NO903535L - Fremgangsmaate for detektering av antistoffer i blod, membranstrimmel og membranbatteri for utfoerelse av fremgangsmaaten. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for å påvise nærvær av antistoffer i blod ved immunoblottingteknikk (vestlig blotting) ved anvendelse av en membran belagt med siktede antigener tilsvarende de antistoffer som skal påvises. Oppfinnelsen angår videre en membranstrimmel samt et membranbatteri for anvendelse ved utførelse av fremgangsmåten .

Det er kjent flere forskjellige fremgangsmåter for å påvise antistoffer og antigener. Antigenene kan f. eks separeres og påvises ved gel-elektroforese, f. eks SDS. Ved denne fremgangsmåte har det vært mulig å splitte opp en nesten vilkårlig blanding av proteiner i sine enkelte komponenter. Mulig-hetene for videre analyse av de separerte proteiner har imidlertid vært begrenset pga deres relative utilgjengelighet innenfor den gel-matrise som anvendes.

For å overvinne den ulempe er gel-matrisen blitt erstattet med en membran hvorpå proteinene kunne fikseres i ubeveglig tilstand.

Fordelene ved den såkalte blottingsteknikk omfatter blant annet det forhold at antigenkonsentrasjonen på overflaten av en membran befinner seg i ubevegelig tilstand, således at de enkelte separerte antigener er lett tilgjengelig for videre identifisering.

En analysemetode basert på immuno-blottingsteknikker kan anvendes for å karakterisere både antistoffer og antigener. Eksempler på antistoffer som kan påvises på denne måte omfatter alle typer av retrovirus, slik som HIV-I, HIV-II, HTLV-I og HTLV-II. Andre eksempler er malaria, schistosomasis, filariasis, afrikansk trypanosomiasis og laishmaniasis. Videre kan allergifrembringende substanser påvises.

Normal immuno-blottingsteknikk utnytter blodprøver som er forbehandlet for å isolere serum. Dett isolserte blodserum bringes i kontakt med en membran i form av en strimmel med bredde typisk 4 - 5 mm og lengde 120 mm, og som er belagt med det siktede antigenet tilsvarende de antistoffer som skal påvises. Etter passende inkubasjonstid fjernes membranen og undersøkes for positiv reaksjon. Denne undersøkelse kan utføres i henhold til en hvilken som helst kjent fremgangsmåte, slik som fargelegging.

Fra Cin Chem 32 (1986) s. 2079 - 2083 er det kjent å måle alphe-feboprotein (AFP) i eluater av tørkede blodprøver på filterpapir ved bruk av en to-punkts enzym-immunoassay. Denne fremgangsmåte tillater ikke bestemmelse av forskjellige antistoffer i en og samme blodprøve.

WO-A-87/03065 angir flerindikerende prøvestrimler for immunoassay, idet prøvestrimlene er utført i et absorberende material og inneholder en eller flere antigener som er særegne for antistoffet av interesse i prøven. Strimlene bringes så i kontaktmed nevnte prøve, hvorpå mengden a bundet antistoff måles. Ingen samtidig påvisning av flere antistoffer er mulig.

Fra GB-A-2.099.578 er det kjent å anvende en fast porøs bæreskive hvorpå antigen, antistoff eller begge kan avsettes ubevegelig i form av flekker eller linjer. Antigenene eller antistoffene er ikke blitt separert ved elektroforese, således at ingen selektiv påvisning av de enkelte determinanter, f. eks for de forskjellige antistoffer, er mulig. Hver flekk eller linje omfatter det totale antigeninnhold useparert. Selv om en fagmann på området skulle finne på å erstatte de kjente strimler fra WO-A-87/03065 med den benyttede bærer i henhold til GB-A-2.099.578, ville man ikke komme frem til den gjenstand som er angitt i krav 5.

Foreliggende oppfinnelse er en videreutvikling og forenkling av den kjente immuno-blottingsteknikk, og innebærer vesentlig nedsatt analysetid. Videre kan analysen utføres på blod i sin helhet i stedet for blodserum, f. eks i form av en blodprøve som er blitt overført til en bærer og derpå koagulert.

Oppfinnelsen gjelder således en fremgangsmåte av den art som er angitt i den innledende del av krav 1, og er kjennetegnet ved at en bærer for den blodprøve som skal undersøkes og som har koagulert etter å ha blitt påført bæreren, innføres i en beholder sammen med membranen i form av strimmel belagt med de siktede antigener samt en elusjons- og inkubasjonsvæske, og membranen etter en forut fastlagt inkubasjonstid tas ut og undersøkes på i og for seg kjent måte.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse har det vist seg velegnet som bærer å bruke et stykke filterpapir som blodprø-ven er sugd opp i. Det er tidligere kjent å anvende filterpapir for å suge opp en blodprøve, men i henhold til de kjente prosesser har det vært nødvendig først å utskille serum fra blodprøven og derpå undersøke antistoffinnholdet i serumet i et påfølgende prosesstrinn.

Ved foreliggende oppfinnelse er det mulig å utføre elusjon og inkubasjon i et enkelt prosesstrinn, hvilket medfører en vesentlig forenkling samt forkortning av analysetiden. Til den oppnådde forkortning av analysetiden bidrar også det forhold at det ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er mulig å anvende en membran i form av en strimmel med ytterst små dimensjoner. Foretrukkede dimensjoner av den anvendte membranstrimmel er da bredde 1,1 - 1,8 mm og lengde 10 - 100 mm. Dette nedsetter i vesentlig grad omkostningene ved prosessen, samt også den påkrevede tid for utskillelse og overføring av antistoffer på membranen er nedsatt i betrakte-lig grad, f. eks fra 3-4 timer til 1-1,5 timer.

Foretrukkede membranstrimler for anvendelse ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er en polyvinyl-idndifluoridfolie oppkuttet i strimler med de angitte dimensjoner, nemlig fortrinnsvis en bredde på 0,1 - 1,8 mm og en lengde på 10 - 100 mm, f. eks 7 0 - 7 5 mm. Eksempler på andre egnede membranmaterialer er nitrocellulose eller polyamid. Hver strimmel kan være merket med en identifiseringskode, slik som en klebeetikett med et journalnummer eller en strekkode direkte på filmstrimlen.

Ved utførelse av prøven kan det anvendes en vilkårlig beholder som er i stand til å inneholde membranen og bæreren med blodprøven, så vel som en elusjons- og inkubasjonsvæske. Hvis et stort antall prøver skal utføres samtidig, er det hensiktsmessig å anvende en beholderblokk med et antall celler hvori et tilsvarende antall membraner og bærere med blodprøver kan innføres.

En hensiktsmessig utførelse av en sådan prøveblokk med et antall celler er vist på tegningen, hvorpå: Fig. 1 er en perspektivskisse av en prøveblokk i henhold

til oppfinnelsen.

Fig. 2 viser i tverrsnitt en del av denne blokk.

Fig. 3 er en perspektivskisse av det ene av de to lokk på

blokken, og

Fig. 4 vise et tverrsnitt av samme art som i fig. 2, hvor membranen, bæreren med blodprøven samt elusjons- og inkubasjonsvæsken er vist innført. Fig. 5 er et membranbatteri med 15 membranstrimler belagt

med samme eller forskjellige antigener.

Fig. 6 er et membranbatteri av samme art som vist i fig.

5, men hvor hver membranstrimmel er oppdelt i tre avsnitt.

Fig. 7 viser membranbatteriet i fig. 6 sett fra siden. Fig. 8 viser sett fra siden og delvis bortskåret en prøve-blokk med et antall kammere egnet for innføring av det membranbatteri som er vist i fig. 7. Fig. 9 viser den angitte prøveblokk i fig. 8 sett ovenfra. Fig. 10 viser et snitt gjennom et prøveblokkammer langs

linjen A-A i fig. 8, og

Fig. 11 viser en bærestrimmel for et antall filterpapir-stykker med blodprøver, samt egnet for innføring i kamrene i den prøveblokk er vist i fig. 8-10.

Prøveblokken består av en plate 1 av et material som er egnet for autoklavbehandling, slik som POM. Et antall parallelle gjennomgående hull 2 er blitt utboret i platen, og i disse hull er det innført gjennomgående rør 3 som rager ut på begge sider av platen 1. I den utførelse som er vist på tegningene er tykkelsen av platen 1 30 mm. Diameteren av hull 2 er 10 mm. Rør av lengde 80 mm og som rager ut 25 mm på begge siden av platene 1, er innført i hullene, således at rørenes åpninger 6 går fri fra platens overflate, og hvert rør er forsynt med en ringformet silikonelastomer-parti 9. Åpningene 6 kan være lukket ved hjelp av to lokk 4 og 5 som er forsynt med uttagninger 7 tilsvarende til røråpningene.

Fig. 4 viser et tverrsnitt av et rør hvor et stykke filterpapir med blodprøve 8 og en membranstrimmel 10 er blitt innført. De to røråpninger 6a, 6b er lukket av lokkene 4,5.

I det følgende vil oppfinnelsen bli beskrevet i forbindelse med påvisning av antistoffer til AIDS-virus, men det vil forstås at denne prosess er like godt egnet for utførelse i forbindelse med tallrike andre antistoffer eller antigener.

EKSEMPEL 1

I hvert hull av en blokk som vist på tegningene innføres en strimmel av en polyvinyl-idendifluoridfilm forsynt med en forsterkningsribbe, hvor filmen på i og for seg kjent måte er blitt belagt med siktede HIV-antigener. Strimlene har en lengde på 70 mm og en bredde på 1,6 mm. De anvendte strimler er hver merket med klebeetiketter som er påført trykt i journalnummeret. Stykker av filterpapir med påførte blod-prøver fra personer som skal undersøkes, blir så skåret til dimensjoner på 5 • 5 mm. Disse stykker innføres i hvert sitt av de viste rør, som alle til 3/4 av sitt volum er fylt med en elusjons- og inkubasjonsbuffer med en pH-verdi på 7,2 og som inneholder PBS, 0,1 % "Tween" 120, 1 % (w/w) kaninserum, 0,05 N NaN3. Røråpningene er lukket lokk 4,5 og hele batte-riet innføres i et roterende apparat, således at væsken i hver celle skyller over de innførte strimler med siktede antigener. Etter ca en time helles elusjons- og inkubasjonsvæsken ut, vask finner sted med destillert vann og inkubasjon med HRP (pepperrot-peroksidasekonjugert igG) i 3/4 timer, fulgt av skylling i destillert vann og fargelegging med TMBS/DONS-substrat. Etter fullstendig fargelegging fjernes strimlene og deteksjon for påvisning av positive eller nega-tive reaksjoner utføres.

EKSEMPEL 2

Det anvendes et membranbatteri som vist i fig. 5 og som omfatter et antall membranstrimler 3 som på et festested 4 er forbundet med klaffer 2 og en bærestrimmel 1 i vannavstøtende plastmaterial. Membranstrimlene 3 er belagt med innbyrdes samme eller forskjellige antigener tilsvarende de antistoffer som skal påvises.

Membranbatteriet innføres i en blokk med tilsvarende antall hull eller gjennomgående utboringer samt med samme innbyrdes mellomrom som membranstrimlene, tilsvarende en hullrekke i den viste blokk i figurene 1-4. Elusjons- og inkubasjonsvæske som stykker av filterpapir med inntørkede blodprøver fra de personer skal undersøkes, innføres samtidig i nevnte hull eller gjennomgående utboringer. Utprøvingen finner sted på samme måte som beskrevet i eksempel 1.

EKSEMPEL 3

Figurene 6 og 7 viser et membranbatteri bestående av en holder eller ribbe 11 med et antall klaffer 12 forsynt med et tilsvarende antall membranstrimler 13 i et plastmaterial, slik som polyvinyl i den difluorid. Hver membranstrimmel er oppdelt i tre avsnitt 13a, 13b og 13c, som er hver er belagt med et antigen som er forskjellig fra antigenene og de øvrige to avsnitt, men tilsvarer de antistoffer som skal påvises. Hver membranstrimmel er således utført for samtidig påvisning av tre forskjellige antigener i en blodprøve fra en og samme person. Ribben 11 er utformet som et rør og således at membranbatteriet lett kan fiskes ut ved hjelp av et holdeverktøy

(ikke vist) som omfatter pinner for å stikkes inn i den rørformede ribbe.

Det anvendes en prøveblokk med tilhørende membranbatteri som vist i fig. 8-10. Dette batteri består av en blokk 21 med antall avlange sporfurede kamre eller celler 22, som er åpne oventil. Avstanden mellom cellene innstilles til avstanden mellom klaffene 12 samt membranstrimlene 13 med antigener. Blokken 21 er forsynt med en langsgående uttagning 23, innrettet for å motta ribbene 11 med klaffer 12 og strimler 13 på membranbatteriet.

Videre er blokken 21 forsynt med en annen langsgående uttagning 24, utført for å motta en ribbe 31 på en holder for filterpapir med blodprøver, se fig. 11.

Nevnte holder omfatter en ribbe 31 med et antall klaffer, hvor stykker av filterpapir 33 er belagt med blodprøver. Fig. 10 viser et snitt gjennom en celle 22 med innskutt holder for blodprøver 31, 32, 33 samt holder for membranstrimlene 11, 12, 13.

Elusjons- og inkubasjonsvæske 14 innføres i cellene, og kulturprosessen samt etterbehandlingen utføres under samme forhold som angitt i eksempel 1. Etter vasking og fargelegging fjernes membranbatteriet og resultatet av under-søkningen avleses.

Det vil forstås at de angitte eksempler bare er anskuelig-gjørende og at fremgangsmåten kan varieres på forskjellig måte, slik det umiddelbart vil erkjennes av fagfolk på området. Som nevnt ovenfor kan fremgangsmåten ikke bare anvendes for å påvise antistoffer i blod, men også for å oppdage antigener i forskjellige væsker. I det sistnevnte tilfelle kan det anvendes strimler med siktede polyklonale eller monoklonale antistoffer.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for å påvise antistoffer i en helblodprøve ved immuno-blottingsteknikk (vestlig blotting), idet det anvendes en membran belagt med siktede antigener tilsvarende de antistoffer som skal påvises, karakterisert ved at et absorberende filtermaterial for den helblodprøve som skal undersøkes og som har koagulert etter å ha blitt påført filtermaterialet, innføres i en beholder sammen med membranen i form av en strimmel belagt med de siktede antigener samt en elusjons- og inkubasjonsvæske, og membranen etter en forut fastlagt inkubasjonstid tas ut og undersøkes på i og for seg kjent måte.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som absorberende filtermaterial anvendes et stykke filterpapir.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes en membranstrimmel med bredde på 1 - 1,8 mm og lengde på 10 - 100 mm.

4. Membranstrimmel for anvendelse ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til krav 1 - 3, karakterisert ved at den er belagt med antigener som er siktet med hensyn på molekylvekt, tilsvarende de antistoffer som skal påvises.

5. Membranbatteri for bruk ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til krav 1 - 3, karakterisert ved at det består av et antall membranstrimler som er festet til en felles bærestrimmel, idet strimlene er belagt med hver sin separate antigen som vedkommende person skal undersøkes for.