Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania aktywnego terapeutycznie polimeru bio¬ kompatybilnego zwanego dalej w skrócie biopolimerem, wykazujacego powinowactwo do sub¬ stancji biologicznych, gdyz na jego powierzchni sa osadzone reaktywne substancje biologiczne, wiazace wybrane specyficzne czynniki chorobotwórcze lub specyficzne grupy czynników choro¬ botwórczych wystepujace w plynach ustrojowych chorego.Przebieg wielu chorób przejawia sie czesto podniesionym poziomem specyficznych protein krwi i innych czasteczek. Zjawisko to wykorzystuje sie zazwyczaj jako pomoc diagnostyczna do okreslenia rodzaju choroby i sledzenia przebiegu leczenia. W wielu przypadkach te specyficzne skladniki krwi sa posrednio lub bezposrednio odpowiedzialne za pierwotne i wtórne objawy procesu chorobowego. Choroby „samouodopornieniowe" mozna opisacjako charakteryzujace sie wystepowaniem krazacych w organizmie przeciwcial wobec endogennych substratów i protein tkankowych potrzebnych dla normalnego wzrostu i zycia organizmu. Choroby nowotworowe zwykle charakteryzuja sie niekontrolowanymwzrostem nieodrózniajacych sie, transformowanych komórek, które omijaja lub przezwyciezaja naturalne mechanizmy obronne organizmu, wytwarza¬ jac czynniki blokujace i tlumiace jego odpornosc, skladniki maskujace powierzchniowe antygeny i/lub skladniki regulatora wzrostu. Specyficzny rozdzial tych czynników chorobotwórczych na zwiazku biokompatybilnym, czyli wykazujacym powinowactwo do pewnych substancji biologi¬ cznych, oznacza przywrócenie normalnych funkcji organizmu poprzez usuniecie czynników cho¬ robotwórczych wystepujacych w procesie chorobowym.Podstawowa funkcja organów, komórek i czastek zawierajacych uklad immunologiczny jest rozpoznawanie i eliminacja z organizmu substancji obcych. Substancje obce eliminowane sa w reakcji zachodzacej pomiedzy nimi i przeciwcialami wytworzonymi w odpowiedzi na ich pojawie¬ nie sie. Zazwyczaj funkcja ta jest wykonywana skutecznie i bez szkody dla gospodarza. Jednak czasami moga wystepowac zaklócenia mogace doprowadzic do zaburzen chorobowych, takichjak np. niekontrolowana reakcja (zaburzenia alergiczne) lub nienormalna reakcja (choroba samo- uodpornieniowa). Przyczyna powstania obu tych zaburzen jest bezposrednio lub posrednio zwiazana z2 142 532 wytwarzaniem przeciwcialwykazujacych reaktywnosc krzyzowa wobec antygenów otoczenia (aler¬ genów) lub autoantygenów (antygenów pochodzenia wewnetrznego).Choroba samouodpornieniowajest stanem chorobowym powstajacym wtedy, gdygospodarz reaguje immunologicznie, wytwarzajac przeciwciala reaktywne wobec autoantygenu. Samouod- pornienie moze dotknac niemal kazda czesc ciala i zazwyczaj przejawia sie reakcja pomiedzy autoantygenem i immunoglobulina (IgM lub IgG) przeciwciala. Przykladowo, choroby samouod- pornieniowe moga objac tarczyce, nerki, trzustke, uklad nerwowy, Mone sluzowa ukladu pokar¬ mowego, gruczoly nadnercza, skóre, krwinki czerwone i torebki maziowe,jak równiez tyreoglobu- line, insuline, kwasy dezoksyrybonukleinowe i immunoglobuliny.W niektórych typach chorób samouodpornieniowych i nowotworowych stosowano z ograni¬ czonym powodzeniem niespecyficzne metody tlumienia immunologicznego, takie jak naswietlanie calego ciala promieniami X lub podawanie leków cytotoksycznych. Niekorzystne strony takiej terapii to toksycznosc uzywanych srodków i zwiekszona czestotliwosc wystepowania róznych postaci raka, szczególnie chloniaków i miesaków siateczkowo-komórkowych w wyniku stosowa¬ nia tego typu leczenia. Ponadto stosowanie niespecyficznych czynników dla czestego tlumienia reakcji i komórek znacznie zwieksza podatnosc pacjenta na powazne infekcje wywolane przez grzyby, bakterie i wirusy otoczenia, które w zwyklych warunkach nie stanowilyby problemów.Wynalazek umozliwia dzialanie specyficzne, poniewaz pozwala na usuniecie jedynie czynnika chorobotwórczego lub tych grup czynników chorobotwórczych, które sa zwiazane ze szczególnymi objawami chorobowymi i sa za nie odpowiedzialne.Przegladajac stan techniki mozna stwierdzic, ze ostatnio stosowane sa dwa sposoby podejscia do leczenia chorób samouodpornieniowych i/lub nowotworowych. Pierwszy z nich polega na podawaniu pacjentowi substancji powodujacej wytwarzanie specyficznego typu tolerancji immu¬ nologicznej. Takiestlumienie reakcjipolegajacej na wytwarzaniu przeciwcialprowadzi do toleran¬ cji atakujacego antygenu. Typowy przyklad takiego podejscia znany jest z opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 4 222 907, w którym przedstawiono sposób leczenia polegajacy na podawa¬ niu pacjentowi zwiazków sprzezonych antygenu, przylaczonych do kopolimeru kwas D-glutami- nowy i D-lizyna.Drugie podejscie to droga zewnetrzna. Sposoby leczenia przewiduja zazwyczaj usuniecie calej krwi, oddzielenie substancji komórkowych i rozpuszczalnych krwi, wymiane lub leczenie plazmy krwi i ponowna infuzje calosci przetworzonej krwi. Pierwszy przyklad tego typu przewiduje podstawienie lub wymiane plazmy na roztwory soli, cukru i/lub protein i zostal opisany przez McCullough'a i in. w „Therapeutic Plasma Exchange", Lab. Med 12/12/, str.745 (1981). Wymiana plazmy jest metoda zgrubna i wymaga duzych objetosci roztworu zastepczego. Drugim przykla¬ dem tego typu jest fizyczna i/lub biochemiczna modyfikacja plazmowej czesci krwi. Typowy, znany przyklad przedstawiono w artykule Termena i in. „Extracorporeal Immunoadsorption: Initial Experience in Human Systemie Lupus Erythematosus", The Lancet, 20 pazdziernika 1979, strony 824-826. W artykule opisano system typu hemodializy z dwoma filtrami mechanicznymi, pomiedzy którymi znajduje sie filtr DNA zawierajacy kolodionowy wegiel drzewny.Typowacecha znanych sposobówjest jedynie czesciowawobec skladników odpornosciowych specyficznosc kolumny adsorpcyjnej, poniewaz substancja weglowa w sposób niespecyficzny usuwa z przerabianej plazmy wiele waznych skladników o niskim ciezarze czasteczkowym. Drugie zastosowanie tego sposobu ilustruje artykul Termana i in. „Specyfic Bemoval of Cierculated Antigen by Means of Immunoadsorption", FBBS Letters, tom 61, nr 1, styczen 1976, strony 59-62.Ukazano w nim specyficzny sposób usuwania radioaktywnie znakowanego antygenu na blonach celulozowych poddanych uprzednio dzialaniu przeciwciala. Autor stwierdza jednak, ze blony kontrolne wykazuja znaczna zdolnosc do niespecyficznej adsorpcji protein.Trzeciezastosowanie tego sposobu podal Bansal i in. w artykule „Ex vivo Removal of Serum IgG in a Patient With Colon Carcinoma", Cancer, 42/1/, strony 1-18 (1978). Opisano w nim czesciowo specyficzna adsorpcje immunoglobuliny poprzez poddanie plazmy in vivo dzialaniu formaliny i zabitych termicznie bakterii Staphylococcus aureus. Biologiczna aktywnosc niektórych szczepów S. aureus przypisuje sie obecnej na sciance komórki czasteczce tak zwanej Proteiny A, która oddzialywuje i wiaze sie z czescia Fe IgG ssaków.Tensposób postepowania, ze wzgledu na reakcje z ugrupowaniem Fe nie pozwala na rozróznienie skladników normalnych i patologicznych142 532 3 IgG, a doswiadczalnie stwierdzono mozliwosc wystepowania powaznych skutków ubocznych takiego postepowania.Czwarte zastosowanie tego sposobu opisal Malcheskyi in. w artykule „On-lineSeparation of Marcromolecules by Hembrane FiltrationWith Cryogalation", Artif. Organs 4:205,1980. Przed¬ stawiono w nim czesciowo specyficzny sposób usuwania z plazmy substancji krioglobulinowych z zastosowaniem kombinacji metod filtracji i wymrazania. Wystepowaniei sklad osadu krioglobuli- nowego nie zawsze wskazuja na chorobe samouodpornieniowa lub nowotworowa* Kolejnyproblem wiazacy sie z obecnie znanymi sposobami polega na tym, ze bez stosowania systemu filtracji mechanicznej nie mozna usunac poszczególnych czynników chorobotwórczych w ilosciach wystarczajaco duzych do poprawienia stanu zdrowia pacjenta, poniewaz kolumny nie adsorbuja w sposób specyficzny jedynie pozadanych czynników chorobotwórczych.Aktywny terapeutycznie polimer biokompatybilny otrzymany sposobem wedlug wynalazku pozwala na wysoce specyficzne i ekonomicznie uzasadnione usuniecie czynnika chorobotwórczego droga przetwarzania krwi i/lub plazmy.Przedmiotem wynalazkujest sposób wytwarzania aktywnego terapeutycznie, biokompatybil- nego polimeru z osadzonymi na nim substancjami reaktywnymi biologicznie, polegajacy na tym, ze biokompatybilny nosnik polimeryczny zlozony z powtarzalnych jednostek co najmniej jednego monomeru wybranego z grupy obejmujacej metakrylan 2-hydroksyetylu, metakrylan glicydylu i N-winylopirolidonaktywuje sie 1-20% w stosunku wagowym bromkucyjanu lub karbodwuimidu i do zaktywowanego polimeru przylacza sie substancje biologiczna wybrana sposród kwasu folio¬ wego, insuliny i immunoglobuliny, majaca co najmniej jedna grupe funkcyjna, zdolna do reakcji z aktywowanym nosnikiem tiokompatybilnym, przy czym czasteczka przylaczanej substancji biolo¬ gicznej mataka wielkosc, zeby nie moglapenetrowac w glabnosnika, albo tez polegajacy natym, ze po aktywowaniu nosnika polimerycznego bromkiem cyjanu lub karbodwuimidem do zaktywowa¬ nego polimeru przylacza sie odstepnik wybrany z kwasu 6-aminokapronowegoi albuminy, majacy grupe reagujaca z aktywowanym nosnikiem biokompatybilnym, otrzymany uklad nosnik- odstepnik aktywuje sie 1-20% w stosunku wagowym karbodwuimidowegoczynnika aktywujacego i na aktywowanym ukladzie nosnik-odstepnik osadza sie substancje biologiczna wybrana sposród kwasu foliowego, insuliny i immunoglobuliny, majaca co najmniej jedna grupe funkcyjna zdolna do reakcji z aktywowanym ukladem nosnik polimeryczny-odstepnik.Leczenie chorób samouodpornieniowych z zastosowaniem aktywnego terapeutycznie, bio- kompatybilnego polimeru otrzymanego sposobem wedlug wynalazku polega na przepuszczaniu krwi, plazmy lub innego plynu ustrojowego pacjenta nad biosepcyficznym polimerem zawieraja¬ cym unieruchomione, reaktywne grupy biologiczne, co pozwala na usuniecie z krwi plazmy chorego okreslonych czynników chorobotwórczychi na zawróceniu tej krwi po przeprowadzonym zabiegu do organizmu pacjenta.Jakonosniki biopolimeru mozna stosowactakie materialy, które nie wywieraja niekorzystne¬ go wplywu na plyny ustrojowe, takiejak plazma lub krew ijednoczesnie pozwalaja utrzymac taka orientacje reaktywnych, unieruchomionych ugrupowan biologicznych, w której ugrupowaniate sa odchylone na zewnatrz od powierzchni nosnika polimeru. Odpowiednimi materialami sa takie, które mozna odlewac w postaci folii i innych form fizycznych, a ponadto musza one wykazywac zdolnosc do wiazaniapreparatów biologicznych bez uszkodzeniazarówno nosnika,jak i substancji biologicznej. Powszechnie uwaza sie, ze odpowiednimi materialami sa zarówno homopolimeryjak i kopolimery.Jak wspomniano, jako nosniki mozna stosowac homopolimery, jednak pod warunkiem, ze taki polimer bedzie chociaz troche usieciowany. Oznacza to, ze powinien on zawierac stosunkowo niewielka ilosc drugiego skladnika albo wystepujacego w produkcji monomeru, albo dodanego celowo w celu osiagniecia stopnia usieciowania wystarczajacego do zabezpieczania homopolimeru przed powolnym rozpuszczaniem sie w plynach zawierajacych wode, na przyklad we krwi. Takim zwykle lekko usieciowanym homopolimerem jest wspomniany poprzednio metakrylan hydroksy- etylu(HEMA). ; W niektórych przypadkach ksztaltowanie kopolimeru z róznych monomerów pozwala na wzmocnienie pozadanych wlasnosci materialu, z którego powstaje nosnik biopolimeru. Przykla¬ dem monomerów odpowiednich do kopolimeryzacji sa metakrylan 2-hydroksyetylu i metakrylan glicydylowy.4 142 532 Uzyteczne sa równiez terpolimery stanowiace podklase kopolimerówi zawierajace trzy spoli- meryzowane monomery. Przykladem odpowiedniego terpolimeru jest metakrylan glicydolowy (N-winylopirolidon), metakrylan 2-hydroksyetylu (GHA/NVP/HEMA/.Sposoby otrzymywania kopolimerówi/lub homopolimerów z wyzej wymienionych monome¬ rów sa dobrze znane. Ich parametry nie sa czynnikiem krytycznym dla aktywnego terapeutycznie polimeru wedlug wynalazku z tym tylko zastrzezeniem, ze otrzymany kopolimeri/lub homopoli- mer nie moze byc toksyczny przy stosowaniu go u zwierzat i u ludzi.Metoda odlewania polimerów w formy odpowiednie do stosowania niejest sprawa o istotnym znaczeniu. Ostatnio zaleca sie odlewanie odsrodkowe, przedstawione w przykladach II, III i IV.Substancje biologiczne stosowane w sposobie wedlug wynalazku mozna ogólnie okreslicjako takie zwiazki chemiczne, majace zdolnosc do tworzenia wiazania kowalencyjnego z nosnikiem biopolimeru lub z odstepnikiem, który w dalszym ciagu zostanie dokladnie omówiony, a jedno¬ czesnie aktywnie wiazace pozadane skladniki chorobotwórcze. Nalezy pamietac o tym, ze poza tym stosowane preparaty biologiczne musza miec takie rozmiary, aby wiazaly sie z powierzchnia nosnika polimeru i byly przy tym wystarczajaco duze tak, aby nie mogly przechodzic przez porowata warstwe nosnika polimeru i tworzyc wiazan z wewnetrzna powierzchnia nosnika. Aby temu zapobiec mozna zastosowac odstepnik (spacer), który sprawia, ze reaktywne miejsca prepa¬ ratu biologicznego znajduja sie w pewnej ód siebie odleglosci i sa zdolne do zwiazaniapozadanego czynnika chorobotwórczego, bedac przy tym dostepne dla tego czynnika, to znaczy, reaktywne miejsca sa odchylone na zewnatrz odpowierzchni nosnikai w ten sposób moga sie lepiej kontakto¬ wac z plynem ustrojowym plynacym nad powierzchnia nosnika. Jak wynika z powyzszego, zdolnosc do wiazania pozadanego czynnika chorobotwórczego zostaje zachowana mimo osadze¬ nia preparatu lub preparatów biologicznych na powierzchni nosnika biopolimeru. Sposród wymienionych wczesniej trzech substancji biologicznych insuline osadza sie na nosniku w celu usuwania przeciwciala antyinsulinowego zwiazanego z opornoscia na insuline wywolana choroba samouodpornieniowa.Kazdy ogólnie znany sposób uzyskania wiazania chemicznego nadaje sie do osadzania wymienionych substancji biologicznych na nosniku biopolimeru, z tym tylko zastrzezeniem, ze otrzymany preparat musi nadal posiadac przynajmniej jedno miejsce reaktywne wzgledem wybra¬ nego czynnika zwiazanego z choroba samouodpornieniowa. Ogólnie stosowane metody przyla¬ czenia chemicznego mozna podzielic na trzy klasy lub drogi przylaczenia. Sa to: 1/ przylaczenie spontaniczne, 2/ chemiczna aktywacja koncowych grup funkcyjnych i 3/przylaczenie sprzezonego reagenta. Spontaniczne przylaczenie kowalencyjne preparatów biologicznych do powierzchni nosnika polimerycznego zachodzi dzieki obecnosci reaktywnych chemicznie grup skierowanych na zewnatrz powierzchni nosnika. I tak na przyklad, obecnosc reaktywnych grup skierowanych na zewnatrz powierzchni polimerycznego nosnika umozliwia latwe przylaczenie preparatów biologi¬ cznych zawierajacych dostepne grupy. Ze wzgledu na wygode, wszystkie tego typu przylaczenia i wiazania okreslono nazwa „osadzanie". Bardziej wyczerpujace omówienie tego typu reakcji mozna znalezc na przyklad w „Chemical Procedures for Enzyme Immubilization of Porous Cellulose Beads", Chem. L.F. i in., Biotechnology and Bioengineering, tom XIX, strony 1463-1473 (1977) oraz w „Epoxy Activated Sepharose", 6B, Pharmacia Fine Chemicals, Affinity Chromatography, strony 27-32(1979).Chemiczna aktywacje koncowych grup funkcyjnych mozna przeprowadzic aktywujac grupy funkcyjne powierzchni polimeru droga chemicznej modyfikacji ich skladników koncowych.Przylaczenie odpowiedniej substancji biologicznej moze nastapic przy uzyciu wspomnianych wczesniej zwiazków tworzacych mostki kowalencyjne pomiedzy polimerem i substancja biologi¬ czna. Polimery i substancje biologiczne zawierajace wolne grupy hydroksylowe i/lub aminowe tworza wiazania kowalencyjne z takim reagentem, jak bromek cyjanu. Bardziej wyczerpujaca dyskusje tego sposobu mozna znalezc na przyklad w cytowanym juz artykule Chena i in.Zalecana metode osadzania reaktywnej substancji biologicznej na biopolimerze wyznacza w danym przypadku czasteczkowe rozmieszczenie reaktywnego, wiazacego ugrupowania tej sub¬ stancji,jak równiez grup funkcyjnych tej substancji i polimeru, któremoga tworzyc pomiedzy soba wiazania kowalencyjne. I tak na przyklad, w przypadku polimerów zawierajacych koncowe grupy hydroksylowe jako grupy funkcyjne, zaleca sie obecnie ich aktywacje alkalicznym roztworem bromku cyjanu (10 do 20% wagowo-objetosciowych). Zazwyczaj mieszanine reakcyjna utrzymuje142 532 5 sie w temperaturze pokojowej (20-25°) przez okolo 30 minut. Wartosc pH roztworu utrzymuje sie w zakresie 10-12 dodajac alkalia, na przyklad KOH lub NaOH. Polimer przemywa sie dokladnie sola fizjologiczna (0,9% wagowych) i poddaje inkubacji w slabo alkalicznym roztworze buforu przez 12 do 16 godzin w temperaturze 2-8°C. Polimer przemywa sie nastepnie dokladnie sola fizjologiczna w celu usuniecia nie zwiazanych lub niespecyficznie zwiazanych skladników biologicznych.Na polimerach zawierajacych ugrupowania glicydolowe substancje biologicznie osadza sie poprzez wiazania eterowe, tioeterowe lub alkiloaminowe. Polimery z aktywowanymi grupami epoksydowymi przemywa sie i nasacza wodnymi roztworami obojetnego buforu w temperaturze pokojowej. Oczyszczone substancje biologiczne, roztwory buforów: boranowego, weglanowego lub fosforanowego poddaje sie inkubacji przez 12-20 godzin z polimerem zawierajacym grupy glicydolowe w temperaturze 4-30°C. Nadmiarowe i niespecyficznie zwiazane substancje usuwa sie przemywajac polimer roztworem soli, kwasu octowego (0,2 do 1,0 M) lub roztworem soli buforo¬ wanymi fosforanami (pH = 7,2±0,2). Aktywacje polimeru zawierajacego grupy aminowe i karbo¬ ksylowe przeprowadza sie traktujac go roztworem oczyszczonych preparatów biologicznych w slabo kwasnych (pH 4,5 do 6,5) roztworach buforowych rozpuszczalnego w wodzie karbodwu- imidu. Substancje biologiczne tworza wiazania kowalencyjne z nosnikiem polimerycznym w wyniku poddania nosnika substancji biologicznych i karbodwuimidowych inkubacji trwajacej 12-16 godzin w temperaturze 2-8°C. Uklady sprzezone polimer — substancja biologiczna prze¬ mywa sie nazmiane kwasnymi i zasadowymiroztworami tak dlugo, dopóki roztworypo przemyciu nie zawieraja juz reagentów biologicznych ani karbodwuimidowych.W celu okreslenia zdolnosci aktywnego terapeutycznie polimeru do specyficznego wiazania skladników substancji biologicznych roztwory fizjologicznej surowicy komplementarnych czaste¬ czek biologicznych poddano dzialaniu aktywowanych Mon. Iloscczastek biologicznych zmierzono radiochemicznie. W wyniku krótkiego okresu poddawania specyficznych zwiazków biologicznych dzialaniu biologicznie modyfikowanego polimeru, ilosc bioczasteczek badanego preparatu zna¬ cznie zmalala.Wspomniany wczesniej „odstepnik" mozna zdefiniowac dla potrzeb niniejszego tekstu jako czasteczke zdolna do wytworzenia wiazania z powierzchnia aktywowanego nosnika, która ma wymiary wystarczajaco duze do ustawienia sie na zewnatrz od tej powierzchni i jest zdolna do wiazania jednej lub kilku substancji biologicznych. Obecnosc odstepnika stanowi gwarancje, ze aktywne miejsce preparatu biologicznego jest odchylone na zewnatrz od powierzchni nosnika tak, ze ma pelniejszy kontakt z plynem ustrojowym. Jak z tego wynika, zdolnosc do wiazania sie z pozadanym kompleksem chorobotwórczym zostaje zachowana po osadzeniu substancji biologi¬ cznych na odstepniku, a tym samym na nosniku biopolimeru.Jako odstepniki stosuje sie czasteczki organiczne o co najmniej dwóch reaktywnych grupach funkcyjnych, zazwyczaj usytuowanych na przeciwleglych koncach czasteczki. Grupy te stanowia czynnik umozliwiajacy wytworzenie wiazania pomiedzy odstepnikiem a nosnikiem polimery¬ cznym i substancja biologiczna. Reaktywne grupy funkcyjne odstepnika moga byc wlasciwie takie same, ale w przypadku sposobu wedlug wynalazku sa rózne, przy czym musza one reagowac z grupamifunkcyjnymi znajdujacymi sie napowierzchni nosnika iz grupamifunkcyjnymi substancji biologicznej z wytworzeniem wiazania kowalencyjnego. Kazda ze znanych metod prowadzenia tego typu reakcji sprzegania moze byc stosowana do tego celu.Jak wspomniano w sposobie wedlug wynalazku jako odstepnik stosuje sie kwas 6- aminokapronowy lub albumine, proteine o niskim powinowactwie, która zwieksza biospecyfi- cznosc polimerycznego nosnika.Wiekszosc, jezeli nie wszystkie, odpowiednie nosniki polimeryczne maja niska wytrzymalosc mechaniczna, w przeciwienstwie do materialów o duzej wytrzymalosci mechanicznej, takichjak na przyklad arkusze polipropylenu. Tak wiec, w wiekszosci zastosowan wynalazku konieczny jest dodatkowy nosnik wytrzymaly mechanicznie. Takinosnik pozwala na uzycie duzych powierzchni i ma zarówno leczniczo, jak i handlowo uzasadniony poziom usuwania skladników zwiazanych z choroba odpornosciowa. Material nosnika, poza tym, ze musi miec odpowiednie wlasnosci mecha¬ niczne, powinien byc tani i nadawac sie do sterylizacji, aby mozna bylo go stosowac zgodnie z wynalazkiem, gdyz leczeniu poddaje sie krew chorego. Przykladowymi materialami, nadajacymi sie do uzycia jako nosniki sa: papier filtracyjny, wlókna poliestrowe, poliweglany, usieciowane6 142 532 poliuretany, NORYDR, politlenek fenylenu wytwarzany przez General Elektronie Company, mikroporowate poliolefiny, takie jak polipropylen oraz tkanina bawelniana.Mozna stosowac wiele sposobów przylaczania aktywowanego nosnika lub nosnika biopoli¬ merycznego z chemicznie przylaczonymi preparatami biologicznymi, na przyklad pokrywanie odsrodkowe, odlewanie na plasko, nasycanie pod próznia, powlekanie przez maczanie, powlekanie przez maczanie i usieciowanie, kopolimeryzacja w roztworze. Niektóre z tych metod opisano w nastepujacych przykladach.Ogólnie mówiac, sposób korzystania z aktywnego terapeutycznie polimeru do leczenia chorób samouodpornieniowych i innych polega na kontaktowaniu krwi lub plazmy chorego z nosnikiem o odpowiedniej wytrzymalosci mechanicznej, na którym znajduje sie biospecyficzny polimer z osa¬ dzanymi na nim reaktywnymi substancjami biologicznymi, usunieciu z krwi lub plazmy pacjenta specyficznych czynników chorobotwórczych i ponownym wprowadzeniu krwi do organizmu pacjenta. Sposób ten moze, ale nie musi, wymagac przeprowadzenia rozdzialu skladników krwi.Takwiec, leczenie przebiega podobnie jak w przypadku dializy, z tym, ze nie zawsze konieczny jest calkowity rozdzial krwi na skladniki, a fizyczne uszkodzenia normalnych skladników krwi sa niewielkie lub nie wystepuja w ogóle.Sposób ten mozna równiez zastosowac do leczenia plazmy. Plazme mozna wydzielic z calosci krwi dowolna ze znanych i stosowanych metod. I tak, mozna wydzielic plazme z krwi pacjenta znanymi sposobami, a nastepnie poddac ja leczeniu omówionym sposobem, polaczyc z pozosta¬ lymi skladnikami krwi i ponownie podac pacjentowi stosujac najnowsze sposoby. Ponadto, plazme stosowana w znanych sposobach leczenia mozna poddac obróbce omówionym sposobem przed podaniemjej pacjentowi, któremu potrzebnajest plazma z banku krwi. Równiez krew z banku krwi mozna z korzyscia poddawac obróbce omawianym sposobem.Nalezy tez pamietac, ze polimer wytwarzany sposobem wedlug wynalazku mozna stosowac wobec innych plynów ustrojowych skutecznie usuwajac z nich czynniki chorobotwórcze.Ze wzgledu na korzysci plynace z zastosowaniem polimeru, zarówno podane wyzej,jak i inne, oczywiste dla fachowca, uwaza sie, ze wiele tych stanów chorobowych mozna leczyc podana tu metoda. Korzystnie mozna leczyc szesc grup stanów chorobowych. Sa to: zaburzenia skladników odpornosciowych, zatrucie nadmiarem leków, wystawienie na dzialanie substancji toksycznych, zaburzenia stanu równowagi substancji ustrojowych, zakazenia i choroby nowotworowe. Wiele chorób leczy sie obecnie metoda plazmoforezy i cytoforezy, w których korzystnym wynikiem leczenia jest usuniecie danej substancji. Polimer mozna stosowac do chorób leczonych obecnie przez plazmoforeze i cytoforeze.Przykladami chorób ukladu odpornosciowego, które mozna leczyc, sa wszystkie stany choro¬ bowe zwiazane z wystepowaniem przeciwcial, antygenów, oddzialywan antycialo-antygen, anty- gen-antygen, i antycialo-antycialo, komórkowych kompleksów powierzchniowych, kompleksów cytoplazmowych itp.Przyklady przedawkowania leków obejmuja: przedawkowanie zelaza, dioxinu, aspiryny, tylenolu, methotrexate i innych zwiazków trójpierscieniowych.Przykladami trucizn i toksyn, w przypadku których polimer wedlug wynalazku nadaje sie do zastosowania, sa olów, aluminium, grzyby (Anatoxim) i fosforany organiczne.Substancje wystepujace w organizmie w nadmiarze moga doprowadzic do choroby. Stosujac polimer otrzymany sposobem wedlug wynalazku mozna usunac na przyklad cholesterol, kwas moczowy, immunoglobuliny, komórki sierpowate, toksyny mocznicowe, bilirubine, porfiryne, hydrokortyzon i prostaglandyny.Przykladami czynników zakaznych sa zaburzenia wirusowe, takie jak cytomegalia; zaburzenia wywolane przez pierwotniaki, jak malaria, spiaczka afrykanska i liszmanioza; zakazenia bakte¬ ryjne, na przyklad streptokokami;zakazenia grzybami, na przyklad lupiez pstry; zakazenia bakte¬ riami mikroplazmowatymi, takimi jak wywolujace zapalenie pluc i oplucnej; choroby powodo¬ wane przez riketsje, jak tyfus i zapalenie opon mózgowych; zakazenia kretkami, na przyklad kila oraz zakazenie bakteriami rodzaju Chlamydia powodujacymi chorobe papuzia, ziarniniaka naczyn limfatycznych i jaglice.Choroby nowotworowe, które mozna leczyc polimerem otrzymanym wedlug wynalazku, to: chloniaki, miesaki, nowotwory i bialaczki. Mozna je leczyc usuwajac w sposób specyficzny linie komórek, inhibitory.inicjatorychoroby i ich kombinacje.142 532 7 Przyklady dalszych stanów chorobowych, które mozna leczyc polimerem wedlug wynalazku, to: zakazenia, takie jak: zapalenie klebuszków nerkowych wywolane przez streptokoki,przewlekle zapalenia osierdzia, kila wtórna, zakazenie pneumokokami, trad wywolany przez Lepromatous, przetoka komorowa, angina monocytowa, dur brzuszny, przewlekle, sklerotyczne zapalenie mózgu, zespól Landry-Cuillan/Barre^o, zakazne zapalenie watroby, czwartaczka, schistosoma- toza, trypanosomatoza; choroby nowotworowe, takie jak: rak watroby, chloniak i ziarnica zlos¬ liwa, ostra bialaczka, rakjasnokomórkowy, rak okreznicy, chloniak Burkittsa; zanurzenia tkanki lacznej, jak: okolotetnicze zapalenie guzkowe, przewlekle zapalenie klebuszków nerkowych, ostre lub przewlekle zapalenie tarczycy, zatrucie chlorkiem winylu, przewlekla choroba watroby, rózne krioglobilunemie, choroba Bergera lub choroba nerek powodowana przez IgA, szybko postepu¬ jace zapalenie klebuszków nerkowych, niedokrwistosc sierpowato-krwinkowa; choroby krwi,jak: plamica maloplytkowa, samouodpornieniowa niedokrwistosc hemolityczna, samoistna plamica maloplytkowa, samoistna neutropenia, aglutynacja krwinek czerwonych, hemoglobinuria napa¬ dowa z oziebieniem, krazace natykoagulanty, hemofilia nabyta, bialaczki, chloniaki, choroba hemolityczna noworodków, niedokrwistosc zlosliwa i chorobyzwiazane z czynnikiem Rh; choroby neurologiczne,jak: ostre bezmielinowe zapalenie mózgu, stwardnienie rozsiane, porazenie wstepu¬ jace ostre, zespól Cuillain-Barre'go, zapalenie nerwu obwodowego i niedomoga miesniowa; kola-. genozy,jak: choroba Raynauda, liszaj rumieniowaty, guzkowe zapalenie okolotetnicze, twardzina skóry, zapalenie skórnomiesniowe, niedowlad kurczowykonczyn, przewlekly postepujacy gosciec stawowy, goraczka reumatyczna, rumien guzowaty; choroby gruczolów dokrewnych, jak: nad¬ czynnosc kory nadnerczy, zapalenie tarczycy, nadczynnosc tarczycy, cisawica i aspermia; choroby jelit, narzadów trawiennych, jak: marskosc, ostre zapalenie watroby, przewlekle zapalenie watroby, rumieniowe zapalenie watroby, marskosc zólciowa, wrzodowe zapalenie jelita grubego, odcinkowe zapalenie jelit i zapalenie trzustki; choroby rózne, jak: hipercholesterolemia, zapalenie klebuszków nerkowych,choroby blonypodstawowej, stany psychogenne—narkotyki, niedokrwi¬ stosc hemolityczna po wstawieniu protezy zastawki aorty, zluszczajace zapalenie skóry, reakcja Id, luszczyca, zespól Behceta, przewlekle bakteryjne zapalenie wsierdzia, nadcisnienie tetnicze, astma, dziedziczny obrzek naczyniowo-ruchowy, dwoinkowe nagminne zapalenie opon mózgowych, choroba Crohna, encefalopatia watrobowa, symetryczna zgorzel konczyn.Ponadto mozna leczyc choroby charakteryzujace sie wystepowaniem przeciwcial do antyge¬ nów jader, antygenów cytoplazmowych, antygenów powierzchni komórki oraz ich podklas.Odpowiednie przyklady to: przeciwciala do natywnego DNA (podwójnie skreconego) lub poje¬ dynczo i podwójnie skreconego, przeciwciala do SS DNA, przeciwciala do protein dezoksyrybo¬ nukleinowych, przeciwciala do histonu, przeciwciala do Sm,przeciwciala do RNP, przeciwciala do Sc 1-1- twardziny skóry, przeciwciala do SS-A- niedowlad kurczowy konczyn, kompleks Sicca, przeciwciala do RAP— przewlekly postepujacy gosciec stawowy, niedowlad kurczowy konczyn, przeciwciala do PM-1- zapalenie wielomiesniowe — zapalenie skórnomiesciowe,przeciwciala do Nucleolar Systemie Sclerosis, niedowlad kurczowy konczyn.Ponadto przeciwciala zwiazane ze specyficznymi chorobami samouodpornieniowymi jak: przeciwciala do miesni gladkich — przewlekle zapalenie watroby, przeciwciala do receptorów acetylocholiny — niedomoga miesniowa, przeciwciala do blony podstawowej na styku skóra — naskórek— pecherzyca noworodków, przeciwciala do kompleksu protein i mukopolisacharydów lub wewnatrzkomórkowej substancji wiazacej, pecherzyca, przeciwciala immunoglobulin — przewlekly postepujacy gosciec stawowy — przeciwciala do blony podstawowej klebuszków — zapalenie klebuszków nerkowych, zespól Goodpasture'a, samoistna zelazica krwi, przeciwciala do erytrocytów — samouodpornieniowa niedokrwistosc hemolityczna, przeciwciala do tarczycy — choroba Hashimoto, przeciwciala do czynnika wewnetrznego — niedokrwistosc zlosliwa, przeciw¬ ciala do czynnika plytek — samoistna plamica maloplytkowa, alloimmunizacja, przeciwciala do mitochondrii—pierwotna marskosc zólciowa, przeciwcialado komórekprzewodów slinowych — miedowlad kurczowy konczyn, przeciwciala do nadnerczy — Idiopathic Adrenal Atropathy, prze¬ ciwciala do mikrozomów tarczycy — choroba Crave'a przeciwciala do komórek wysepkowych— Diabetes Mellitus i przeciwciala do tyreoglobuliny — cisawica; paraproteinemie, jak szpiczak mnogi, makroglobulinemia, krioglobulinemia, choroby lancuchowe; hiperlipidemie, jak: pier¬ wotna marskosc zólciowa, hipercholesterolemia; choroby gruczolów dokrewnych, jak: choroba8 142 532 Grave'a, cukrzyca; alloimmunizacja, jak: choroba krwi u noworodków, odrzucenie przeszczepu nerki.Ponadto do leczenia nadaja sie: plamica po transfuzji, zespól Goodpasture'a, niedomoga miesniowa, pecherzyca, choroba hematologiczna, samoistny samouodpornieniowy rumien farom- bocytowy, samoudpornieniowa niedokrwistosc hemolityczna, inhibitor czynnika VIII i zapalenie wielokorzonkowe.Choroby zwiazane z kompleksem immunologicznym: jak: liszaj rumieniowaty, guzkowe zapalenie okolotetnicze, zapalenie naczyn skórnych, przewlekly postepujacy gosciec stawowy, zapalenie klebuszków nerkowych i zapalenie skórno-miesniowe.Nie przyznajac zadnej z teorii wyzszosci nad innymi, przeglad prawdopodobnego przebiegu choroby samouodpornieniowej sugeruje, ze inicjujeja najprawdopodobniej wolny antygen, potem nastepuje rozwój przeciwcial i ich kompleksowanie, co prowadzi w koncu do nadmiaru przeciwcial i unieruchomienia utworzonych kompleksów na czynnikach uzupelniajacych wzgledem nich. Stad prawidlowy wybór biopolimeru o odpowiedniej skutecznosci wymaga wczesniejszego okreslenia dominujacej formy czynnika autoimmunologicznego. Przyklad takiego wlasnie postepowania opisano ponizej dla przypadku leczenia choroby reumatycznej. Chorobe reumatyczna mozna krótko scharakteryzowac w postaci nastepujacego ciagu: a) wolny antygen RF (nietypowa Ig) (stan reumatyczny), b) rozwój wolnego antygenu RF i jego kompleksowanie i na koniec c) nadmiarprzeciwcialiunieruchomienie aktywowanego kompleksuRF na czynnikach uzupelnia¬ jacych.Tak wiec, rozwój choroby reumatycznej w jej wczesnym stadium mozna wykryc dzieki obecnosci nietypowych immunoglobulin przy przeciwcialach jednoklonowego czynnika reuma¬ tycznego (m-RF). Na tym etapie leczenie przeprowadza sie najskuteczniej stosujac biospecyficzny polimer aktywowany m-RF w celu usuniecia agresywnego antygenu i zapobiezenia w ten sposób rozwojowi endogennych cial (e-RF). Stwierdzenie obecnosci e-RF wskazywaloby na koniecznosc uzycia niespecyficznego polimeru zawierajacego zarówno substancje biologiczne aktywne wzgle¬ dem m-RF, jak i agregaty gammaglobulin (antygen RF). Mozna tez zastosowac kolejno dwa polimery, z których kazdy zawiera jeden typ aktywnych ugrupowan biologicznych: W óbu przy¬ padkach taka kombinacja m-RF i agregatów gammaglobuliny zaadsorbuje zarówno agresywne antygeny, jak i czasteczki przeciwciala, powstrzymujac rozwój choroby.W przypadku, gdy wykrywa sie duze ilosci kompleksu antygen — przeciwcialo — zaleca sie stosowac biopolimery zawierajace Clq i/lub czasteczki efektora kolagenu. Natomiast, jesli proces chorobowy osiagnal stadium unieruchomienia utworzonego kompleksu immunologicznego skute¬ czny polimer biospecyficzny powinien zawieracjedno lub wiecej przeciwcial do czynników uzupel¬ niajacych, takich jak anty-Clq, anty-C3, anty-C4. Równiez i w tym przypadku preparaty biologi¬ czne,jesli potrzebnyjest wiecej nizjeden, mozna unieruchomic najednym nosniku lub kazdy z nich mozna unieruchomic na oddzielnym nosnikui polaczycje na przemian zaleznie od przeplywu krwi lub plazmy.Jak stwierdzono powyzej, skuteczne wykorzystanie polimeru wedlug wynalazku polega na okresleniu dynamiki i stadium odpowiedzi immunologicznej, co umozliwia skuteczne leczenie.Obecnie do leczenia chorób przezusuwanie szkodliwych substancji lub komórekz krwi stosuje sieplazmoforeze i cytoforeze. Uwaza sie powszechnie, ze kazda chorobapoddawana plazmoforezie i/lub cytoforezie w celu usuniecia specyficznej substancji moze byc leczona z zastosowaniem polimeru wedlug wynalazku.Bardziej szczególowo mozna przedstawic metode leczenia calej krwi w nastepujacy sposób: a)zapewnia sie dostep do naczynia krwionosnego, który umozliwia: b) przeplyw krwi w ilosci do okolo 30 ml/min do okolo 200 ml/min, c) do krwi dodaje sie srodek antykoagulujacy, d) zapewnia sie pompe, e) przepuszcza sie krew nad polimerem otrzymanym sposobem wedlug wynalazku, f) zaleznie od rodzaju uzytego srodka antykoagulujacego mozna lub nalezy dodac substancje neutralizujacajego wplyw na przetwarzana krew, g) przetworzona krew wprowadza sie ponownie do organizmu pacjenta. Takicykl leczniczy trwa od okolo 2 do okolo 4 godzin. Oczywiscie w miare potrzeby mozna go skrócic lub wydluzyc.142532 9 Metode leczenia plazmy mozna przedstawic w nastepujacy sposób: a) zapewnia sie dostep do naczynia krwionosnego, który umozliwia: b) przeplyw krwi w ilosci od okolo 30 ml/min do okolo 200 ml/min, c) do krwi dodaje sie srodek antykoagulujacy, d) zapewnia sie pompe, e) zapewnia sie srodki do rozdzielania krwi na skladniki, f) przepuszcza sie plazme nad polimerem wedlug wyna¬ lazku, g) filtruje sieja przez filtr 0,2 • 10"6m w celu usuniecia wszystkich mikrozatorów, bakterii i/lub grzybów, h) ponownie laczy sie przetworzona plazme i skladniki krwi, i) zaleznie od rodzaju uzytego srodka antykoagulujacego mozna lub nalezy dodac substancje neutralizujacajego wplyw na przetwarzana krew,j) przetworzona krew wprowadza sie ponownie do organizmu pacjenta.Dostep do naczynia krwionosnego mozna zapewnic znanymi w medycynie sposobami. Na przyklad, do zyly lub arterii mozna wprowadzic rurke o duzej srednicy. Odpowiednie do tego celu zyly i arterie to zyla przedlokciowa, zyla podobojczykowa, tetnica ramieniowa i promieniowa.Mozna tez zastosowac przetoke zylno-tetnicza (Vshubt). W tym przepadku czynnikiem pompuja¬ cym jest serce. Jesli nie stosuje sie przetoki, to przy dostepie zylnym zaleca sie stosowac pompe perystaltyczna o wydajnosci od okolo 30 ml/min do okolo 200 ml/min.Odpowiednie srodki antykoagulujace, to na przyklad kwasny cytrynian dekstrozy (w ilosci w przyblizeniu 1 ml na 8 ml krwi), heparyna, mieszanina heparyny i kwasnego cytrynianu dekstrozy (np. 1250 jm heparyny w 125 ml kwasnego cytrynianu dekstrozy na 11 roztworu)i prostaglandyny.Nalezy zwrócic uwage na to, ze gdy stosuje sie heparyne lub prostaglandynyjako srodki antykoagu¬ lujace, to nalezy je dodawac do krwi lub plazmy przed jej zawróceniem do organizmu lub przed podaniem pacjentowi.Ponadto przy obróbce plazmy mozna stosowac wszystkie znane sposoby usuwania utworzo¬ nych skladników krwi, takie jak plazmoforeze, odwirowywanie komórek, sedymentacje komórek w worku na plazme. Odpowiednie sa zarówno ciagle,jak i periodyczne metody rozdzialu i nie maja one wplywu na zastosowanie polimeru wedlug wynalazku.Ponadto postac, jaka przyjmuje polimer otrzymany sposobem wedlug wynalazku nie jest sprawa pierwszoplanowa. Mozna stosowac nosniki biopolimeru w postaci arkuszy, wydrazonych wlókien, wlókien cylindrycznych, sieci, kanalików o przekroju okraglym lub prostokatnym, granu¬ lek i ich kombinacji, w niektórych przypadkach uzycie zloza fluidalnego moze okazac sie korzystne.Przyklad I. W przykladzie opisano metode odlewania nosnika biopolimeru i chemicznego unieruchomienia preparatu biologicznego bezposrednio na nosniku. Ponadto, w przykladzie opi¬ sano sposób stosowania ukladu, który nie zostal wzmocniony mechanicznie.Adsorpcja przeciwcial antyinsulinowych przy zastosowaniu blony wykonanej z polimetakry¬ lanu hydroksyetylowego (p-HEMA) aktywowanego insulina.A. Odlewanie polimeru. Roztwory monomeru przygotowano laczac 15,0 g metakrylanu 2- hydroksyetylu (produkcji Polysciences Inc., Warrington, PA), 15,0 g glikolu etylenowego (produk¬ cji Fischer Scientific, Pittsburg, PA), 0,08 g dwusiarczku sodu (Fischer) i 0,036 g nadsiarczanu amonu (Fischer). Roztwór mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Okolo 5 ml roztworu umieszczono na plytce szklanej (dlugosc 127 mm, szerokosc 127 mm, gr. 9,5 mm) w zaciskach polietylenowych o grubosci 0,254 mm wycietych w formie uszczelki z okienkiem o wymiarach 101,6 mm X 101,6 mm. Nad uszczelka i roztworem umieszczono druga plytke szklana, docisnieto zaciski i calosc wygrzewano przez noc w temperaturze 60°C. Usunieto zaciski, nieco rozchylono plytki i przeniesiono je do kapieli ze zdejonizowana woda na co najmniej 24 godziny.Spomiedzyplytek ostroznie wyjeto napeczniala blone polimeru iprzemywanoja przez co najmniej trzy dni zmienianymi porcjami zdejonizowanej wody (500 ml dziennie).B. Aktywacja polimeru. Z arkusza polimeru wycieto krazki blony o srednicy 5 mm do aktywacji i analiz. Przygotowano roztwór bromkucyjanu (Eastmann Kodak CO., Rochester,NY) o stezeniu 10-20% molowych rozpuszczajac 1,69 g rozdrobnionych krysztalów BrCN w 10 ml roztworu Na2C03 o stezeniu 0,2 M i pH równym 11,1 ciagle mieszajac, w temperaturze 4°C.WartoscpH roztworu utrzymywano na poziomie powyzej 11 poprzez wkraplanie roztworu NaOH o stezeniu 5M az do rozpuszczenia krysztalów i ustabilizowania wartosci pH. 4 krazki blony umieszczono na malym sicie, przemyto 5 ml 0,1 N HC1 i inkubowano przez 15 min w roztworze bromku cyjanu. Kazdy z krazków przemyto nastepnie jeszcze co najmniej 2 razy porcjami 0,1 N10 142 532 HC1 po 5 ml i inkubowano przez noc w 5 ml roztworu insuliny do iniekcji V-100ILETINR (Elli Lilly, Indianapolis, Inc.), którego odczyn sprowadzono do wartosci pH równej 8,7 dodatkiem IN NaOH. Krazki blony przemyto 5 ml roztworem 0,5 M NaCl, 0,1 M NaaCOs i trzykrotnie Sml roztworu solanki o stezeniu 0,9% molowych buforowanego fosforanem (0,05 m). Odczyn roztworu wynosil pH=7,4.C. Ocena adsorpcji przeciwciala antyinsulinowego na blonie. Przeprowadzono podwójna analize radioimmunologiczna wspólzawodniczacego wiazania przeciwcial inkubujac 560 pg (piko- gramów) insuliny wieprzowej znaczonej I125 (New England Nuclear, Boston, MA) i serie roztwo¬ rów (980 do 15 pg) nieznaczonej insuliny wieprzowej (Cambridge Nuclear, Billerica, MA) lub krazki wykonane z p-HEMA z 280 pg przeciwciala skierowanego przeciwko insulinie wieprzowej, wyodrebnionego ze swinki morskiej (New England Nuclear) w 0,5 ml roztworu solanki o stezeniu 0,9% mola i wartosci pH=7,4 buforowanego fosforanem (0,05 M) i zawierajacego 1% mol albu¬ miny surowicy wolowej (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Nastepnie krazki p-HEMA usunieto z testowanych roztworów. Do kazdego z nich dodano 0,1 ml wyodrebnionej z kozy antygammaglobuliny skierowanej przeciwko swince mor¬ skiej. Roztwory mieszano i inkubowano jeszcze przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do kazdej probówki dodano 1,0 ml zimnej (2-4°C) solankibuforowanej fosforanami (pH 7,4). Kazdyz roztworów zamieszano i wirowano przez 15 min w temperaturze 4°C przy 7500 g, a supernatant zdekantowano do fiolek scyntylacyjnych o pojemnosci 20 ml. Supernatant zzelowano dodajac 5,0 mlplynu do scyntylacji (New England Nuclear) i zliczano na liczniku Isocap 300 (Searle Analitic Inc., Des Plains, IL) przez 4,0 min. Krazki blony poddane dzialaniu insuliny adsorbowaly 111 pg przeciwciala antyinsulinowego z roztworu lub 690 pg na cm2 powierzchni.Przyklad II. W przykladzie opisano sposób wytwarzania blony biospecyficznej bez nos¬ nika,jak równiezsposób uzycia kwasu 6-aminokapronowegojako odstepnikado unieruchomienia insuliny na nosniku biopolimeru stosowanego do usuwania przeciwcial insuliny i adsorpcji prze¬ ciwcial antyinsulinowych, stosujac blone z polimetakrylanu hydroksyetylu (p-HEMA) aktywo¬ wana insulina.A. Odlewanie polimeru. Roztwory polimeru przygotowano mieszajac 15,0 g metakrylanu 2-hydroksyetylu (Polysciences Inc., Warrington, PA), 15,0g glikolu polietylenowego (Fischer Scientific, Pittsburg, PA), 0,08 g dwusiarczku sodu (Fischer) i 0,036 g nadsiarczanu amonu (Fis¬ cher). Roztwór mieszano przez 15 min. w temperaturze pokojowej. Okolo Sml roztworu umie¬ szczono na plytce szklanej o wymiarach 127 mm X127 mm X 9,5 mm w zaciskach polietylenowych o grubosci 0,254mm wycietych w formie uszczelki z okienkiem o wymiarach 101,6 mm X101,6 mm.Nad uszczelka i roztworem umieszczono druga plytke szklana, docisnieto zaciski i calosc wygrze¬ wano przez noc wtemperaturze 60°C. Usunieto zaciski, nieco rozchylono plytki i przeniesionoje do kapieli ze zdejonizowana woda na co najmniej 24 godz. Spomiedzy plytek ostroznie wyjeto nape- czniala blone polimeru i przemywano ja przez co najmniej 3 dni zmienianymi porcjami wody zdejonizowanej (500 ml dziennie).B. Aktywacja polimeru. Krazki blony przygotowano tak jak opisano w przykladzie I. Przy¬ rzadzono roztwór bromkucyjanu (Eastmann Kodak Co., Rochester,NY) o stezeniu 10-20% mol rozpuszczajac 1,69 g dokladnie rozdrobnionych krysztalów BrCN w 10 ml roztworu Na2COs o stezeniu 0,2 M i pH 11,1 przy ciaglym mieszaniu w temperaturze 4°C; pH roztworu utrzymywano na poziomie powyzej 11 wkraplajac 5 N NaOH do rozpuszczenia krysztalów i stabilizacji wartosci pH. Czterykrazki umieszczono na malym sicie iprzemyto 5 ml 0,1 N HC1, a nastepnie inkubowano przez 15 min w roztworze bromku cyjanu. Kazdy z krazków przemyto jeszcze przynajmniej dwa razy porcjami 0,1 N HC1 po 5 ml i inkubowano przez noc w 10 ml roztworu kwasu 6- aminokapronowego o stezeniu 10% mol (Sigma Chemical Co.) przygotowanego w roztworze buforowym 0,1 M Na2C03, 0,5 M NaCl o pH8,6.Krazki przemyto 5 ml buforu 0,1M Na2C03/ 0,5 M NaCl i trzykrotnie 5 ml roztworu solanki o stezeniu 0,9% mol buforowanego fosforanem (0,05 M) o pH 7,4. Krazki wyjeto z roztworu myjacego, aktywowano przez inkubacje w 10 ml roztworu l-cykloheksylo-3-/2-morfolinoetylo//karbodwuimidu (Sigma Chemical Co.) o stezeniu 10% wagowo-objetosciowych, przygotowanego w buforze — kwasie 2-/N-morfolino/etanosulfo- nowym (MES) o stezeniu 0,1 M i pH 6,0 w ciagu 30 min. w temperaturze pokojowej. Nastepnie kazdy krazek przemyto 5 ml zimnego (4°C) buforowanego roztworu solanki. Druga porcje kraz¬ ków inkubowano przez noc w 53 ml roztworu insuliny do iniekcji U-100ILETIM lub roztworu ILETIN insuliny wieprzowej (Elli Lilly, Indianapolis, IN) w temperaturze 4°C. Krazki wyjeto z roztworów protein i przemyto trzykrotnie 5 ml roztworu solanki buforowanego fosforanem.142 532 U C. Ocena adsorpcji przeciwciala antyinsulinowego na krazkach. Przeprowadzono podwójna analize radioimmunologiczna wspólzawodniczacego wiazania przeciwcial inkubujac 560 pg insu¬ liny wieprzowej znaczonej I125 (New England Nuclear, Boston, MA) i serie roztworów (980 do 15 pg) nieznaczonej insuliny wieprzowej (Cambrige Nuclear, Billarica, MA) lub krazki wykonane z p-HEMA z 280 pg przeciwciala skierowanego przeciwko insulinie wieprzowej, wyodrebnionego ze swinki morskiej (New England Nuclear) w 0,5 ml roztworu solanki o stezeniu 0,9% mol i odczynie pH 7,4 buforowanego fosforanem (0,05 M) i zawierajacego 1% mol albuminy surowicy wolowej (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Nastepnie krazki p-HEMA usunieto z testowanych roztworów.Do kazdego roztworu dodano 0,1 ml wyodrebnionej ¦z kozy anty-gammaglobuliny skierowanej przeciwko swince morskiej. Roztwory mieszano i inku- bowano jeszcze przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Do kazdej probówki dodano 1,0 ml zimnej (2^4°C) solanki buforowanej fosforanami (pH 7,4). Kazdy z roztworów zamieszano i wirowano przez 15 min. w temperaturze 4°C przy 7500 g, supernatant zdekantowano do fiolek scyntylacyjnych o pojemnosci 20ml. Supernatant zzelowano dodajac 5,0ml plynu do scyntylacji Aauasol (New England Nuclear) i zliczano na liczniku Isocap 300 (Searle Analitic Inc., Des Plaines, IL) przez 4 min. Krazki blony poddane dzialaniu insuliny adsorbowaly 271pg przeciwciala antyinsulinowego z roztworu lub 690 pg na cm2 powierzchni.Przyklad III. W przykladzie opisano sposób odlewania nosników biopolimerów zarówno wzmocnionych mechanicznie, jak i niewzmocnionych, metoda odlewania odsrodkowego. Ponadto opisano w nim drugi sposób chemicznego zwiazania preparatu biologicznego z nosnikiem biopolimeru.Adsorpcja przeciwcial antyludzkiej immunpglobuliny C (IgG) („czynników" typu reumaty¬ cznego) przy uzyciu blony wykonanej z kopolimeru metakrylan hydroksyetylu — metakrylan glicydolowy (p-HEGL) aktywowanej immunoglobulina.I. Odlewanie polimeru., W przykladzie opisano.;sposób wytwarzania blon z polimeru z nosni¬ kiem i bez nosnika metoda odlewania odsrodkowego.A. Urzadzenie do odlewania odsrodkowego. Urzadzenie do odlewania odsrodkowego to zamkniety aluminiowy beben o sciankach grubosci 6,35 mm. Wymiary wewnetrzne bebna wyno¬ sza: srednica — 101,6 mm, dlugosc — 127 mm. Beben podlaczony jest do obracajacego sie silnika (Fischer Dyna-Mix; Fischer Scientific Co., Pittsburg, PA), którego szybkosc obrotu mierzy sie fototachometrem stroboskopowym (model 1891M Power Instrument Inc., Skobie, IL). Dmu¬ chawa ciepla (Fischer Scientific Co.) ogrzewa obracajacy sie beben, do pomiaru temperatury wewnatrz bebna i temperatury powietrza oplywajacego beben stosuje sie termopary. Przed i .podczas polimeryzacji wnetrze bebna przemywa sie azotem.B. Wytwarzanie blony na nosniku. W celu mechanicznego wzmocnienia produktów odlewa¬ nia odsrodkowego zastosowano utwardzony papier filtracyjny Whatman Grade 50 (Fischer Scien¬ tific, Pittsburg, PA)jako element wzmacniajacy nosnika. Papier pocieto na prostokaty o wymia¬ rach 125,4 mm X 315,9 mm i nasaczono je glikolem etylenowym (FC) (Fischer Scientific Co., Cat.No. E-177) przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Nadmiar glikolu osuszono; po osuszeniu papier zawieral 2-4 g EG. Tak przygotowany papier zwinieto w rurke i umieszczono wewnatrz bebna do odlewania odsrodkowego. Zewnetrzna powierzchnie papieru docisnieto do scianki bebna, aby usunac cala ilosc powietrza znajdujacego sie pomiedzy nimi. Kiedy papier znajdzie sie na miejscu zaleca sie, chociaz niejest to konieczne, zetkniecie ze soba jego konców. Moga one nieco zachodzic na siebie. Sprawdzono, czy nie utworzyly sie kieszenie powietrzne; jezeli sa, nalezy je usunac bagietka z gumka.Jezeli w wyniku polimeryzacji otrzymuje sie polimer o duzej przyczepnosci, beben urzadzenia mozna najpierw wylozyc papierem z naniesionym najego powierzchni czynnikiem silikonowym o malej przyczepnosci tak, aby nieposmarowana strona stykala sie ze sciankami bebna. Na te warstwe mozna wtedy nie ostro nalozyc utwardzony papier filtracyjny marki Whatman uwazajac, aby nie utworzyly sie kieszenie powietrzne.C. Polimeryzacja. Ponizej przedstawiono reprezentatywne przepisy na otrzymanie polimerów, stosowane ostatnio. W kazdym przypadku inicjator polimeryzacji mieszano z monomerem lub monomerami przez 30 min. w temperaturze pokojowej lub tez az do rozpuszczania inicjatora.12 142 532 Kopolimer GMA—HEMA (50: 50) 6,25 g metakrylanu 2-hydroksymetylu (HEMA) 6,25 g metakrylanu glicydolowego (GMA) \2t5 g glikolu etylenowego (EG) 0,02 g chlorowodorku 2,2'-azobis/2-amidynopropanu/ (ABAP) Kopolimer GMA-NVP-HEMA (50:40:10) 6,25 g GMA 1,25 gNVP 5,00 g HEMA 12.5 g^EG" 0,02 g ABAP * mase glikolu etylenowego podano lacznie z masa glikolu znajdujacego sie na papierze filtracyjnym Whatman (2-4 g).D. Odlewanie odsrodkowe. Podczas rozpuszczania inicjatora polimeryzacji w monomerze lub monomerach zamocowuje sie beben w urzadzeniu do odlewania odsrodkowego. Beben obraca sie z szybkoscia 1400 obr/min. w temperaturze pokojowej i przeplukuje sie go azotem przez 15 min.Nastepnie podaje sie do wnetrza 25 ml roztworu inicjatora monomeru strzykawka z elastycznym teflonowym zamknieciem. Wznawia sie przeplukiwanie ukladu azotem i zwieksza szybkosc obro¬ tów bebna do 2900 obr/min.Wlacza sie wentylator o wydajnosci okolo 1 m3/s igrzejnik i ogrzewa sie beben wtemperaturze 70-75°C przez 90 minut. Wtedy wylacza sie ogrzewanie, ale pozostawia sie dzialajacy wentylator az do czasu, gdy wewnetrzna temperatura bebna opadnie do okolo 30°C. Po ochlodzeniu beben usuwa sie z urzadzenia do odlewania i napelnia woda zdejonizowana. Po godzinnym przebywaniu w wodzie odlany polimer wyjmuje sie z bebna.II. Aktywacja polimeru. Krazki blony przygotowano tak jak opisano w przykladzie I. 14 krazkówinkubowano pojedynczo w 1 ml roztworu heksylenodwuaminy (Eastman Kodak, Roche¬ ster, N.Y.) o stezeniu 1,0 M przez 72 godziny w temperaturze 4°C. Nastepnie krazki wyjeto z roztworu aminy i przemyto trzykrotnie 2 ml roztworu solanki buforowanego fosforanami. Roz¬ twór ludzkiej gammaglobuliny (HCG) (Sigma Chemical Co.) o stezeniu 4,0% mol przygotowano rozpuszczajac 4,0 gm HCG w 100 ml 0,1M buforu MES (pH 6,0), delikatnie mieszajac w tempera¬ turze pokojowej. Po calkowitym rozpuszczeniu proteiny przygotowano serie roztworów przeno¬ szac kolejno 1,0 ml roztworuproteiny do 9,0 ml roztworu MES otrzymujac stezenie proteiny równe 4 mg/ml, 400//g/ml, 40/ig/ml i 4/ig/ml buforu. Dwa krazki polimeru inkubowano w 0,5 ml roztworów proteiny i 0,5 ml roztworu 0,25M l-etylo-3-/3-dwumetyloaminopropylo/karbodwu- imidu (Sigma Chemical Co.) w buforze MES przez 72 godziny w temperaturze 4°C. Krazki wyjeto nastepnie z roztworu proteiny i przemyto trzykrotnie 2 ml zimnej (4°C) solanki buforowanej fosforanami.III. Ocena adsorpcji przeciwciala anty-IgG z roztworów fizjologicznych na blonie. Analize radioimmunologiczna przeprowadzono inkubujac pojedyncze krazki blony z 10 ng znaczonej I12 antyludzkiej IgC z kozy (New England Nuclear) w 1,0 ml PBS zawierajacym 1,0 gm % albuminy surowicy ludzkiej (Sigma Chemical Co.) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie usunieto znaczony roztwór i kazdy krazek przemyto trzykrotnie 2,0 ml roztworu PBS. Krazki inkubowano przez noc w roztworach uzytych do ostatniego plukania w temperaturze 4°C. Po wyjeciu zroztworu myjacego krazkipoddano zliczaniu w liczniku Innotron Hydragamma (Scienti- fic Products), przez minute kazdy.Ilosc zliczen na minute przeliczono na ilosc rozpadów na minute (DPM) dzielac je przez sprawnosc detektora. Ilosc zaadsorbowanego antyciala obliczono w przy¬ blizeniu dzielac srednia wartosc DPM aktywnosc roztworu znaczonego. Otrzymano nastepujace wyniki: Ilosc HCG Ilosc zaadsorbowanego anty-IgG (mg/ml) (pg/cm2)x 20,0 2453 2,0 1919 0,2 1271 0,02 664 0,002 xx * pikogramy znaczonej substancji na centymetr kwadratowy powierzchni blony "aktywnosc tla142 532 13 P r z y kl a d IV.W przykladzie przedstawiono zastosowanie kwasu aminokapronowego jako odstepnika dla gammaglobuliny.Adsorpcja przeciwcial anty-ludzkiej Immunoglobuliny G (IgG) („czynników" typu reumatycz¬ nego) z zastosowaniem blon wykonanych z kopolimeru metakrylanu hydroksyetylu i metakrylanu glicydolowego (p-HEGL) aktywowanych immunoglobulina.A. Odlewanie polimeru. Blony z p-HEGL odlewane metoda odsrodkowaprzygotowanojak w przykladzie II.B. Wprowadzenie grup funkcyjnych i aktywacja polimeru. Krazki blony otrzymano i przygo¬ towano zgodnie z opisem z przykladu II z tym, ze zamiast heksylenodwuaminy zastosowano 1,0M roztwór kwasu 6-aminokapronowego (Sigma Chemical Co.) jako odstepnik.C. Ocena adsorpcji przeciwcial anty-IgG z roztworów fizjologicznych na blonie. Analize radioimmunologiczna przeprowadzono tak jak opisano w przykladzie II i uzyskano nastepujace wyniki: Ilosc HGG Ilosc zaadsorbowanej IgG (mg/ml) (pg/cm2)x 20,0 2395 2,0 1828 0,2 1310 0,02 732 0,002 158 * ilosc pikogramów substancji znaczacej przypadajacej na 1 cm2 powierzchni blony.PrzykladV. W przykladzie przedstawiono zastosowanie albuminy (67000 — ciezar cza¬ steczkowy)jako odstepnika dla soli kwasu foliowego. Soli kwasu foliowego uzywa sie do usuwania protein wiazacych kwas foliowy.Adsorpcja protein wiazacych kwas foliowy (FABP) na blonach z metakrylanu hydroksyetylu (p-HEMA) aktywowanych kompleksem soli kwasu foliowego z albumina.A. Odlewanie polimeru. Blony z p-HEMA wzmocnione papierem filtracyjnym otrzymano metoda odlewania dosrodkowego,jak opisano w przykladzie II stosujac mieszanine do polimeryza¬ cji o nastepujacym skladzie: 15,0 g metakrylanu 2-hydroksyetylu 15,0 g glikolu etylenowego 0,08 g metadwusiarczku sodu 0,036 g nadsiarczanu amonowego B. Wprowadzanie grup funkcyjnych i aktywacja polimeru. Przygotowano kompleks kwasu folio¬ wego i albuminy surowicy wolowej w drodze kondensacji grup karboksylowych kwasu z konco¬ wymi grupami aminowymi albuminy. W tym celu 200 mg kwasu foliowego (Sigma Chemical Co.) rozpuszczono w 8 ml 0,1 N NaOH i 400 mg metho-p-toluenosulfonianu l-cykloheksylo-3/2- morfolinoetylo/karbodwuimidu (Sigma Chemical Co.) rozpuszczono w 2,0 ml 0,1M buforu MES (pH 6,0) i 1,0 gm albuminy surowicy wolowej (BSA) rozpuszczono w 40,0 ml 0,1M buforu MES.Roztwory te polaczono, zmieszano i inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 4°C. Nieprze- reagowana sól kwasu foliowego i karbodwuimidu usunieto z roztworu traktujac 20 ml mieszaniny 20 ml zawiesiny BSA (2,5 gm%) i wegla drzewnego (1,25 gm%) przez 30 minut w temperaturze 4°C.Zawiesine wirowano przez 15 minut przy 3400 g w temperaturze 4°C, zdekantowano i przefiltro- wano przez filtr 0,22 mikrona.Krazki blony przygotowano i potraktowano roztworem bromku cyjanu, jak opisano w przykladzie I. Po przemyciu krazków zimnym roztworem solanki zestawy po 8 krazków inkubo¬ wano w 20 ml soli fizjologicznej lub 160 mg % BSA lub roztworze kompleksu soli kwasu foliowego z albumina. Inkubacje prowadzono w temperaturze 4°C przez 72 godziny. Kazdy zestaw blon wyjeto z roztworu, wytarto do sucha i umieszczono w 20 ml roztworu solanki o temperaturze 4°C na przynajmniej 24 godziny w celu uzycia. Równolegle zestaw blon potraktowano 8 ml roztworu aldehydu glutarowego o stezeniu 1% przez 1 minute i przemywano przez noc 20 ml roztworu solanki buforowanego fosforanami.14 142 532 C. Ocena adsorpcji protein wiazacych kwas foliowy (FABP) z roztworu fizjologicznego na blonie. Analize radioimmunologiczna wspólzawodniczacego wiazania protein przeprowadzono inkubujac 370pg kwasu 3H-pteroiloglutaminowego PGA (Anersham Corp., Arlington Heights) i standardowe.roztwory (48 do 348 pg) nieznaczonego PGA (Sigma Chemical Co.) lub krazki blony p-HEMA o zdolnosci do wiazania 234 pg FABP (Kamen B.A. i Caston J.D., „Pirect Radioche- mical Assay for Serum Folate: Compatiton between 3H-Folic Acid and 5-Methyl-tetrahydrofolic Acid for a Folate Binder", J. Lab. Clin. Med., 83,164,1974) w 1,0 ml 0,05 M buforu fosforanowego (pH 7,6) zawierajacego 20/ii zwyklej surowicy ludzkiej wolnej od soli kwasu foliowego i 5 mg askorbinianu sodowego (Sigma Chemical Co.). Zawartosc probówek wymieszano, inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut i w temperaturze 4°C przez 10 minut. Pojedyncze krazki wyjeto z roztworów i do kazdej probówki dodano 0,5 ml zimnej (4°C) zawiesiny BSA (2,5 gm%) i wegla drzewnego (1,25 gm%). Wszystkie roztwory inkubowano przez 10 minut w temperaturze 4°C i odwirowywano przy 2000 g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Supernatanty zdekantowano do 20 ml fiolek scyntylacyjnych. 12,0 ml plynu do scyntylacji (Fischer Scientific, Pittsburg, PA) dodano do kazdej fiolki. Próbki zliczano w liczniku Isocap 300 (Seatle Analytic Inc.) przez dwie minuty kazda. Otrzymano nastepujace wyniki: Obróbkablony Ilosc zaadsorbowanego FABP pg/cm2 solanka 67 bromkiemcyjanu 54 albumina surowicywolowej 39 kompleksem soli kwasu foliowego zBSA 758 Przyklad VI. W przykladzie zilustrowano wytwarzanie biospecyficznego polimeru z odstepnikiem. Ponadto podano skutecznosc polimeru biospecyficznego wytworzonego sposobem wedlug wynalazku do usuwania czynnika reumatycznego z surowicy krwi.A. Osadzanie odstepnika. W sposób zilustrowany w przykladzie III otrzymano nosnik poli- meryczny zlozony z 50% metakrylanu glicydylowego, 46% N-winylopirolidonu i 4% metakrylanu hydroksyetylu. Spolimeryzowany nosnik polimeryczny uwodniono przez umieszczenie polimeru na 3 godziny w zdejonizowanej wodzie. Uwodniony nosnik polimeryczny umieszczono nastepnie w obiegu z przeplywajacym plynem, przez który przepuszczano 10 ml 1,0M kwasu 6-aminokapro- nowego (AOA) w postaci roztworu o pH 7,2, kontaktujac nosnik polimeryczny z roztworem o szybkosci przeplywu 0,33 ml/min. Obieg oczyszczono z nadmiaru roztworu ACA, a nastepnie przepuszczano przezen 40 ml 0,1M kwasu 2-/n-morfolino/etanosulfonowego (MES) z szybkoscia przeplywu 0,33 ml/min, pozwalajac na zrównowazenie sie nosnika polimerycznego.B. Aktywacja polimeru/osadzanie biologiczne/. Nosnik polimeryczny osadzonym odstepni¬ kiem z ACA traktowano w obiegu z przeplywem plynu 10 ml roztworu IM l-etylo-3-/3- dwuetyloaminopropylo/karbodwuimidu (CDI). CDI recyrkulowano w obiegu w zetknieciu z nosnikiem polimeru z osadzonym odstepnikiem z szybkoscia 0,5 ml/min. Reakcje prowadzono 30 minut. Nadmiar CDI usunieto z polimerycznego nosnika przez przepuszczenie przez obieg 10 ml 0,2M roztworu MES przy szybkosci przeplywu 2 ml/min. 10 ml agregowanej na cieplo roztworu gammaglobuliny ludzkiej (HGG) recyrkulowano w obiegu kontaktujac ja z aktywowanym nosnikiem polimerycznym przy szybkosci przeplywu 0,5 ml/min. Aktywowanemu nosnikowi polimerycznemu pozwolono reagowac z agregowana HGG przez 72 godziny w temperaturze pokojowej i otrzymano polimer biospecyficzny.C. Ocena polimeru biospecyficznego do usuwania przeciwciala czynnika reumatycznego.Prowadzono 3 próby stosujac 3 zródla surowicy krwi dodatnie dla przeciwcial czynnika reumaty¬ cznego. Dla kazdej próby polimer biospecyficzny umieszczano w obiegu z przeplywem plynu ze zbiornikiem, pompa i zaworem odcinajacym. Zawór ustawiono tak, zeby polimer biospecyficzny odizolowac od reszty obiegu. Przed kazda próba caly obieg napelniano 0,05M roztworem PBS na okolo 24 godziny. Polimer biospecyficzny odizolowano nastepnie od pozostalej czesci obiegu za pomoca zaworu odcinajacego. Obieg (z wylaczeniem polimeru biospecyficznego) oczyszczono z142 532 15 roztworu PBS i do zbiornika obiegu dodano nastepnie 6,0 ml odpowiedniej surowicy kontrolnej o dodatnim czynniku reumatycznym i recyrkulowano przez okolo 15 minut do glównego obiegu.Zawór odcinajacy polimer biospecyficzny otwarto nastepnie i pozwolono, zeby badana surowica przeplywala przez caly obieg z szybkoscia przeplywu 0,414 ml/min w odstepach czasu 7 1/2,15,30, 60 i 120 minut, przy czym 0,5 ml próbki badanej surowicy usuwano ze zbiornika w celu okreslenia stezenia czynnika reumatycznego na drodze analizy nefelometrycznej. Analizy przeprowadzano w analizatorze nefelometrycznym II ICA Beckmana. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli. Po kazdej próbie przez obieg cyrkulowano dwie oddzielne porcje 5,0 ml 1,0 M roztworu kwasu octowego w celu usuniecia zwiazanego czynnika reumatycznego z biopolimeru.Tabela Surowica kontrolna dodatni RF Czas recyr¬ kulacji (minuty) 7,5 15 30 60 120 Poziom 1 335x 225 234 230 226 219 Odczyt poczatkowy RF kalibratora Beckmana (IU/mg) 400 Odczyt (lU/ml) 163 166 201 210 200 Surowica pacjenta 211 147 154 154 155 156 IU — jednostka uodporniajaca x Odczyt poczatkowy wynika czesciowo ze skutków rozcienczania Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania aktywnego terapeutycznie, biokompatybilnego polimeru z osadzo¬ nymi substancjami reaktywnymi biologicznie, znamienny tym, ze biokompatybilny nosnik polime- ryczny zlozony z powtarzalnych jednostek co najmniej jednego monomeru wybranego z grupy obejmujacej: metakrylan 2-hydroksyetylu, metakrylan glicydylu i N-winylopirolidon aktywuje sie z 1-20% w stosunku wagowym bromku cyjanu lub karbodwuimidu i do zaktywowanego polimeru przylacza sie substancje biologiczna wybrana sposród kwasu foliowego, insuliny i immunoglobu- liny, majaca co najmniej jedna grupe funkcyjna zdolna do reakcji z aktywowanym nosnikiem biokompatybilnym, przy czym czasteczka przylaczanej substancji biologicznej ma wielkosc unie¬ mozliwiajaca penetracje w glab nosnika. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako karbodwuimidowy czynnik aktywujacy stosuje sie l-etylo-3-/3-dwumetyloaminopropylo/ karbodwuimid albo l-cykloheksylo-3-/2-mor- folinoetylo/karbodwuimid. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze czynniki aktywujace i substancje biologiczne poddaje sie jednoczesnie reakcji z nosnikiem biokompatybilnym. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie polimer osadzony na trwalym mechanicznie elemencie nosnym. 5. Sposób wytwarzania aktywnego terapeutycznie, biokompatybilnego polimeru z osadzo¬ nymi substancjami reaktywnymi biologicznie, znamienny tym, ze biokompatybilny nosnik polime- ryczny zlozony z powtarzalnych jednostek co najmniej jednego monomeru wybranego z grupy obejmujacej: metakrylan 2-hydroksyetylu, metakrylan glicydylu i N-winylopirolidon aktywuje sie 1-20% w stosunku wagowym bromku cyjanu lub karbodwuimidu i do zaktywowanego polimeru przylacza sie odstepnik wybrany z kwasu 6-aminokapronowego i albuminy, majacy grupe reagu¬ jaca z aktywowanym nosnikiem biokompatybilnym, otrzymany uklad nosnik-odstepnik aktywuje sie 1-20% w stosunku wagowym karbodwuimidowego czynnika aktywujacego i na aktywowanym ukladzie nosnik-odstepnik osadza sie substancje biologiczna wybrana sposród kwasu foliowego, insuliny i immunoglubuliny, majaca co najmniej jedna grupe funkcyjna zdolna do reakcji z aktywowanym ukladem nosnik polimeryczny-odstepnik.16 142 532 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze jako karbodwuimidowy czynnik aktywujacy stosuje sie l-etylo-3-/3-dwumetyloaminopropylo/ karbodwuimid albo l-cykloheksylo-3-/2-mor- folinoetylo/karbodwuimid. 7. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze czynniki aktywujace i substancje biologiczne poddaje sie jednoczesnie reakcji z biokompatybilnym ukladem nosnik-odstepnik. 8. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze stosuje sie polimer osadzony na trwalym mechanicznie elemencie nosnym.Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz Cena 220 zl PL