AT391480B - Verfahren zur herstellung des enzymes myeloperoxydase - Google Patents
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Description
Nr. 391480
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms Myeloperoxydase durch Reinigung und Aktivierung menschlicher Leukozyten, Aufschließen und Extraktion des erhaltenen Stoffes und Reinigung des Enzyms.
Das Enzym Myeloperoxydase kann als Diagnostikum in Infarktfällen verwendet werden, die Größe des Infarktes ist dem Myeloperoxydase-Spiegel im Gewebe proportional (Journal of Cardiovascular Pharmakology 7, 1154-1160,1985). Auch zwischen entzündlichen Erkrankungen und dem Myeloperoxydase-Spiegel besteht ein Zusammenhang (Blood, Vol. 60, No. 3, September 1982). Auch ein Herstellungsverfahren für Myeloperoxydase ist in der Literatur beschrieben (Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 245, No. 1,167-173/1986/ und Biochemistry, Vol. 3, No. 9,1234-1238/1964/), in dessen Verlauf jedoch nicht aktiviert wird.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms Myeloperoxydase durch Reinigung und Aktivierung menschlicher Leukozyten, Aufschließen und Extraktion des erhaltenen Materials und Reinigung des Enzyms. Für das Verfahren ist charakteristisch, daß man als Ausgangsstoff zur Herstellung von Interferon und Interleucin bereits verwendetes buffy coat verwendet, als Aktivierungsmittel Senday-Viren oder Concanavalin A, Phytohämagglutinin, aus Linsen (Lens culinaris) gewonnenes Lectin und Calcimycin (= Calcium Ionophor) einsetzt und bei der Reinigung des Enzyms den chromatographischen Reinigungsschritt an einer mit carboxymethyl-controlled pore-glass gefüllten Säule vamimmt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird demnach zur Herstellung der zur Induktion der Myeloperoxydase erforderlichen Interferon beziehungsweise hiterleucin 2 bereits genutztes buffy coat verwendet
Die Herstellung menschlichen Leukozyteninterferons ist in der HU-PS 182 209 beschrieben.
Die Reinigung und Aktivierung der Leukozyten, ihr Aufschluß und die sich anschließende Extraktion sowie die Reinigung des Enzyms werden in den folgenden Beispielen näher beschrieben, die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt
Beispiel 1
Reinigung der Leukozyten
Als Ausgangsstoff wird das sog. "buffy coat" verwendet, eine leukozytenreiche Fraktion, die bei der Auftrennung des nativen Blutes anfällt. Eine Einheit buffy coat enthält 1,4 x 10^ Leukozyten und hat ein Volumen von etwa 40 ml. Eine konzentrierte Variante davon ist handelsüblich, diese hat ein Volumen von 10 ml. Das buffy coat enthält neben Leukozyten auch Erythrozyten und Blutplasma. Bei der Reinigung müssen diese Stoffe entfernt werden.
Zu 100 Einheiten buffy coat (4000 ml bzw. 1000 ml) wird die dreifache Menge einer auf 0±4 °C gekühlten, 0,83 %igen Ammoniumchloridlösung gegeben, und der Ansatz wird für 10 Minuten zur Kühlung auf Eis gestellt. Dann werden die Zellen durch Zentrifugieren (1400 min'^, 20 Minuten lang) aus der Suspension abgesetzt, der Überstand wird abgegossen und die Zellmasse in etwa 400 ml PBS suspendiert
Zusammensetzung derPBS-Lösung: 8800 mgA 220 mg/1 3500 mg/1 224 mg/1
NaCl KCl
Na2HP04.12H20 NaH2P04. H20 pH: 7,2 - 7,4
Die Zellsuspension hat ein Volumen von etwa 500 ml, die Konzentration der Zellen beträgt 3 - 4 x 10** Zellen/ml.
Die Behandlung mit Ammoniumchlorid wird wiederholt mit dem Unterschied, daß zu einem Volumenteil Zellsuspension 9 Volumenteile 0,83 %ige Ammoniumchloridlösung gegeben werden.
Die nach dem Zentrifugieren erhaltene Zellmasse wird in 400 ml PBS erneut suspendiert, das Volumen der Suspension beträgt etwa 500 ml.
Beispiel 2
Aktivierung
Die Aktivierung dient dazu, die Leukozyten zur Produktion von Myeloperoxydase anzuregen. 500 ml Leukozytensuspension, die etwa 1,4 x 1011 Zellen enthält, werden in 10 000 ml Nährflüssigkeit folgender Zusammensetzung gegeben: mg/1 CaCl2 200 Fe(N03)3.9H20 0,1 KCl 400 MgS04.7H20 200 NaCl 6400 -2-
Nr. 391 480
NaHC03 2000 NAH2P04.H20 120
Glucose 4500
Phenolrot 10
Menschliches Blutserum, frei von Gammaglobulin 1000
Zum Aktivieren werden 15 ml einer Sendai-Virensuspension des Titers von 100 HA/ml verwendet. Das Gemisch wird bei 37°C 15-20 Stunden lang gerührt. Danach werden die Zellen durch Zentrifugieren (2000 g,
10 30 Minuten) aus der Nährlösung entfernt. Der Überstand wird verworfen, die Zellen werden in so viel PBS suspendiert, daß das Endvolumen der Suspension 500 ml beträgt
Beispiel 3
Aufschließen der Leukozyten 15 Um das Enzym Myeloperoxydase freizusetzen, müssen die Leukozyten aufgebrochen werden. Zu diesem Zweck wird die Zellsuspension siebenmal eingefroren und wieder aufgetaut. Das Einfrieren geschieht bei -70°C, das Auftauen bei Raumtemperatur.
Bei dieser Behandlung zerfallen die Zellen, und das Enzym geht in Lösung. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren (20 000 g, 60 Minuten) von der enzymhaltigen Lösung abgetrennt. 20
Beispiel 4
Reinigung der Myeloperoxydase
Die niedermolekularen Verunreinigungen werden durch Ultrafiltration entfernt Die Extrakte werden mit einem Ultrafilter AMICON DC-4 unter Verwendung eines Hollow fiber Einsatzes mit dem "cut off Wert von 25 100 000 diafiltriert Dieser Einsatz hält Moleküle einer Molmasse von über 100 000 zurück und läßt Moleküle mit einer unter 100 000 liegenden Molmasse durch. Die Enzymaktivität befindet sich in der Fraktion mit mehr als 100 000 Molmasse. Das Volumen der enthaltenen enzymhaltigen Fraktion wird auf etwa 200 ml eingestellt
Die Verunreinigungen werden durch Veränderung des pH-Wertes ausgefällt Zu der enzymhaltigen Fraktion (200 ml) werden 200 ml 0,1 M Kaliumcitratlösung (pH = 4) gegeben, wodurch 400 ml Lösung eines pH-Wertes 30 von etwa 4,5 entstehen. Durch die Veränderung des pH-Wertes fällt ein Teil der verunreinigenden Eiweiße aus. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (7000 g, 30 Minuten) entfernt. Der Überstand (etwa 350 ml) enthält das Enzym.
Chromatographie an einer CM-CPG-Säule a) Adsorption: Die 350 ml enzymhaltiger Fraktion (pH 4,5) werden mit einer Volumengeschwindigkeit von 35 100 ml/h auf eine chromatographische Säule C 16/20 gedrückt, die 20 ml CM-CPG enthält. Die unten an der Säule austretende Flüssigkeit wird rezirkuliert, wodurch eine effektivere Adsorption erreicht wird. Auf diese Weise wird eine Nacht lang bei 0...4°C adsorbiert. b) Wäsche I: Die Füllung wird mit 60 ml 0,1 M Kaliumcitratlösung (pH 4) gewaschen. Die Waschlösung zeigt keine Enzymaktivität, sie wird verworfen. 40 c) Wäsche II: Die Säule wird mit 60 ml PBS-Lösung gewaschen, die Waschlösung wird verworfen. d) Elution: Die Myeloperoxydase wird mit einer Lösung, die 1,5 M NaCl und 0,5 M TRIS enthält und einen pH-Wert von 8,2 hat, von der Säule gewaschen. Die Enzymaktivität erscheint in einer einzigen scharfen Fraktion, die ein Volumen von etwa 20 ml hat.
Chromatographie auf Acrylamid-Agarose Copolymer. 45 Die an der CM-CPG-Säule gewonnene enzymhaltige Fraktion (20 ml) wird auf eine 1800 ml Acrylamid-Agarose Copolymer (Handelsbezeichnung: ULTRAGEL AcA 54) enthaltende Säule K 50/100 aufgebracht und mit 2M NaCl/PBS-Lösung eluiert. In der Fraktion der Molmasse von 6040 - 8040 ist die Myeloperoxydase rein erhältlich. Zur Auswahl der entsprechenden Fraktionen wird die Säule vorher mit Hilfe von Molmasse-Standards kalibriert 50 Die Gesamtaktivität des erhaltenen Produktes beträgt durchschnittlich 2000/E, die ein Maß für die Reinheit des Produktes bildende spezifische Aktivität liegt bei 70-100/E/mg Protein. Die Konzentration beträgt 50/E/ml.
Die Bestimmung der Enzymmenge
Die Menge von Enzymen wird üblicherweise in auf Grund der Aktivität bestimmten Enzymeinheiten angegeben. Defintionsgemäß ist eine Einheit diejenigen Enzymmenge, die innerhalb einer Minute, bei 25°C, in 55 einem Medium vom pH 6,00 1 μΜ H202 zersetzt. Die Geschwindigkeit der Zersetzung des H202 kann spektrophotometrisch verfolgt werden. Genaue Beschreibung der Methode: G. Allan, P. Phattacherjee, C. D. Brook, N. G. Read, A. S. Parke: J. Cardiovasc. Pharm. 2,1154-1160 (1985).
Beispiel 5 60 Man verfährt auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise, verwendet zum Aktivieren statt des Senday-Virus jedoch Concanavalin A in einer Konzentration von 15 pg/ml. -3-
Claims (1)
- 5 Nr. 391 480 Beispiel 6 Man verfährt auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise, verwendet zum Aktivieren statt des Senday-Virus jedoch Phytohämagglutinin in einer Konzentration von 10 pg/ml. Beispiel 7 Man verfährt auf die Beispiel 2 beschriebene Weise, verwendet zum Aktivieren statt des Senday-Virus jedoch aus Linsen (Lens culinaris) gewonnenes Lectin in einer Konzentration von 30 μg/ml. 10 Beispiel 8 Man verfährt auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise, verwendet als Aktivierungsmittel jedoch Ca^-Ionophor (= Calcimycin). 15 PATENTANSPRUCH 20 25 Verfahren zur Herstellung des Enzyms Myeloperoxydase durch Reinigung und Aktivierung menschlicher Leukozyten, Aufschließen und Extraktion des erhaltenen Materials und Reinigung des Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff zur Herstellung von unter anderem Interferon oder Interleucin bereits verwendetes buffy coat verwendet, als Aktivierungsmittel Senday-Viren oder Concanavalin A, Phytohämagglutinin, aus Linsen (Lens culinaris) gewonnenes Lectin oder Calcimycin einsetzt und bei der 30 Reinigung des Enzyms den chromatographischen Reinigungsschritt an einer mit carboxymethyl-controlled pore-glass gefällten Säule vomimmt 35
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