Opis patentowy opublikowano: G5. 06.1982 114120 Int. C1.*G61N 33/16 Twórca wynalazku — Uprawniony z patentu: Kommandiittiyhtio Finnipipette Osmo A. Suova- niemi, Helsinki (Finlandia) Element ksztaltowy do aparatów stosowanych do badan immunologicznych i reakcji enzymatycznych Przedmiotem -wynalazku jest element ksztaltowy do aparatów stosowanych do badan immunologicz¬ nych i reakcji enzymatycznych. Badania immuno¬ logiczne, w których moze byc stosowany ten ele¬ ment ksztaltowy, moga stanowic badania radioim- munologiEzne (BIA), enzymatyczne badania immu¬ nologiczne (EIA), badania immunologiczne z sor¬ bentem zwiazanym z enzymem (ELISA), hamowa¬ nie aglutynacji krwinek (HI), badania wirusoim- rnunologiczne, badania immunofluorescencyjne i spi- noimmunoloigiczne. Poza tym, element ksztaltowy mozna wykorzystywac w metodach, w których sto¬ suje sie enzymy unieruchomione.Dotychczas w tego rodzaju badaniach material reaktywny, taki jak antygeny, przeciwciala i hep- teay, osadzano na wewnetrznej powierzchni pro¬ bówki wzglednie kuwety. Dana ilosc roztworu an¬ tygenu lub przeciwciala odmierzano pipeta, np. do rurki z tworzywa sztucznego, przez co wewnetrzna powierzchnia rurki, kontaktujaca sie z ciecza, zo¬ stawala poryta antygenami lub przeciwcialami.Sposób ten ma kilka wad, a mianowicie: jest on niedokladny, poniewaz ilosc bialka przylegajacego do wewnetrznej powierzchni rurki zmienia sie za kazdym razem, np. ze wzgletlu na fakt, ze zmienia sie pole wewnetrznej powierzchni rurki kontaktu¬ jacej sie z ciecza. Ponadto, tworzywo, z którego sa wytworzone rurki nie zawsze stanowi mozliwie naj¬ lepszy material z punktu widzenia wiazania bialka.Poza tym jako material na kuwety, które powinny 10 15 20 25 30 byc przezroczyste, moga byc wybrane tylko trie- które tworzywa np. polistyren i akrylany. Aby irie byla oslabiona jakosc optyczna, bialka moga byc zwiazane z tymi tworzywami tylko przez adsorpcje.Ponadto pokrycie rurek i kuwet przeciwcialami, antygenami lub innymi bialkami jest w praktyce niewygodne, poniewaz nalezy pobrac za kazdym ra¬ zem pipeta dokladnie odmierzona ilosc roztworu bialka, a poza tym rurki i kuwety zajmuja duzo miejsca w stadiach powlekania, przechowywania i przenoszenia. Stosowane dotychczas rurki i kuwe¬ ty w warunkach powlekania moga byc przechowa¬ ne tylko w czasie ograniczosnym. Powloka musi byc nalozona ostatecznie przez uzytkownika laborato¬ rium, skutkiem tego praca laboratoryjna jest pro¬ wadzona w trudnych warunkach, poniewaz powle¬ czone rurki lub kuwety nie sa dostepne w handlu.Powleczone rurki i kuwety zazwyczaj sa po uzy¬ ciu wyrzucane, co powoduje wysokie straty mate¬ rialowe.Z powyzszych wzgledów wprowadzono udoskona¬ lenie, polegajace na zwiazaniu antygenu, przeciw¬ ciala, heptenii, enzymu lub innego bialka lub weglo¬ wodanu z elementem ksztaltowym. Tworzywo ele¬ mentu ksztaltowego jest wybierane pod katem spe¬ cjalnych wymagan dla kazdego sposobu wiazania, np. szklo, celuloza lub masy plastyczne, zas same elementy ksztaltowe moga byc wytwarzane np. przez ciecie, wytlaczanie, z termoutwardzalnych mas pla¬ stycznych lub odlewanie cisnieniowe. Element ks* 114 120114120 3 4 taltowy, pokryty odpowiednim materialem reakty¬ wnym stosowanym w badaniach, umieszcza sie w probówce, kuwecie lub innym naczyniu reakcyj¬ nym.Element ksztaltowy do aparatów stosowanych do badan immunologicznych i reakcji enzymatycznych, wedlug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze ma postac pierscienia wzglednie pierscienia otwartego, na którego zewnetrznej powierzchni sa wykonane wystepy, umozliwiajace kontakt cieczy znajdujacej sie w probówce z powierzchnia tego elementu przez uniemozliwienie kontaktu zewnetrznej powierzch¬ ni elementu z wewnetrzna powierzchnia probówki.Pierscien.. moze ~*byc porowaty, rowkowany lub moze skladac sie- z-Allku warstw materialów. Za¬ stosowanie pierscienia^ wedlug wynalazku pozwala na wyeliminowanie niektórych niedogodnosci, wy¬ stepujacych nieodlacznie przy stosowaniu osadzania materialów reaktywnych na wewnetrznej powierz¬ chni probówek lub kuwet, a takze przy osadzaniu na znanych elementach ksztaltowych. Pierscien ta¬ ki jest odpowiedni dla kazdego sposobu wiazania i moze byc przystosowany do rurki, wglebienia, probówki, lub kuwety czlonowej.Przez zastosowanie pierscienia wedlug wynalaz¬ ku uzyskuje sie liczne korzysci, a mianowicie; pole powierzchni perscienia jest niezmienne w kazdej próbie, wskutek czego wzrasta dokladnosc badan.Pierscien moze byc wytworzony w róznych wymia¬ rach i jego pole powierzchni moze byc zwiekszone, np. przez wytworzenie pierscienia rowkowanego lub porowatego. Tworzywo pierscienia moze byc do¬ brane z najbardziej odpowiednich dla poszczegól¬ nego postepowania. Ponadto pierscien nie musi byc wykonany z tworzywa przezroczystego, poniewaz swiatlo przechodzi przez miedzysciankowa prze¬ strzen pierscienia (w czlonie kuwety lub zbiornicz¬ ka plytkowego).. Pokrycie pierscienia antygenem, przeciwcialem lub enzymem nawet w duzej ilosci jest stosunkowo -latwe, a ustalona ilosc bialka przylega do kazdego pierscienia.Nie stanowi trudnosci powlekanie, prze¬ chowywanie: i przenoszenie pierscieni o malych wy¬ miarach. .:-...Pierscien, do którego bialko przylega przez silne zwiazanie, np. przez wiazanie kowalentne, zacho¬ wuje warunki pokrycia bialkiem przez dlugotrwa¬ ly, okres. - -Pokryte pierscienie sa odpowiednie do celów han¬ dlowych. Wystepuje minimalna ilosc surowca odpa¬ dowego, wystepujacego przy produkcji tego typu -pierscieni. Pierscienie pokryte enzymem moga byc uzyte kilka razy. Sa one latwe do przemycia i prze¬ chowywania. Mozna stosowac pierscienie pojedyncze lub kilka pierscieni jednoczesnie. Do jednoczesnego zastosowania pierscienie moga korzystnie byc zwia¬ zane ze wspólna podstawa lub plytka nosna.Istnieje mozliwosc przylaczenia do pierscieni je¬ dnego lub kilku bialek. Pierscien moze wówczas skladac sie z jednej lub kilku substancji lub moze byc pokryty kilkoma róznymi substancjami.Trwalosc bialek zwiazanych z pierscieniem bar¬ dzo czesto wzrasta. Na przyklad, jesli w przypadku enzymów odpornosc na dzialanie ciepla wzrasta, wówczas mozna stosowac wyzsza temperature re¬ akcji, zeby zwiekszyc równiez szybkosc reakcji.Pokryte pierscienie doskonale nadaja sie do sto¬ sowania z kuwetami czlonowymi i zbiorniczkami plytkowymi. Pierscien jest odpowiedni do kazde- 5 go typu zbiorniczków plytkowych z-dnem pozio¬ mym, o ksztalcie V i o ksztalcie U.' Pierscien moze byc tak skonstruowany, ze jest w nim przestrzen dla bialka w stanie wolnym albo zwiazanego z wlasciwym tworzywem albo z we- 10 wnetrzna powierzchnia pierscienia. Scianka kazde¬ go takiego pierscienia ma otwory od wnetrza prze¬ strzeni do zewnetrznej powierzchni pierscienia, przy czym otwory sa korzystnie tak male, ze bialko lub inna duza czasteczka nie moze przejsc przez otwór. 15 Pierscien tego rodzaju moze sluzyc równiez np. jako elektroda enzymatyczna.Inna szczególna postacia wykonania jest pierscien, który jest pokryty bialkiem i jest polaczony wy¬ stepem z zatyczka korkowa lub z plytka nosna. 2 Plytka nosna podtrzymuje wiele takich pierscieni z wystepami. Wystep umozliwia, w razie potrzeby, regulacje polozenia pierscienia w probówce lub ku¬ wecie. Po polaczeniu wystepem wielu tych wystepów z plytka nosna w okreslonych odstepach, przesu* wanie pierscieni staje sie bardzo latwe. Plytka nos¬ na moze byc przezroczysta lub moze miec otworki w celu pomiaru wiazek swiatla zgodnie z zasadna pomiaru pionowego, takze jesli jest stosowana plyt¬ ka nosna w polaczeniu ze zbiorniczkami plytko- 30 wymi.Pierscien wedlug wynalazku moze byc równiez stosowany do pobierania i analizowania próbek. Dla tego rodzaju zastosowania pierscien, wykonany z od¬ powiedniego tworzywa pokrywa sie znanym anty- 35 genem, a nastepnie pokryty antygenem pierscien moze byc wykorzystany do osadzenia, rip. na noso¬ wych lub gardlowych blonach sluzowych, antyge¬ nów, które wylawiaja odpowiednie do nich przeciw¬ ciala, po czym zostaje on przemywany wlasciwym 40 roztworem przemywajacym w taki sposób, ze prze¬ ciwciala — jesli w ogóle wystepuja — nie sa od¬ dzielane od pierscienia. Nastepnie pierscien umiesz¬ cza sie w probówce, kuwecie, kuwecie czlonowej lub we wglebieniu zbiorniczka plytkowego i doda- 45 je sie mieszanine reakcyjna, która zazwyczaj za¬ wiera roztwór buforowy i enzym sprzegajacy prze¬ ciwcialo, odpowiedni dla przeciwciala; które jest oznaczane. Mieszanine reakcyjna zawierajaca sub¬ stancje podstawowa dodaje sie po inkubacji i prze- 50 myciu. Wynik ocenia sie na podstawie powstalego zabarwienia lub bardziej dokladnie — albo kine¬ tycznie, albo przez dokonanie pomiaru punktu kon-^ cowego.Postepujac jak opisano wyzej, istnieje mozliwosc 55 dokonania szybkiego rozpoznania, np. infekcji dróg oddechowych lub dró,g moczowych. Poza tym prób¬ ke z pierscieniem jest latwo przechowywac i trans¬ portowac.Sam pierscien, na który pobrano próbke, np. w o- 60 pisany sposób, moze sluzyc do oznaczenia. Warun¬ ki sa ustalone albo na samym pierscieniu, albo po dodaniu jednego lub kilku reagentów, albo w eta¬ pach posrednich, w których jeden lub kilka rea¬ gentów wyplukuje sie w taki sposób, aby substan- 66 cja utrwalona na pierscieniu mogla byc okreslona,114120 5 6 np.-przez reakcje, barwna dajaca sie wizualnie za¬ obserwowac lub przez odmycie barwy z pasemka powloki lub pierscienia, np. do probówki i nastep¬ nie dodanie do tego roztworu jednego lub kilku re¬ agentów dla uzyskania wyraznego zabarwienia.Próbka moze byc takze pobrana na pasemko ma¬ jace rózny ksztalt, przy czym pasemko moze byc wygiete, tworzac pierscien kolowy, otwarty lub zamkniety. Takipierscien moze byc umieszczony np. w probówce, kuwecie, kuwecie oslonowej lub wgle¬ bieniu zbiorniczka plytkowego.Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przy¬ kladach wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia element ksztaltowy w postaci pierscie¬ ni a, fig. 2 — pierscien w ksztalcie cylindrycznym, fig, 3 — rowkowany pifciscien cylindryczny, fig. 4 — pierscien dwuczesciowy, fig. 5 — pierscien po¬ rowaty, fig. 6 i 7 — pierscien warstwowy, fig, 8 — pierscien umieszczony w ustawionej pionowo pro¬ bówce, fig. 9—¦ dwa. pierscienie umieszczone w pro¬ bówce ustawionej ukbistie, fig. la — rzut pionowy pierscienia otwartego, figUH^ rzut.poziomy pier¬ scienia otwartego z figi l4©! fig. 12.¦—' plyte nosna z otworami; dó pomiaru Wiazki swiatla: i pierscie¬ niami uchwytowymi, fig. 13 ¦— naczynia reakcyjne o rozmaitym ksztalcie dna, z umieszczonym we¬ wnatrz pierscieniem, fig. 14 — koncówki pipety, a fig. 15 — otwarty pierscien w postaci zaokraglo¬ nego pasemka z pionowym wydluzeniem.Na figurze 1 jest przedstawiony pierscien, które¬ go wymiary i tworzywo tego pierscienia maja zmie¬ niac sie jak przedstawiono powyzej i w dalszej czesci opisu. Pierscien moze byc zamkniety lub ot¬ warty, Fig. 2 przedstawia pierscien d ksztalcie cy¬ lindrycznym, przy ozym cylinder moze miec rózne ksztalty, powierzchnie cylindra moga byc gladkie lub przedstawiac rózne uksztaltowania. Zewnetrz¬ na powierzchnia pierscienia moze byc równiez stoz¬ kowa lub porowa prosta i wobec tego takie ksztal¬ ty moze miec powierzchnia wewnetrzna. Fig. 3 przedstawia, jako przyklad wykonania, pierscien cylindryczny, którego powierzchnia zewnetrzna jest wydluzona przez czesci wystajace 1 i wystep 2 bie¬ gnacy pod spodem dolnej czesci pierscienia. Wystep 2 moze byc ciagly lub przerywany. Ostrobrzezny wystep 2 chroni dolna krawedz pierscienia przez opieraniem sie o spód poziomego dna kuwety. Pier¬ scien na fig. 4 ma czesc plaszczowa 4 i wystepy 5, których moze byc trzy lub wiecej na dolnej powie¬ rzchni pierscienia. Czesc rdzeniowa 3 i czesc plasz¬ czowa 4 moga byc z, tego samego lub róznego two¬ rzywa. Czesc rdzeniowa 3 moze sluzyc jako mecha¬ niczna podpora a czesc plaszczowa 4 jako spoiwo danej substancji, jednej lub kilku. Czesc rdzenio¬ wa 3 moze byc z zelaza i w tym przypadku jest mozliwosc uzycia magnesu w celu usuniecia piers¬ cienia z probówki, kuwety lub wglebienia zbiorni¬ czka plytkowego. Fig. 5 przedstawia pierscien, któ¬ ry jest porowaty w celu zwiekszenia obszaru po¬ wierzchni. Pierscien równiez zawiera wystepy 6 na zewnetrznej a takze dolnej plaszczyznie. Wystepy te moga byc czescia pierscienia rozmaitego ksztal¬ tu i wytworzonego z róznego tworzywa. Fig. 6 przed¬ stawia pierscien skladajacy sie z trzech róznych warstw 7, 8 i 9. Warstwy moga byc przewidziane w dowolnej ilosci i moga miec odpowiedni ksztalt oraz zastosowanie w dowolnej kolejnosci. Pierscien przedstawiony na fig. 7 ma czesc rdzeniowa 10, czesc srodkowa 11 i Czesc plaszczowa 12. Ilosc 5 warstw jest dowolna, przy czym grubosc i ksztalt warstw moga byc rózne. Dzialanie poszczególnych warstw jest odmienne. Na przyklad czesc rdzenio¬ wa 10 moze wiazac enzymy, a czesc plaszczowa 12 przepuszczac tylko czasteczki, które sa mniejsze od czasteczek enzymów, o które chodzi. Opisane pier¬ scienie sa tak skonstruowane^ ze wspólpracuja ze scianka kuwety, probówki lub zbiorniczka plytko¬ wego, za posrednictwem zewnetrznej powierzchni pierscienia lub jego wystepów lub innych czesci wystajacych. Scianka kuwety probówki lub zbior¬ niczka plytkowego moze miec takze np. garby, wy¬ stepy, zeberka lub inne równowazne wystepy, za pomoca których pierscien opiera sie na sciance. Na fig. 8 pierscien 13 jest umieszczony na zadanej wy¬ sokosci, w probówce 14. Kiedy probówka jest wstrza¬ sana, np. podczas reakcji, to ciecz 15 zawarta w pro¬ bówce bedzie podchodzic do wysokosci pierscienia 13s iw razie potrzeby, troche powyzej pierscienia.Pierscien '13- jest w&wcaasi w kontakcie z ciecza 15 tylko podczas wstrzasania i substancja lub substan¬ cje z pierscienia moga ha pierscieniu reagowac z substancja znajdujaca sie w cieczy. Mieszanie po¬ maga, szybkosci reakcji. Na lig. .9 dwa podobne lub rózniace sie pierscienie 16 i 17 sa umieszczone w pro¬ bówce 18. Substancje znajdujace sie w cieczy 19 moga reagowac np. najpierw z substancjami pier- scieilia 16, pózniej z substancjami z pierscienia 17 — po odwróceniu probówki 13. Kiedy probówka 18 jest wstrzasana; to substancje zawarte w cieczy 19 beda reagowac z substancjami wystepujacymi za¬ równo na pierscieniu 16, jak i ha pierscieniu 17.Jest oczywiste, ze moze byc jeden lub kilka piers¬ cieni umieszczonych na zadanej wysokosci w sto¬ sunku do scianki probówki. Poza tym jedna lub kilka substancji reagujacych moga byc umiejsco¬ wione na korku 20 probówki. Probówka moze byc zastapiona kuweta, kuweta czlonowa, wglebieniem zbiorniczka plytkowego lub kazdym innym naczy¬ niem reakcyjnym. Pierscien otwarty pokazano w rzucie pionowym na fig. 1Q i ten sani pierscien w rzucie poziomym na fig. 11. Pierscien tego, typu ma dowolny ksztalt, np. taki jak którykolwiek z po¬ przednio opisanych, przy czym wielkosc czesci ot¬ wartej moze byc rózna. Pierscien tego typu, moze miec takze rózne warstwy, jak i wystepy 21 na po¬ wierzchni zewnetrznej lub dolnej. Ponadto, piers¬ cien tego typu moze byc utworzony równiez z wy¬ mienionego wyzej pasemka o róznym ksztalcie. Pier¬ scien otwarty tego typu moze byc umieszczony w probówce jak opisano wyzej.Figura 12 przedstawia plytke nosna #£ z otwo¬ rami 23 do pomiaru wiazki swiatla i uchwytowymi pierscieniami 25 na przedluzeniach 24. Jak opisano wyzej, polozenie pierscieni w odniesieniu do plytki nosnej 22 moze byc regulowane za pomoca prze¬ dluzen 24.Figura 13 przedstawia wglebienia lub rurki 26, 27 i 28 o dnie w ksztalcie U, poziomym lub V. Pier¬ scienie 29 sa umieszczane we wglebieniach. Przy przepuszczaniu swiatla pionowo w kierunku wzdlu- 15 20 45 30 35 40 45 50 55 60114120 7 8 znej osi kuwety, pierscien 29 w kuwecie jest w po¬ zycji poziomej, jak pokazano na fig. 13, aby swiatlo moglo przechodzic przez srodkowy otwór pierscie¬ nia. Kiedy pomiar jest prowadzony zgodnie z tra¬ dycyjna zasada pomiaru poziomego, tj. przechodze¬ nia swiatla w plaszczyznie poziomej, najpierw przez pionowa scianke kuwety, nastepnie przez slupek cieczy i w koncu przez druga pionowa scianke ku¬ wety, wówczas pierscien jest umieszczony w ku¬ wecie w pozycji pionowej, aby swiatlo moglo przejsc przez srodkowy otwór pierscienia. Kiedy pomiar jest zgodny z zasada pomiaru pionowego lub poziomego, pierscien moze byc kolisty, kwadratowy, prosto¬ katny lufo kazdego innego typu. W zwiazku z tym pierscien równiez moze byc otwarty, jak pokazano na fig. 10 i 11. Zgodnie z zasadami opisanymi wy¬ zej pierscien moze byc uzyty takze do analizatora odsrodkowego, sw którym swiatlo biegnie pionowo do detektora, najpierw przez jedna scianke kuwety, nastepnie przez slupek cieczy i w koncu przez dru¬ ga scianke kuwety. W analizatorze odsrodkowym pierscien jest umieszczony w plaszczyznie pozio¬ mej. Tu, jak we wszystkich poprzednich rozwia¬ zaniach, pierscien moze miec kazdy dowolny ksztalt, np. pierscieniowy, cylindryczny, kwadratowy, pro¬ stokatny lub cylindra stozkowego, przy czym moze on byc pierscieniem pelnym lub otwartym. Piers¬ cien równiez moze byc o budowie kubicznej, maja¬ cy w przeciwstawnych plaszczyznach otworki prze¬ puszczajace pomiarowa wiazke swiatla lub stano¬ wi zwarta bryle o kazdym dowolnym ksztalcie ma¬ jaca otwór, przez który moze przechodzic pomia¬ rowa wiazka swiatla. Wymieniony wyzej i przed¬ tem opisany pierscien moze byc umieszczony poje¬ dynczo w kuwecie lub w probówkach lub kilka pierscieni moze byc umieszczone jednoczesnie, sto¬ sujac plytki nosne.Przedluzenia 24 plytki nosnej 22 przedstawione na fig. 12 moga byc magnetyczne lub magnesowal- ne, azeby pierscienie 25, jesli zawieraja zelazo, mo¬ gly przylgnac do przedluzenia 24. Pierscienie 25 mo¬ ga byc rozmieszczone w plaszczyznie poziomej lub pionowej, w zaleznosci do kierunku pomiarowej wiazki swiatla. Tu takze pierscienie moga miec ka¬ zdy dowolny ksztalt. Oprócz tego pierscienie te mo¬ ga byc np. zamkniete lub otwarte, jak opisano wy¬ zej i które sa np. kolowe, kwadratowe, prostokatne lub maja ksztalt kazdego innego wielokata. Czesc zelazna w oddzielnym pierscieniu równiez umozli¬ wia, aby pierscien w probówce lub kuwecie wiro¬ wal od dzialania z zewnatrz np. za pomoca miesza¬ dla magnetycznego. W ten sposób uzyskuje sie do¬ bre mieszanie, np. podczas trwania reakcji w pro- 5 bówce. Na fig. 14 sa widoczne koncówki 30 pipety, które sa oddzielne lub stanowia czesc skladowa za¬ konczenia plytki. W kazdej koncówce 30 moga byc umieszczone pierscienie stozkowe 31 azeby w kon¬ cówce pipety mogla zachodzic reakcja. Tu takze pierscienie moga byc stosowane w róznych odmia¬ nach i róznych badaniach, jak opisano wyzej. Jest mozliwe umieszczenie pierscienia 32 na zewnatrz koncówki 30 i jest to stosowane w taki sposób jak uprzednio opisano. Plytka z koncówkami takze mo¬ ze byc dogodnie uzyta do transportowania piers¬ cieni 32, jesli pierscien 32 ma wlasciwa pozycje w powiazaniu z koncówka 30. Jeden lub kilka piers¬ cieni moga byc rozmieszczone wewnatrz lub na ze¬ wnatrz koncówki. Oczywiscie równiez jest mozliwe stosowanie koncówek na plytce, tak samo pierscie¬ ni, w badaniach, materialach i sposobach postepo¬ wania opisanych powyzej.Na figurze 15 przedstawiono przykladowo pasem¬ ko 33 i wydluzenie 34. Wydluzenie 34 moze byc po¬ wiazane z pasemkiem 33 w rózny sposób, tworzac z nim nierozdzielna calosc lub moze byc odlaczal- ne. Ponadto pasemko moze byc takze bez wydlu¬ zenia. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL