PL132453B1 - Process for preparing phosphatidyl choline,containing an oil and/or phosphatidyl ethanolamine in specified reduced amounts - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia fosfatydylocholiny, zawierajacej olej i/lub fos¬ fatydyloetanoloamine w okreslonych zmniejszonych ilosciach, z zawierajacych olej i/lub fosfatydyloeta¬ noloamine, rozpuszczalnych w alkoholu, surowych produktów fosfatydylocholinowych na drodze chro¬ matografii adsorpcyjnej, tzn. przez oddzielenie na tej drodze oleju i/lub fosfatydyloetanoloaminy w okreslonych ilosciach.W przemysle srodków spozywczych i kosmetycz¬ nych potrzebne sa mieszaniny fosfatydowe, zawie¬ rajace obok fosfatydylocholiny olej i/lub fosfatydy¬ loetanoloamine w scisle okreslonych ilosciach, mniej¬ szych od ich ilosci zawartych w produktach fosfaty¬ dylocholinowych, otrzymywanych z naturalnych fosfolipidów.Roslinne fosfatydy surowe, otrzymywane podczas wytwarzania oleju jadalnego, zawieraja obok fosfa¬ tydylocholiny równiez fosfaltydyloetanoloaminy i mono-, dwu i trójglicerydy (olej) oraz fosfatydy- loinozyt i inne, fosfor zawierajace estry gliceryny i substancje, takie jak peptydy, aminokwasy, stero¬ le, estry steroli, wolne kwa^y tluszczowe i pochodne weglowodanowe. Opisano juz liczne sposoby oddzie¬ lania zawartych w surowym fosfatydzie substancji towarzyszacych. Z reguly odoleja sie roslinny fos- fatyd w pierwszym etapie w acetonie (wylozeniowy opis Republiki Federalnej Niemiec DAS nr 1053299, opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 3268335, wyloze¬ niowy opis Republiki Federalnej Niemiec DAS nr 10 15 20 25 30 1047597) i nastepnie w drugim etapie ekstrahuje etanolem (opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 2725649).W trzecim etapie frakcje fosfatydu, rozpuszczalna w etanolu poddaje sie chromatografii kolumnowej w temperaturze nie przewyzszajacej 35°C (opis pa¬ tentowy St. Zjedn. Am. nr 3031478). Sposób ten prze¬ widuje odolejanie surowego fosfatydu acetonem, ekstrakcje odolejonego fosfatydu surowego etano¬ lem i pozostawienie tego ekstraktu w ciagu kilku dni. Unikano przewyzszania temperatury 35°C, po¬ niewaz panowal poglad, ze w temperaturze powyzej 35°C zachodzi rozklad fosfatydylocholiny. W przy¬ padku acetonowego odolejenia tworza sie w malych ilosciach produkty nastepcze acetonu, takie jak tlenek mezytylu, alkohol dwuacetonowy, foron i in¬ ne. Usuwanie tych toksycznych i z powodu charak¬ terystycznego zapachu wlasnego przeszkadzajaco dzialajacych substancji wymaga bardzo wysokich nakladów, a niekiedy nawet nie jest mozliwe. Poza tym acetonowe odolejanie jest zwiazane ze wzros¬ tem ilosci nadtlenków, których niekorzystne oddzia¬ lywania fizjologiczne sa znane.Alkoholowa ekstrakcja roslinnych fosfatydów su¬ rowych prowadzi do zawierajacych olej frakcji fos¬ fatydu (ogloszeniowy opis Republiki Federalnej Nie¬ miec DOS nr 2718797, opis patentowy Republiki Fe¬ deralnej Niemiec nr 1492952, wylozeniowy opis Re¬ publiki Federalnej Niemiec DAS nr 1692568), z któ¬ rej po chromatograficznej obróbce w temperaturze pokojowej mozna otrzymac zawierajaca olej fosfa- 132 453132 453 n tydylocholine uwolniona od fosfatydyloetanoloami- ny. W próbach wlasnych stwierdzono, ze udaje sie j^ll^iplanie^oiejli droga dodania malych ilosci wody i otrzymywani* bezolejowej fosfatydylocholiny o wysokim stogniu czystosci. Lacznie jednak to -wodnfrHDctotejahje stanowi w przypadku uzsykiwa- ili2LiSS2Si&^&Jfosfatydylocholiny, proces trzyeta- powy (ekstrakcja, chromatografia, odolejanie), któ¬ ry dodatkowo zwiazany jest z obróbka wodnych roztworów etanolowych.We wszystkich tych sposobach chodzi o oddzie¬ lenia calej ilosci tych substancji towarzyszacych od fosfatydylocholiny. Zadnym z tych sposobów nie mozna sterowac tak, zeby udawalo sie wytwarzac produkty fosfatydylocholinowe o scisle okreslonej, uprzednio zalozonej zawartosci oleju i/lub fosfaty¬ dylocholiny. Dalsza niedogodnoscia tych uprzednio znanych sposbów w skali technicznej jest okolicz¬ nosc, iz stosowany adsorbent, a mianowicie zasado¬ wy tlenek glinowy, jest po obróbce chromatogra¬ ficznej obciazony zanieczyszczeniami, zwlaszcza fos- fatydyloetanoloamina, totez trzeba go odrzucac.Kolejna niedogodnosc tkwi w tworzeniu lizofosfa- tydylocholiny podczas tej chromatografii [O. Ren- konen, J. Lipid. Res. 3, 181-3 (1962), D. Van Damme i wspólpracownicy, Int. Symp. Chromatogr. Elektro- phoresis, 5th, 1968 (pub. 1969), 268—78).Chromatografii na zelu krzemionkowym przypi¬ sywano dotychczas tylko znaczenie analityczne i preparacyjne. I tak fosfatydy w heksanowych roz¬ tworach nie adsorbuja sie na zelu krzemionkowym (japonski opis patentowy JA 77012202, opis paten¬ towy St. Zjedn. Am. nr 3869482), natomiast fosfaty¬ dy w roztworach alkoholowych zatrzymuja sie na zelu krzemionkowym [H. Richter i wspólpracowni¬ cy, Pharmazie, 1977, 32 (3), 164]. Te rozmaite zacho¬ wania nalezy wyjasniac tworzeniem lipifilowych, wieloczasteczkowych micel fosfatydu w heksanie w porównaniu z wystepujacymi w postaci czastecz¬ kowej fosfatydami w alkoholu. Chromatografie te równiez i tu prowadzi sie w temperaturze pokojo¬ wej. Rozdzielanie i selektywna desorbcja fosfaty- dów w przypadku stosowania alkoholowych roztwo¬ rów fosfatydu nastepuje albo za pomoca ukladu alkohol/amoniak (japonski opis patentowy JA49093400) albo za pomoca mieszanin chloroformu z metanolem [C. H. Lea i wspólpracownicy, Bio- chem. J. 60, 353—63 (1965)] lub mieszanin chloro¬ form (metanol) woda (opis patentowy Niemieckiej Republiki Demokratycznej nr 79916). Ta droga po¬ stepowania nie miala dotychczas zadnego znaczenia, poniewaz jako eluent zawsze stosowano mieszanine substancji toksycznych, takich jak amoniak lub chloroform, których odzyskanie i usuniecie z lecy¬ tyny jest bardzo nakladochlonne.Dostepne w handlu surowe produkty fosfatydy¬ locholinowe, zwlaszcza z fosfatydów sojowych, sta¬ nowia produkty otrzymane droga ekstrakcji alko¬ holem, które sa rozpuszczalne w alkoholu oraz za¬ wieraja olej i fosfatydyloetanoloamine jako glówne zanieczyszczenia. Sa jednak, tez takie surowe pro¬ dukty fosfatydylocholinowe, które, jak juz wspom¬ niano, zawieraja jeszcze tylko jeden z dwóch glów¬ nych zanieczyszczen.Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu otrzymywania fosfatydylocholiny, zawiera¬ jacej olej i/lub fosfatydyloetanoloamine w okreslo¬ nych zmniejszonych ilosciach, droga oddzielenia ok¬ reslonego udzialu oleju i/lub fosfatydyloetanoloami- 5 ny, ewentualnie zawartych w fosfatydylocholino- wych produktach rozpuszczalnych w alkoholu. Spo¬ sób ten powinien umozliwiac otrzymywanie takich produktów fosfatydylocholinowych, które zawiera¬ lyby jedno lub oba z tych zanieczyszczen w okres- io lonej, w porównaniu z zanieczyszczeniem dostep¬ nych w handlu surowych produktów fosfatydylo¬ cholinowych zmniejszonej ilosci uzaleznionej od tego, jaka zawartosc oleju i/lub fosfatydyloetanolo- aminy wymaga sie w przypadku stosowania w prze- !5 mysle srodków spozywczych lub w przemysle kos¬ metycznym.Stwierdzono nieoczekiwanie, ze z-rozpuszczalnych w alkoholu, frakcji fosfatydowych, zawierajacych olej i/lub fosfatydyloetanoloamine, za pomoca chro- 20 matografii kolumnowej na zelu krzemionkowym w wysokiej temperaturze mozna wytwarzac tego ro¬ dzaju produkty fosfatydylocholinowe.Sposób otrzymywania fosfatydylocholiny, zawie¬ rajacej olej i/lub fosfatydyloetanoloamine w okres- 25 lonych zmniejszonych ilosciach, zawierajacych olej i/lub fosfatydyloetanoloamine, rozpuszczalnych w al¬ koholu, surowych produktów fosfatydylocholinowych na drodze chromatografii adsorbcyjnej polega we¬ dlug wynalazku na tym, ze roztwór, zawierajacego 30 olej i/lub fosfatydyloetanoloamine i w alkoholu rozpuszczalnego, produktu fosfatydylocholinowego w nizszym alkanolu o 1—4 atomach wegla lub w mieszaninie kilku nizszych alkanoli o 1—4 atomach wegla, ewentualnie zmieszanym lub zmieszanej z co 35 najwyzej 20% wagowymi wody, wprowadza sie w podwyzszonej temperaturze do ponizej 60°C na ko¬ lumne z zelem krzemionkowym, w tej temperaturze kolumne te eluuje sie za pomoca nizszego alkanolu o 1—4 atomach wegla i oddziela sie przy tym wstep- 40 ny odciek, zawierajacy olej i/lub fosfatydyloetanolo¬ amine w takiej ilosci, by zawartosc oleju i/lub fos- fatydyloetanoloaminy w fosfatydylocholinie ulegla zmniejszeniu, a od niego osobno zbiera sie eluat o okreslonej zmniejszonej ilosci oleju i/lub fosfatydy- 45 loetanoloaminy, zawierajacy fosfatydylocholine, a z tego eluatu na znanej drodze oddziela sie rozpu¬ szczalnik.Korzystnie jako eluent wprowadza sie stosowany rozpuszczalnik, co szczególnie upraszcza postepowa- 50 nie. Jako nizszy alkanol o 1—4 atomach wegla sto¬ suje sie korzystnie etanol.Ilosc wstepnego odcieku zalezy od wprowadzonego produktu fosfatydylocholinowego i od zadanych od¬ dzielanych ilosci oleju iyiub fosfatydyloetanoloami- 55 ny. W odcieku wstepnym w zaleznosci od zastoso¬ wanego produktu fosfatydylocholinowego znajduja sie takze inne, zwykle obecne substancje towarzy¬ szace, takie jak sterole, pochodne steroli, glikolipidy i fosfolipidy, które mozna doprowadzac do dalszego 60 stosowania.Droga latwych metod analitycznych mozna ustalic, od którego momentu podczas kazdorazowo stoso¬ wanej podwyzszonej temperatury odciek wstepny zawiera ilosc w takim zakresie, w którym zawartosc 65 . w fosfatydylocholinie jest w porównaniu z zawar-5 132 453 6 toscia wsubstracie fosfatydylocholinowym zmniej¬ szona tak, ze cala ilosc dalej jako odciek glówny na¬ stepujacego eluatu daje po oddzieleniu rozpuszczal¬ nika produkt fosfatydylocholinowy, który zawiera olej i/lub fosfatydyloetanoloamine w zadanym za¬ kresie ilosci, zmniejszonej wzgledem substratu.Jako zel krzemionkowy mozna stosowac tradycyj¬ ne produkty o rozmaitym uziarnieniu do celów chromatografii albo tez prasowany zel krzemionko¬ wy, ewentualnie zaktywowany lub dezaktywowany.Korzystnie stosuje sie obojetne produkty z zelu krzemionkowego.Sposób wedlug wynalazku mozna przeprowadzac pod cisnieniem normalnym lub tez pod cisnieniem zwiekszonym. Zupelnie szczególna zaleta sposobu wedlug wynalazku polega na tym, ze zel krzemion¬ kowy po przeprowadzonej chromatografii mozna stosowac ponownie. Po zebraniu eluatu glównego zel pozostaje obciazony tylko nieznaczna iloscia szczatkowa fosfatydylocholiny. Dalsza zaleta zelu krzemionkowego tkwi w bardzo wysokiej obciazal¬ nosci tego irodka sorpcyjnego. I tak w kolumno¬ wym rozdzielaniu chromatograficznym za pomoca 100 czesci zelu krzemionkowego oddziela sie okolo 60 czesci substancji stalej z rozpuszczalnej w alko¬ holu frakcji i fosfatydu.Przyklady. Metody analityczne. Fosfatydy analizowano na drodze chromatografii cienkowarst¬ wowej. Zawartosc oleju porównywano z zawartoscia dajaca sie dializowac. Wode oznaczono metoda Karl'a Fischer'a, a resztkowa zawartosc etanolu ok¬ reslano droga chromatografii gazowej.Chromatografia kolumnowa. Stosowano kolumne chromatograficzna o podwójnym plaszczu (wew¬ netrzna srednica 4,5 cm, wysokosc 37 cm). Przed ko¬ lumna wlaczono wymiennik ciepla w celu zapewnie¬ nia jednakowej temperatury zasilania i temperatury kolumny. Kolumne napelniono zawiesina 200 g zelu krzemionkowego (firmy Merck) w kazdorazowo po¬ danym rozpuszczalniku. Po zakonczonej chromato¬ grafii mozna zel krzemionkowy wykorzystac ponow¬ nie.Substrat. Surowy fosfatyd sojowy ekstrahuje sie w temperaturze 35°C za pomoca 95% objetosci eta¬ nolu w stosunku wagowym 1 :2,5 (surowy fos¬ fatyd: etanol). Osad oddziela sie w temperaturze pokojowej od nad nim polozonej warstwy etanolo- wej. Warstwe etanolowa odparowuje sie. Przy tym 10 15 20 30 35 40 45 fosfatydyloetanoloamina (PE): 12% olej: 21% Te substancje stala, zanieczyszczona olejem i fos¬ fatydyloetanoloamina stosowano w przykladzie I.Stosowana w przykladzie II substancje stala od- olejona lecz zanieczyszczona przez fosfatydyloetano¬ loamine, wytworzono w sposób omówiony nizej.Z surowego fosfatydu sojowego oddziela sie olej acetonem i nastepnie odolejony fosfatyd ekstrahuje za pomoca 95% objetosciowo etanolu. Rozpu¬ szczalna w etanolu frakcje fosfatydowa odparowuje sie i poddaje analizie: zawartosc PC: 52% zawartosc PE: 20% Wytwarzanie stosowanej w przykladzie III sub¬ stancji fosfatydylocholinowej, zawierajacej olej lecz uwolnionej od fosfatydyloetanoloaminy, opisano w ogloszeniowym opisie Republiki Federalnej Niemiec DE-OS nr 2718797 (przyklad 3): zawartosc PC: 68% zawartosc oleju: 28% Stosowanie w przykladach I—III substratów fos- fatydylocholinowych, zanieczyszczonych olejem i/lub fosfatydyloetanoloamina, swiadczy o mozliwosci wy¬ korzystania w sposobie wedlug wynalazku surowych produktów fosfatydowyeh z róznych zródel pocho¬ dzenia. Przyklad I. Chromatografie kolumnowa pro¬ wadzi sie w róznych temperaturach: Zasilanie kolumny: po 118 g substancji stalej na 275 g 95% objetosciowo etanolu, eluent: 95% objetosciowo etanol dla 4 litrów eluatu, temperatura kolumny: 30°C, 40°C, 50°C, 55°C.Po zebraniu 1 litra odcieku wstepnego odbiera sie lacznie 3 litry odcieku glównego. Odciek glówny odparowuje sie i poddaje analizie. Wyniki zestawio¬ no w podanej tablicy.Przyklad II.Zasilanie kolumny: 110 g substancji stalej (rozpusz¬ czalna w etanolu frakcja z odolejonego fosfatydu surowego) w 40% 95% objetosciowo etanolu, eluent: 95% objetosciowo etanol dla 4 litrów eluatu, temperatura kolumny: 50°C.Po zebraniu 1 litra odcieku wstepnego odbiera sie lacznie 3 litry odcieku pozostalego (odcieku glów¬ nego). Odciek pozostaly odparowuje sie i poddaje analizie: Temperatura kolumny 30°C 40°C 50°C 55°C Wydajnosc1) substancji stalej 53% 42% 37% 35% Sklad PC 53% 67% 77% 86% PE 17% 11% 7% 3% olej 25% 17% 11% 6% inne * 5% 5% 5% 5% 1) w % wydajnosci teoretycznej w odniesieniu do sub¬ stancji stalej substratu; 2) inne skladniki otrzymana substancja stala ma nastepujacy sklad: fosfatydylocholina (PC): 43% 65 wydajnosc substancji stalej: 30% wydajnosci teoretycznej zawartosc PC: 86% zawartosc PE: 8%132 453 8 zawartosc oleju; < 1% wydajnosc PC w odniesieniu do substancji stalej substratu 50% wydajnosci teoretycznej Przyklad III.Zasilanie kolumny: 80 g substancji stalej (wytwo¬ rzonej wedlug DE-OS nr 2718797, przyklad 3) w 30 g 95% objetosciowo etanolu, eluent: 95% objetosciowo etanol dla 4 litrów eluatu, temperatura kolumny: 40°C.Po zebraniu 0,3 litra odcieku wstepnego odbiera sie 3,7 litra odcieku pozostalego (odcieku glównego).Odciek pozostaly odparowuje sie i poddaje analizie: wydajnosc substancji stalej: 68% wydajnosci teoretycznej zawartosc PC: 80% zawartosc oleju: 157o wydajnosc PC w odniesieniu do substancji stalej substratu 80% wydajnosci teoretycznej f W Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania fosfatydylocholiny, zawie¬ rajacej olej i/lub fosfatydyloetanoloamine w okres¬ lonych zmniejszonych ilosciach, z zawierajacych olej i/lub fosfatydyloetanoloamine, rozpuszczalnych 10 15 20 25 w alkoholu, surowych produktów fosfatydylocholi- nowych na drodze chromatografii adsorpcyjnej, zna¬ mienny tym, ze roztwór, zawierajacego olej i/lub fosfatydyloetanoloamine i w alkoholu rozpuszczal¬ nego, produktu fosfatydylocholinowego w nizszym alkanolu o 1—4 atomach wegla lub w mieszaninie kilku nizszych alkanoli o 1—4 atomach wegla, ewentualnie zmieszanym lub zmieszanej z co naj¬ wyzej 20% wagowymi wody, wprowadza sie w pod¬ wyzszonej temperaturze do ponizej 60°C na kolum¬ ne z zelem krzemionkowym, w tej temperaturze kolumne te eluuje sie za pomoca nizszego alkanolu o 1—4 atomach wegla i oddziela sie przy tym wstepny odciek, zawierajacy olej i/lub fosfatydylo¬ etanoloamine w takiej ilosci, by zawartosc oleju i/ /lub fosfatydyloetanoloaminy w fosfatydylocholinie ulegla zmniejszeniu, a osobno zbiera sie eluat o ok¬ reslonej zmniejszonej ilosci oleju i/lub fosfatydylo¬ etanoloaminy, zawierajacy fosfatydylocholine, i z te¬ go eluatu na znanej drodze oddziela sie rozpusz¬ czalnik. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie taki sam rozpuszczalnik do rozpuszcza¬ nia substratu fosfatydylocholinowego i do eluowa- nia kolumny z zelem krzemionkowym. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze jako nizszy alkanol o 1—4 atomach wegla sto¬ suje sie etanol.ZGK, Druk. im. K. Miarki w Mikolowie, zam. 7654/1131/5, 80 Cena 100 zl PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania fosfatydylocholiny, zawie¬ rajacej olej i/lub fosfatydyloetanoloamine w okres¬ lonych zmniejszonych ilosciach, z zawierajacych olej i/lub fosfatydyloetanoloamine, rozpuszczalnych 10 15 20 25 w alkoholu, surowych produktów fosfatydylocholi- nowych na drodze chromatografii adsorpcyjnej, zna¬ mienny tym, ze roztwór, zawierajacego olej i/lub fosfatydyloetanoloamine i w alkoholu rozpuszczal¬ nego, produktu fosfatydylocholinowego w nizszym alkanolu o 1—4 atomach wegla lub w mieszaninie kilku nizszych alkanoli o 1—4 atomach wegla, ewentualnie zmieszanym lub zmieszanej z co naj¬ wyzej 20% wagowymi wody, wprowadza sie w pod¬ wyzszonej temperaturze do ponizej 60°C na kolum¬ ne z zelem krzemionkowym, w tej temperaturze kolumne te eluuje sie za pomoca nizszego alkanolu o 1—4 atomach wegla i oddziela sie przy tym wstepny odciek, zawierajacy olej i/lub fosfatydylo¬ etanoloamine w takiej ilosci, by zawartosc oleju i/ /lub fosfatydyloetanoloaminy w fosfatydylocholinie ulegla zmniejszeniu, a osobno zbiera sie eluat o ok¬ reslonej zmniejszonej ilosci oleju i/lub fosfatydylo¬ etanoloaminy, zawierajacy fosfatydylocholine, i z te¬ go eluatu na znanej drodze oddziela sie rozpusz¬ czalnik.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie taki sam rozpuszczalnik do rozpuszcza¬ nia substratu fosfatydylocholinowego i do eluowa- nia kolumny z zelem krzemionkowym.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze jako nizszy alkanol o 1—4 atomach wegla sto¬ suje sie etanol. ZGK, Druk. im. K. Miarki w Mikolowie, zam. 7654/1131/5, 80 Cena 100 zl PL