Opis patentowy opublikowano: 30.09.1983 CZYTELNIA Urzedu Pattntowtoo Twórcawynalazku Uprawniony zpatentu: Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim (Republika Federalna Niemiec) Sposób wytwarzania zwiazków bis-(2,4dwunitrofenylo)-metylopirydyniowych oraz srodek do oznaczania pH Przedmiotem omawianego wynalazku jest sposób wytwarzania zwiazków bis-(2,4-dwunitrofenylo)- metylopirydyniowych o wzorze ogólnym 1, w którym jedna z grup Ri i R2 oznacza grupe bis-(2,4- dwunitrofenylo)-metylowa, a druga oznacza nizsza grupe alkilowa, zwlaszcza grupe metylowa lub III-rzed. butyIowa, albo w przypadku gdy R2oznacza atom wodoru ewentualnie grupe trójfluorometylowa, zas R3 i R4 oznaczaja atomy wodoru albo razem z atomami wegla, do których sa przylaczone, pierscien benzenowy, natomiast X® oznacza odpowiedni anion kwasowy wzglednie zwiazek wystepujejako betaina, stosowanych jako wskazniki pH.Fotometria reemisyjna zyskala uznanie w chemii klinicznej, zwlaszcza ze wzgledu na proste i nieskom¬ plikowane wykorzystanie pasków testowych i zwiazane z tym zaoszczadzenie kosztów.Pomiary powinno sie przeprowadzic przy uzyciu mozliwie niedrogich przyrzadów, które w przeciwien¬ stwie do spektrofotometrów i fotometrów liniowych pracuja w szerokim zakresie widma. Taki przyrzad przedstawiony jest przykladowo w opisie patentowym RFN DOS nr 20 56 232.W celu zapewnienia wystarczajacej czulosci pomiaru paski testowe, mierzone za pomoca tych przyrza¬ dów, musza zawierac wskazniki, które nie wykazuja stromych pików absorpcyjnych lecz szerokie pasma absorpcyjne. Wieksza czesc pasm absorpcyjnych powinna byc dopasowana do charakterystyki emisji lamp jarzeniowych stosowanych korzystnie w takich przyrzadach, a zatem lezec powyzej 600mm. Ponadto wskazniki musza charakteryzowac sie tym, zeby postac czasteczki, która nie jest uwzgledniona w pomiarze, absorbowala tylko w tym zakresie, którego fotometr remisyjny nie rejestruje, gdyz wówczas przez reakcje mozna wytworzyc duza róznice barw i przez to wyrazny sygnal pomiarowy. Oznacza to z reguly, ze ta postac musi byc bezbarwna do zabarwienia zóltego. Takipasek testowy, np. do szybkiego i ilosciowego oznaczania glikozy w plynach ustrojowych jak we krwi, surowicy itd., przedstawiony jest w opisie patentowym RFN DOS nr 22 64438. Odpowiednio do wymienionych wyzej wymagan stawianych wskaznikom do pomiaru na niedrogich fotometrach reemisyjnych ten pasek testowy zawiera pochodne benzydyny. W zredukowanej postaci sa one bezbarwne do zóltych, a wiec absorbuja w zakresie bardzo krótkich fal, natomiast produkty utlenienia absorbuja w szerokim zakresie fal dlugich az prawie do podczerwieni.Dotychczas do oznaczenia zawartosci mocznika we krwi nie znano jeszcze pasków testowych, które laczylyby proste stosowanie z krótkim czasem reakcji i precyzyjna ocena za pomoca fotometru reemisyjnego.Szczególnie w naglych przypadkach, np. przy spiaczce mocznicowej, dla wstepnych zabiegów terapeuty¬ cznych konieczne jest otrzymanie wjak najkrótszym czasie mozliwie dokladnego wyniku analizy. Wprowa¬ dzeniem testu szybkosciowego do oznaczania mocznika przy uzyciu fotometru reemisyjnego, takze w1 118 634 rutynowej pracy laboratorium klinicznego, osiagneloby wyrazny postep, poniewaz odpadlyby zmudne odmierzanie pipeta, stosowanie czesciowo malo trwalych i zracych odczynników oraz dlugi czas reakcji.Opracow anie takiego paska testowego do oznaczania mocznika nie udawalo sie dotychczas ze wzgledu na brak odpowiednich wskazników. W przeciwienstwie do opisanego wyzej paska testowego do oznaczania glukozy ze wskaznikiem redoksy, w chemii klinicznej do oznaczania mocznika stosuje sie jako barwne wskazniki w lancuchu reakcji wskazniki pH do oznaczania utworzonego amoniaku. Dotychczas nie znano wskazników pH, które obok latwej dostepnosci spelniaja wymienione wyzej wymagania widmowe i równo¬ czesnie wykazuja dostateczna rozpuszczalnosc i odpowiednia wartosc pK. Dwa znane zwiazki, a mianowicie szescionitrofenylometan i ester etylowy kwasu 2-bis-(2,4-dwunitrofenylo)-octowego, wykazuja wprawdzie uzyteczna absorpcje, ale z drugiej strony za mala rozpuszczalnosc wzglednie za wysoka wartosc pK.Innych znanych wskazników pH nie mozna wykorzystac, poniewaz albo zarówno kwasowa, jak tez zasadowa postac absorbuje w szerokim zakresie fal dlugich i dlatego fotometr reemisyjny nie rozdziela ich ostro, albo zabarwiona postac absorbuje tylko w wiecej albo mniej stromym piku tak, ze pomiar prostymi przyrzadami, które obejmuja tylko szeroki zakres fal dlugich jest niemozliwy.Zaidahiem omawianego wynalazku jest opracowanie wskazników pH, które w kwasowej postaci sa bezbarwne, a w postaci zasadowej sa silnie zabarwione, przy czym zabarwienie musi odznaczac sie szerokim pasmem absorpcyjnym. Przynajmniej jedna postac tych wskazników musi wykazywac dostateczna rozpu¬ szczalnosc tak, aby mozna bylo zastosowac ja przy wytwarzaniu pasków testowych. Poza tym wskazniki te powinny wykazywac dostatecznie niska wartosc pK, np. 5-10,5, która umozliwi ustawienie rozsadnego dla pasków testowych na mocznik, to znaczy pozwalajacego na oznaczenie amoniaku, zakresu pH.Stwierdzono, ze wymagania te spelniaja zwiazki bis-(2,4-dwunitrofenylo)-metylopirydyniowe o wzorze ogólnym 1, w którym jedna z grup Ri i R2oznacza grupe bis-(2,4-dwunitrofenylo)-metylowa, a druga oznacza nizsza grupe alkilowa, zwlaszcza grupe metylowa lub Ill-rzed.butylowa, albo w przypadku gdy R2 oznacza atom wodoru wzglednie grupe trójfluorometylowa, zas R3 i R4 oznaczaja atomy wodoru albo razem z atomami wegla, do których sa przylaczone, pierscien benzenowy, natomiast X® oznacza odpowiedni anion kwasowy wzglednie zwiazek wystepuje jako betaina.Sposób wytwarzania wedlug wynalazku nowych zwiazków o wzorze ogólnym 1 polega na tym, ze a) poddaje sie nitrowaniu zwiazek o wzorze ogólnym 1', w którym jedna z grup Ri i R2 oznacza grupe dwufenylometylowa, a inne grupy maja znaczenie podane we wzorze ogólnym 1, przy czym grupe X® ewentualnie zastepuje sie w znany sposób inna grupa X® albo wprowadza sie grupe alkilowa Ri.Czteronitrowanie zwiazków o wzorze 1' wymaga wzglednie ostrych warunków i dlatego korzystnie prowadzi sie je mieszanina dymiacego kwasu azotowego i oleum w temperaturze 20-100°C. Grupe X® albo przedtem albo nadmiarem kwasu siarkowego w srodowisku reakcji przeprowadza sie w grupe siarczanowa.Wprowadzenie grupy alkilowej R1 do zwiazku wyjsciowego o wzorze 1' nastepuje w znany sposób przy uzyciu srodka alkilujacego, na przyklad halogenku alkilowego, siarczanu dwualkilowego albo estru kwasu alkanosulfonowego, w obojetnych rozpuszczalnikach jak toluenie, eterze, dioksanie, acetonie itd.Wymiane grupy X® na inna prowadzi sie droga reakcji z odpowiednim nadmiarem odpowiedniego HX albo zwlaszcza jego soli, której kation z majaca byc usunieta grupa X® tworzy trudno rozpuszczalna, latwa do oddzielenia sól. Poza tym przez dodanie zasady jak wodnego roztworu amoniaku albo wodorotlenków metali alkalicznych mozna wytworzyc betaine, która ewentualnie przezdodanie innego kwasu przeprowadza sie ponownie w nowa sól czwartorzedowa.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku znajduja zastosowanie jako wskazniki pH przy wytwarzaniu pasków testowych do oznaczania mocznika. Srodek do oznaczania pH zwlaszcza amoniaku w testach na mocznik zawiera zwiazki o wzorze 1 naniesione na bibule filtracyjna ewentualnie w polaczeniu z innymi substancjami np. buforami. Jak wskazuja dane ponizszego przykladu IV, przy uzyciu zwiazków wytworzonych sposobem wedlug wynalazku udaje sie wytworzyc do oznaczania ilosciowego mocznika papierek testowy, który obejmuje 66,5% zakresu pomiarowego fotometru reemisyjnego. Przy stosowaniu do dotychczasowego wskaznika pH, np. blekitu bromofenolowego, otrzymuje sie dajacy sie tylko odczytac wizualnie test pólilosciowy, np. przyklad V, poniewaz zabarwia on tylko okolo 23% zakresu pomiarowego.Nowe zwiazki nadaja sie oczywiscie do stosowania jako wskazniki pH same, ewentualnie takze razem z innymi wskaznikami w postaci mieszaniny wskaznikowej, w celu zwiekszenia zakresu pH.Ponizsze przyklady blizej objasniaja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Wytwarzanie czterofluoroboranu l-(bis-(2,4-dwunitrofenylo)-metylo)-pirydyniowego. 16,3 g (0,05 mola)bromku dwufenylometylopirydyniowego o temperaturze topnienia 216-219°C, otrzy¬ manego z dwufenylobromometanu przez ogrzewanie z nadmiarem pirydyny przez 30 sekund w temperaturze 120°C, zatezenie, wymieszanie z eterem, rozpuszcza sie w 30ml stezonego kwasu siarkowego. Przez otrzy¬ many roztwór przepuszcza sie w ciagu 1 godzin CO2, ogrzewa do temperatury 80°C, oziebia do temperatury pokojowej i nastepnie roztwór ten wkrapla sie w ciagu 15 minut do mieszaniny nitrujacej zlozonej z 30ml118 634 3 stezonego kwasu siarkowego i 8,65 g dymiacego kwasu azotowego, utrzymujac przy tym temperature ponizej 50°C. Nastepnie wkrapla sie mieszanine 11,4ml kwasu azotowego o gestosci 1,52 i 42,5 ml oleum zawieraja¬ cego 15% SO 3, a potem ogrzewa calosc przez 3 godziny w temperaturze 70°Ci po oziebieniu wylewa na 600 ml lodu. Zólty osad rozpuszcza sie w mieszaninie acetonu i izopropanolu i wytraca przez dodanie eteru. Surowy produkt zawierajacy poza pozadanym zwiazkiem jeszcze kilka produktów ubocznych rozdziela sie chroma¬ tograficznie na kolumnie z zelu krzemionkowego stosujac jako eluent aceton. Tak otrzymuje sie 5,6 jednorodnego wedlug chromatografii, bezpostaciowego wodorosiarczanu, który w metanolu z wodnym 38% roztworem kwasu czterofiuoroborowego daje 4,8 g czyli 20,7% czterofluoroboranu l-(bis(2,4- dwunitrofenylo)-metylo)-pirydyniowego o temperaturze topnienia 187-191°C.Przyklad II. Wytwarzanie jodku (dwufenylometylo)-l-metylopirydyniowego. 0,1 mola dwufenylopirydylometanu rozprasza sie w 200ml toluenu, dodaje 51,25 g = 45 ml (0,36 mola) jodku metylu i calosc ogrzewa przez 2 godziny w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna. Mieszanine reakcyjna oziebia sie do temperatury pokojowej i dodaje do niej 50ml eteru, po czym wydzielone krysztaly odsacza pod zmniejszonym cisnieniem, przemywa dokladnie eterem i suszy tlenkiem fosforowym. Zaleznie od pozycji podstawienia zwiazku wyjsciowego otrzymuje sie produkty o wzorze ogólnym 2, przedstawione szczególowo w tablicy I. Ciezar czasteczkowy: 387,2 Tablica I .R Temperatura topnienia Wydajnosc wzór 3 228°C (rozklad) 98,1% wzór 4 160°C (rozklad) 91,6% wzór 5 152-155°C (rozklad) 96,5% Wytwarzanie azotanu (dwufenylometylo)-l-metylopirydyniowego. 0,1 mola przedstawionego wyzej jodku (dwufenylometylo)- l-metylopirydyniowego rozpuszcza sie w 500ml metanolu, dodaje roztwór 0,1 mola azotanu srebra w mieszaninie 400ml metanolu i lOOml wody i miesza przez 1 godzine w temperaturze pokojowej, po czym odsacza pod zmniejszonym cisnieniem utwo¬ rzony jodek srebra i przesacz zateza w wyparce obrotowej. Pozostalosc po destylacji rozpuszcza sie w malej ilosci metanolu i wytraca azotan przez dodatnie eteru. Po odsaczeniu pod zmniejszonym cisnieniem, przemyciu eterem i wysuszeniu nad tlenkiem fosforowym utrzymuje sie czysty azotan w postaci bezbarwnych krysztalów. Zaleznie od pozycji podstawienia zwiazku wyjsciowego otrzymuje sie produkty o wzorze ogólnym 2, przedstawione szczególowo w tablicy II. Ciezar czasteczkowy: 322,3.Tablica II R Temperaturatopnienia Wydajnosc wzór 6 171° 93,8% wzór 7 138°C 88,4% wzór 8 176-178°C 96,3% Wytwarzanie wodorosiarczanu (bis-(2,4-dwunitrofenylo)-metylo)- l-metylopirydyniowego.W kolbie trójszyjnej o pojemnosci 500ml, zaopatrzonej w mieszadlo, chlodnice, termometr i wkraplacz umieszcza sie 17,8ml = 27,2g (0,431 mola) kwasu azotowego o gestosci 1,52 w 90g=50ml (0,98 mola) stezonego kwasu siarkowego o gestosci 1,84 i przy mieszaniu dodaje sie 16,1 g (0,05 mola)przedstawionego wyzej azotanu dwufenylometylo-l-metylopirydyniowego tak, ze temperatura mieszaniny reakcyjnej nie przekroczy 50°C. Nastepnie ogrzewa sie powoli do temperatury 70°C i w tej temperaturze wkrapla miesza¬ nine 60 ml oleum o zawartosci 15% S03i 30 ml = 47,5 g (0,75 mola)kwasu azotowego o gestosci 1,52po czym ogrzewa przez 1 godzine w temperaturze 90°C i wreszcie wylewa na 500 ml lodu. Otrzymany surowy produkt rozpuszcza sie przy podgrzaniu w malej ilosci metanolu, traktuje weglem aktywowanym, odsacza pod zmniejszonym cisnieniem i wytraca wodorosiarczan przez dodanie eteru. Przez ponowne rozpuszczenie i wytracenie z ukladu aceton-eter otrzymuje sie jednorodne wedlug chromatografii bezpostaciowe wodoro¬ siarczany czteronitrozwiazkówo wzorze ogólnym 2 i ciezarze czasteczkowym 547,3, przedstawiono szczegó¬ lowo w tablicy III.118 634 Tablica 111 Temperatura topnienia Wydajnosc Chromatografia** cienkowarstwowa Eluent Wartosc RF ¦wzór 10 bezpostaciowe spiekanie 70°C 31,5% wzór 11 bezpostaciowe spiekanie od 120°C 25,6% rozklad wzór 12 bezpostaciowe spiekanie od 70°C 32,1 % XM ksylen-metyloetyloketon 1:1 DEW21I n-butanol-lodowat\ kwas octowy-woda 2:1:1 izopropanol-octan n-butylu-woda-amoniak 50:30:15:8 0,2i 0,19 0,45 1 gotowe plytki z zelu krzemionkowego 60 F 254 firmy Merck Wytwarzanie bis-(2,4-dwunitrofenylo)-( l-metylo-x-pirydynio)-metanidów.Powyzej opisane wodorosiarczany rozpuszcza sie w wodzie i dodaje amoniak albo rozcienczony roztwór wodorotlenku metalu alkalicznego az do uzyskania pH 9-10,5. Pirydyniobetainy o zabarwieniu gleboko niebieskim do fioletowego odsacza sie pod zmniejszonym cisnieniem, przemywa woda oraz mieszanina 1; 1 eteru naftowego i ligroiny, po czym suszy nad tlenkiem fosforowym. Takotrzymuje sie zwiazki o wzorze 13, które szczególowo przedstawione sa w tablicy IV.Przy ogrzewaniu rozkladaja sie one bez topnienia. Ciezar czasteczkowy: 438,5.Tablica IV Pozycja x Temperatura rozkladu Wydajnosc % Wartosc pK Absorpcja (nm) 225°C 238°C 233°C 90,2 93,5 95,1 9 10,5 6,5 400-810 400-900 400-810 Przyklad III. Wytwarzanie bis-(2,4 40 g (0,071 mola) bromku l-(bis-(2,4-dwunitrofenylo)-metylo)-4-III-rzed.butylo-l-pirydyniowego)albo czterofluoroboranu l-(bis-(2,4-dwunitrofenylo)-metylo)-4-III-rzed. butylo-1-pirydyniowego) o temperatu¬ rze topnienia 204-205°C, wytworzonego z metanolowego roztworu surowego bromku przez dodanie 38% kwasu czterofluoroborowego, rozpuszcza sie w 300 ml dwumetyloformamidu z dodatkiem 2ml 48% kwasu bromowodorowego i przy energicznym mieszaniu oraz sprawdzaniu za pomoca elektrody szklanej ustawia sie pH 10 przez wkroplenie 950 ml 5% etanolowego lugu potasowego. Nastepnie odsacza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem wydzielony bis-(2,4-dwunitrofenylo)-(4-III-rzed.butylo-l-pirydynio)-metanid, przemywa 31 wody i suszy betaine nad zelem krzemionkowym i tlenkiem fosforowym. Takotrzymuje sie 33,5 g co stanowi 97,8% zwiazku wymienionego w tytule w postaci krysztalów o metalicznym polysku. Zwiazek rozklada sie w temperaturze 225°C, bez topnienia.Chromatografia cienkowarstwowa: gotowe plytki zzelu krzemionkowego 60F 254firmy Merck;eluent: izopropanol-octan n-butylu-woda w stosunku 5:3:2; wartosc RF = 0,63.W celu wytworzenia pirydyniobetainy mozna równiez tak postepowac, ze roztwór odpowiedniej soli w dwumetyloformamidzie wprowadza sie do mieszaniny zlozonej z dwumetyloformamidu i amoniaku, ustawia pH 9-10, a nastepnie przez dodanie czterokrotnej ilosci wody powoduje sie wydzielenie betainy, która traktuje sie dalej w sposób podany wyzej. W taki sam sposób wytwarza sie betainy o wzorze ogólnym 14, przedstawione szczególowo w tablicy V.Przyklad IV. Ilosciowe oznaczanie mocznika w surowicy a) Bibula zawierajaca ureaze Bibule filtracyjna nasyca sie roztworem o ponizszym skladzie, suszy i tnie na paski o szerokosci 6mm; ureaza (5J/mg) — 6g; dwutioerytryt — 0,lg; 0,3 molowy bufor TRIS HC1 o pH 8,5-100ml. b) Bibula wskaznikowa Bibule filtracyjna nasyca sie roztworem o ponizszym skladzie, suszy i tnie na paski równiez o szerokosci 6 mm; chlorek l-(bis-(2,4-dwunitrofenylo)-metylo)-4^III-rzed.butylopirydyniowy — 0,39g; eter monomety- lowy glikolu etylenowego — 42ml; 0,25 molowy roztwór malonianu sodowego —jako bufor o pH 2,8 — 48 ml.118 634 5 Tablica V R® wzór 15 ciezar czasteczkowy — 481,4 wzór 16 ciezar czasteczkowy — 425,3 wzór 17 ciezar czasteczkowy — 475,3 wzór 18 ciezar czasteczkowy — 475,3 Tempera¬ tura roz¬ kladu 225°C 250° 210°C 230PC Wdaj- nosc % 97,8 96,5 95,6 96,6 Wartosc pK 8,5 8,5 8 7 Absorpcja (nm) 400-850 Widmo absorp¬ cyjne pokazane jest na rysunku 1 400-800 400-850 400-850 c) Przekladka dystansowa Hydrofobizowana zywica silikonowa tkanine do sitodruku o grubosci wlókien okolo 100 fi i otwartej powierzchni sita okolo 35% tnie sie na tasmy o szerokosci 25-40mm. d) Siatka przykrywajaca Hydrofilowa siatke nylonowa o grubosci okolo 60 \x i grubosci wlókien 40 /u oraz o wolnej powierzchni otworów okolo 65% tnie sie na tasmy o szerokosci 15 mm. e) Folia Jako folie nosna i uchwyt stosuje sie tasme o szerokosci 6-10 cm i grubosci okolo 0,2-0,3mm z folii poliestrowej pokrytej topliwym klejem.Wytwarzanie pasków testowych Bibule zwierajaca uraze, bibule wkaznikowa oraz przekladke dystansowa razem z siatka przykrywajaca bibule zawierajaca ureaze osadza sie w sposób pokazany na rysunku 1 na koncu folii o szerokosci 6-10 cm pokrytej topliwym klejem i utworzona tasme tnie sie na paski o szerokosci 6 mm tak, ze otrzymuje sie pola testowe o wymiarach 6X6mm na uchwycie o dlugosci 6-10cm.Na siatke przykrywajaca takiego paska testowego nanosi sie 10/xl surowicy i zamyka naklejka. Po uplywie 7 minut usuwa sie bibule zawierajaca ureaze i siatke przykrywajaca razem z przekladka dystansowa.Zabarwienie warstwy wskaznikowej mierzy sie od góry za pomoca fotometru reemisyjnego. Wzaleznosci od stezenia mocznika otrzymuje sie wartosci pomiarowe przedstawione w tablicy VI.Tablica VI mg mocznika/100 ml surowicy 20 40 60 80 100 150 200 Sygnal ± 1 s1 pomiarowy (dzialki skali) Wartosc srednia z 10 wartosci 12,9 ±0,75 27,5±1,5 46,1 ±1,9 61,5±1,4 69,0±0,4 77,2±0,5 79,4 ±0,5 Przyklad V. Pólilosciowe oznaczanie mocznika we krwi a) Bibula zawierajaca ureaze jak podano w przykladzie IV. b) Bibula wskaznikowa Bibule filtracyjna nasyca sie roztworem o ponizszym skladzie i suszy w temperaturze 70°C; blekit bromofenolowy — 0,1 g; eter monometylowy glikolu etylenowego — 9ml; kwas winowy — 0,4g; woda — 21 ml.o 118 634 c) Przekladka dystansowa Hydrofobizowanc zywica silikonowa runo poliamidowe o grubosci okolo 80 fi. d) Siatka przykrywajaca jak podano w przykladzie IV.Paski testowe wytwarza sie w sposób podany w przykladzie IV. W celu oznaczania zawartosci mocznika we krwi calkowitej nanosi sie jedna krople krwi na pasek testowy. Po uplywie 7 minut powstaja, zaleznie od zawartosci mocznika, dajace sie dobrze rozrózniac barwy reakcji: 20 mg mocznika/100 ml krwi zabarwienie zólte 40mg mocznika/100ml krwi zabarwienie zielonkawozólte 60mg mocznika/100ml krwi zabarwienie zóltozielone 80 mg mocznika/100 ml krwi zabarwienie zielone 100 mg mocznika/100 ml krwi zabarwienie niebiesko-zielone 150 mg mocznika/100 ml krwi zabarwienie zielonkawo-niebieskie 200 mg mocznika/100 ml krwi zabarwienie niebieskie PL PL