PL126445B2 - Method of isolating and purifying "c" cytochrome from extracts obtained from hearths of pigs - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania i oczyszczania Cytochromu c z ekstraktów z serc wieprzowych, w skali przemyslowej, celem otrzymania preparatu o wysokiej czystosci, który moze byc uzyty w formie leku podawanego dozylnie.Cytochrom c jest jednym z niezbednych skladników ukladu cytochromowego bedacego ostatnim ogniwem lancucha utlenian komórkowych. W zwiazku z jego funkcja biologiczna, Cytochrom c stosuje sie w formie wlewów dozylnych w przypadkach, w których procesy utleniania tkankowego ulegaja uposledzeniu - na przyklad przy zatruciach tlenkiem wegla,gazem swietlnym i srodkami nasennymi. Cytochrom c dziala równiez skutecznie w przypadkach schorzen kardiologi¬ cznych jak dusznica bolesna, rozedma pluc, uszkodzenia miesnia sercowego, a takze w stanach przed i pooperacyjnych zapobiegajac wstrzasowi. Stwierdzono na przyklad, ze lek ten powodowal ustapienie boli i dusznosci u chorych z niedomoga wiencowa i wada krazenia, u których stosowanie tradycyjnej terapii nie dawalo rezultatów (Gaertner H., Gurda M., Blach A., Kosiniak-Kamysz A., JanuszL., (1976), Terapia i leki, IV/XXVI, 300-304.Wysokooczyszczone preparaty Cytochromu c stosowane sa takze szeroko w badaniach bio¬ chemicznych lancucha oddechowego i w dydaktyce a takze jako substancje wzorujace do kalibracji kolumn przy powszechnie uzywanej metodzie chromatografii na sitach molekularnych.Stan techniki Cytochrom c jest bialkiem stosunkowo stabilnym. Poczatkowo starano sie go wytracac z ekstraktów z serc zwierzecych za pomoca kwasu trójchlorooctowego, proces ten powodowal jednak jego denaturacje. Wszystkie wspólczesne sposoby izolownia Cytochromu c opieraja sie na zatezaniu i oczyszczaniu tej substancji na adsorbentach lub wymiennikach jonowych i wytracaniu zanieczyszczen siarczanem amonu. Jako adsorbentu uzywano tlenku glinu (Szczepkowski T.W., (1955), Acta Biochimica Polon., 2, 169-174), a z wymienników jonowych powszechnie stosowana jest zywica polistyrenowa z grupami karboksylowymi o nazwie handlowej Amberlit IRC 50 (BrodzickiCz., PayerchinF., (1969), Acta Polon. Pharm. 24, 177-179).Zaden ze znanych sposobów nie pozwala na wyodrebnienie czystego Cytochromu c w duzej skali w prosty sposób. Tlenek glinu wymaga uciazliwego przygotowania i wykazuje mala pojem-2 126 445 nosc. Amberlit IRC 50 jest latwiejszy w przygotowaniu i dlatego jest czesciej uzywany. Stosowana dotad adsorpcja Cytochromu c na kolumnie trwa, przy wiekszych objetosciach ekstraktu, kilka¬ nascie lub kilkadziesiat godzin, co jest niekorzystne zarówno z punktu widzenia zmian molekular¬ nych Cytochromu C jak i organizacji producji. Przy elucji stosuje sie najczesciej gradient stezenia soli, a wiec metode trudna do zastosowania w produkcji Cytochromu c w skali przemyslowej.Ponadto, wszystkie znane dotad metody sa wieloetapowe i czasochlonne, przy czym obejmuja kilka dlugotrwalych dializ. Wyzej wymienionych niedogodnosci nie zawiera postepowanie wedlug wynalazku.Istota wynalazku polega na doborze takich procesów izolowania i oczyszczania Cytochromu c z ekstraktów z serc wieprzowych oraz ich kolejnosci i sposobu technicznego przeprowadzenia, które gwarantuja, ze Cytochrom c o wysokiej czystosci otrzymuje sie w wyniku zaledwie trzyetapo- wego postepowania technologicznego a mianowicie: Etap 1 — I adsorpcja Cytochromu c na Amberlicie IRC 50 metoda „batch" przy pH 6,8-8,5, korzystnie 7,0 elucja jego roztworem amoniaku o stezeniu 2 mol/l — równiez metoda „batch" — oraz zobojetnianie eluatów kwasem solnym o stezeniu 5 mol/l.Etap 2 — wysalanie substancji towarzyszacych siarczanem amonu w ilosci 600 g/l zobojet¬ nionego eluatu oraz dializa od siarczanu amonu (do wody).Etap 3 — II adsorpcja Cytochromu c na amberlicie IRC 50 metoda „batch" przy pH 6,8-8,5 korzystnie przy pH 7 elucja jego roztworem amoniaku o stezeniu 2 mol/l — na kolumnie, dializa od amoniaku (do wody) i zobojetnienie wydializowanych eluatów kwasem solnym.W etapie 1 i 3, do adsorpcji Cytochromu c na Amberlicie IRC 50, a w etapie 1 takze do elucji, zastosowano metode „batch" zamiast najczesciej uzywanych kolumn chromatograficznych.Metoda ta polega na mieszaniu okreslonej ilosci adsorbenta z cala objetoscia plynu, z którego wyadsorbowuje sie wydzielana substancje i oddzieleniu adsorbenta od plynu po zakonczeniu prowadzonego procesu. Przy elucji zalewa sie adsorbent okreslona objetoscia eluatu, miesza sie przez pewien czas i w koncu oddziela od niego eluat zawierajacy izolowana substancje.Zastosowanie metody „batch" w 1 etapie do adsorpcji i elucji Cytochromu c z Amberlitu umozliwia przeprowadzenie tego procesu w skali przemyslowej w krótkim czasie: 6 do 8 godzin.Dodatkowo, aparature do elucji metoda „batch" mozna latwo zhermetyzowac przez co eliminuje sie zagrozenie zdrowia pracowników. Dalszym istotnym elementem ciagu technologicznego wed¬ lug wynalazku jest wprowadzenie procesu zobojetniania amoniakalnych eluatów po I adsorpcji, przez co eliminuje sie wielogodzinna dialize. W stosunku do znanej metody izolowania Cyto¬ chromu c z serc wieprzowych w skali przemyslowej (BrodzickiCz., PayerchinF., (1969), Acta Polon. Pharm. 24, 177-179), sposób wedlug wynalazku wielokrotnie skraca czas adsorpcji w etapie 1, eliminuje dialize I eluatów amoniakalnych, eliminuje pracochlonny i trwajacy 3-4 dni proces adsorpcji Cytochromu c na tlenku glinu, a nastepnie 48 godzinna dialize od amoniaku, oraz zezwala na zorganizowanie produkcji zgodnie z wymogami BHP.Sposobem wedlug wynalazku mozna izolowac Cytochrom c o wysokiej czystosci (kwalifikuja¬ cej go do sporzadzania leku do wstrzykiwan dozylnych) z ekstraktów z kilkuset kilogramów serc wieprzowych, w sposób bezpieczny dla personelu i przy zastosowaniu nieskomplikowanej apara¬ tury produkcyjnej. Powtarzalnosc technologii charakteryzuja dane zamieszczone w tabeli li.Czystosc spektralna Cytochromu c okresla sie przez stosunek absorbancji preparatu, zreduko¬ wanego dwutioninem sodu, przy dlugosci fali 550 nm (charakterystyczny szczyt pochlaniania swiatla przez Cytochrom c) do absorbancji preparatu, po utlenieniu zelazicyjankiem potasu, przy dlugosci fali 280 nm charakterystycznej dla wszystkich bialek zawierajacych aminokwasy aromaty¬ czne. Wartosc stosunku A550/A280 najbardziej oczyszczonych cytochromów ssaków lezy w grani¬ cach 1,22 do 1,26. Wszystkie preparaty przedstawione w tabeli 1 wykazuja czystosc, która kwalifikuje je do zastosowania w formie leku.Przyklad.Etap 1. Z 209 kg swiezych serc wieprzowych, usunieto tluszcz, skrzepy krwi i przerosniete tkanki. Uzyskano 150 kg miesnia sercowego, który zmielono w chlodni, zalano 3001 zimnej wody wodociagowej i pH zawiesiny ustawiono na 4,0 za pomoca kwasu solnego o stezeniu 2 mol/l. (Od tego momentu cala procedure izolowania Cytochromu c przeprowadzano w temperaturze 4 do 8°C). Ekstrakcje Cytochromu c prowadzono wolno mieszajac zawiesine, przez 3 godziny po czym126445 3 pH podwyzszono do 7,0 za pomoca roztworu wodorotlenku sodowego o stezeniu 2 mol/l. Czesci stale oddzielono saczac zawiesine przez geste plótno. Klarowny przesacz w objetosci 3001 przepom¬ powano do dwu reaktorów szklanych o pojemnosci roboczej 1501 i do kazdego z nich dodano stalego siarczanu amonu w proporcji 0,1 kg/1001 plynu i zregenerowany Amberlit IRC 50: 101/1001 plynu. Mieszano przez 4 godziny z szybkoscia 150 obrotów na minute a nastepnie dolnym spustem usunieto z reaktora Amberlit z zaadsorbowanym Cytochromem c (zabarwienie zywicy intensywnie rózowo-czerwone), przemyto dokladnie woda wodociagowa i partiami przenoszono do reaktora szklanego o pojemnosci roboczej 251, zalewano w nim równa objetoscia roztworu amoniaku o stezeniu 2 mol/l i mieszano przez 40 minut a nastepnie eluaty spuszczano dolnym spustem, w ukladzie zhermetyzowanym. Wszystkie eluaty zawierajace Cytochrom c (objetosc 301) polaczono w reaktorze szklanym i przy stalym mieszaniu, doprowadzono ich pH do 7,0 za pomoca kwasu solnego o stezeniu 5 mol/l. Wytraconego przy tym brunatnego osadu nie oddzielano, tylko przystapiono niezwlocznie do etapu 2.Etap 2. Do reaktora zawierajacego zobojetniony eluat Cytochromu c z I adsorpcji na Amberli- cie IRC 50 dodano 21 kg stalego siarczanu amonu (proporcja: 600 g siarczanu amonu na 11 zobojetnionego eluatu), mieszano 3 godziny od momentu rozpuszczenia a nastepnie wytracony osad odsaczono na bibule. Klarowny przesacz dializowano w workach tomofanowych do biezacej wody wodociagowej przez 48 godzin.Etap 3. 701 oddializowanego plynu przepompowano do reaktora o pojemnosci roboczej 1001 i dodano 2,11 zregenerowanego Amberlitu IRC 50 (31 Amberlitu na 1001 plynu) i mieszano przez 3 godziny. Nastepnie Amberlit z zaadsorbowanym Cytochromem c (zabarwienie zywicy czerwono- brazowe) przeniesiono do szklanej kolumny. Elucje prowadzono za pomoca roztworu amoniaku o stezeniu 2 mol/l. Pierwsze frakcje o zabarwieniu brunatnym odrzucano, a zbierano eluujace sie pózniej frakcje o intensywnie czerwonym, krwistym zabarwieniu. Eluat (21) dializowano do wody destylowanej przez 48 godzin, zobojetniono roztworem kwasu solnego o stezeniu 2 mol/l i przesa¬ czono przez bibule. Uzyskano 2,11 roztworu Cytochromu c o stezeniu 5 mg/cm3 i czystosci 1,28.Wydajnosc w cyklu produkcyjnym 11 g,co odpowiada wydajnosci 5,26 g/100 kg serc wieprzowych.Tabela 1.Wydajnosc oraz czystosc spektralna Cytochromu c izolowanego sposobem wedlug wynalazku Serca wieprz.Ckg) 192 195 131 163 286 286 209 Otrzymany Cytochrom c (g) 10,0 13,2 9,0 8,0 17,0 15,0 11,0 Czystosc spektralna A55 1,14 1,19 1,05 1,20 1,03 1,22 1,28 Wydajnosc (gCyt.c/1001 serc) 5,21 6,72 6,87 4,90 5,94 5,24 5,26 Zastrzezeniepatentowe Sposób izolowania i oczyszczania Cytochromu c z ekstraktów z serc wieprzowych, znamienny tym, ze Cytochrom c adsorbuje sie metoda „batch" na wymienniku jonowym Amberlit IRC 50 przy * pH 6,8-8,5, korzystnie przy pH 7,0 i eluuje metoda „batch" roztworem amoniaku o stezeniu 2 mol/l, eluaty zobojetnia kwasem solnym o stezeniu 5 mol/l i dodaje stalego siarczanu amonu w ilosci 600 g na kazdy litr zobojetnionego eluatu, a po odsaczeniu wytraconych substancji towarzy-4 126445 szacych usuwa sie z roztworu siarczan amonu przez dialize do wody i z wydializowanego roztworu ponownie adsorbuje sie Cytochrom c metoda „batch" na Amberlicie IRC 50 przy pH 6,8-8,5, korzystnie przy pH 7,0. eluuje na kolumnie roztworem amoniaku o stezeniu 2 mol/l i usuwa amoniak zeluatu przez dialize do wody, a w koncu roztwór po dializie neutralizuje kwasem solnym.Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 100 zl PL

Claims (1)

1. Zastrzezeniepatentowe Sposób izolowania i oczyszczania Cytochromu c z ekstraktów z serc wieprzowych, znamienny tym, ze Cytochrom c adsorbuje sie metoda „batch" na wymienniku jonowym Amberlit IRC 50 przy * pH 6,8-8,5, korzystnie przy pH 7,0 i eluuje metoda „batch" roztworem amoniaku o stezeniu 2 mol/l, eluaty zobojetnia kwasem solnym o stezeniu 5 mol/l i dodaje stalego siarczanu amonu w ilosci 600 g na kazdy litr zobojetnionego eluatu, a po odsaczeniu wytraconych substancji towarzy-4 126445 szacych usuwa sie z roztworu siarczan amonu przez dialize do wody i z wydializowanego roztworu ponownie adsorbuje sie Cytochrom c metoda „batch" na Amberlicie IRC 50 przy pH 6,8-8,5, korzystnie przy pH 7,0. eluuje na kolumnie roztworem amoniaku o stezeniu 2 mol/l i usuwa amoniak zeluatu przez dialize do wody, a w koncu roztwór po dializie neutralizuje kwasem solnym. Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz. Cena 100 zl PL