 19 10 kg painavaa kurpitsaa (Cucurbita maximae fructus), joka sisältää 15 % kuiva-ainetta, 4 % pelkistäviä ja 5 # ei-pelkistäviä sokereita sekä 3»0 $6 polysakkarideja, leikataan ja puhdistetaan ytimistä. Kurpitsoista tehdään desinteg-raattorissa lietettä, tämä laimennetaan 10 litralla vettä. Seos lämmitetään 35 °C:een samalla sekoittaen ja sitä pidetään tässä lämpötilassa yhden tunnin ajan sekoittamalla 72735 1¾ sitä samalla vilkkaasti. 6-tuntisen seisottamisen jälkeen liete puristetaan. Saadaan 12 litraa puristemehua. Puriste-jäännös lietetään 10 litraan vesijohtovettä, sitä sekoitetaan yhden tunnin ajan, ja sitten se puristetaan uudelleen. Jälleen saadaan 12 litraa puristemehua. Puristemehut yhdistetään ja lämmitetään 60 °C:een samalla sekoittaen. Laskeutunut valkuaissaostuma poistetaan sentrifugoimalla. Sentrifu-goitu liuos suodatetaan suodatinpaperin Seitz K-5 läpi, sakka heitetään pois. Kirkas liuos väkevöidään vähennetyssä paineessa, 60 °C:ssa 10-20 #:n kuiva-ainepitoisuuteen. Huoneenlämpötilaan jäähdytetty jäännöstilavuus sentrifugoi-daan, sakka heitetään pois. Liuokseen lisätään kaksinkertainen tilavuus metanolia. Saostumapitoinen liuos jätetään seisomaan 24 tunniksi huoneenlämpötilaan. Kirkas yläjae dekantoidaan ja kaadetaan pois. Saostuman sisältävä liuos 3entrifugoidaan. Saostuma desintegroidaan 500 ml:aan metanolia ja sitten se sentrifugoidaan. Sentrifugoinnin jälkeen saostuma pestään vielä kaksi kertaa metanolilla. Saostuman kolmannen desintegroinnin jälkeen viedään liuos saostumineen sintterille ja emäliuos poistetaan imemällä.

Imukostea, valkoinen saostuma desintegroidaan 10-kertaisen määrän kanssa tislattua vettä. Saatu liuos lämmitetään 75 °C:een samalla sekoittaen ja sentrifugoidaan vielä lämpimänä. Puhdistettuun liuokseen lisätään samalla sekoittaen kolminkertainen tilavuus metyylialkoholia. Seos jätetään seisomaan 24 tunniksi huoneenlämpötilaan. Tämän jälkeen se sentrifugoidaan, saostuma desintegroidaan 300 ml:aan metanolia ja sentrifugoidaan uudelleen. Tämä metanolilla suoritettu pesu toistetaan vielä kaksi kertaa. Kolmannen pesun jälkeen saostuma tuodaan tyhjöimusuodattimelle, poistetaan imun avulla ja kuivataan tyhjössä 40 °C:ssa. Saadaan 21,1 g valkoista, jauhemaista polysakkaridikonsent-raattia.

15 72735

Jatkopuhdistusta varten liuotetaan polysakkaridi 50 °C:ssa 600 altaan tislattua vettä, liuos jätetään seisomaan yhdeksi tunniksi ja sitten se sentrifugoidaan. Kirkas liuos suodatetaan 5 atmosfäärin paineessa membraanisuodattimellä (Diaflo XM 500, valmistaja: Amicon Co, USA), joka pidättää yhdisteet, joiden molekyylipaino on yli 75 000. Membraanisuodat-timen suurimolekyylisellä puolella liuos laimennetaan kolminkertaisella tilavuudella tislattua vettä, sitten painesuoda-tusmenettely toistetaan. Lopuksi suodattimen suurimolekyyli-selle puolelle jäänyt liuos sentrifugoidaan ja saatu kirkas liuos laimennetaan kolminkertaisella määrällä metanolia samalla sekoittaen. Seos jätetään seisomaan huoneenlämpötilaan 24 tunniksi. Saostuma imetään pois tyhjösuodattimella ja kuivataan tyhjössä 40 ^Crssa. Saadaan 15,2 g polysakkaridiko nsentraattia.

Esimerkki 20 10 kg sarviapilansiemeniä (Trigonella foenum graecum) hienonnetaan 5 mm:n arinaseulalla varustetussa vasaramyllyssä. Jauhatusaines sekoitetaan 40 litraan vettä 55 °C:n lämpötilassa, seosta sekoitetaan 6 tunnin ajan ja sitten separaattorissa neste erotetaan kiinteästä jakeesta. Uuttaminen toistetaan 50 1:11a vesijohtovettä, jonka lämpötila on 55 °C, 5 tunnin ajan.

Yhdistetyt vesiuutteet lämmitetään 60 °C:een ja puhdistetaan sitten sentrifugoimalla ja suodattamalla. Nestejakeeseen lisätään kaksinkertainen tilavuus 96 #:sta etyylialkoholia ja tällöin seosta sekoitetaan tehokkaasti.

Työn viimeistely suoritetaan esimerkissä 19 esitetyllä tavalla. Saadaan 180 g polysakkaridiväkevöitettä.

Happamen hydrolyysin jälkeen voidaan osoittaa galaktoosi ja mannoos i.

72735 16

Tasaosa esimerkkien 1-20 mukaan valmistettuja polysakkaridi-konsentraatteja pantiin Sephadex G 75:llä täytettyihin pylväisiin ja analysoitiin. Saatiin seuraavat tulokset: molekyylipaino 75 000-2 000 000 - korkeintaan 5 £:n typpipitoisuus ja korkeintaan 5 #:n fosforipitoisuue (P20^:na ilmaistuna), - korkeintaan 25 #:n hehkutusjäännös, vähintään 60 % sokereita, joista vähintään 50 # pelkistäviä sokereita, happanen hydrolyysin jälkeen voitiin osoittaa kaksi glukoosigalaktoosi-, ksyloosi-, ramnoosi-, arabi-noosi- tai monihappokomponenteista, rotankäpälällä suoritetussa karrageeni-ödeema -testissä mitattu, tulehdusta estävä vaikutus on fenyylibutatsonin ja indometasiinin vaikutuksen suuruusluokkaan verrattavissa p.o. hiirillä määritetyt LD50 -arvot ovat yli 3 000 mg/kg ruumiinpainoa.

Esimerkki 21

Tulehdusta estävien peräpuikkojen valmistamiseksi esimerkin 19 mukaan valmistettu polysakkaridiväkevöite pilkotaan 1-5 mikronin suuruisiin osasiin. Peräpuikot valetaan 40 °C:ssa 5-30 # kaakaovoita (Butirum cacao) sisältävästä lanoliinista (Adeps solidus) (Pharmacopea Hungarica VI, julkaisu VII, nide 1). Kuhunkin 3 gin painoiseen peräpuikkoon otetaan laskuissa huomioon 0,5 g hienonnettua polysakkaridia.

Esimerkki 22

Ulkonaisesti käytettävän geelin valmistamiseksi säädetään 5 örisen Carbopolin 934 vesiliuoksen pH 1 N natronlipeällä pH 7,0:ksi. Vesiliuokseen lisättiin edeltäpäin 3 # esimerkin 19 mukaan valmistettua polysakkaridikon&entraattia. Geeli 72735 17 säilytetään 0,5 #:n kanssa sorbiinihappoa tai 0,1 #:n kanssa Nipagiinia.

Esimerkki 23

Voiteen valmistamiseksi liuotetaan veteen säilöntäaine esimerkin 22 mukaisesti sekä 5 #:a esimerkin 20 mukaan valmistettua polysakkaridikonsentraattia. Liuos lisätään 1 000 g:an Unguentum emulsificanea (koostumus: 100 g karbok-sietaani-stearaattia, 100 g parafiinia, 300 g setyylialkoho-listearaattia, 500 g vaselinum albumia) ja homogenoidaan sen kanssa.

Esimerkki 24

Suun kautta annettavan suspension valmistamiseksi liuotetaan 100 g:an vettä 5 g esimerkin 20 mukaan valmistettua polysakkaridikonsentraattia. Liuokseen lisätään 0,12 g sorbiitti-happoa, 2,8 g magnesiumoksidia, 8 g aluminiumhydroksidia, 60 g metyyliselluloosahydrogeeliä sekä 20 g sorbitolia. Seos täytetään kaksi kertaa tislatulla vedellä 200 g:an.

Esimerkki 25

Suun kautta annettavien tablettien valmistamiseksi puristetaan tableteiksi 0,25 g esimerkin 19 mukaista polysakkaridikonsentraattia 0,25 gin kanssa granulatum simplexiä, jolla on seuraava koostumus: 60 paino-osaa lakitoosia 16 paino-osaa sakkaroosia 20 paino-osaa perunatärkkelystä 2 paino-osaa talkkia 2 paino-osaa magnesiumstearaattia

KeksinnÖnmukaisten polysakkaridikonsentraattien tulehdusta 18 727 35 estävä vaikutus määritettiin rotankäpälällä suoritettavassa karrageeni-ödeema -testissä intraperitoneaalisen annostuksen jälkeen. Samanaikaisesti määritettiin myös toksisuus LD50 (i·ρ·)·

Polysakkaridikonsentraatti Annos Esto LD^q mg/kg % mg/kg

Kamomilla (tuoreet kukat)

Esimerkki 1 50 74,1 1 500

Kamomilla (kuivatut kukat)

Esimerkki 2 100 71,7 1 500

Lehmuksenkukat, kuivatut

Esimerkki 17 100 80,3 1 000

Tuoreet valkoisen malvan juuret, Esimerkki 10 100 54,2 1 500

Tuoreet kvitteninsiemenet

Esimerkki 8 100 52,5 1 000

Pellavansiemenet, kuivatut

Esimerkki 9 100 43,8 1 000

Fenyylibutatsoni 100 45,0 215

Joidenkin keksintömenetelmässä mukana olevien polysakkaridikonsentraattien tulehdusta estävää vaikutusta verrattiin kokeellisesti indometasiinin vaikutukseen. Koe oli sama ödeematesti kuin yllä. Tutkittavat polysakkaridit injisoitiin vatsaontelon sisään tunti ennen tulehduksen aiheuttaman karrageenin annostelua. Vertailuna käytettiin suun kautta annettua indometa-eiinia. Sitä annettiin CFY-rotille tai CFLP-hiirille, yksi tunti ennen karrageenin antoa, 1 $6:seen metyyliselluloosaan 19 72735 lietettynä, mahasondin avulla. Myös toksisuustutkimuksissa meneteltiin samalla tavalla. Joidenkin polysakkaridikonsent-raattien tulehdusta estävää vaikutusta, LD^q -arvoa sekä terapeuttista indeksiä on verrattu seuraavassa taulukossa (rotat i.p.)

Polysakkaridi Tulehdusta LD50- Terapeuttinen estävä vaikutus indeksi ED50 mg/kg mg/kg LD50 / ED50 2 h 5 h 2 h 5 h

Kurpitsa

Esimerkki 19 0,51 0,37 112 219,5 302,7

Lehmus

Esimerkki 7 2,83 2,20 150 53,0 68,2

Sarviapila

Esimerkki 20 2,19 1,17 200 91,3 170,9

Indometasiini per os 3,14 2,20 32 10,2 14,5

Seuraavassa sarjassa verrataan keksintömenetelmän polysakka-ridikonsentraattien vaikutusvoimakkuutta indometasiinin vaikutusvoimakkuuteen. Suhteellinen vaikutusvoimakkuus on indometasiinin ED^osn ja polysakkaridin ED5o:ri osamäärä.

Polysakkaridikonsentraatti Suhteellinen vaikutus- voimakkuus 2 h:n kuluttua 5 h:n kuluttua

Kurpitsa (esimerkki 19) 6,16 5,95

Lehmus (esimerkki 7) 1,11 1,00

Sarviapila (esimerkki 20) 1,43 1,88 20 7 2 7 3 5

Seuraavassa taulukossa verrataan keksintömenetelmän pöly-sakkaridikonsentraattien joitakin farmaseuttisia tietoja laajalti käytettyjä tulehdusta estäviä aineita koskeviin tietoihin.

Polysakkaridi- Annos Tulehdusta Annos/ konsentraatti mg/kg estävä vaikutus mg/kg LD50 %

Kurpitsa 10 54 214 0,046

Trigonella 10 40 250 0,040

Indometasiir.i per os 10 51 17 0,580

Fenyylibutatsoni per os 90 40 470 0,190

Aspiriini per os v400 36 1 200 0,330

Keksinnönmukaisesti valmistettavilla polysakkaridikonsentraa-teilla on merkittävää vaikutusta myös kroonisiin tulehdus-tyyppeihin. Taulukko ilmaisee apuaineniveltulehduksen kolmiviikkoisen käsittelyn vaikutuksen rotilla.

Polysakkaridi- Annos Tulehdusta estävä konsentraatti mg/kg vaikutus, %

Kurpitsa 50 46

Kurpitsa 10 46

Trigonella 50 37

Fenyylibu- tatsoni 50 64

Farmakologiset tutkimukset todistavat edelleen, että polysak-karidikonsentraatit tai niiden tulehdusta estävä, vaikuttava aine vaikuttavat tulehduksen kiniini-vaiheen vaikutuksen kautta. Kuten on tunnettua, erotetaan karrageeni-ödeeman 72735 21 kehittymisessä kolme vaihetta: amiinivaihe (histamiini, sero-toniini), kiniinivaihe (bradykiniini) ja prostaglandiini-vaihe (PG). PG-vaiheen kehittämiseen tarvitaan 5 tuntia laskettuna tulehduksen laukaisevan karra^eenin ruiskuttami-sesta alkaen. Keksintömenetelmän polysakkaridikonsentraatit eivät estä PG:n synteesiä, koska niillä ei ole mitään ulsero-geenista vaikutusta. Tätä täytyy korostaa erityisesti sen vuoksi, koska ei-steroidi-tyyppiset, tulehdusta estävät aineet ja reumalääkkeet - jotka saavat aikaan tulehdusta estävän vaikutuksensa estämällä PG-syntetaasi-entsyymin -aiheuttavat haavaumia mahalaukussa ja suolistossa. Kun ei-steroidityyppinen, tulehdusta estävä aine, ensisijassa indometasiini ja asetyylisalisyylihappojohdannaiset, yhdistetään keksintömenetelmän polysakkaridien kanssa, niin-voidaan tällä tavalla vähentää näiden aineiden haavaumia muodostavaa vaikutusta. Toksikologiset tutkimukset osoittavat, että keksintömenetelmän polysakkaridikonsentraateille - rotilla ja hiirillä - erittäin jyrkkä annos-vaste -käyrä on tyypillistä. Akuutin LD^q -annoksen kolmasosa tai kymmenesosa, jota annettiin i.p. yli 8 päivän ajan, käytännöllisesti katsoen ei johtanut kuolemaan rotilla eikä hiirillä.

Claims (5)

1. 22 PATENTTIVAATIMUKSET 7 2 7 3 5
2. 1. Menetelmä erityisesti tulehdusta estävien polysakkaridien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä käsitellään tuoreita tai kuivattuja tai haluttaessa orgaanisilla liuottimilla uutettuja rohtokasveja, Jotka kuuluvat heimoihin: Cucurbitaceae, Papilionaceae, Tlliaceae, Labiatae, Malvaceae, Asteraceae, Umbelliferae, Rutaceae, Chenopodiaceae, Linaceae, Rosaceae, Ja Plantaginaceae, edullisesti sukuihin tai lajeihin Chamomillae flos, Tiliae flos, Altheae radix, Malvae folium et flos, Malvae arborae herba, Plantaginis folium, Psyllii semen, Cydoniaea semen, Lini semen, Trigonella foeni-graeci semen, Cucurbita maximae fructus, Kitaibela vitifoliae herba, Daucus carottae radix, Beta vulgaris convarietas conditivae radix, käsitellään lämpötila-alueella 0 °C - 40 °C, satunnaisesti edeltävän pilkkomisen Jälkeen tai yhtäaikaa pilkkomisen kanssa vedessä 1-24 tuntia, kiinteät aineet erotetaan, nestemäisestä osasta erotetaan haluttaessa valkuaisainetyypplset aineet, Ja tämän Jälkeen polysakkaridi-konsentraatti saostetaan lisäämällä Ci_3 -alkoholeja, asetonia tai elektrolyyttejä, Jotka sisältävät 1-3 -arvoisia kationeja, tämä erotetaan vesijakeesta Ja puhdistetaan haluttaessa saostamalla vesipitoisesta väliaineesta sellaisten polysakkaridien saamiseksi a) Joiden molekyylipaino on 75 000 - 2 000 000, Ja Jotka sisältävät b) korkeintaan 5 % typpeä, c) (fosforipentoksldina ilmaistuna) korkeintaan 5 % fosforia, d) korkeintaan 25 % tuhkaa, 23 72735 e) ne sisältävät vähintään 30 % pelkistäviä sokereita Ja f) niiden kokonaissokeripitoisuus nousee vähintään 60 £:in, (happohydrolyysin jälkeen, glukoosina ilmaistuna) g) ne eivät olennaisesti sisällä yhtään aineita, Joiden molekyylipaino on alle 75 000 tutkittaessa molekyylisiivilä Sephadex F 75:llä, h) happamen hydrolyysin jälkeen ne sisältävät komponentteja, jotka kuuluvat ryhmään: glukoosi, galaktoosi, ksyloosi, ramnoosi, arabinoosi, uronihappo, ehdolla, että ne sisältävät ainakin kaksi mainittua komponenttia, i) rotankäpälällä suoritetussa karrageeni-ödeema -testissä niillä on fenyyllbutatsonin Ja indometasiinin vaikutukseen verrattavaa, tulehdusta estävää vaikutusta, k) niiden hiirillä p.o. määritetty LD^Q-arvo on suurempi kuin 3 000 mg/kg tai rotilla suurempi kuin 2 000 mg/kg.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vesikäsittelyssä käytetyn veden määrä painon mukaan on 1-20 kertainen käsitellyn kasvin painoon nähden.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että tuore kasvi tai vedellä käsitelty kuivattu kasvi jauhetaan tai pilkotaan, rouhe puristetaan, jäännöstä käsitellään vedellä Ja puristetaan toistuvasti. 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vesipitoisessa uutteessa esiintyvien proteiinityyppisten aineiden erottamiseksi uute kuumennetaan 40-80 °C lämpötilaan, Ja saatu saostuma erotetaan. 24 PATENTKRAV 727 35
5. 1. Förfarande för framställning av speciellt anti-inflammato-riska polysackarider, kännetecknad därav, att de färska eller torkade eller om önskas med organiska lösnings-medel extraherade läkeväxter, vilka hör tili stam: Cucurbitaceae, Papilionaceae, Tiliaceae, Labiatae, Malvaceae, Asteraceae, Umbelliferae, Rutaceae, Chenopodiaceae, Linaceae, Rosaceae, och Plantaglnaceae, fördelaktigaste tili släkterna eller arterna Charaomillae flos, Tiliae flos, Altheae radix, Malvae folium et flos, Malvae arborae herba, Plantaginis folium, Psyllii semen, Cydoniaea semen, Lini semen, Trigonella foenigraeci semen, Cucurbita macimae fructus, Kitaibela vltlfoliae herba, Daucus carottae radix, Beta vulgaris convarietas conditivae radix, behandlas vid en temperatur mellan 0 °C och 40 °C, tillfälligtvis efter en föreg&ende sönderdelning eller samtidigt som en sönderdelning med vatten under 1-24 tlmmar, det fasta ämnent separeras och fr&n den vattenhaltiga delen, om s& önskas efter utfällning av de protelnlika ämnena, utfälls ett polysackarldkoncentrat genom tillsats av alkoholer med 1-3 kolatomer, aceton eller elektrolyter, som inneh&ller 1-3 värda katjoner, koncentratet separeras frän vattenfasen och renas genom utfällning ur vattenhaltigt medium, om s& önskas för att producera sädana polysackarider att a) deras molekylvikt är 75 000 - 2 000 000 och de inneh&ller b) högst 5 % kväve, c) högst 5 % fosfor (uttryckt som fosforpentoxid), d) högst 25 % aska, e) minst 30 % reducerande socker,