Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu immunobioterapeutycznego przeciwko chorobom dróg oddechowych.Znane sa sposoby wytwarzania preparatów immunobioterapeutycznych sluzacych do zwal¬ czania róznych chorób. Ogólnie, sposoby te polegaja na hodowli w odpowiednim srodowisku hodowlanym okreslonych bakterii, a nastepnie na sporzadzeniu lizatów z tak wyhodowanych bakterii.Dotychczas nie byly opisane ani stosowane tego rodzaju preparaty przeciwko chorobom dróg oddechowych.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie nowy, bardzo skuteczny preparat przeciwko chorobom dróg oddechowych. Preparat ten uzyskano dzieki zastosowaniu specjalnie dobranych, nie stosowanych dotychczas w takim celu, szczepów bakteryjnych. Preparat otrzymany wedlug wynalazku jest bardzo skuteczny przeciwko chorobom dróg oddechowych, spowodowanych zaka¬ zeniem bakteriami rodzaju Staphylococcus, Streptococcus, Neiserria, Hemophilus i/lub Klebsiella.Preparat otrzymany sposobem wedlug wynalazku zawiera lizat jednego lub wiecej szczepów sposród Staphylococcus aureus 1-049, 1-050, 1-051, 1-052,1-053 i 1-054, Streptococcus viridans 1-046, 1-047 i 1-048 i Neisseria catarrhalis 1-045 oraz Hemophilus influenzae serotyp b NCTC 8467, Diplococcus pneumoniae serotypy 1, 2, 3 i 47, NCTC 7465, 7466, 7978 i 10319, Klebsiella pneumoniae NCTC 204 i 5056, Klebsiella ozaemae NCTC 5050, Streptococcus pyogenes serogurpa A NCTC 8191 i Neisseria catarrhalis NCTC 3622i 3625.Szczepy oznaczone symbolami NCTC sa skatalogowane i ogólnie dostepne w National Collection of TypeCulturas, Londyn, natomiast oznaczone symbolami I zostaly zlozone 14 marca 1978 r. w Callection national de cultures de microorganismes Institit Pasteur, Paryz,przez zglasza-* jacego niniejszy wynalazek.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze poddaje sie hodowli w pozywce jeden lub wiecej szczepów sposród Staphylococcus aureus 1-049, 1-050, 1-051, 1-52, 1-53 i 1-54, Streptococcus vinidians 1-046,1-047 i 0-48, Neisseria catarrhalis 1-045, Hemophilus influenzae serotyp b NCTC2 126 416 8467,Diplococcus pneumoniae serotypy 1, 2, 3 i 47, NCTC 7465, 7466, 7978 i 10319, Klebsiella pneumoniae NCTC 204 i 5056, Klebsiella ozaneae NCTC 5050, Streptococcus pyogenes serogrupa A NCTC 8191 i Neisseria catarrhalis NCTC 3622 i 3625, a z wyhodowanych bakterii sporzadza sie lizat, który miesza sie z odpowiednim nosnikiem farmaceutycznym w takich proporcjach, aby dawka dzienna zawierala 1-50 miliardów bakterii.Pozywka hodowlana ma dla kazdego szczepu bakteryjnego ten sam sklad podstawowy, a mianowicie korzystnie zawiera w 1 litrze wody 22,5g bulionu miesnego, 7,5g wyciagu z drozdzy, 2,5gchlorku sodu, 0,5goctanu sodu, 2,0gwodorofosforanudwusodowego, 2,0ml 70%mleczanu sodu, 2,0ml 50% mleczanu amonu, 3,0mg aneuryny , 3,0mg kwasu nikotynowego i 3,0gglukozy, przy czym powyzszy sklad moze zmieniac sie w granicach ±5%.Powyzke sterylizuje sie przez autoklawowanie lub przez saczenie.Lizat komórek bakteryjnych korzystnie sporzadza sie wedlug nastepujacej zasady: posiew kultury bakteryjnej inkubacja zebranie bakterii -natezenie — zawiesina mianowanie zawiesiny bakteryjnej liza mieszanina lizatów — koncentrat natywny sterylizacja przez saczenie —koncentrat lizatów bakteryjnych.Hodowle bakterii prowadzi sie sposobami konwencjonalnymi w bakteriologii, w warunkach najkorzystniejszych dla namnazania.Hodowle w pozywkach plynnych po zakonczeniu inkubacji mianuje sie, szczep po szczepie, nefelometrycznie lub mikroskopowo. Nastepnie odwirowuje sie komórki bakteryjne, zawiesza w roztworze fizjologicznym, roztwór ponownie mianuje i poddaje komórki lizie alkalicznej (pH9do 10), w temperaturze od 20 do 40°C. Jako srodki do lizy alkalicznej stosuje sie miedzy innymi wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu oraz pierwszo-, drugo- i trzeciorzedowe aminy.Lize prowadzi sie w ciagu 1-5 dni, pod kontrola mikroskopowa.Hodowle w pozywkach stalych przerabia sie zwyklymi sposobami. Otrzymane zawiesiny komórek bakteryjnych mianuje sie, szczep po szczepie i poddaje lizie alkalicznej, jak wyzej opisana.Objetosc lizatu kazdego szczepu oblicza sie na podstawie wyników mianowania. Lizaty miesza sie w dowolnym stosunku, a mianowicie stosujac 0-100% kazdego rodzaju lizatu. Dzienna dawka preparatu dla doroslego czlowieka odpowiada 1 do 50 miliardom bakterii, wszystkich szczepów lacznie.Preparat korzystnie podaje sie w postaci tabletek, kapsulek, pastylek lub granulek, zawieraja¬ cych lizat w postaci liofilizowanej lub w postaci roztworu, w jednodawkowych ampulkach, syropu lub kropli zawierajacych lizat. Preparat mozna równiez podawac przez nos i gardlo (w postaci aerozolu lub kropli) lub pozajelitowo.Dawke dzienna, która w przypadku doroslego czlowieka zawiera lizat z 1 do 50 miliardów bakterii, korzystnie podaje sie niepodzielona. Dziecku podaje sie polowe dawki dla czlowieda doroslego.Badania farmakologiczne. Sporzadzono liofilizowany lizat bakteryjny, zawierajacy w jednej dawce 6 miliardów bakterii kazdego rodzaju z podanych we wstepie i w zastrzezeniach.Badania skutecznosci lizatu podawanego droga doustna przeprowadzono na myszach rasy Balb/c, w rozmaity sposób zakazanych. Próby czynnosci ochronnej przeprowadzono podajac produkt, w dawce wielkosci 1/5 dawki przewidzianej dla czlowieka, w ciagu 10 dni droga doustna (grupie 24 myszy). Zakazenia dokonywano w 5 do 20 dni po zakonczeniu podawania preparatu.Wyniki wykazuja statystycznie znaczaca ochrona wobec zakazenia przez Klebsiella pneumoniae, droga dootrzewnowa, dokonanego 5 dni po zakonczeniu podawania preparatu. Równiez w przy¬ padku zakazenia dokonanego w 20 dni po zakonczeniu podawania preparatu obserwuje sie zmniejszenie smiertelnosci. Immunobioterapeutyczny lizat powoduje równiez stymulacje niespecy¬ ficznego mechanizmu obrony, przejawiajacego sie zmniejszeniem smiertelnosci zwierzat zakazo¬ nych wirusem grypy w aerozolu.Badania biochemiczne i morfologiczne makrofagów otrzewnowych przeprowadzono na pró¬ bach pochodzacych od myszy Balb/c, potraktowanych lizatem jak w próbie poprzedniej. Otrzy¬ mane wyniki wykazaly charakterystyczne zwiekszenie liczby i objetosci komórek w 5 i 20 dni po126416 3 zakonczeniu podawania preparatu. Zwiekszenie czynnosci enzymatycznej w porównaniu z kon¬ trola wykazano na przykladzie fosfatazy i /J-galaktozydazy.Doustne podanie lizatu myszy powoduje zwiekszenie stezenia gammaglobuliny A w plynie plucnym z dróg oddechowych. Wyraza sie ono dodatnia reakcja wytracania wobec surowicy z przeciwcialami, rozcienczonej w stosunku 1: 16. Biorac pod uwage niski poziom gammaglubulin A normalnie wydzielanych i znaczne zwiekszenie poziomu gammaglobulin tego typu pod wplywem lizatu, mozna przyjac, ze sumaryczne zwiekszenie poziomu gammaglobulin jest prawie wylacznie wynikiem zwiekszenia gammaglobulin A.Badania kliniczne. Dwunastu zdrowym ochotnikom podawano w ciagu 10dni,codziennie,po kapsulce zawierajacej równowaznik 6 miliardów bakterii kazdego rodzaju z podanych na wstepie opisu i w zastrzezeniu 1. Badania prób pobieranych w ciagu 3 miesiecy i dluzej wykazaly statycznie znaczace zwiekszenie poziomu gammaglobulin wydzielanych w slinie i poziomu gammaglobulin w osoczu. Odpowiedz ta jest zgodna z aktualna koncepcja odpowiedzi immunologicznej.Siedmiu autorów badalo klinicznie wyzej opisane kapsulki w przypadkach zakazenia w sferze ucha, nosa i krtani, jak np. zapalenia zatok. Obliczono wskaznik leczniczy i wskaznik zapobiega¬ wczy leku. Pacjentom podawano lek w ciagu 10 dni miesiecznie, a laczny czas trwania zabiegu wynosil kilka miesiecy. Zabiegów dokonywano z zasady w miesiacych zimowych. Wyniki zesta¬ wiono w tabeli.Tabela Wskaznik leczniczy % Wskaznik zapobiegawczy % Liczba przypadków 242 100 131 100 dobre 146 60,3 94 71,8 Wyniki srednie 72 29,8 12 9,1 brak 25 9,9 25 19,1 Leczenie preparatem wytworzonym sposobem wedlug wynalazku jest szczególnie zalecane w przypadkach niezytu oskrzeli, ostrego i przewleklego, angin, zapalenia migdalów, zapalenia krtani, zapalenia gardla, kataru nosa, zapalenia zatok, zapalenia ucha, zakazen opornych na leczenie antybiotykami i powiklan bakteryjnych zakazen wirusowych ukladu oddechowego, zwlaszcza u dzieci i osób w podeszylym wieku.Wynalazek ilustruja, nie ograniczajac jego zakresu, nastepujace przyklady: Przyklad I. Hodowla bakterii rodzaju Hemophilus.Szczep: utrzymywany przez przeszczepianie dwa razy w tygodniu.Inokulum: — w tej samej pozywce cieklej, która jest stosowana do hodowli w masie; — objetosc: 1/10 objetosci koncowej hodowli w masie.Pozywka do hodowli w masie — zawiera na litr wody: bulion miesny 22,5 g wyciag z drozdzy 7,5 g chlorek sodu 2,0 g octan sodu 0,5 g wodorofosforan sodowy 2,0 g mleczan sodu 70% 2,0 ml mleczan amonu 60% 2,0 ml aneuryna 3,0 mg kwas nikotynowy 3,0 mg glukoza 3,0 g4 126416 Po przesaczeniu dodaje sie: proszek „Pugonbroth/BBL" 6,0g. Nastepnie ogrzewa sia w auto¬ klawie 20min. w 120°C, po czym dodaje sie w sposób jalowy: wyciag z drozdzy piekarniczych 20,0 ml wyciag „Fildes/Bifco" 5,0 ml koncowe pH wynosi 7,2.Warunki hodowli — w fermentorze stosujac 8 litrów na szarze — przy automatycznej regulacji pH na 7,0 — pod kontrola przeciwpienna — w kontrolowanej temperaturze 37° — napowietrzenie 5 l/min — mieszanie 300-400 obr/min — czas trwania 8-14 godz.Obliczanie ilosci bakterii na ml: — za pomoca mierzenia stopnia zmetnienia mieszaniny i mikroskopowo.Inaktywacja termiczna: 2-3 razy 1 godz. w 56°, w odstepach co 24godz.Wirowanie: osad zawiera sie w wyjalowionej wodzie destylowanej, nastepnie homogenizuje sie za pomoca mieszania magnetycznego i powtórnie oblicza sie ilosc bakterii nami.Nastepnie stosuje sie progresywna lize alkaliczna w 37° z zastosowaniem tabletek sody kaustycznej do pH 9,0-10,0. Prowadzi sie kontrole mikroskopowa lizy. Czas trwania okolo 3dni.Lizat przechowuje sie w temperaturze 4° do momentu produkcji koncentratów lizatów bakteryjnych.Przyklad II. Postepuje sie jak w przykladzie I, stosujac jednakze do hodowli bakterie rodzaju Pneumococcus. Hodowle prowadzi sie w fermentorze, dodajac do pozywki podstawowej 0,3% glukozy i 0,5% osocza konskiego. pH pozywki i warunki fermentacji jak w przypadku bakterii rodzaju Hemophilus.Przyklad III. Postepuje sie jak w przykladzie I stosujac jednakze do hodowli bakterie rodzaju Streptococcus. Hodowle prowadzi sie w fermentorze, dodajac do pozywki podstawowej 0,3% glukozy. pH pozywki i warunki fermentacji jak w przypadku bakterii rodzaju Hemophilus.Przyklad IV. Postepuje sie jak w przykladzie I, stosujac jednakze do hodowli bakterie rodzaju Klebsiella. Hodowle prowadzi sie na pozywce stalej, w kolbach Roux, w 37°C, w ciagu 48 godzin. Do pozywki podstawowej dodaje sie 0,2% zelatyny i 2,4% agaru.Przyklad V. Postepuje sie jak w przykladzie I stosujac jednakze do hodowli bakterie rodzaju Staphylococcus. Hodowle prowadzi sie na pozywce stalej, w warunkach jak w przypadku bakterii rodzaju Klebsiella.Przyklad VI. Postepuje sie jak w przykladzie I, stosujac jednakze do hodowli bakterie rodzaju Neisseria. Hodowle prowadzi sie na pozywce stalej, w warunkachjak w przypadku bakterii rodzaju Klebsiella.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania preparatu immunobioterapeutycznego przeciwko chorobom dróg oddechowych na drodze hodowli bakterii w pozywce hodowlanej i wytwarzania lizatu z wyhodo¬ wanych bakterii, znamienny tym, ze poddaje sie hodowli w pozywce jeden lub wiecej szczepów bakteryjnych sposród Staphylococcus aureus 1-049, 1-50, 1-51, 1-52, 1-53 i 1-54, Streptococcus viridans 1-046, 1-47 i 048, Neisseria catarrhalis 1-045, Hemophilus influenzae serotyp b NCTC 8467, Diplococcus pneumoniae serotypy 1, 2, 3 i 47, NCTC 7465, 7466, 7978 i 10319, Klebsiella pneumoniae NCTC 204 i 5056, Klebsiella ozaenae NCTC 5050, Streptococcus pyogenes serogrupa A NCTC 8191 i Neisseria catarrhalis NCTC 3622 i 3625, a z wyhodowanych bakterii sporzadza sie lizat, który miesza sie z odpowiednim nosnikiem farmaceutycznym.126416 5 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ze stosuje sie wszystkie wymienione szczepy. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, ze hodowle bakterii prowadzi sie w pozywce zawierajacej w 1 litrze wody 22,5g bulionu miesnego, 7,2g wyciagu z drozdzy, 2,5gchlorku sodu, 0,5g octanu sodu, 2,0g wodorofosforanu dwusodowego, 2,0ml 70% mleczanu sodu, 2,0ml 50% mleczanu amonu, 3,0mg aneuryny, 3,0mg kwasu nikotynowego i 3,0g glukozy, przy czym powyzszy sklad moze zmieniac sie w granicach ±5%. PL PL PL