NO160968B - Bioforenlige polymerer med biologiske komponenter hvis bindingskomplementer er patologiske fremkallere. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår bioforenelige polymerer

som har immobiliserte reaktive biologiske komponenter derpå

som binder utvalgte spesifikke patologiske fremkallere eller spesifikke grupper av patologiske fremkallere forbundet med syke kroppsvæsker.

Forløpet av mange sykdomstilstander gjenspeiles ofte

av forhøyede nivåer av spesifikke blodproteiner og andre molekyler. Dette fenomen utnyttes typisk som et diagnostisk verktøy for å definere patologien og følge forløpet av klinisk behandling. I mange tilfeller er disse spesifikke blodkomponenter direkte eller indirekte ansvarlige for de primære eller sekundære manifestasjoner for sykdomsforløpet. "Autoimmune" sykdommer kan beskrives som sykdommer kjennetegnet ved sirkulerende antistoffer overfor endogene substrater og vevproteiner som kreves av kroppen for normal vekst og opp-rettholdelse. "Neoplastiske" sykdommer er typisk karakteri-

sert ved ukontrollert vekst av en udifferensiert overført cellelinje som unngår eller bringer kroppens naturlige forsvars-mekanisme i fare ved å fremkalle immunoundertrykkende blokker-

ende faktorer, overflate-antigenmaskerende komponenter og/eller vekstregulatorbestanddeler. Spesifikk oppdeling av disse patologiske fremkallere på et bioforenelig substrat stemmer overens med restaureringen av den "normale" kropps-

funksjon ved fjerning av de patologiske fremkallere av sykdomsprosessen .

Hovedfunksjonen av organene, celler og molekyler som

omfatter immunsystemet, er å gjenkjenne og eliminere fra kroppen fremmede substanser. Disse fremmede substanser eli-

mineres ved reaksjon mellom de fremmede substanser og anti-

stoffer som dannes i respons på substansen. Generelt utføres denne funksjon effektivt og uten noen skade på pasienten. I

visse tilfeller kan imidlertid forstyrrelser oppstå som kan lede til patogene forstyrrelser slik som f.eks. en ukontrollert respons (allergisk sykdom) eller en abnormal response (auto-

immun sykdom). Patogenesen for begge disse sykdommer er direkte eller indirekte tilknyttet produksjonen av anti-

stoffer med kryss-reaktiviteter til enten omgivende antigener

(allergener) eller selv-antigener.

En autoimmun sykdom er en patologisk tilstand som opp-står når en pasient svarer immunologisk med produksjon av antistoffer med reaktivitet overfor et selv-antigen. Auto-immunitet kan ramme praktisk talt hver eneste del av kroppen og innbefatter generelt en reaksjon mellom et selv-antigen og et immunoglobulin (IgM eller IgG) antistoff. Representative autoimmune sykdommer kan innbefatte skjoldbruskkjertelen, nyrer, pancreas, neuroner, maveslimhinnen, binyrene, hud, røde celler og synovialmembraner såvel som thyroglobulin, insulin, deoxyribonucleinsyrer og immunoglobuliner.

For enkelte typer av autoimmune og neoplastiske sykdommer har ikke-speslfikk immunoundertrykkende behandling slik som røntgenbestråling av hele kroppen eller administrering av cytotoksiske legemidler, vært anvendt med begrenset hell. Ulempene ved slik behandling innbefatter toksisiteten av de anvendte midler og den forøkede hyppighet av forskjellige cancere, spesielt lymphomas og reticulum celle-sarcomas som etterfølger en slik behandling. I tillegg vil anvendelse av ikke-spesifikke midler for kronisk cellulær undertrykkelse sterkt øke pasientens ømfintlighet overfor alvorlig infeksjon fra omgivende fungi, bakterier og virus som under vanlige omstendigheter ikke vil skape noen problemer. Den her beskrevne oppfinnelse er spesifikk ved at den fjerner bare den patologiske fremkaller eller de grupper av patologiske fremkallere som er beslektet med og ansvarlig for manifestasjoner for en bestemt sykdom.

Betrakter man teknikkens stand, finner man at i den siste tid har det generelt vært to muligheter for terapeutisk behandling av autoimmune og/eller neoplastiske sykdommer.

Den første av disse er å innføre et materiale i pasienten

som bevirker at en spesifikk type av immunologisk toleranse fremkalles. Denne undertrykkelse av antistoffrespons vil deretter bevirke en toleranse overfor det provoserende antigen. Et typisk eksempel på denne type av mulighet er beskrevet i

US patentskrift 4 222 907. Ifølge denne publikasjon gies en syk pasient en terapeutisk behandling som består i innføring av konjugater av et antigen kjedet til en D-glutaminsyre: D-lysin-copolymer.

Den andre mulighet har vært via den ekstrakorporeale vei. Prosedyrene innbefatter generelt fjerning av helblod, separering av cellulære og løselige blodsubstanser,. substitu-sjon eller behandling av blodplasma og rekombinasjonsinfusjon av det behandlede helblod. Det første eksempel på denne løs-ning vil være plasmasubstitusjon eller utbytting med salt, sukker og/eller proteinløsningér, og dette er beskrevet av McCullough et al, "Therapeutlc Plasma Exchange", Lab. Med. 12(12), s. 745 (1981). Plasmautbytting er en relativt røff teknikk som krever et stort volum av erstatningsløsning. Et —-annet eksempel på denne mulighet innbefatter fysikalsk og/eller biokjemisk modifikasjon av plasmadelen av helblodet. Et typisk eksempel på den kjente teknikk med hensyn til denne„ terapeutiske behandling er Terman et al's artikkel "Extra-corporeal Immunoadsorption: Initial Experience in Human Systemic Lupus Erythematosus", The Lancet, 20. oktober 1979, s. 824-826. Denne artikkel beskriver ét hemodialysetype-system som gjør bruk av to mekaniske filtere med et DNA-kollodium benkullfilter mellom de to mekaniske filtere. Typisk for denne kjente teknikk er imidlertid at adsorbent-kolonnen bare er semispesifikk for immunkomponenter fordi ben-kullsubstratét vil ikke spesifikt utslette mange vitale lav-molekylære bestanddeler fra det behandlede plasma. En andre anvendelse av denne mulighet kan illustreres ved artikkélen av Terman et al "Specific Removal of Circulated Antigen by

Means of Immunoadsorption", FÉBS Letters, vol. 61, nr. 1, januar 1976, s. 59-62. I denne publikasjon beskrives den spesifikke fjerning av radiomerket antigen med antistoff-behandlede cellulosemembraner. Forfatteren viser imidlertid at kontrollmembraner har en signifikant kapasitet til ikke-spesiftkt å adsorbere proteiner.

En tredje anvendelse av denne mulighet er illustrert i artikkelen av Bansal et al "Ex vivo Removal of Serum IgG in a Patient With Colon Carcinoma", Cancer, 42(1), s.1-18

(1978). Denne publikasjon beskriver den semi-spesifikke adsorpsjon av immunoglobulin ved ex vivo-behandling av plasma med formalin og varmedrept Staphylococcus aureas. Den biologiske aktivitet av visse stammer av S. aureas tilskrives et molekyl tilstedeværende på celleveggen, kalt protein A, som samvirker med og bindes til Fc-delen av IgG fra pattedyr. Fordi denne samvirker med Fc-delen, skiller denne behandling ikke mellom normale og patologiske IgG-komponenter, og forsøk har vist muligheten for signifikante bivirkninger.

En fjerde anvendelse av denne mulighet kan illustreres ved artikkelen av Malchesky et al "On-line Separation of Macromolecules by Membrane Filtration With Cryogelation", Artif. Organs 4:205, 1980. Denne publikasjon beskriver semispesifikk fjerning av cryoglobulinsubstanser fra plasma ved en kombinasjon av filtrering og kaldbehandlingskammere. Fore-komsten og sammensetningen av cryoglobulære bunnfall er ikke nødvendigvis i overensstemmelse med, eller noen indikasjon på mange autoimmune eller neoplastiske sykdommer.

Et annet problem forbundet med den eksisterende kjente

teknikk er at uten systemer som gjør bruk av mekanisk filtrering, har de spesifikke patologiske fremkallere som man ønsker å fjerne, ikke blitt fjernet i store nok mengder til å medføre noen bedring for den syke pasient ved at kolonnene ikke spesifikt absorberer bare den ønskede spesifikke patologiske fremkaller.

Det er nå funnet at høy spesifisitet ved fjerning av patologiske effektorer kan oppnåes ved behandling av blod og/eller plasma på en økonomisk måte under anvendelse av foreliggende biospesifikke polymer.

Foreliggende oppfinnelse angår således en biospesifikk polymer, som er kjennetegnet ved at den består av

(a) en bioforenlig polymerbærer valgt fra en hydrogel eller modifisert cellulose, hvilken bioforenlig polymerbærer er bundet til en mekanisk stabil støttedel valgt fra renset cellulose, polyesterfiber, mikroporøse polyolefiner, bomullsduk, polystyren, polycarbonat, polyfenylenoxyd, nettformede polyurethaner og kombinasjoner derav; (b) eventuelt en avstandsforbindelse covalent bundet til angitte bioforenlige polymerbærer; og (c) en biologisk substans eller substanser immobilisert på angitte avstandsforbindelse eller på angitte polymerbærer, og hvorved den biologiske substans eller substanser bibeholder sin reaktivitet for binding av spesifikke patologiske fremkallere eller spesifikke grupper av patologiske fremkallere.

Også;beskrevet er et system for terapeutisk behandling av autoimmune sykdommer ved hvilket en syk pasients blod, plasma eller annen kroppsvæske føres over en biospesifikk polymer som har immobilisert reaktive biologiske substanser, hvorved de ønskede patologiske fremkallere fjernes fra pasientens blod eller plasma hvoretter blodet returneres til pasienten.

Disse og andre sider ved oppfinnelsen beskrives i detalj i den etterfølgende beskrivelse og krav.

I. Bioforenelig polymerbærer

De bioforenelige polymerbærere som er anvendbare ifølge oppfinnelsen, er materialer som ikke er tilbøyelige til å fremkalle skadelige virkninger når de kommer i kontakt med kroppsvæsker slik som f.eks. plasma eller helblod, mens de samtidig opprettholder en reaktiv, men immobilisert biologisk substans orientert slik at den biologiske substans rager ut fra overflaten av polymerbæreren. De materialer som er egnet, er de som kan støpes i filmer og andre fysikalske former samtidig som de er i stand til å ha angitte biologiske substanser kjemisk bundet til disse uten å skade hverken seg selv eller de biologiske substanser bundet dertil. De typer av materialer som generelt betraktes å være egnet, er de som innen faget er kjent som hydrogeler og som enten kan være

copolymerer eller homopolymerer.

Modifisert cellulose og cellulosederivater, spesielt celluloseacetat, har også funnet anvendelse som bioforenelige bærere som er anvendbare ifølge oppfinnelsen. Med modifiserte cellulosederivater menes at cellulosepolymeren er overflate-modifisert ved covalent binding av vedhengende bioforenelige overflategrupper til cellulosesubstratpolymeren, hvilket gjør denne mer bioforenelig. Slike overflategrupper er velkjente og behøver ikke; beskrives nærmere her, men som eksempel kan angles at albumin har utvist særlig anvendelighet som en modi-fiserende gruppe. Metoder for binding av slike grupper er beskrevet i det etterfølgende.

Homopolymerer kan også anvendes som egnede bioforenelige polymerbærere ifølge oppfinnelsen. Det skal imidlertid for-

ståes at når homopolymerer angles, kan disse innbefatte materialer som også kan identifiseres som svakt tverrbundne homopolymerer. Dvs;, at de inneholder en relativt liten mengde av en annen komponent som enten forefinnes i materialet ved fremstilling av monomeren eller som tilsettes det formål å

sikre tilstrekkelig tverrbinding for å beskytte homopolymeren mot langsom oppløsning i et vandig medium slik som blod. Et eksempel på denne type av homopolymer som ofte er svakt tverrbundet, er hydroxyethylmethacrylat (HEMA).

Når det gjelder hydrogelene, kan egnede polymerer enten

være regulære homopolymerer som i det vesentlige ikke inne-

holder noe annet materiale 1 deres matriser, eller de kan være copolymerer fremstilt fra to eller flere monomerer slik som f.eks. styren og vinylacetat. I visse tilfeller kan denne type av komponering av copolymerene med forskjellige monomerer øke de ønskede egenskaper til det bioforenelige polymerbærer-materiale. Eksempler på egnede monomerer som kan copolymeri-seres, innbefatter f.eks. hydroxyethylmethacrylat og glycidylmethacrylat.

Også anvendbare er terpolymerer som er en underklasse av copolymerer inneholdende tre monomerer som polymeriseres. Et eksempel ipå en egnet terpolymer er glycidylmethacrylat/N-vinylpyrrolidon/hydroxyethylmethacrylat (GMA/NVP/HEMA).

I tillegg til de spesifikke copolymerer og homopolymerer som er angitt ovenfor, kan copolymerer, fremstilt med eller uten forskjellige ytterligere monomerer, og homopolymerer som er egnet ifølge oppfinnelsen, polymeriseres fra følgende monomerer: hydroxyalkylacrylater og hydroxyalkylmethacrylater, f.eks, hydroxyethylacrylat, hydroxypropylacrylat bg hydroxy-butylmethacrylat; epoxyacrylater og epoxymethacrylater slik som f.eks. glycidylmethacrylat; aminoalkylacrylater og amino-alkylmethacrylater; N-vinyl-forbindelser slik som f.eks. N-vinylpyrrolidon, N-vinylcarbazol, N-vinylacetamid og N-vinyl-succinimid; aminostyrener; polyvinylalkoholer og polyvinyl-aminer som må fremstilles fra egnede polymere forløpere; polyacrylamider og forskjellige substituerte polyacrylamider; vinylpyridin; vinylsulfonat og polyvinylsulfat; vinylen-carbonat; vinyleddiksyre og vinylcrotonsyre; allylamin og allylalkohol; vinylglycidylether og allylglycidylether. Frem-gangsmåter og prosedyrer for fremstilling av copolymerer og/eller homopolymerer fra de ovenfor angitte monomerer, er velkjente innen faget. Disse parametere er ikke kritiske for oppfinnelsen forutsatt at den endelige copolymer og/eller homopolymer ikke er toksisk for dyr, innbefattet mennesket.

Den anvendte metode for støping av disse materialer i en form egnet for bruk ifølge oppfinnelsen, er ikke av kritisk betydning. En foretrukken metode er spinnstøping, og denne er eksemplifisert i eksempel 2, 3 og 4.

II. Biologiske substanser

Som angitt her, kan en biologisk substans og/eller substanser defineres som en kjemisk forbindelse som utviser evne til covalent å bindes til den bioforenelige polymerbærer eller avstandsforbindelse (definert i det etterfølgende) samtidig som den bibeholder en aktivitet til å binde en ønsket bestanddel som bevirker en patologisk tilstand. Det skal også forståes at i tillegg må den anvendte biologiske substans eller substanser ha en slik størrelse at de covalent bindes til overflaten av polymerbæreren og ikke er tilstrekkelig små til å gjennomtrenge den porøse matrise av polymerbæreren slik at de kjemisk kan bindes på innsiden av eller i det indre av bærermaterialet. Under en slik omstendighet kan en avstandsforbindelse anvendes for å sikre at det reaktive sete av den biologiske substans som er tilbake og er i stand til å bindes til den ønskede patologiske bestanddel, virkelig kan presen-teres overfor denne bestanddel, dvs. at den holdes utover fra bæreren slik at den kommer i kontakt med den kroppsvæske som strømmer over bæreren. Det er selvsagt innlysende at reaktiviteten for binding av den ønskede patologiske bestanddel virkelig bibeholdes etter immobilisering av den biologiske substans eller substanser på den bioforenelige polymerbærer. Eksempler på materialer som kan anvendes som biologiske substanser, innbefatter f.eks. acetylcholin-reseptorproteiner, histoforeneligehets-antigener, ribonucleinsyrer, basal-membranproteiner, immunoglobulinklasser og endeklasser, myelomaproteinreseptorer, komplementkomponenter, myelin-proteiner og forskjellige hormoner, vitaminer og deres resep-torkomponenter. Særlige eksempler er f.eks. binding av insulin til en bioforenelig polymerbærer for å fjerne anti-insulin-antistoff som er forbundet med den autoimmune sykdom insulinresistens; binding av anti-Clq og/eller Clq til en bioforenelig polymerbærer for å fjerne immunkomplekser som er forbundet med bindevevs- og celledelingssykdommer slik som f.eks. rheumatoid arthritis og carcinoma.

Enhver generelt kjent metode for kjemisk binding vil være tilstrekkelig for å binde de biologiske substanser til den bioforenelige polymerbærer forutsatt at den biologiske substans fremdeles har minst ett aktivt sete for den bestemte autoimmun-sykdomstllknyttede komponent. Generelt vil de anvendte metoder for kjjemisk binding falle inn under tre klasser eller metoder for binding. Disse tre metoder er, 1) spontan binding, 2) kjemisk aktivering av funksjonelle endegrupper, og 3) koblingsreagensbinding. Spontan covalent binding av biologiske substanser til polymerbæreroverflaten forløper via kjemiskei reaktive grupper som rager ut fra polymerbæreren. Reaktive grupper slik som f .eks. aldehyd og epoxy som rager ut fra polymerbæreren, binder lett biologiske substanser inneholdende tilgjengelig hydroxyl-, amino- eller thiolgrupper. Også fri aldehydgrupper på polymerbæreren kobler via acetal-bindinger til hydroxyl-holdige biologiske substanser og via imidkjeder til amino-holdige molekyler. I tillegg kan eksempelvis fri oximgrupper kobles via alkylamin-, ether- og thio-etherbindinger til biologiske substanser inneholdende amin, hydroxyl og thiogrupper. Av hensiktsmessige grunner er alle bindinger og koblinger her definert som immobiliseringer.

Mere inngående diskusjoner over disse reaksjoner kan f.eks. finnes i "Chemical Procedures for Enzyme Immobilization of Porous Cellulose Beads", Chen, L. F. et al, Biotechnology and Bioengineering, vol.. XIX, s. 1463-1473 (1977) og "Epoxy Activated Sepharose", 6B, Pharmacia Fine Chemicals, Affinity Chromatography, s. 27-32 (1979).

Kjemisk aktivering av funksjonelle endegrupper kan ut-føres ved aktivering av funksjonelle polymeroverflategrupper ved kjemisk modifisering av deres endekomponenter. Denne metode kan eksempelvis være oxydasjon av epoxy-endefunksjoner med perjodsyre under dannelse av aktive aldehydgrupper.

Denne metode er ytterligere eksemplifisert i f.eks. "Immobilization of Amyloglucosidase on Poly [(Glycidyl Methacrylate) Co (Ethylene Dimethacrylate)] Carrier and Its Derivatives", Svec, F. et al, Biotechnology and Bioengineering, vol. XX,

s. 1319-1328 (1979). Immobilisering av de biologiske substanser forløper som ovenfor beskrevet. Kondensasjonsreak-sjoner kan utføres mellom de fri carboxyl- og amingrupper via carbodiimidaktivering av carboxygruppene som beskrevet i f.eks. "New Approaches to Non-Thrombogenic Materials",

Hoffman et al, Coagulation - Current Research and Clinical Applications, Academic Press, N.Y. (1973). Kort angitt kan immobiliseringen av de biologiske substanser utføres ved carbodiimidaktivering av enten polymerens eller den biologiske substans carboxylgrupper og kondensasjonen med et fritt amin under dannelse av en stabil peptidbinding. Den endelige orientering av den biologiske substans bestemmes generelt av hvorvidt en amin- eller en carboxyl-holdig polymer anvendes.

Koblings-reagensbinding kan utføres under anvendelse

av et utall av koblingsmidler under dannelse av covalente broer mellom polymer og biologiske substanser. Fri hydroxyl-og/eller amin-holdige polymerer og biologiske substanser kobles her covalent med reagenser slik som f.eks. cyanogenbromid, diisocyanater, dialdehyder og triklor-s-triazin. En inngående diskusjon over denne teknikk kan f.eks. finnes i den ovenfor angitte artikkel av Chen et al.

Den foretrukne metode for immobilisering av en reaktiv biologisk substans på et bioforenelig polymersubstrat i et gitt tilfelle bestemmes generelt av den molekylære lokaliser-ing av den reaktive bindende del av den biologiske substans og de funksjonelle grupper på den biologiske substans og polymersubstratet som kan.kombineres covalent. Når det gjelder polymersubstrater inneholdende hydroxy-endefunksjoner, fore-trekkes det f.eks. for tiden å aktivere ved behandling med en alkalisk løsning av cyanogenbromid (10 til 20% w/v).

Typisk opprettholdes reaksjonsblandingen ved romtemperatur

(20 til 25°C) i ca. 30 minutter. pH på løsningen opprettholdes i. et område på fra 10 til 12, ved tilsetning av alkalisk materiale, f.eks. KOH eller NaOH. Polymeren vaskes grundig med fysiologisk saltvann (0,9 g%) og inkuberes med løsninger av en renset biologisk substans oppløst i en svakt alkalisk bufferløsning i 12 til 16 timer ved 2 til 8°C. Polymeren skylles grundig med fysiologisk saltvann for å fjerne ubundne eller ikke spesifikt bundne biologiske komponenter.

Biologiske substanser immobiliseres på glycidylholdige polymerer via ether, thioether eller alkylaminbindinger. Epoxy-aktiverte polymersubstrater skylles og svelles med vandige nøytrale bufferløsninger ved romtemperatur. Rensede biologiske substanser, oppløst borat, carbonat eller fosfat-bufferløsninger inkuberes med glycidyl-polymersubstratet i 12 til 20 timer ved 4 til 30°C. Overskudd av ikke-spesifikt bundet biologisk substans fjernes ved skylling av polymeren med saltvann, eddiksyre (0,2 til 1,0M) og fosfatbufrede

(pH = 7,2 - 0,2) saltløsninger. Aktivering av amin- og carboxyl-holdige polymermatriser utføres ved behandling med rensede biologiske substanser oppløst i svakt sure (pH 4,5 til

6,5) bufferløsninger av et vannløselig carbodiimid. Biologiske substanser kobles covalent til polymerbærersubstratene ved inkubering av polymerbæreren, biologisk substans og carbodiimidreaktanter i 12 til 16 timer ved 2 til 8°C. Polymer-biologisk substans-konjugater vaskes alternativt i sure og deretter alkaliske skyllevann inntil vaskeløsningene er fri for biologisk substans og carbodiimidreaktanter.

For å bestemme de spesifikke bindingskarakteristika av polymer-immobiliserte biologiske substanser ble fysiologiske serumløsninger av komplementære biomolekyler behandlet med aktiverte membraner. Mengdene av biomolekyler ble målt radio-kjemisk. Signifikant reduksjon av spesifikke biomolekyler fant sted etter kortvarig eksponering overfor de biologisk modifiserte polymersubstrater.

III. Avstandsforbindelser

En avstandsforbindelse kan defineres

som et molekyl eller en forbindelse som er i stand til å bindes til overflaten av en biospesifikk polymerbærer, som er stor nok til å rage ut fra overflaten av angitte bærer og som er i stand til å immobilisere en biologisk substans og/eller biologiske substanser. Avstandsforbindelsen sikrer at det aktive sete av den biologiske substans holdes utover bort fra bæreren for således å kontakte kroppsvæsken mere effektivt. Fra det ovenfor angitte er det selvsagt at reaktiviteten for binding med det ønskede syke kompleks virkelig bibeholdes etter immobilisering av den biologiske substans eller substanser på avstandsforbindelsen og derfor til den bioforenelige polymerbærer.

Avstandsforbindelsene er avledet fra organiske molekyler som har minst to reaktive funksjonelle grupper som generelt befinner seg ved motsatte ender av molekylet. Slike grupper tjener som bindingsbærere som er i stand til å koble avstandsforbindelsen til polymerbæreren og til den biologiske substans. De reaktive funksjonelle grupper på avstandsforbindelsen kan være like eller forskjellige forutsatt at de reagerer med funksjonelle grupper langs overflaten av polymerbæreren og de funksjonelle grupper som rager ut fra den biologiske substans som danner covalenite bindinger. En hvilken som helst kjent metode for utførelse av slike koblingsreaksjoner vil være tilstrekkelig. Eksempelvis kan de ovenfor beskrevne koblings-metoder for binding av den biologiske substans direkte til polymerbæreren også anvendes.

Egnede eksempler på avstandsforbindelser som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, hvor de reaktive funksjonelle grupper er de samme, innbefatter f.eks. 1,6-diaminohexan, glutaraldehyd, 1,4-cyclohexan-dicarboxylsyre, ethylendiamin-tetraeddiksyre, triethylenglycol, 1,4-butandiol-diglycidyl-ether, methylen-p-fenyl-diisocyanat og ravsyreanhydrid. Eksempler på avstandsforbindelser hvori de reaktive funksjonelle grupper ikke er de samme, innbefatter f.eks. 6-aminocapronsyre, p-nitrobenzoylklorid, 1,2-epoxy-3-(p-nitrofenoxy)-propan, aminopropyltriethoxy-silan og homocystein-thiolacton.

Polypeptider og proteiner kan også anvendes som avstandsforbindelser ifølge oppfinnelsen. Albumin, et lav-affinitets-protein, har f.eks. med hell vært anvendt som en avstandsforbindelse. I tillegg virker albumin og andre naturlige proteiner til å gjøre polymerbæreren mer bioforenelig.

Endelig skal det forståes at visse materialer kan virke samtidig som en avstandsforbindelse og som aktivator ved reaksjonen anvendt til å kombinere avstandsforbindelsen og den bioforenelige bærer. Eksempler på denne type av forbindelser innbefatter f.eks. glutaraldehyd og 1,4-butandiol-diglycidylether .

IV. Støttedel

Mesteparten, om ikke alle, av de egnede bioforenelige polymerbærere har meget lav mekanisk stabilitet. Mesteparten av disse materialer er i realiteten geler eller gellignende i motsetning til materialer som har høy mekanisk stabilitet, slik som f.eks. ark av polypropylen. I de fleste utførelses-former som gjør bruk av foreliggende oppfinnelse, er en støtte-del som er mekanisk stabil, nødvendig. Denne støttedel muliggjør at store overflatearealer kan anvendes for å sikre raske og medisinsk akseptable, såvel som kommersielt akseptable, nivåer av fjerning av den immune sykdomstilknyttede komponent. Støttedelen skal ved siden av å være mekanisk stabil, også være billig og må være steriliserbar for at den skal bli forenelig ved bruk i et system hvori blodet fra en syk pasient behandles ifølge oppfinnelsen. Eksempler på materialer som er egnet ifølge oppfinnelsen som støtte-deler, innbefatter f.eks. filterpapir, polyesterfibre, poly-carbonater, nettformede polyurethaner, Noryl® , en poly-fenylenoxydpolymer fremstilt av General Electric Company, mikroporøse polyolefiner slik som polypropylen, og bomullsduk.

Mange metoder for festing av den aktiverte eller bioforenelige polymerbærer med biologiske substanser kjemisk bundet dertil, kan anvendes. Således kan f.eks. metoder slik som spinnbelegging, horisontalstøping, vakuumimpregnering, dyppbelegging, dyppbelegging med etterfølgende tverrbinding, og løsningscopolymerisering anvendes. Spesifikke eksempler på disse metoder kan finnes i de etterfølgende eksempler.

V. Terapeutisk system

Generelt angitt er det terapeutiske system som taes i betraktning, terapeutisk behandling av autoimmune og andre sykdommer hvorved en syk pasients blod eller plasma utsettes for en biospesifikk polymer som har immobilisert reaktive biologiske substanser, hvorved de spesifikke patologiske fremkallere fjernes fra pasientens blod eller plasma, hvoretter blodet deretter returneres til pasienten. Denne terapeutiske behandling kan eller kan ikke nødvendiggjøre bruk av blod-separasjonsteknikker. Således taes det i betraktning at be-handlingen utføres på lignende måte som en dialysebehandling med den fordel at total blodseparasjon ikke er nødvendig og at det er meget liten, om overhodet noen, fysikalsk skade på normale blodkomponenter.

Det er selvsagt også mulig å utnytte oppfinnelsen og ved behandling av plasma.

Plasma kan erholdes fra helblod ved en hvilken som helst av de for tiden kjente og anvendte metoder. Således kan f.eks. plasma separeres fra en pasients blod etter kjente metoder, kan deretter behandles og rekombineres med de andre blodkomponenter og returneres til pasienten under anvendelse av vanlig kjente prosedyrer. I tillegg kan plasma som anvendes ved kjent medisinsk behandling, anvendes ifølge oppfinnelsen for å behandle plasma før dette administreres til en pasient med behov for plasma fra eksempelvis en blodbank. Selvsagt kan helblod fra en blodbank også behandles og trekke fordeler av foreliggende oppfinnelse.

Det skal også forståes at oppfinnelsen også kan anvendes på andre kroppsvæsker for å bevirke fjerning av patologiske fremkallere.

På grunn av de ovenfor angitte fordeler som oppnåes ifølge oppfinnelsen, såvel som andre, vil det være klart for fagmannen at mange typer av sykdomstilstander taes i betraktning når det gjelder respons på oppfinnelsen anvendt i et terapeutisk system. Generelt angitt kan seks grupper av sykdomstilstander med fordel behandles. Disse seks sykdomskate-gorier er sykdommer i immunkomppnenter, overdoser av legemidler, toksineksponering, ubalanse i kroppssubstanser, infeksjoner og neoplastiske tilstander. Mange sykdommer behandles for tiden under anvendelse av plasmaforese og cytoforese hvor det ønskede resultat er fjerning av en spesifikk

substans. Foreliggende oppfinnelse

vil kunne anvendes på disse sykdommer som for

tiden behandles med plasmaforese og cytoforese.

Eksempler på immunkomplekssykdommer som kan behandles, er f.eks. enhver sykdomstilstand som innbefatter antistoff,

antigen, antistoff-antigen, antigen-antigen og antistoff-antistoff-interaksjoner, celleoverflatekomplekser, cytoplasmiske komplekser, etc.

Eksempler på legemiddeloverdoser som kan behandles, er f.eks. overdoser av jern, dioxin, aspirin, tylenol, metho-trexat og andre tricycliske forbindelser.

Eksempler på gifter og toksiner overfor hvilke oppfinnelsen er Segnet, er f.eks. bly, aluminium, sopp (Anatoxin) og organiske fosfater.

Når kroppssubstanser er tilstede i overskudd, kan disse lede til sykdom. Eksempler på slike som kan elimineres under anvendelse, av oppfinnelsen, innbefatter f.eks. cholesterol, urinsyre, immunoglobuliner, sigdceller, uremiske toksiner, bilirubin, porfyrin, cortisol og prostaglandiner.

Enkelte eksempler på infektiøse midler som kan behandles, er f.eks. virale sykdommer slik som cytomegalovirus ; protozoale sykdommer slik som malaria, trypanosomer og leishmanias; bakterieinfeksjoner slik som streptococci; fungusinfeksjoner slik som tinea versicolor; mycoplasma slik som pleuro-pneumonia-lignende organismer, rickettsia-sykdommer slik som tyfus og flekktyfus; spirochetes slik som syfilis og chlamydia-midler i psittacosls lympho-granuloa-trachoma-sykdomsgruppen.

Neoplasmiske sykdommer som kan behandles under anvendelse av foreliggende oppfinnelse, innbefatter f.eks. lymphomas, sarcomas, carcinomas og leukemi. Disse kan fjernes ved spesifikk fjerning av en cellelinje, inhibitorer, initiatorer for sykdommen og kombinasjoner derav.

Ytterligere eksempler på sykdomstilstander som kan behandles under anvendelse av oppfinnelsen, innbefatter f.eks. følgende: Infeksjoner slik som: post-streptococcal glomerulonephritis, subakutt bakteriell endocarditis, sekundær syfilis, pneumococcal sepsis, lepromatøs spedalskhet, ventrikulær shunt-infeksjon, infektiøs mononucleosis, tyfoidfeber, subakutt scleroserende encephalitis, Landry-Guillain-Barre syndrom, hepatitis B infeksjon, Quartan malaria, Schistosomi-asis og Trypanosomiasis.

Neoplasmiske sykdommer slik som: hepatoma, lymphoma

og Hodgkins sykdom, akutt leukemi, hypernephroma, carcinoma på kolon, bronchogenisk carcinoma og Burkitts lymphoma.

Bindevevssykdommer slik som Periarthritis nodosa, kronisk glomerulonephritis, akutt eller subakutt thyroiditis, vinylklorid-forgiftning, kronisk leversykdom, blandet cryo-globulinemias, Bergers sykdom eller Iga nephropati, hurtig progressiv glomerulonephritis og sigdcelle-anemi.

Hematologiske sykdommer slik som thrombisk thrombocytopenisk purpura, autoimmun hemolytisk anemi, idiopatisk thrombocytopenisk purpura, idiopatisk neutropenia, kald hemagglutinin-sykdom, Paroxysmal kald.hemoglobinuria, sirkulerende antikoagulanter, medfødt hemofili, leukemi, lymphomas, Erythroblastosis fetalis, pernisiøs anemi og Rh-sykdommer.

Nevrologiske sykdommer slik som akutt demyelinerende encephalitis, multippel sclerose, Landrys paralyse, Guillain-Barre syndrom, perifer neuritis og Myasthenia gravis.

Collagen-sykdommer slik som Raynauds, Lupus Erythematosus, Polyarthritis nodosa, Scleroderma, dermatomyositis, Sjøgrens syndrom, rheumatoid arthritis, reumatisk feber og Erythema nodosa.

Endokrine sykdommer slik som f.eks. Cushings syndrom og sykdom, Thyrolditis, Thyrotoxicosis, Addisons sykdom og Aspermatogenesis.

Gastroirttestinale sykdommer slik som portal cirrhosis, akutt hepatitis, kronisk aktiv hepatitis, lupoid hepatitis, galle-cirrhosis, ulcerativ colitis, regional enteritis og pancreatitis.

Forskjellige sykdommer slik som f.eks. hypercholesterolemia, glomerulonephritis, basal membransykdom, psykogene tilstander - legemidler, postaortisk klaff-prosthesis - hemolytisk anemi, exfoliativ dermatitis, Id reaksjon, psoriasis, Behcets syndrom, carcinoma, subakutt bakteriell endocarditis, hypertensjon, astma, arvelig angionevrotisk ødem, meningococcemia, Crohnssykdom, hepatisk encefalopati og Raynauds sykdom.

Sykdommer karakterisert ved antistoffer overfor kjerne-antigener, cytoplasmiske antigener, celleoverflateantigener og underklasser, kan behandles ifølge oppfinnelsen. Egnede eksempler innbefatter f.eks. antistoffer overfor naturlig-DNA (dobbeltstrenget) eller enkelt- og dobbeltstrenget, antistoffer overfor SS DNA, antistoffer overfor deoxyribo-nucleoprotein, antistoffer overfor histon, antistoffer overfor Sm, antistoffer over RNP, antistoffer over Sc 1-1 - scleroderma, antistoffer overfor SS-A - Sjøgrens syndrom, Sicca complex, antistoffer overfor RAP - rheumatoid arthritis, Sjøgrens syndrom, antistoffer over PM-1 - polymyositis-dermatomyositis, og antistoffer overfor nucleolar-systemisk sclerosis, Sjøgrens syndrom.

Også antistoffer forbundet med spesifikke autoimmune sykdommer slik som antistoffer overfor glattmuskel - kronisk hepatitis, antistoffer overfor acetylcholin-reseptorer - Myasthenia gravis, antistoffer overfor basalmembran ved den dermale-epidermale forbindelse - blæreformet pemphigoid, antistoffer overfor mucopolysaccharidprotein-kompleks eller intracellulær sementsubstans - Pemphigus, antistoffer overfor immunoglobuliner - rheumatoid arthritis, antistoffer overfor glomerular basalmembran - Glomerulonephritis, Goodpastures syndrom, idiopatisk primær hemasiderosis, antistoffer overfor erythrocytter - autoimmun hemolytisk anemi, antistoffer overfor skjoldbruskkjertelen - Hashimotos sykdom, antistoffer overfor grensefaktor - pernisiøs anemi, antistoffer overfor blodplater - idiopatisk thrombocytopenisk purpura, alloimmunisering, antistoffer overfor mitochondria - primær gallecirrhosis, antistoffer overfor spyttgangceller - Sjøgrens syndrom, antistoffer overfor binyrene - idiopatisk binyreatropati, antistoffer overfor thyroid microsomal - Graves sykdom, antistoffer overfor thyroglobulin - Addisons sykdom og antistoffer overfor holmeceller - Diabetes mellitus.

Paraproteinemia slik som multippel myeloma, macro-globulinemia, cryoglobulinemia og lett kjedesykdom,

hyperlipidemia slik som primær gallecirrhosis og familial hypercholesterolemia.

Endocrinopatier slik som Graves sykdom og Diabetes mellitus.

Alloimmunisering slik som hemolytisk sykdom av nyfødte og renal homotransplantasjpnsawisning.

Også egnet for behandling under anvendelse av foreliggende oppfinnelse er f.eks. posttransfusjon purpura og auto-antistoffsykdommer slik som Goodpastures syndrom, Myasthenia gravis, Pemphigus vulgaris, hematologiske sykdommer, idiopatisk (autoimmun) thrombocytopenisk purpura, autoimmun hemolytisk anemi, inhibitor overfor faktor VIII og poly-radiculopati/Guillain-Barre syndrom.

Immunkomplekssykdommer kan også behandles og innbefatter f. eks. systemisk Lupus Erythematosus, Polyarthritis nodosa, cutan vasculitis, rheumatoid arthritis, Glomerulonephritis og Dermatomyositis i.

Selv om man ikke vil slutte seg til noen bestemt teori overfor noen annen, antyder en gjennomgang av det sannsynlige forløp for autoimmun patologi at den patologiske sekvens sannsynligvis startes av en fri antigenutfordring, etter-fulgt av antistoffutvikling og kompleksdannelse, og avsluttes med antistoffoverskudd og komplementbinding av dannede komplekser. Riktig valg av den biospesifikke polymerformulering og tilveiebringelse av riktig virkning vil nødvendiggjøre preliminære diagnostiske prosedyrer for å bestemme den dominerende form av den autoimmune fremkaller. E<J>, illustra-tivt eksempel på dette er beskrevet i det etterfølgende for behandling av rheumatoid sykdom. Kort kan rheumatoid sykdom karakteriseres som å følge forløpet fra a) fri RF antigen (atypisk lg) (rheumatoid tilstand), b) fri RF antistoffutvikling og RF kompleksdannelse og til slutt c) antistoffoverskudd og komplementaktivert RF kompleksbinding. Behandling av rheumatoid sykdom i dens tidlige utvikling kan således bestemmes ved påvisning av atypiske immunoglobuliner med monoklonale rheumatoid faktor (m-RF) antistoffer. Behandling på dette trinn vil best kunne utføres med m-RF-aktiverte biospesifikke polymerer for å fjerne det provoserende antigen og således forhindre utvikling av endogene RF (e-RF) antistoffer. Diagnostisk bevis på e-RF vil indikere anvendelse av biospesifikke polymerer som både har m-RF og aggregert gammaglobulin-aktive biologiske substanser (RF antigen). Alternativt kan to biospesifikke polymerer i serie anvendes, som hver har én type av aktiv biologisk substans. I hvert tilfelle vil denne kombinasjon av m-RF og aggregert gammaglobulin adsorbere både det provoserende anti-

gen og antistoffmolekyler for å stanse sykdomsforløpet.

I det tilfelle hvor signifikante nivåer av RF antigen-anti-stoffkompleks påvises, kan biospesifikke polymerer inneholdende Clq og/eller collagen effektormolekyler anvendes. Hvis endelig sykdomsprosessen har utviklet seg til komplementbinding av dannede immunkomplekser, kan en effektiv bio-spesif ikk polymer inneholde ett eller flere anti-komplement-antistoffer slik som f.eks. anti-Clq, anti-C3 eller anti-C4. Igjen kan de biologiske substanser - hvis mer enn én er ønskelig, være immobilisert på enkel bioforenelig bærer eller hver kan være på en separat bærer og kobles i serie i for-hold til blod- eller plasmastrømningen.

Som ovenfor foreslått, oppnåes effektiv bruk av oppfinnelsen gjennom grundig definering av dynamikken og graden av immunrespons for å oppnå effektiv sykdomsbehandling.

I dag er plasmaferese og cytoferese de sykdomsbehand-linger som anvendes for fjerning av skadelige substanser eller celler fra blodet. Det er for tiden antatt at enhver sykdom som behandles med plasmaferese og/eller cytoferese, hvor det ønskede resultat er fjerning av en spesifikk substans, med fordel kan anvendes med produktet ifølge oppfinnelsen.

Nærmere bestemt kan et terapeutisk system som for tiden taes i betraktning for helblod, illustreres som følger: a) en vaskulær adgang tilveiebringes som vil muliggjøre:

b) en blodstrømning på fra 30 ml/min til 200 ml/min,

c) et antikoaguleringsmiddel administreres til blodet, og

d) en pumpeanordning tilveiebringes,

e) blodet bringes i kontakt med produktet ifølge oppfinnelsen, f) avhengig av det anvendte antikoaguleringsmiddel kan ytterligere medikamentering være nødvendig eller ønsket for å nøytralisere den antikoagulerende effekt på det behandlede blod, g) det behandlede blod returneres til pasienten.

Tidsrammen som for tiden taes i betraktning for det ovenfor illustrerte system, er fra 2 timer til 4 timer. Det taes selvsagt i betraktning at en slik tidsramme kan enten forkortes eller forlenges avhengig av situasjonen.

Et terapeutisk system som for tiden taes i betraktning for plasma, kan illustreres som følger: a) en vaskulær adgang tilveiebringes som vil muliggjøre

b) en blodstrømning på fra 30 ml/min til 200 ml/min,

c) et antikoagulasjonsmiddel administreres til blodet,

og

d) en pumpeanordning tilveiebringes,

e) separasjonsanordninger for å tilveiebringe en plasma-rik blodkomponent, tilveiebringes, f) plasma føres i kontakt med produktet ifølge oppfinnelsen, g) filtrering foretaes gjennom et 0,2^um filter for å fjerne enhver mikroemboli, bakterier og/eller fungi, h) det behandlede plasma og de dannede blodkomponenter rekombineres,

i) avhengig av den anvendte antikoagulant kan ytterligere medikamentering være nødvendig eller ønskelig for å nøytralisere den antikoagulerende effekt på det behandlede blod,

j) det behandlede blod returneres til pasienten.

Den vaskulære adgang kan tilveiebringes under anvendelse av velkjente teknikker og prosedyrer innen medisinen. Således kan f.eks. en iboende stor borekanyle anvendes intravenøs eller arterielt. Eksempler på egnede vener og arterier innbefatter antecubitalvenen, nøkkelbensvenen og brachial- eller radial-arteriene. Det skal ennvidere forståes at en arteri-ell venøs shunt eller fistel (AV-shunt) også kan anvendes. I dette tilfelle er hjertet pumpeanordningen. Hvis en AV-shunt eller fistel ikke anvendes, er den foretrukne pumpeanordning under venøs adgang en peristaltisk pumpe som er i stand til å tilveiebringe en strømningshastighet på fra 30 ml/min til 200 ml/min.

Egnede antikoaguleringsmidler som er anvendbare ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, innbefatter surt citrat (ca. 1 ml til hver 8. ml helblod), heparin, heparin/surt citrat-dextroseblandinger (f.eks. 1250 IU heparin i 125 ml surt citrat-dextrose/L), og prostaglandin. Ved anvendelse av antikoaguleringsmidler slik som heparin og prostaglandiner skal det generelt forståes at en motvirkende medikamentering må administreres til det behandlede blod eller plasma før returnering eller administrering av angitte blod eller plasma til en pasient.

Når det gjelder behandling av plasma, skal det ennvidere forståes at en hvilken som helst konvensjonell metode for å fjerne de dannede blodkomponenter kan anvendes. Egnede eksempler på metoder for separering av plasma fra dannede blodkomponenter innbefatter plasmaferese, sentrifugal celle-separasjon og cellesedimentering i en plasmapose. Hvor det er mulig, kan både kontinuerlig separasjon og satsvis separasjon være egnet, idet de ovenfor angitte metoder for separering er uavhengig av oppfinnelsen og dens bruk..

Formen på produktet ifølge oppfinnelsen er generelt ikke kritisk. Således kan oppfinnelsen utnytte en bioforenelig bærer inneholdende den biologiske substans i form av ark, hulfibre, sylindriske fibre, nettverk, sylindriske eller rektangulære kanaler, perler og kombinasjoner derav. Anvendelse av fluidisert skikt kan også være fordelaktig i enkelte tilfeller.

Eksempel 1

Dette eksempel beskriver en metode for støping av den bioforenelige polymerbærer og en metode for kjemisk binding av en biologisk substans direkte til polymerbæreren. Dette eksempel anvendes også for å beskrive anvendelse av et system som ikke har noen mekanisk bærer forbundet dertil. Absorpsjon av anti-insulin-antistoffer under anvendelse av insulin-aktivert polyhydroxyethylmethacrylat (p-HEMA)-membran

A. Polymerstøplng

Monomerløsninger ble fremstilt ved å kombinere 15,0 g 2-hydroxyethylmethacrylat, 15,0 g ethylenglycol, 0,08 g natriumbisulfitt og 0,036 g ammoniumpersulfat. Løsningen ble omrørt i 15 minutter ved romtemperatur.' Ca. 5 ml av løsningen ble anbrakt på en glassplate (12,7 x 12,7 x 0,952 cm) i sentret av et polyethylen-skillestykke (10 mil tykt) kuttet under dannelse av en pakning med et vindu på 10,16 x 10,16 cm. En andre glassplate ble anbrakt over pakningen og løsningen, ble klemt på plass, og hele montasjen ble inkubert ved 60°C over natten. Klemmene ble fjernet, og glassplatene ble trukket forsiktig fra hverandre og overført til et avionisert vannbad i minst 24 timer. Den svellede polymermembran ble forsiktig fjernet fra glassplaten og ble skylt-hydratisert i minst 3 dager i friskt, utbyttet, avionisert vann (500 ml pr. dag).

B. Polymeraktiyerlng

Membranskiver (5 mm diameter) ble kuttet fra polymerarket for aktivering og analyse. En 10-20 g% cyanogenbromidløs-ning ble fremstilt ved oppløsning av 1,69 g finoppdelt BrCN-krystaller i 10 ml 0,2 M Na2C03 (pH 11,1) under kontinuerlig omrøring ved 4 C. pH på løsningen ble opprettholdt over 11 ved dråpevis tilsetning av 5N NaOH inntil krystallene var opp-løst og pH var stabilisert. 4 membranskiver ble anbrakt i en liten sikt og skylt med ca. 5 ml 0,1N HC1 og inkubert i 15 minutter i cyanogenbromidløsningen. Skivene ble hver skylt minst to ganger til med 5 ml porsjoner av 0,1N HC1 og ble inkubert over natten i 5,0 ml U-100 regulær "Iletin" insulin-injeksjonsløsning som var blitt justert til pH 8,7 ved tilsetning av IN NaOH. Membranskivene ble skylt med 5 ml 0,5M NaCl, 0,1M Na2CO.j-løsning og 3 ganger i 5 ml prøver av fosfat (0,05M) bufret saltvann-(0,9 g%) løsning (pH = 7,4).

C. Vurdering av membranadsorpsjon av anti- lnsulln- antlstoff

En dobbelt kokurrerende radioimmuno-antistoff-bindingsbestemmelse ble utført ved inkubering av 560 picogram 125

I -merket svineinsulin og seriefortynninger (980 til 15 picogram) av ikke-merket svineinsulin eller p-HEMA-membranskivene med 280 pg marsvin anti-svineinsulin-antistoff i 0,5 ml fosfat-(0,05M) bufret (pH 7,4) saltvann (0,9 g%) inneholdende 1 g% okseserumalbumin i 2 timer ved romtemperatur. p-HEMA-skivene ble fjernet fra hver testløsning. En 0,1 ml prøve av geite-anti-marsvin gammaglobulin ble tilsatt til hvert testrør. Testløsningene ble blandet og inkubert i ytterligere 2 timer ved romtemperatur. En 1,0 ml prøve av kaldt(2-4°C) fosfatbufret saltvann (pH 7,4) ble tilsatt til hvert rør. Hver testløsning ble blandet og sentrifugert i 15 minutter ved 4°C ved 7500 G, og supernatanten ble dekantert i 20 ml scintillasjonsampuller. Supernatanten ble gelert med 5,0 ml Aquasol® væskeformig scintillasjonsvæske og telt i en Isocap 300

teller i 4,0 minutter. Insulinbehandlede membranskiver adsorberte 111 pg anti-insulin-antistoff fra løsningen eller 690 pg pr. cm 2 overflateareal.

Eksempel 2

Dette eksempel beskriver hvordan en uopplagret bio-spesif ikk membran kan fremstilles. Det beskriver også hvordan 6-aminocapronsyre (med en kjede på 6 carbonatomer) kan anvendes som en avstandsforbindelse for å feste insulin til den bioforenelige polymerbærer anvendt for å fjerne insulin-antistoff og adsorpsjon av anti-insulin-antistoff under anvendelse av den insulin-aktiverte poly-hydroxyethyl-methacrylat-(p-HEMA)-membran.

A. Polymerstøplng

Monomerløsninger ble fremstilt ved å kombinere 15,0 g 2-hydroxyethylmethacrylat, 15,0 g ethylenglycol, 0,08 g natriumbisulfitt og 0,036 g ammoniumpersulfat. Løsningen ble omrørt i 15 minutter ved romtemperatur. Ca. 5 ml av løsningen ble anbrakt på en glassplate (12,7 x 12,7 x 0,952 cm) i sentret av et polyethylen-avstandsstykke (10 mil tykt) kuttet under dannelse av en pakning med et vindu på 10,16 x 10,16 cm. En andre glassplate ble anbrakt over pakningen og løsningen, klemt på plass, og hele montasjen ble inkubert ved 60°C over natten. Klemmene ble fjernet, og glassplatene ble trukket forsiktig fra hverandre og overført til et avionisert yannbad i minst 24 timer. Den svellede polymermembran ble forsiktig fjernet fra glassplatene og ble skylt-hydratisert i minst 3 dager i friskt, utbyttet, avionisert vann (500 ml pr. dag).

B. Polymeraktivering

Membranskiver ble fremstilt som tidligere beskrevet i eksempel 1. En 10-20 g% cyanogenbromidløsning ble fremstilt ved å oppløse 1,69 g finoppdelte BrCN-krystaller i 10 ml 0,2M Na2C03 (pH 11,1) under kontinuerlig omrøring ved 4°C. pH på løsningen ble opprettholdt over 11 ved dråpevis tilsetning av 5N NaOH inntil krystallene var oppløst og pH var stabilisert. 4 membranskiver ble anbrakt i en liten sikt og ble skylt med ca. 5 ml 0,1N HC1 og ble inkubert i 15 minutter i cyanogenbromid-løsningen. Skivene ble hver skylt ytterligere minst to ganger med 5 ml porsjoner av 0,1N HC1 og ble inkubert over natten i 10 ml av en 10 g% 6-amino-capronsyreløsning (w/v), fremstilt i 0,1M Na2C03, 0,5M NaCl-bufferløsning, pH 8,6. Membranskivene ble skylt med 5 ml 0,1M Na2C03, 0,5M NaCl-buffer og tre 5 ml prøver av fosfat-(0,05M) bufret (pH 7,4) saltvahnsløsning (0,9 g%). Membranskivene ble fjernet fra skylleløsningen, ble aktivert ved inkubering i 10 ml av en 10%-ig (w/v) l-cyclohexan-3-(2-morfolinoethyl)-carbodiimid-løsning fremstilt i 0,1M (2-[N-morfolino]-ethansulfonsyre)- (MES) buffer (pH 6,0) i 30 minutter ved romtemperatur, og hver skive ble skylt i 5 ml kald (4°C) fosfatbufret saltvannsløsning. Duplikate membranskiver ble inkubert over natten i 5,0 ml av enten U-100 regulær "Iletin" insulininjeksjonsløsning eller regulær svineinsulin "Iletin"-løsninger ved 4°C. Membranskivene ble fjernet fra proteinløsningene og skylt tre ganger i 5 ml fos-

fatbufret saltvannsløsning.

C. Vurdering av membranadsorpsjon av anti- insulin- antistoff En dobbelt kokurrerende radioimmuno-antistoffbindings-125 bestemmelse ble utført ved inkubering av 560 pg I -merket svineinsulin og seriefortynninger (980 til 15 pg) av ikke-merket svineinsulin eller p-HEMA-membranskiver med 280 pg marsvin anti-svineinsulin-antistoff i 0,5 ml fosfat-(0,05M) bufret (pH 7,4) saltvann (0,9 g%) inneholdende 1 g% okseserumalbumin i 2 timer ved romtemperatur. p-HEMA-skivene ble fjernet fra hver testløsning. En 0,1 ml prøve av geite-anti-marsvin-gammaglobulin ble tilsatt til hvert testrør. Testløsningene ble blandet og inkubert i ytterligere 2 timer ved romtemperatur. En 1,0 ml prøve av kaldt(2-4°C) bufret saltvann (pH 7,4) ble tilsatt til hvert rør. Hver testløsning ble blandet og sentrifugert i 15 minutter ved 4°C ved 7500 G, og supernatanten ble dekantert i 20 ml scintillasjonsampuller. Supernatanten ble gelert med 5,0 ml Aquasol^7væskeformig scintillasjonsvæske og telt i en Isocap 300 teller i 4,0 minutter. Insulinbehandlede membranskiver adsorberte 271 pg anti-insulin-antistoff fra løsningen eller 690 pg pr. cm <2>overflateareal.

Eksempel 3

Dette eksempel beskriver en metode for støping av bioforenelige polymerbærere, både med og uten mekanisk under-støttelse, via rotasjonsstøping. Dette eksempel beskriver også en annen metode for kjemisk binding av den biologiske substans til den bioforenelige polymerbærer.

Adsorpsjon av anti-human immunoglobulin G(IgG) antistoff ('faktorer" av rheumatoid type) under anvendelse av immunoglobulin-aktivert polyhydroxyethylmethacrylat-co-glycidylmethacrylat-( p- HEGL) - membraner

I. Polymerstøplng

Det etterfølgende eksempel illustrerer fremstillingen

av både opplagrede og uopplagrede polymermembraner ved rota-

sjonsstøpeteknikker.

A. Rotasjonsstøpeanordning

Rotasjonsstøpeanordningen besto av en lukket aluminium-trommel med 6,35 mm tykke vegger. Innsidedimensjonene av trommelen var 10,16 cm i diameter og: 12,70 cm i lengde. Trommelen var koblet til en motor som roterte.trommelen, og trommelens omdreiningshastighet pr. minutt ble målt med et stroboskop-fototakometer. En varmeblåsepistol oppvarmet den roterende trommel, og termoelementer målte den indre trommeltemperatur og temperaturen på luften som strømmet over trommelen. Trommelen ble spylt med nitrogen før og under polymeriseringen.

B. Fremstilling av opplagret membran

Whatman hardt filterpapir av kvalitet 50 ble anvendt som underlag for å tilveiebringe mekanisk styrke for disse rotasjonsstøpinger. Papiret ble kuttet i rektangulære ark (12,53 x 31,59 cm) og ble deretter dyppet i ethylenglycol (EG) i 30 minutter ved romtemperatur. Overskudd av glycol ble fjernet fra papiret ved avrenning, og etter avrenningen inneholdt papiret 2-4 g EG. Det kondisjonerte papir ble krøllet i form av en sylinder og anbrakt på innsiden av rota-sjønsstøpetrommelen. Utsidekanten av papiret ble presset mot trommelveggen for å drive ut luft mellom veggen og papiret. Når papiret er på plass, er det foretrukket, men ikke nødven-dig, at endene av papiret støter an mot hverandre idet det kan være en viss overlapning. Papirbaksiden ble kontrollert med hensyn til luftlommer, og hvis slike var tilstede, ble disse fjernet med en gummibit.

For polymerisasjoner som gir en meget klebende polymer, kan rotasjonsstøpesylinderen først f6res med et ark av silikon-slipp-papir ved å anbringe den ikke-behandlede side av papiret mot sylinderen. Det kondisjonerte Whatman filterpapir kan deretter anbringes mot slipp-papiret forsiktig for ikke å innelukke luft.

C. Polymerisasjonsformuleringer

I det etterfølgende er angitt representative polymeri-sas jonsformuleringer som for tiden anvendes. I hvert tilfelle ble initiatoren omrørt med de reaktive monomerer ved romtemperatur i 30 minutter eller inntil initiatoren var opp-løst.

GMA-HEMA ( 50/ 50) copolymer

6,25 g 2-hydroxyethylmethanoxylat (HEMA)

6,25 g glycidylmethacrylat (GMA)

12,5 g ethylenglycol (EG)

0,02 g 2,2'-azobis-(2-amidinopropan)-hydroklorid (ABAP)

GMA- NVP- HEMA ( 50/ 40/ 10) copolymer

6,25 g GMA

1,25 g NVP

5,00 g HEMA

12,5 g EG<ft>

0,02 g ABAP

Ethylenglycolvekten innbefatter 2-4 g EG på Whatman-papiret.

D. Rotasjonsstøpeprosedyre

Mens initiatoren ble oppløst i monomerene, ble

trommelen anbrakt i rotasjonsstøpemontasjen. Trommelen ble drevet ved 1400 opm ved romtemperatur og ble spylt med nitrogen i 15 minutter, hvoretter initiator-monomerløsningen (25,0 ml) ble injisert i trommelen med en hypodermisk sprøyte med en fleksibel TefloiP^-spiss. Nitrogenspylingen ble gjentatt, og trommelhastigheten ble øket til 2900 opm.

Viften (ca. 990 l/min) og oppvarmeren på sprøytepistolen ble startet, og trommelen ble oppvarmet til 70-75°C i 90 minutter. Varmen ble deretter slått av, men viften fikk stå på for å avkjøle trommelen inntil den indre trommeltemperatur falt til ca. 30°C. Den avkjølte trommel ble fjernet fra rota-sjonsstøpeapparaturen og ble fylt med avionisert vann. Etter vannbehandling i 1 time ble det støpte produkt fjernet fra trommelen.

II. Polymeraktivering

Membranskiver ble fremstilt som tidligere beskrevet

i eksempel 1. 14 individuelle skiver ble hver inkubert i 1,0 ml 1,0M hexandiaminløsning i 72 timer ved 4°C. Skivene ble fjernet fra hexandiaminløsningen og ble vasket tre ganger med 2 ml fosfatbufret saltvannsløsning. En 4,0 g% human gammaglobulin-(HGG) løsning ble fremstilt ved å oppløse 4,0 g HGG i 100 ml 0,1M MES-buffer (pH 6,0) med forsiktig omrøring ved romtemperatur. Etter at proteinet var fullsten-dig oppløst, ble seriefortynninger foretatt med suksessive overføringer på 1,0 ml proteinløsning til 9,0 ml MES-løsning under dannelse av proteinkonsentrasjoner på 4 mg/ml, 400^ug/ml, 40^ug/ml og 4^ug/ml buffer. To individuelle polymerskiver ble hver inkubert i 0,5 ml av proteinløsningene og 0,5 ml av 0,25M l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-løsning fremstilt i MES-buffer i 72 timer ved 4°C. Hver membranskive ble fjernet fra proteinløsningen og skylt

3 ganger med 2 ml kaldt(4°C) fosfatbufret saltvann.

III. Vurdering av membranadsorpsjon av anti-IgG-antistoff fra fysiologiske løsninger

En radioimmunobestemmelse ble utført ved å inkubere

125

individuelle membranskiver med 10 ng I geite-anti-human-IgG 1 1,0 ml PBS som inneholdt 1,0 g% humant serumalbumin i

2 timer ved romtemperatur. Radioindikatorløsningen ble fjernet, og hver membran ble skylt tre ganger med 2,0 ml PBS-løsning. Membranene ble inkubert i den siste skylleløs-ning over natten ved 4°C. Individuelle membraner ble fjernet fra skylleløsningene og tellet i en Innotron hydragamma-teller hver i 1 minutt. Slag pr. minutt ble omdannet til desintegrasjoner pr. minutt (DPM) ved dividering med detektor-effekten. Mengden av adsorbert antistoff ble bestemt ved å dividere den midlere DPM med den spesifikke radioindikator-aktivitet. Følgende resultater ble erholdt:

Eksempel 4

Dette eksempel viser anvendelse av aminocapronsyre som en avstandsforbindelse for gammaglobulin.

Adsorpsjon av anti-humant Immunoglobulin G (IgG) antistoff ("faktorer" av rheumatoid type) under anvendelse av immunoglobulin-aktivert polyhydroxyethylmethacrylat-co-glycidylmethacrylat-membraner (p-HEGL).

A. Polymerstøpnlng

Rotasjonsstøpte p-HEGL-membraner ble fremstilt som beskrevet i eksempel 2.

B. Polymermodifiserlng ag aktivering

Membranskiver ble fremstilt og behandlet som beskrevet

i eksempel 2 med det unntak at 1,0M 6-aminocapronsyre ble anvendt istedenfor hexandiamin som modifiserings- og avstandsforbindelse.

C. Vurdering av membranadsorpsjon av anti-IgG antistoff fra fysiologiske løsninger

En radioimmunobestemmeIse ble utført som beskrevet i eksempel 3, og følgende resultater ble erholdt:

Eksempel 5

Dette eksempel viser anvendelse av albumin (molvekt 67.000) som en avstandsforbindelse for folat. Folatet anvendes for å fjerne folsyrebindende protein.

Adsorpsjon av folsyrebindende proteiner (FABP) med folat-albumin-aktivert polyhydroxyethylmethacrylat-membraner (p-HEMA):

A. Polymerstøplng

Filterpapir-opplagrede p-HEMA-polymermembraner ble rotasjonsstøpt som beskrevet i eksempel 2 under anvendelse av følgende polymerformulering:

15,0 g 2-hydroxyethylmethacrylat

15,0 g ethylenglycol

0,08 g natriummetabisulfitt

0,036 g ammoniumpersulfat

B. Polymermodifisering og aktivering

Et folsyre-okseserum-albuminkompleks ble fremstilt ved carbodiimidkondensasjon av folat-carboxylgrupper med albumin-amin-endegrupper. For å oppnå dette ble 200 mg folsyre oppløst i 8 ml 0,1N NaOH, og 400 mg l-cyclohexyl-3-(2-morfolinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluensulfonat ble opp-løst i 2,0 ml 0,1M MES-buffer (pH 6,0), og 1,0 g okseserumalbumin (BSA) ble oppløst i 40,0 ml 0,1M MES-buffer. Løs-ningene ble kombinert, blandet og inkubert i 72 timer ved 4°C. Det uomsatte folat og carbodiimid ble fjernet fra løsningen ved behandling av 20 ml av blandingen med 20 ml av en BSA (2,5 g%) - benkull (1,25 g%) suspensjon i 30 minutter ved 4°C. Suspensjonen ble sentrifugert i 15 minutter ved 3400 G ved 4°C, ble dekantert og filtrert gjennom et 0,22^,um filter.

Membranskiver ble fremstilt og behandlet med cyanogen-bromidløsning som tidligere beskrevet 1 eksempel 1. Etter at skivene var skylt i kald saltvannsløsning ble sett på 8 skiver tilsatt til og inkubert i 20 ml av enten fysiologisk saltvann, 160 mg% BSA eller den tidligere fremstilte folat-albuminkompleksløsning. Skivene ble inkubert i 72 timer ved 4°C. Hvert membransett ble fjernet fra løs-ningen, ble tørket og anbrakt i 20 ml saltvannsløsning ved 4°C for å skylles i minst 24 timer. Duplikate membraner ble behandlet med 8 ml 1% glutaraldehydløsning i 1 minutt og ble skylt over natten i 20 ml fosfatbufret saltvannsbuffer.

C. Vurdering av membranadsorpsjon av folsyrebindende protein ( FABP) fra fysiologisk løsning

En konkurrerende proteinbindende radiobestemmelse ble utført ved inkubering av 370 pg <3>H-pteroylglutaminsyre (PGA) og standardfortynninger (48 til 348 pg) av ikke-radioaktivt PGA eller p-HEMA-membranskiver med 234 pg bindende aktivitet av FABP (Kamen, B. A. og Caston, J. D., "Direct Radiochemical Assay for Serum Folate: Competition between <3>H-Folic Acid

and 5-Methyl-tetrahydrofolic Acid for a Folate Binder",

J. Lab. Clin. Med., 83, 164, 1974) i 1,0 ml 0,05M fosfat-buffer (pH 7,6) som inneholdt 20^ul folat fri, normal human-serum og 5 mg natriumascorbat. Radiobestemmelsesrørene ble blandet, inkubert i 30 minutter ved romtemperatur og 10 minutter ved 4°C. Individuelle membranskiver ble fjernet fra testløsningene, og 0,5 ml av en kald (4°C) BSA (2,5 g%) - benkull (1,25 g%) suspensjon ble tilsatt til hvert rør.

Alle testløsninger ble inkubert i 10 minutter ved 4°C og ble sentrifugert ved 2000 G i 15 minutter ved 4°C. Supernatantene ble dekantert i 20 ml scintillasjonsampuller. 12,0 ml væskeformig scintillasjonsvæske ble tilsatt til hver ampulle.

Prøvene ble telt i en Isocap 300 teller hver i 2 minutter.

Følgende resultater ble erholdt:

Claims (5)

1. Biospesifikk polymer, karakterisert ved at den består av k (a) en bioforenlig polymerbærer valgt fra en hydrogel eller modifisert cellulose, hvilken bioforenlig polymerbærer er bundet til en mekanisk stabil støttedel valgt fra renset cellulose, polyesterfiber, mikroporøse polyolefiner, bomullsduk, polystyren, polycarbonat, polyfenylenoxyd, nettformede polyurethaner og kombinasjoner derav; (b) eventuelt en avstandsforbindelse covalent bundet til angitte bioforenlige polymerbærer; og (c) en biologisk substans eller substanser immobilisert på angitte avstandsforbindelse eller på angitte polymerbærer, og hvorved den biologiske substans eller substanser bibeholder sin reaktivitet for binding av spesifikke patologiske fremkallere eller spesifikke grupper av patologiske fremkallere.

2. Biospesifikk hydrogelpolymer ifølge krav 1, karakterisert ved at angitte bioforenlige polymerbærer er valgt fra svakt tverrbundet hydroxyethylmethacrylat-homopolymer, hydroxyethylmethacrylat-homopolymer, copolymerisert hydroxyethylmethacrylat og glycidylmethacrylat eller glycidylmethacrylat, N-vinylpyrrolidon, hydroxyethylmethacrylat-terpolymer.

3. Biospesifikk polymer ifølge krav 1, karakterisert ved at den biologiske substans er insulin anvendt til å fjerne anti-insulin antistoff.

4. Biospesifikk polymer ifølge krav 1, karakterisert ved at den biologiske substans er renset gammaglobulin.

5. Biospesifikk polymer ifølge krav 1, karakterisert ved at avstandsforbindelsen er valgt fra 6-aminocapronsyre og albumin.