NO863643L

NO863643L - Fremgangsmaate for maaling av ligand/anti-ligand- veksel-virkninger.

Info

Publication number: NO863643L
Application number: NO863643A
Authority: NO
Inventors: David H Mitchell; Ralph M Mitchell
Original assignee: Sensor Diagnostics Inc
Priority date: 1985-01-14
Filing date: 1986-09-12
Publication date: 1986-11-12
Also published as: DK438486D0; EP0210224A1; FI863679A; FI863679A0; DK438486A; US4713347A; JPS62502061A; EP0210224A4; CA1249026A; NO863643D0; WO1986004147A1

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Denne oppfinnelse vedrører analytiske metoder og apparater, mer spesielt metoder, apparater og sensorer for påvisning av et stoff av interesse i en fluidprøve.

Det er mange typer standardtester eller assays for påvisning av tilstedeværelse og/eller konsentrasjon av spesifikke stoffer i fluider. Inntil nylig krevde mange av disse assays utvikling av forskjellige reagenser og fremgangsmåter for påvisning av hvert stoff. Eksempler på disse tilnærminger inkluderer forskjellige enzym-assay-fremgangsmåter i biokjemilabora-torier og Technicon SMAC-maskinene, duPont automatisert klinisk analyseapparat og Kodak Ektachem 700 maskiner i klinisk kjemiske laboratorier.

I de siste to ti-år har en ny type diagnostisk test eller assay fått økt anvendelse - antistoff-baserte assay, eller immu-no-assay. I immunoassays kan et antistoff brukes, for eksempel for å bevise tilstedeværelse av et spesielt antigen, hapten eller et annet molekyl.

Immunoassays har flere potensielle fordeler i forhold til

tidligere assays:

(a) de har en fremgangsmåte som kan generalisere; dvs. samme type assay-prosedyrer og reagenser kan brukes til å påvise de fleste antigener, uansett hva de kjemiske egenskaper av et spesielt antigen er; (b) de er høyt spesifikke; dvs. de kan potensielt skille

godt mellom strukturelt beslektede forbindelser;

(c) de er potensielt veldig følsomme.

Immunoassays er en spesifikk type av en mer generell assay-strategi, ligand/antiligand-assay. Alle ligand/anti-ligand-assay er basert på to premisser: (1) at spesielle par av stoffer (liganden og antiliganden) har en sterk og spesifikk affinitet for hverandre, dvs. at de vil ha en tendens til å binde seg til hverandre, mens de binder seg lite eller ikke i det hele tatt til andre stoffer; og (2) at fremgangsmåter og apparater kan ut-vikles som muliggjør påvisning av ligand/antiligand-bindings-interaksjoner så snart komplekser er blitt dannet. Som anvendt her, er lagånd definert som stoffet som skal påvises og anti ligand stoffet anvendt for å bevise tilstedeværelse av liganden. (I noen 'ligand/antiligand-assays, kan en tilleggs-, kanskje modifisert, ligand brukes som konkurrerer med stoffet som skal påvises, om bindingssteder på antiliganden.)

I mange tilfeller blir påvisning av et ligand/antiligand-kompleks muliggjort ved å merke én komponent av komplekset på en eller annen måte, for å gjøre hele komplekset "synlig" for et egnet påvisningsinstrument. For eksempel bruker radioimmuno-assay (RIA) en radioisotop som markør. Se US-patent 3 555 143 og 3 646 346. Enzym-immunoassays (EIA) bruker et enzym som kan produsere en påvisbar farve under passende betingelser. Se US-patent nr. 3 654 090, 3 791 932 og 3 850 752. På samme måte bruker fluorescens-immunoassays (FIA) en fluorescerende markør.

Ennå en annen ligand/antiligand-assay som er i ferd med å bli av økende viktighet, er nukleinsyre-hybridiserings-assay, for eksempel DNA-prøveassay, som bruker en "prøve"-streng av nukleinsyre som antiligand for å teste for tilstedeværelse av en komplementær DNA-sekvens. DNA-prøveassays, lik immunoassays, bruker ofte radioaktive markører, fluorescerende markører eller enzym-markører.

Nylig er andre ligand/antiligand-assayteknikker som bruker mindre standard-markør, blitt utviklet. For eksempel bruker partikkel-tellings-immunoassay små lateks-kuler som sprer lys på kjente måter når kulene agglutinerer på grunn av antigen-antistoff-interaksjon. Både immunoassays og DNA-prøveassays har og-så brukt luminescerende markører.

Markører kan øke følsomheten av ligand/antiligand-assays sterkt ved å assosiere tilstedeværelse av det merkede kompleks med et påvisbart signal. Imidlertid har markør-anvendende assays også ofte medført ulemper. Først og fremst må de merkede immuno-reageriser fremstilles, hvilket kan kreve tid og utgifter. Flere prosess-trinn kan også være nødvendig i løpet av assayen slik som tilsetning av markør, inkubering for å tillate reaksjon mellom komponenter, bortvasking av overskuddsmarkør, overføring til et påvisningsinstrument og påvisning av det merkete kompleks.

På grunn av deres relative kompleksitet kan mange av disse assays bruke betraktelig tid og kreve faglig teknisk hjelp. Slike assays kan også være relativt vanskelig å automatisere, unntatt ved hjelp av dyrt utstyr. Videre måler disse assays hovedsakelig nivået av bare én ligand om gangen. Enda videre kan de merkete reagenser være ustabile, uhåndterlige eller farlig å hånd-125 32

tere, som med isotopene I eller p og karsinogene enzymsubstrater. Også ved å bruke de ovenfor nevnte og andre alminne-lig tilgjengelige markør-avhengige assays er det ikke mulig å måle nivået av antigen kontinuerlig; således for å følge nivået av et antigen eller antistoff over en utstrakt tid må prøver tas ut ved intervaller, behandles med markør og testes.

Et stort antall teknikker er i bruk i handelen eller under utvikling som søker å unngå noen av problemene som er notert ovenfor ved å unngå anvendelse av markører eller ved å modifisere hvordan markørene ble brukt. Mange slike teknikker undersøker for dannelsen av ligand/antiligand-komplekser ved hjelp av op-tiske midler. For eksempel måler sammenlignende nefelometri, en type immunoassay, forandringer i den angulære fordeling av spredt lys, idet antigener og antistoffer danner aggregater under spesielle betingelser. Imidlertid er denne metode ikke særlig følsom, og krever testing av to fortynninger av prøven.

Graviditetstesting, syfilis-testing og blodantigen-testing, blant andre, gjøres ofte ved visuell inspeksjon for dannelse av presipiterte eller agglutinerte antigen/antistoff-komplekser. Strengt talt kunne imidlertid cellene eller partiklene som ofte anvendes i disse tester for å gjøre aggregering synlig, kalles markører. Uansett har de noen av ulempene assosiert med markør-er nevnt ovenfor, slik som mangel på kapasitet til kontinuerlig måling eller til å lage samtidige påvisninger av multippel-ligander i samme prøve. Et stort antall andre immunoassay-systemer bruker en eller annen form for optisk påvisning uten å være avhengig av presipitat-dannelse, agglutinering eller standard mar-kører. Se US-patenter nr. 3 975 238, 4 054 646 og 4 321 057.

Det er også flere typer immunoassays basert på elektrisk påvisning av ligand/antiligand-komplekser. Disse assays fokuserer på å overvinne en eller flere av ulempene nevnt ovenfor. En slik metode er motstandspuls-teknikken forklart av US-patent nr. 4 191 739, som lager en bulk-konduktans-måling. Denne teknikk er en modifisering av (Coulter-metoden, hvorved et ledende fluid som inneholder ikke-ledende partikler, blir passert gjennom en trang, sammensnørt kanal, hvis totale (bulk) motstand måles.

Den totale motstand øker når en ikke-ledende partikkel går gjennom kanalen, og størrelsen av "pulsen" som blir produsert, er proporsjonal med partikkelens volum. Således, hvis partiklene er belagt med antistoff, for eksempel blir utsatt for antigen under passende betingelser, vil det danne aggregater, og den øk-te størrelse og antall aggregater kan relateres til mengden av antigen som er til stede. Imidlertid er denne teknikkens følsom-het begrenset ved tilstedeværelsen av selv-aggregater som dannes i løpet av fremstillingen av selve de antistoff-belagte partikler. US-patent nr. 4 191 739 søker å eliminere dette problem og således øker følsomheten av denne teknikken ved belegning med antistoff av to partikkelpreparater av forskjellige størrelser og telling av bare aggregater som inneholder både store og små partikler som indikering på tilstedeværelse av antigen. Imidlertid krever teknikken, som beskrevet, et dyrt apparat. Det krever og-så en markør (partiklene som antistoff eller en annen antiligand er festet til), og den kan ikke så lett tilpasses til å måle multiple ligander ved samme tid i en enkelt prøvefluid, heller ikke til å måle en kontinuerlig varierende prøve.

US-patent nr. 4 236 893 og 4 242 096 vedrører anvendelsen

av en piezoelektrisk oscillator som er blitt belagt med antigen for å påvise tilstedeværelse av antigen eller antistoff i en fluid-prøve. Mere spesifikt er det en forandring i frekvensen av oscillatoren når dens masse forandrer seg på grunn av binding av antistoff til antigen på dens overflate. Selv om denne assay ikke krever merkete reagenser eller avanserte instrumenter, krever den som beskrevet en komplisert fremgangsmåte som inkluderer fjerning av sensoren fra løsningen etter at den har vært i kontakt med fluidprøven og tørking av den før målinger kan gjøres.

US-patent nr. 4 054 646 vedrører anvendelsen av kapasitans som én av flere måter for å måle den relative tykkelse av et antigen/antistoff-bimolekylær-lag. Spesielt blir et ledende .stoff utsatt for et antigen, antistoff eller en annen antiligand, hvorved et monomolekylært lag av antiligand dannes på den ledende overflate, som generelt vil være en elektrisk isolator når den er tørr. Denne overflate blir så utsatt for en løsning som inneholder liganden av interesse, og et lag av denne er også isolator når det er tørt. Til slutt blir en kvikksølvdråpe eller

en annen elektrode brakt i kontakt med det tørre ligand-lag.

Det ledende stoff og kvikksølvdråpen omfatter de to ledende plater av en kondensator adskilt ved et isolerende lag, hvis tykkelse avhenger av mengden av ligand som har bundet seg til antiliganden. Kapasitansen av denne kondensator blir så målt ved hjelp av et egnet instrument. Denne teknikk krever ikke merkete immunoreagenser eller dyre instrumenter. Imidlertid krever den slik som den piezoelektriske assay ovenfor, at den ligand-inne-holdende kondensator fjernes fra løsningen og tørkes før målingene kan gjøres.

Andre typer elektriske assays har søkt å forenkle ligand/ antiligand-assayprosedyrene ved å måle forandringer i elektriske egenskaper assosiert med en overflate eller grenseflate i kontakt med en elektrolytt. For eksempel, når en overflate slik som en metall-elektrode blir utsatt for en elektrolyttløsning, fremkommer det sterke lokale gradienter av elektrisk ladning og potensial i området ved elektrode/elektrolytt-grenseflaten. Fordi gradientene og assosierte elektriske potensialer er sterke, kan ligand-molekyler som interagerer med et immunoreagens eller en annen antiligand som er immobilisert ved grenseflaten, ha en betraktelig virkning på de generelle elektriske egenskaper ved grenseflaten og kan således gi sterke elektriske signaler av forskjellige slag. Eksempler på assays basert på fenomenet ovenfor inkluderer voltametrisk assay som beskrevet i US-patent nr. 4 233 144; felt-effekt transistorbaserte assays og andre semi-konduktor-baserte assays som beskrevet i US-patenter nr. 4 238 757 og 4 334 880; elektrisk motstands-assays som beskrevet i US-patent nr. 4 219 335; antistoff-elektrodeassays (Analytical Chem. 56,801 (1984); Chem. & Eng. News, 2. april 1984, s. 32)

og andre potensiometriske assays, for eksempel som beskrevet i US-patenter nr. 4 151 049 og 4. 081 334....... • .

Slike grenseflate-baserte assays kan være raske, enkle å utføre og kontinuerlige, siden en prøve kan måles så lenge som den er i kontakt med grenseflaten. Slike assays kan også være markør-uavhengige og kan tilpasses til å kontrollere multiple analytter samtidig. Imidlertid kan grenseflate-elektriske egenskaper bli påvirket på mange ikke-spesifikke måter, slik som ved variasjoner i pH eller elektrolytt-sammensetning eller ved ikke-spesifikk adsorpsjon av stoffer i løsning på, eller inn i overflaten eller grenseflaten. Således er metoder som er basert på måling av slike egenskaper, ofte utsatt for interferenser som er uforutsigbar eller vanskelig å kontrollere. Videre krever mange av disse metodene fremstilling av en membran eller et mole-kylært lag ved eller på grenseflaten som inneholder ligand eller antiligand, og dette kan være vanskelig å gjøre på en reproduserbar måte.

Det ville derfor være fordelaktig å ha et ligand/antiligand-assaysystem som bevarer fordelene mens de overvinner ulempene som er assosiert med de ovenfor beskrevne assays. Mer spesifikt ville det være fordelaktig å ha en økonomisk assay som er rask (kan fullføres på mindre enn 1 minutt), er i.stand til å være kontinuerlig, i stand til å påvise tilstedeværelse av multiple ligander samtidig i en fluidprøve, enkel å utføre og markøruav-hengig. Det ville også være fordelaktig å ha et apparat som muliggjør at en slik assay blir utført, og som kan miniatyr-gjø-res i den forstand at den tillater måling av ligand/antiligand-interaksjon i et ekstremt lite volum.

Sammendrag

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det gitt metoder, apparater og sensorer for påvisning av tilstedeværelse av en ligand i en fluidprøve ved å måle forandringer i bulk-elektrisk konduktans av et testvolum. Konduktans-forandringene gjøres ligand-spesifikke ved tilstedeværelse i eller nær testvolumet av et predeterminert område som inneholder lokalisert antiligand eller ligand. Dette predeterminerte område blir utsatt for fluidprøve, ligand/antiligand-interaksjon forekommer, og de resulterende konduktans-forandringer blir målt av et hvilket som helst egnet konduktans-målingsinstrument.

Denne oppfinnelse vedrører også fremgangsmåter og apparater for eliminering av ikke-spesifikk støy og avvik ved i) sammenligning av bulk-konduktansen av et testvolum.med nærliggende negative eller positive kontrollvolumer, og/eller ii) minimalisering av virkninger av fenomener som forekommer ved elektrode/elektrolytt-grensef låtene gjennom anvendelse av en null-strøm, fire-elektrode-målingsteknikk og inntrukne elektroder.

Mer spesifikt, i én utgave, flyter fluidprøven gjennom et predeterminert område som består av en matriks hvorpå en anti ligand eller ligand er immobilisert. Et egnet kontrollmolekyl kan være immobilisert i et nærliggende predeterminert område. Både test og kontroll-predeterminerte områder er små (typisk

av størrelsesorden på 0,1 ul)/og ledningsevne av testvolumene blir målt ved å bruke en null-strøm fire-elektrodet teknikk, inntrukne elektroder og et passende konduktans-målingsinstrument.

Fordeler med den foreliggende oppfinnelse inkluderer dens hastighet og enkelhet i anvendelse. Målingen kan være kontinuerlig og er i stand til å måle flere ligander samtidig. Hvis ønsket kan den være markør-uavhengig, likevel kan den også bruke en rekke egnete, trygge, billige markører for å øke følsomheten med lite eller ikke noe tap i hastighet og enkelthet i anvendelse. Den foreliggende oppfinnelse minimaliserer også virkningene av fenomener som forekommer ved elektrode/elektrolytt-grensefla-ter. Videre kan elektrodene være fysisk atskilt fra området som inneholder lokalisert antiligand eller ligand; dette tillater en separat fremstilling av elektroder og lokaliserte antiligand eller ligand-sammensetninger, tillater deres fremstilling å være potensielt enkel og billig, og tillater fleksibilitet i valg av metoder, teknikker og materialer. Til slutt eksisterer en rekke instrumenter som kan brukes eller modifiseres til å måle forandringer i bulk-konduktans på grunn av ligand/antiligand-interaksjoner.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur IA viser forandringen i konduktansforhold mellom en test-sensor og en kontrollsensor etter tilsetning av en fluid-prøve som inneholder en konstant konsentrasjon av ligand;

figur IB er en kalibreringskurve som relaterer starthastigheten for forandring av konduktansforhold til en kjent konsentrasjon av ligand i fluidprøven. Figur 2A viser forandringen i konduktansforhold i en fluid-prøve hvor ligandkonsentrasjonen varierer med tiden; figur 2B viser forandringen i konduktansforhold etter en fluidprøvepuls. Figur 3A er en kalibreringskurve som vedrører prosenten av bindingssteder som er okkupert i et predeterminert område ved likevekt med en kjent konsentrasjon av ligand; figur 33viser forandringen i konduktansforhold målt via målinger gjort ved

likevekt.

Figur 4A illustrerer bindingen av ligand/partikkel-komplekser til et predeterminert område hvor testvolumet inkluderer i det minste overflaten av det predeterminerte område; figur 4B illustrerer bindingen av ligand/partikkel-komplekser til overflaten av et predeterminert område, hvor testvolumet ikke inkluderer noen del av det predeterminerte område. Figur 5A viser et typisk apparat brukt i påvisning av til stedeværelsen av en ligand i en fluidprøve; figur 5B viser den elektriske ekvivalent. Figur 5C og 5D viser andre mulige utform- inger av apparatet. Figur 6A viser et multippel sensorapparat med flere testceller og en negativ og positiv kontroll, idet hver celle har sin egen elektriske vei og fluidvei; figur 6B viser et multippel sensorapparat med celler i serier, idet alle cellene har en felles strømvei og fluidvei. Figur 7 viser to versjoner av en inntrukket plan sensor og

apparat.

Figur 8A viser et tverrsnitt av måleinnretningene i en IVEP-sensor (se definisjoner) med biolaget innfelt i sensoren;

figur 8B viser et nærbilde av det følsomme område i IVEP-sensoren.

Figur 9A viser et tverrsnitt gjennom måleinnretningene til en EVEP-sensor (se definisjoner); figur 9B viser et vannbad for anvendelse med en IVEP eller EVEP sensor. Figur 10 viser spesifikk påvisning av et antistoff rettet mot kanin IgG ved å bruke en IVEP sensor, med påfølgende forsterkning av signalet ved å bruke en partikkel. Figur 11 viser samtidig påvisning av to forskjellige ligander og anvendelse aven positiv kontroll. Figur 12 er lik figur 10 med unntak av at en EVEP sensor

ble brukt.

Figur 13 viser en spesifikk påvisning av et antigen ved å

bruke en kolonnesensor.

Figur 14 er et blokk-diagram av en krets for å måle ledningsevnen for anvendelse med test- og kontrollceller ved å bruke fire-terminale målinger. Figur 15 er et skjematisk diagram som viser videre detaljer av komparator-kretsen i figur 14. Figur 16 er et skjematisk diagram som viser videre detaljer av transformator-kretsen i figur 14. Figur 17 er et skjematisk diagram som viser videre detaljer av avskjermings- og sikrings-forsterkerne i figur 14. Figur 18 er et skjematisk diagram som viser videre detaljer av en AC bi-quad-forsterker anvendt i kretsen i figur 14. Figur 19 er et skjematisk diagram som viser videre detaljer av fase-vekslingskretsen i figur 15. Figurene 20, 21 og 22 er flow-diagrammer som viser en fremgangsmåte hvorved en ledningsevnemåling kan utføres ved hjelp av kretsen beskrevet her; og

figur 23 viser en alternativ utgave til utgaven vist i figur 14.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

De følgende definisjoner er gitt for å forenkle forståelsen av den foreliggende oppfinnelse. I den grad definisjonen varierer fra betydningene på fagspråket, er definisjonene nedenfor gitt som kontroll.

Ligand betyr stoff som skal påvises, som spesifikt binder seg til et annet stoff, antiliganden.

Antiligand betyr stoff som brukes til å teste for tilstedeværelse av en ligand som spesifikt binder seg til liganden.

Test-volumet betyr volumet hvis konduktans måles for å påvise forekomsten av ligand/antiligand-interaksjon i et predeterminert område.

Predeterminert område betyr et område som har ligand eller antiligand lokalisert på seg.

Lokaliserende midler er midlene som brukes til å lokalisere antiligand eller ligand i det predeterminerte område.

Kontaktbringende midler er midlene som brukes for å sikre kontakt mellom de lokaliserende midler og fluidprøve som-inneholder liganden av interesse..

Måle-innretninger er innretningene som brukes til å måle bulk-konduktans av testvolumet.

Sensor betyr de lokaliserende midler og måleinnretningene tatt sammen.

Effektivitet E av en sensor betyr motstanden i det predeterminerte område dividert på motstanden i testvolumet.

Konduktans C betyr konduktansen av testvolumet dividert på konduktansen av det negative kontrollvolum.

IVEP sensor betyr et indre spenningsekvivalenspunkt-sensor-apparat.

EVEP sensor betyr et ytre spenningsekvivalenspunkt-sensorapparat.

Bioområde betyr lokaliserende midler som er montert på et biolag.

Biolag betyr kombinasjonen av et eller flere bioområder og et egnet fast støtteinventar, konstruert for lett innføring eller plassering av biologiske områder i eller på et sansende apparat.

Denne oppfinnelse vedrører fremgangsmåter, apparater og sensorer for påvisning av tilstedeværelse av en ligand i en fluidprøve ved å måle ligand-induserte forandringer i bulk-elektrisk konduktans.

I en foretrukket utgave er antiligand mot liganden av interesse lokalisert i et predeterminert område. Det predeterminerte område utsettes for fluidprøven som skal analyseres, og bulk-konduktansen av et volum (testvolumet) som i det minste delvis inneholder det predeterminerte område, måles. Forandringer i bulk-konduktansen av dette testvolum som fremkommer som et resultat av ligand/antiligand-interaksjon i det predeterminerte område, kan brukes for å påvise tilstedeværelsen av ligand i fluidprøven.

Mer generelt kan det eksistere en rekke romlige relasjoner mellom det predeterminerte område og testvolumet. For eksempel kan testvolumet helt inkludere det predeterminerte område, eller alternativt, det predeterminerte område kan helt inkludere test-volumet. Det predeterminerte område og testvolumet kan overlappe, kan være nær hverandre men ikke overlappe, eller være i en

distanse fra hverandre.

Selv om de foreliggende fremgangsmåter og apparater er utformet til å påvise tilstedeværelse av en ligand i en fluidprø-ve, kan de lett modifiseres til å påvise tilstedeværelse av en ligand i en gass, for eksempel ved å løse eller boble gassen gjennom et egnet fluid, ..eller i et fast stoff, for eksempel ved å løse det faste stoff i et egnet fluid.

Selv om vi ikke ønsker å være bundet av teori, er det

trodd at en ligand-spesifikk konduktans-forandring forekommer i testvolumet, fordi tilstedeværelse eller fravær av ligand påvirker fordelingen og/eller konsentrasjonen av ladete stoffer som bærer elektrisk strøm gjennom testvolumet. For eksempel, når ligand binder seg til antiligand som er immobilisert i det predeterminerte område innen testvolumet, okkuperer den bundete ligand rom i testvolumet, som så ikke lenger er tilgjengelig til å lede strøm.

Forandringer i bulk-konduktans som oppstår fra ligand/antiligand-kompleksdannelse, er i mange tilfeller små (av størrelses-orden på 1 % eller mindre). Store ikke-spesifikke forandringer i konduktans kan oppstå fra lokale forandringer i omgivelsene, for eksempel i temperatur, sammensetning av fluidprøven, viskosi-tetsforandringer eller ikke-spesifikk binding av proteiner eller andre stoffer til det predeterminerte område eller testvolum. Disse forandringer kan tendere til å overdøve de ligand-spesifikke forandringer som man ser etter. For eksempel kan en forandring i temperatur på 1°C produsere en 2 % til 3 % forandring i konduktivitet - kanskje større enn hele den ligand-spesifikke virkning man søker etter.

For å være i stand til å påvise og nøyaktig kvantifisere den ligand-spesifikke konduktansforandring av interesse i nærvær av ikke-spesifikke forandringer, sammenligner man i en foretrukket utgave bulk-konduktansen av et testvolum med bulk-konduktansen av minst ett kontrollvolum. Både positive og negative kontrollvolumer kan brukes.

Generelt bør et negativt kontrollvolum være så fritt som mulig for ikke-spesifikke interaksjoner som forårsaker forandringer i bulk-konduktans. Ved et minimum bør det negative kontrollvolum ikke inneholde antiligand som reagerer med liganden av interesse. Det kan være tilstrekkelig at kontrollvolumet ganske enkelt ikke inneholder noe lokalisert stoff. Imidlertid, for den sterkeste anvendelse av dette differensielle eller komparative prinsipp bør testen og den negative kontroll være så like som mulig. For eksempel inneholder i en foretrukket utgave det negative kontrollvolum delvis minst ett predeterminert område som er utsatt for fluidprøven, og dette predeterminerte område har i seg lokalisert et molekyl hvis fysiske egenskaper er lik de fysiske egenskaper til antiliganden lokalisert i det predeterminerte område av testvolumet, men som ikke binder seg spesifikt til liganden av interesse. For eksempel, hvis et testpredeterminert område inneholder muse-IgG rettet mot et hepatitt-virus-antigen, kunne en god negativ kontroll være muse-IgG fra et normalt dyr. Anvendelse av denne differensielle teknikk reduserer behovet for nøyaktig ytre temperaturmåling og kontroll. Dette forenkler konduktansmålingene sterkt og hjelper til å gjøre dem mer presise. Spesifikk apparatur som gjør bruk av differensielle teknikker er beskrevet senere.

Konduktansen av et testvolum kan sammenlignes med konduktansen med et negativt kontrollvolum på forskjellige måter. For eksempel kan verdien av hver konduktans måles,.så verdien av den negative kontroll subtrahert fra verdien av testvolumet manuelt eller elektrisk. Fortrinnsvis blir konduktanser uttrykt ratiometrisk som funksjon av tiden, ved å bruke konduktansforholdet C, hvor C = konduktans av prøvevolum/konduktans av negativ kon-rollvolum. Testvolumet og/eller det negative kontrollvolum kan videre sammenlignes med et positivt kontrollvolum. I dette tilfelle er en positiv kontroll-ligand til stede i kjent konsentrasjon i fluidprøven, og det positive kontrollvolum inneholder i det minste delvis et predeterminert område som selv har lokalisert innen dette en antiligand.som reagerer med den positive kontroll-ligand. Testvolumet og det positive kontrollvolum kan sammenlignes med det negative kontrollvolum for å korrigere for ikke-spesifikke konduktans-forandringer, så med hverandre. Det positive kontrollsignal kan brukes som en kalibreringsmetode, som en måte å måle strøm på, eller som en sjekk på god funksjon av fremgangsmåten og apparatet.

Lokalisering av antiligand kan utføres på en rekke måter. Fortrinnsvis omfatter lokalisering immobilisering av antiligand på en matriks. En rekke kommersielt fremstilte matrikser er tilgjengelige. Slike materialer er lette å håndtere, og antiligander blir lett bundet til dem på direkte måte som er kjent for fagmenn på området. Matrikser inkluderer gelkuler, gel-lag, glasskuler, polymere kuler, mikropoirøse membraner, porøst papir, filtermateriale eller blandinger av disse. Fortrinnsvis er matriksen en porøs membran eller et papir som binder en rekke antiligander, slik som nitrocellulosefiltere (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Forskjellige antiligander kan bindes til forskjellig predeterminerte områder av matriksmateriale, hvilket tillater multippel-ligander å påvises i en enkelt fluid-prøve .

Lokalisering av antiligand kan også utføres ved å avgrense antiliganden innen et område definert ved grensene av en semi-permeabel membran som er permeabel i det minste for liganden, men ikke for antiliganden. For eksempel kan det predeterminerte område bestå av en antistoff-løsning begrenset av en dialyse-membran.

Fluidprøven og det predeterminerte område kan bringes i kontakt på en rekke måter som beskrevet i mere detalj nedenfor. For eksempel kan en flytende strøm av fluidprøve bringes i kontakt med matriksen av det predeterminerte område. Fluidet kan flyte enten gjennom matriksen eller forbi matriksen med diffusjon som bringer liganden av interesse inn i matriksen.

Der hvor det predeterminerte område omfatter antiligand av-grenset innen en semi-permeabel membran, forårsakes fluid å flyte over membranen. Liganden diffunderer gjennom membranen inn i det predeterminerte område.

Den foreliggende oppfinnelse kan brukes i en hvilken som helst situasjon hvor et ligand-antiligand-par assosierer. Eksempler på ligander som kan påvises ved å bruke dette system,

er antigener bundet til celleoverflater eller andre partikler, frie antigener, haptener, antistoffer, nukleinsyrer, enzymer eller mutant-enzymer, ko-faktorer, enzymsubstrater, reseptorproteiner, permeaseproteiner, transportproteiner, spesifikke bindingsproteiner slik som periplasmiske proteiner, molekyler bundet av et reseptorprotein eller andre bindingsproteiner, karbohydrater, lectiner, metallioner, metallbindingsproteiner eller andre spesifikke bindingsstoffer. I hvert av tilfellene ovenfor er det et stoff som spesifikt binder seg til den nevnte ligand. For eksempel, hvis liganden er et antigen, kan antiliganden være et antistoff. Hvis liganden er et antistoff, kan antiliganden være et antigen. Hvis liganden er en nukleinsyre-sekvens, kan antiliganden være en komplementær nukleinsyresek-vens. Hvis liganden er et.hormon, kan antiliganden være et reseptorprotein for det hormonet, etc. Denne liste over ligander og antiligander er ikke ment å være uttømmende, men ganske

enkelt å illustrere det generelle prinsipp, at denne oppfinnelse kan brukes for å påvise enhver ligand for hvilken en antiligand er kjent å eksistere, kan finnes, eller kan konstrueres.

I en spesielt anvendbar anvendelse av denne oppfinnelse kan ligander på celleoverflater brukes for å påvise tilstedeværelse av hele celler eller partikler, for eksempel røde blodceller, hvite blodceller, bakterier, eller membranfragmenter fra disse. Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er spesielt sterk i slike tilfeller, fordi liganden allerede er assosiert med et ikke-ledende volum som er mye større enn dets eget volum (av molekylstørrelse).

Det er i økende grad i ferd med å bli mulig å syntetisere og/eller modifisere molekyler for å gi dem de egenskapene som er ønsket for spesifikke antiligander, slik som en spesiell affinitet eller spesifisitet. For eksempel kan det isoleres mutant-enzymer med forandret affinitet, spesifisitet eller enzymatisk aktivitet. Antiligander kan behandles kjemisk for å forandre deres egenskaper. Nukleinsyresekvenser kan syntetiseres, spesifikke peptidsekvenser kan syntetiseres, eller nukleinsyresekvenser som utfører syntese av spesielle proteiner, kan forandres spesifikt, for eksempel ved å bruke gen-manipulasjonsteknikker, og således tillate syntese av forandrete proteiner. Disse og andre teknikker kjent for fagmenn på området, tillater anvendelse av en økt mengde antiligander med den foreliggende oppfinnelse. Referanse til noen av disse teknikker kan finnes i det føl-gende, beskrivelsen av disse er innbefattet ved referanse her: Advances in Enzyme Technology: "Artificial, Semisynthetic, and Designed Enzymes", (Technical Insights, Inc., Pt. Lee, NJ) ; Morinaga et. al., Biotechnology, juli 1984, side 636.

Antiligander som enten.har høy.affinitet.eller lav affinitet til liganden, kan!-brukes. Høy affinitet betyr at antiliganden har tendens til å binde seg sterkt til liganden, lav affinitet at den har tendens til å binde seg svakt. Et brukbart kvantitativt mål for affinitet er affinitetskonstanten K, som er lik konsentrasjonen av fri ligand som trengs for å mette halvparten av de antiligand-bindende steder ved likevekt (så lenge som det totale antall ligandmolekyler er mye større enn antallet bindingssteder). Når affiniteten er høy, er affinitetskonstanten lav, og vice versa. Mer spesifikt er antistoffer med

affinitetskonstanter mindre enn 10 10 M generelt betraktet å

ha høy affinitet, og antistoffer med affinitetskonstanter stør-

— 8

re enn 10 M er betraktet å ha lav affinitet. For formålene av den foreliggende oppfinnelse er høy og lav affinitet typisk definert situasjonsbetinget; En antiligand er betraktet å ha høy affinitet når konsentrasjonen av liganden av interesse i fluidprøven er mye høyere enn affinitetskonstanten, og lav affinitet ellers. Selv om en ikke ønsker å være bundet av teori,

er modeller beskrevet nedenfor, som er til hjelp i forståelsen av hvordan ligand/antiligand-interaksjoner kan kvantifiseres.

I høy-affinitetssituasjoner overstiger assosiasjonsgraden

rl= kl ^ av 1;i-gand°9antiligand for å danne et kompleks sterkt dissosiasjonsgraden r2= k2(L/AL) av ligand/antiligand-kompleks så lenge som en signifikant fraksjon av bindingsstedene er uokkupert; videre er så å si alle bindingsstedene okkupert ved likevekt. (I disse uttrykkene er k1gradskonstanten fremover, k2er gradskonstanten tilbake, og (L), (AL) og (L/AL) er henholdsvis konsentrasjonene av fri ligand, ubundet antiligand og ligand/antiligand-kompleks i det predeterminerte område). Dette følger fra definisjonen av affinitetskonstanten K, hvor

K = k 2/k ^.

Således kan som en første tilnærming dissosiasjonsgraden

av r2 av ligand/antiligand-kompleks ignoreres, og assosiasjonen av ligand og antiligand er i det vesentlige irreversibel. Idet fluidprøve passerer gjennom matriksen i en slik situasjon, er binding stort sett kvantitativ så lenge som fluidet passerer gjennom matriksen langsomt nok, og en signifikant fraksjon av bindingsstedene er tilgjengelige; dvs., praktisk talt 100 % av liganden binder seg til immobilisert antiligand og blir fjernet fra fluidprøven. I.praksis avhenger, strømhastigheten som trengs for kvantitativ binding av reaksjonsbetingelsene slik som saltkonsentrasjon, temperatur og tykkelsen, og porestørrelsen av matriksen og også av den nominelle reaksjonsgrad fremover. Typisk tillater lineære strømhastigheter av størrelsesorden på millimetere eller tiendedeler av millimetere pr. sekund kvantitativ eller nær-kvantitativ binding til en matriks som er 0,1 mm tykk,

-4

0,45 pm i porestørrelse og 10 Mi immobilisert antiligand.

Binding trenger ikke å være kvantitativ. I noen tilfeller kan det være passende å la fluid passere gjennom det predeterminerte område i en hastighet som ikke gir tid til kvantitativ binding. I et slikt tilfelle kan det være tilfredsstillende å kjenne prosenten av binding som forekommer, selv om denne ikke er 100 %. I et ekstremt tilfelle vil man la fluid passere gjennom det predeterminerte område så raskt at bare en liten del av liganden som går inn i det predeterminerte område, binder seg til det i løpet av dens gjennomgangstid.

Kvantitative bindingstilstander har den fordel at mengden som er bundet, ikke er sterkt avhengig av den nøyaktige konsentrasjon av immobilisert antiligand eller av den nøyaktige tykkelse av det predeterminerte område, så lenge som matriksen forblir umettet. Den ekstreme ikke-kvantitative bindingssituasjon, som kan nærme seg den homogene kinetikk-situasjon, har den fordel at den ikke er sterkt avhengig av strømhastigheten.

For kvantitativ binding vil mengden av ligand bundet pr. tidsenhet være proporsjonal både med konsentrasjonen av ligand i fluidprøven og med strømhastigheten. Dette gir et høyt affinitets-, eller kinetisk, mål for ligand. For.eksempel, hvis kon-duktansf orholdet C plottes som en funksjon av tiden (som nevnt ovenfor), er hellingen av den resulterende linje en funksjon bå-de av ligandkonsentrasjon og strømhastighet. Således, hvis strømhastigheten er kjent, kan ligandkonsentrasjon bestemmes. For eksempel, idet det nå refereres til fig. IA, hvis konsentrasjonen av liganden er konstant, vil hellingen 10 være konstant inntil de predeterminerte område blir mettet 12, idet den antar en konstant strømhastighet.

Den observerte vedi av hellingen dC/dT vil avhenge bare av konsentrasjonen av den spesielle ligand i fluidprøven og strøm-hastigheten, men også av andre spesielle ting i.den eksperimentelle oppsetning, slik som (1) porestørrelsen av det predeterminerte område; (2) det totale volum av fluidet i bioområdet som er tilgjengelig for ionestrøm; (3) effektiviteten E av sensorene, (4) den effektive størrelse av liganden som er immobilisert (for eksempel det delvise molare volum av liganden er et volum eller ion, eller cellevolumet hvis liganden er bundet til en celleoverflate); og (5) forandringer i partielt molart volum av ligand eller antiligand eller begge som kommer av forandringene i deres struktur på grunn av binding. Således må en standard- kurve slik som i figur IB, bestemmes for et spesielt sett av anvendte eksperimentelle betingelser. Med en gang dette er gjort kan imidlertid tilstedeværelse og konsentrasjon av ligand i en ukjent fluidprøve bestemmes ved referanse til standardkurven.

Fordi dC/dT avhenger av (4) og (5) ovenfor, kan den foreliggende oppfinnelse brukes for å studere eller bestemme slike karakteristika. Dette kunne være anvendbart i forskning, for eksempel studier av konformasjonsforandringer i antistoffer når de binder seg til sine antigener. (Se Protein Conformation as an Immunological Signal, Celada et al., Plenum, NY (1983)).

Forskjellige midler kan anvendes for å sikre en kjent strøm-hastighet, som vil være klart for en fagmann på området. For eksempel kan apparatet utformes til å opprettholde en konstant, kjent strømhastighet gjennom hele løpet av målingen, for eksempel gjennom anvendelse av egnete fluidresistorer og/eller en peri-staltisk pumpe. Strøm kan måles ved hjelp av forskjellige kommersielt tilgjengelige innretninger (for eksempel en G-1000 ul pr. minutt strømmeter med regulator-klaff, fra Gilmont Instruments, Great Neck, NY, USA). For spesielle prøvefluider og ligander kan forandringen i konduktans av en.matriks på grunn av både spesifikk og ikke-spesifikk binding av materiale fra fluid-prøven godt korreleres på en kjent måte med forandringen i strøm-hastighet gjennom filteret ved et gitt, anvendt trykk, siden begge forandringer kan fremkomme fra felles årsaker slik som binding av materiale fra fluidprøven. Konduktansforholdet kan selv noen ganger brukes som et mål på strømhastighet.

Idet det nå refereres til fig. 2A, hvis ligandkonsentrasjonen i fluidet som passerer gjennom det predeterminerte område, varierer med tid, vil hellingen dC/dT variere med tiden. For eksempel, ved punkt 17, er ligandkonsentrasjonen i fluidet som passerer gjennom apparatet, signifikant, og som et resultat minker konduktansforholdet i en signifikant grad idet liganden binder seg til og okkuperer rom i det predeterminerte område. Senere, ved punkt 19, har ligandkonsentrasjonen falt til et upåvisbart nivå, og!konduktansforholdet. forandrer seg ikke påvisbart. Enda senere, ved punkt 21, har ligandkonsentrasjonen steget til et veldig høyt nivå, og til slutt, ved punkt 23, har det igjen falt til et veldig lavt nivå. Ligandkonsentrasjonen ved en spesiell tid kan bestemmes ved å måle den øyeblikkelige grad av forandring av konduktansforholdet, dvs. hellingen av kurven på den tiden, idet vi igjen antar at strømhastigheten holdes konstant, eller i det minste er kjent. Dette gir en kontinuerlig måling av ligandkonsentrasjon.

Prøvefluid kan også bringes i kontakt med det predeterminerte område på en pulsert måte, hvilket resulterer i en kurve slik som den vist i fig. 2B. For eksempel kan fluidprøve inji-seres inn i en flytende bufferstrøm med samme konduktivitet ved å bruke standard-kommersielt klaff-utstyr (for eksempel Rheodyne-klaffer med prøve-injeksjonssløyfe, Rheodyne Instruments, Cotati, CA, USA). Etter en kjent tid, avhengig av prøvevolumet og strømhastigheten, vil prøvepulsen passere helt gjennom sensoren. Der hvor ligandbindingen er kvantitativ, kan enten grad-en av forandring 13 av konduktansforholdet eller den totale forandring 14 av konduktansforholdet brukes til å kvantifisere konsentrasjonen av ligand så lenge som det predeterminerte område ikke er blitt mettet. Den sistnevnte metode har den fordel at den ikke er avhengig av at man kjenner den eksakte strømhastig-het. Den førstnevnte har den fordel at den er raskere. Hver av metodene kan være den mest egnete under spesielle eksperimentelle omstendigheter.

Som nevnt ovenfor kan det i noen situasjoner være ønskelig

å bruke en antiligand med lav.affinitet til sin ligand. En slik situasjon kan fremkomme, for eksempel der hvor liganden av interesse er til stede i høy konsentrasjon i fluidprøven, for eksempel 10 -3mol, og det er ønskelig å måle konsentrasjonen av ligand kontinuerlig over en utstrakt tidsperiode. Siden det predeterminerte område har en begrenset kapasitet til å binde ligand, ville tiden som konsentrasjonen kunne måles.over, gitt. kvantitativ binding, være begrenset. Dette potensielle problem blir håndtert ved å bruke en antiligand hvis affinitetskonstant K typisk er innen en størrelsesorden av' konsentrasjonen av ligand som er forventet i fluidprøven, dvs. en lavaffinitetssitua-sjon. I denne situasjonen er dissosiasjonsgraden r2av ligand/ antiligand-komplekset signifikant sammenlignet med assosiasjonsgraden r^ (dvs. binding er reversibel), og en signifikant fraksjon av bindingsstedene er uokkupert ved likevekt. Fraksjonen

av uokkuperte eller okkuperte bindingssteder vil være en kjent funksjon av konsentrasjonen av ligand under gitte eksperimentelle betingelser, som vist i fig. 3A. (På denne figuren representerer K, affinitetskonstanten 15, konsentrasjonen av ligand som trenges for å mette halvparten av bindingsstedene i det predeterminerte område ved likevekt som nevnt ovenfor.) En kurve slik som den i fig. 3A kan således brukes som standard-kurve for å bestemme tilstedeværelse eller konsentrasjon av en ligand i en fluidprøve. Den dynamiske rekkevidde av slike lav-affinitets- eller likevekts-metoder kan økes hvis det er ønsket, ved å bruke flere predeterminerte områder som inneholder antiligander for den samme ligand, men med forskjellige affiniteter, eller ved å immobilisere flere slike antiligander i et enkelt predeterminert område.

Idet det refereres til fig. 3B, er det vist et eksempel på anvendelse av lav-affinitets-antiligand i påvisningen.av/varierende konsentrasjoner av ligand i en fluidprøve. Når konsentrasjonen av ligand i fluidprøven som passerer gjennom sensoren stiger (16), faller konduktansforholdet idet ligand binder seg til å okkuperer rom i det predeterminerte område, idet det gjør det rommet utilgjengelig for strømledning. Når ligandkonsentrasjonen faller (18), stiger konduktansforholdet. Ved 25 har li-gandkonsentras jonen falt til et veldig lavt nivå, langt under affinitetskonstanten, slik at lite eller ikke noe ligand får bli bundet til det predeterminerte område, og således nærmer konduk-tansf orholdet seg eller er lik sin opprinnelige verdi. Enda senere stiger, ligandkonsentrasjonen igjen (20), når en ny høyde

(27), og faller så igjen (22).

Responstiden for denne fremgangsmåte avhenger av dissosiasjonsgraden r2=^2(L/AL) av ligand/antiligand-komplekset. -For antistoffer hvorav mange har hastighetskonstanter forover av størrelsesorden på 2 x 10 7 pr. mol/sek., betyr dette at antistoffer med affinitetskonstanter på 10 —9 M .eller større har re-sponstider på størrelsesorden på 1 minutt eller mindre.

Det bør nevnes at antistoffer eller andre antiligander med raske dissosiasjonstider kan tjene som sanseelementer i egnete, raske, gjenbrukbare sensorer. Slike sensorer krever lite eller ingen behandling for å fjerne bundet ligand.

Passende valg av lav- eller høyaffinitets-antiligander kan

gjøres av fagmenn på området. Som nevnt ovenfor, kan antiligander selv forandres til å variere sin affinitet. Også kan affinitetskonstanter forandres på en rekke andre måter, slik som variasjon i saltkonsentrasjon, temperatur eller mengder av detergent inkludert i et eksperiment, og kjemisk forandring av matriksen hvortil antiligand blir immobilisert.

Følsomheten av høyaffinitetsmetoden er invers proporsjonal

med volumet av det predeterminerte område. Jo større det predeterminerte område er, jo større er det totale antall av bindingssteder (idet man antar at en definert fraksjon av predeterminert område i vekt er antiligand); således, jo større antallet av ligandmolekyler trenges for å resultere i en gitt fraksjon av okkuperte bindingssteder. Derfor, der hvor prøvestørrelsen er begrenset eller konsentrasjonen av ligand i prøven er lav, er det ønsket at det predeterminerte område er lite. Videre er følsom-heten av målingen også proporsjonal med effektiviteten, E, av det spesielle måleapparatet. Således bør både testvolumet og det predeterminerte område være lite for maksimum følsomhet. Fortrinnsvis er testvolumet av størrelsesorden på ca. 0,1 m1

til 1 ul/eller enda mindre, volumet av det predeterminerte område er også av denne størrelsesorden eller mindre, og effektiviteten E er 10 % til nesten 100 %. Et slikt apparat er beskrevet nedenfor.

Som et eksempel, anta at 1 ml av en fluidprøve som inneholder 1 ug/ml ligand, flyter gjennom en sensor, volumet av det predeterminerte område er omtrent 1 yl, med kvantitativ binding av ligand; så, idet vi antar at den spesifikke vekt av liganden er av størrelsesorden 1, vil mikrogrammet av bundet ligand okkupere et volum på ca. 1 nanoliter innen det predeterminerte område, dvs. 0,1 % av volumet av det predeterminerte område, hvilket gir en konduktansforandring på omtrent 0,1 % (eller mindre hvis effektiviteten E av sensoren er lav). Hvis på den annen side volumet av det predeterminerte område er 10 ganger mindre (0,1Ml)/vil det samme ene mikrogram av ligand okkupere 1 % heller enn 0,1 % av det predeterminerte område og vil således gi en større kon-duktansf orandring .

I noen tilfeller kan det være ønskelig å forøke forandringen i konduktans som forekommer når en ligand og antiligand binder seg til hverandre. Som nevnt ovenfor, er det trodd at forandringen i konduktans ofte er.proporsjonal med volumet okkupert av bundet ligand. Dette signalet kan derfor forsterkes hvis tilstedeværelsen (eller fraværet) av tilleggs-ikkeledende volum kan assosieres med bindingen av ligand. Resulterende konduktans-forandringer vil så gjenspeile tilstedeværelsen (eller fraværet) av dette tilleggsvolumet. Dette kan utføres på en rekke måter.

Mer spesifikt kan et kompleks dannes mellom en ligand som interagerer med antiliganden og en partikkel. Partikkelen kan være sammensatt av en rekke materialer slik som antiligand som interagerer med liganden av interesse, antiligand som interagerer med liganden av interesse bundet til et forsterkende stoff, makromolekyler, molekylære komplekser, latekskuler, lipidvesik-ler, ikke-ledende polymerkuler, andre ikke-ledende partikler, delvis ledende partikler, magnetiske partikler eller blandinger av disse. En rekke metoder for å feste ligander til passende partikler er kjent for fagmenn på området.

Den enkleste anvendelse av en partikkel for å forøke forandringen i bulk-konduktans, er der hvor ligand i fluidprøven er direkte bundet til partikler ved inkubering. Ligand/partikkel-kompleks i fluidprøven blir så utsatt for det predeterminerte område, hvilket gir et større signal idet ligand/partikkel-komplekser binder seg enn hvis liganden alene hadde bundet seg.

I en variasjon av det ovenfor nevnte, kan en kjent mengde ligand som interagerer med antiligand, tilsettes til fluidprøven. Denne ligand kan konkurrere med ligand/partikkel-komplekser for antiligand, og således danne basis for en kompetitiv partikkelforsterket konduktansbestemmelse.

I en annen variasjon blir en kjent mengde av en kjent li-, gand somøver vekselvirkning med antiligand, først bundet til .■ partikler og dette kompleks blir tilsatt til fluidprøven; ligand fra fluidprøven kan så konkurrere med dette ligand/partikkel-kompleks, idet det danner en annen type partikkelforsterket kompetitiv konduktans-assay.

I enda en annen variasjon blir et forhåndsbestemt område som inneholder immobilisert antiligand, utsatt for et forhåndsdannet kompleks som omfatter ligand og en partikkel, og komplekset tillates å binde seg til området. Dette område blir så utsatt for prøvefluid.som inneholder ligand, som kan konkurrere bort ligand/partikkel-komplekset. I en variasjon av denne teknikk kan ligand/partikkel-komplekser som er frigjort fra et forhåndsbestemt område, selv påvises, for eksempel ved å måle konduktansen av et testvolum assosiert med en filtermatrise som tenderte til å fange slike frigjorte komplekser, der hvor test-volumet er lokalisert en distanse fra det forhåndsbestemte område (dvs. nedstrøms). Påvisningen kan også gjøres ved å måle en farveforandring eller en trykkforandring over filteret, eller ved hjelp av andre midler.

I ennå en annen variasjon, idet det nå henvises til fig. 4A, blir en kjent mengde ligand kompleksdannet med en partikkel. Dette forhåndsdannete kompleks 24 blir avsondret i minst ett område 26, som er tilstøtende til det forhåndsbestemte område

28. Rom 26 må selv være i det minste innen testvolum 30. Dette danner basis for en annen type partikkel-forøket kompetitiv konduktans-assay. Den kan brukes til kontinuerlig måling av ligand i en fluidprøve. Rom 26 kan for eksempel dannes ved å avdempe

kompleks 24 i en semipermeabel membran 32 som er permeabel for

liganden av interesse. Når fluidprøven ikke inneholder noe fri ligand, vil kompleks 24 tendere til å ligge inne i testvolumet, siden det vil binde seg til antiliganden i det forhåndsbestemte område. Når prøvefluidet inneholder et høyt nivå av liganden,

vil mange komplekser 24 ligge utenfor testvolum 30, hvilket forandrer konduktansen av testvolumet, siden de vil bli konkurrert bort fra det forhåndsbestemte område 28 ved liganden i fluidprø-ven og vil være frie til å bevege seg gjennom rom 26. Ligand/ partikkel-komplekset 24 kan binde seg bare til overflaten av det forhåndsbestemte område, eller det kan like godt binde seg internt.

Det bør nevnes at testvolumet og det forhåndsbestemte område ikke behøver å overlappe for å produsere en virksom metode. I fig. 4B, for eksempel, overlapper ikke testvolum 30 og det forhåndsbestemte område 28, men ikke desto mindre er de nær nok til hverandre slik at ligand-antiligand-vekselvirkning som forekommer i det forhåndsbestemte område, influerer på konduktansen av testvolumet.

Mer spesifikt diffunderer ligand inn i rom 26 og det forhåndsbestemte område 28 og konkurrerer med partikkelkompleks 24 for antiligand-bindingssteder. Når ligandkonsentrasjonen i fluidprøven er lav, er det meste av kompleks 24 bundet til det forhåndsbestemte område 28. Når den er høy, er det meste av kompleks 24 fritt til å bevege seg gjennom rom 26. Hvis testvolum 30 er i en distanse fra overflaten av det forhåndsbestemte område 28, som vist i fig. 4B, vil testvolum-konduktansen øke når ligandkonsentrasjonen er lav, idet komplekser 24 forlater testvolum 30 og binder seg til predeterminert område 28. Hvis testvolum 30 inkluderer i det minste en del av området ovenfor overflaten av det forhåndsbestemte område okkupert av bundete komplekser, kan testvolum-konduktansen minke når ligandkonsent-ras jonen er lav, idet komplekser binder seg til overflaten og okkuperer en del av volumet av testområdet. I hvert tilfelle, kan måling av konduktansen av testvolumet brukes til å bestemme tilstedeværelsen og konsentrasjon av ligand i fluidprøven.

Magnetiske partikler som er kompleksdannet med ligand, kan brukes i konjunksjon med et magnetisk felt for å modifisere par-tiklers evne til å feste seg til et forhåndsbestemt område eller til å modifisere deres fordeling nær det forhåndsbestemte område. For eksempel tenderer en magnet som er plassert under det forhåndsbestemte område 28 i fig.' 4A eller fig. 4B, til å tiltrekke seg ligand/partikkel-komplekser 24 hvis de inneholder magnetisk materiale. Ved å variere styrken eller avstanden av magneten, kan man variere partiklenes evne til å feste seg til forhåndsbestemt område 28 og også gjennomsnittskonsentrasjonen av partiklene ved forskjellige avstander ovenfor dette område.

På samme måte kan et tangensial-strømfelt brukes for å in-fluere partiklenes evne til å feste seg til en overflate. For eksempel kan man fjerne partikler fra en fluidprøve mens man måler mengden av ligand til stede ved å passere prøven hurtig over et filter som inneholder immobilisert antiligand; hvis filterets porestørrelse er mindre enn partiklene, vil.de bli ekskludert fra filteret og vil også bli forhindret fra å hope seg opp på filteret ved "sveipe"-virkningen fra fluidet som flyter tangen-sialt over overflaten. Partikkelfri fluid som bærer ligand,

kan i mellomtiden passere gjennom filteret, og tillate binding av ligand til den immobiliserte antiligand. På den annen side, hvis man ønsker å måle tilstedeværelsen av partikler som selv

har ligand bundet til sin overflate, kunne man bruke en langsommere strøm, sterk nok til å minimalisere ikke-spesifikk partikkel-tilhefting, men svak nok til å tillate tilhefting av deønskede partikler via ligand/antiligandbinding.

Konduktansforandringer kan også forsterkes ved å danne

et kompleks mellom en partikkel og antiligand som er spesifikk for liganden av interesse. I en slik utgave blir en kjent mengde antiligand og partikler inkubert til å danne et forutdannet kompleks. Dette kompleks blir tilsatt til fluidprøven. Ligand i prøven binder seg til antiligand i komplekset og også til antiligand lokalisert i det forhåndsbestemte område. Antallet partikler bundet til det forhåndsbestemte område avhenger av mengden av fri ligand i prøven. Dette gir en sandwich-type av immu-nometrisk partikkelforsterket konduktans-assay. I en variasjon av denne metoden er antiligand selv partikkelen, eller et polymerisert kompleks av antiligand er partikkelen.

Partikler som kan kompleksdannes med antiligand, er lik dem som kan kompleksdannes med ligand, og deres.anvendelsesmetoder med den foreliggende oppfinnelse vil fremkomme for fagmannen på området. For eksempel fåes lett en konduktansversjon av sandwich-Tandem-assay of Hybritech (San Diego, CA, USA, US-patent nr. 4 376 110; et monoklonalt antistoff som.er spesifikt for et forlenget antigen, blir immobilisert, for eksempel på et nitrocellulosefilter. Fluidprøve som inneholder antigenet,

blir utsatt for filteret, hvilket tillater antigen å binde seg. Så blir et sekundært, ikke-interfererende monoklonalt antistoff som er spesifikt for antigenet, kompleksdannet med en partikkel hvis ønsket, tillatt å binde seg til antigenet, og en konduktans-forandring som resulterer fra denne binding blir målt.

I henhold til ennå en annen variasjon er ligand som øver^ vekselvirkning med antiligand til liganden av interesse, lokalisert i et forhåndsbestemt område. Det forhåndsbestemte område blir utsatt for fluidprøven og også for en antiligand som øver vekselvirkning både med liganden i fluidprøven og med liganden lokalisert i det forhåndsbestemte område. Bulk-konduktansen av et testvolum som i det minste delvis inneholder det forhåndsbestemte område, blir målt.

Som med den tidligere beskrevne utgave hvor antiligand er lokalisert i det forhåndsbestemte område, kan bulk-konduktansen av testvolumet sammenlignes med bulk-konduktanten av et eller flere kontrollvolumer. Den lokaliserte ligand kan immobilise-res på en matrise, og matrisen kan bringes i kontakt med en flytende strøm av fluidprøve. Alternativt kan ligand lokaliseres ved å avgrenses innen grensene av en membran, for eksempel som del av et partikkelkompleks eller i en polymerisert form. Denne membran er permeabel for liganden som skal påvises, og for antiliganden somøver vekselvirkning med liganden som skal påvises. Disse utgaver er lik utgavene som er beskrevet ovenfor som bruker lokalisert antiligand. Variasjoner vil vise seg for en fagmann på området og er ment som del av denne oppfinnelse.

Det bør forståes at konvensjonelle merkingsteknikker også kan brukes i konjunksjon med den foreliggende oppfinnelse. For eksempel, i en sandwich-assay hvor ligand fra fluidprøven er blitt bundet til immobilisert antiligand og så blitt utsatt for et forhåndsdannet partikkelkompleks som inneholder en annen antiligand, kan komplekset i tillegg inneholde en enzym-markør, på en måte lik ELISA assays. Enzymsubstrat blir så plassert over den dannete sandwich og danner derved en ønsket konduktansforandring in situ i det forhåndsbestemte område.

For eksempel kan enzymet omdanne del av substratet til gass-bobler. Siden disse bobler er ikke-konduktive, senker de konduktansen av testvolumet. Alternativt kan et substrat brukes, som blir enzymatisk omdannet til et uløselig presipitat som binder seg til det forhåndsbestemte område og som igjen minker konduktansen av testvolumet. Disse fremgangsmåter er delvis fordelak-tige utgaver fordi den produserte markør kan påvises in situ,

i et høyt lokalisert område. Selvfølgelig kan andre enzymer, substrater og markører brukes.. For eksempel kunne et enzym anvendes som danner et ladet.stoff, og således forandrer konduktiviteten.

Andre teknikker som kan forbedre gjennomføringen av ligand/ antiligand-assays, er kjent for fagmenn på området, og mange av disse kan anvendes med den foreliggende oppfinnelse. For eksempel beskriver US-patent nr. 4 092 408 en fremgangsmåte for å oppnå mer reproduserbar, effektiv binding av antistoff til en matrise ved å bruke en forhåndsbelegning av sekundært antistoff. Det er også teknikker som beskriver anvendelsen av sekundære antistoffer merket med biotin eller enzymer, og mange av disse kan også anvendes, så lenge som markøren forandrer konduktansen på en ønsket måte.

Følsomheten av de ovenfor nevnte ligand/antiligand-assays kan økes ved å minke interfererende effekter slik som ikke-spesif ikk binding. Den praktiserende fagmann kan som en guide i forøkningen av følsomheten av slike konduktans-baserte assays, bruke teknikker som er anvendt i lignende ikke-konduktansbaser-te assays. For eksempel, idet han prøver å påvise en spesiell antigen-binding til immobilisert antistoff, er det mulig først å immobilisere til en passende matriks et protein som binder antistoffer slik som protein A eller sekundært antistoff. Det primære antistoff blir så immobilisert ved å binde seg til protein A eller sekundært antistoff. Dette kan resultere i mindre ikke-spesifikk binding når antigen binder seg enn hvis det primære antistoff hadde vært direkte bundet.til matriksen.

Fordi den foreliggende oppfinnelse avhenger av å måle forandringer i konduktansen av et testvolum, bør passende forsiktig-het utøves av den praktiserende for å unngå innføring av materialet inn i testvolumet, som kan interferere med målingen, slik som skitt-partikler, celler og tilfeldige bobler. For eksempel kan forhånds-filtrering og avlufting av prøve eller buffer være på sin plass under noen omstendigheter. I andre tilfeller kan uønskede partikler ekskluderes fra en del av eller hele test-volumet gjennom bruk av en membran, gel eller porøst materiale som er impermeabelt for partiklene. For eksempel, for å måle konsentrasjonen av et molekyl i blod uten interferens fra konduktans-f orandringer på grunn av variasjoner i antallet eller orienteringen av røde blodceller i testvolumet, kunne testvolumet okkuperes av en porøs matriks som tillater plasma, men ikke celler å gå inn, for eksempel ved diffusjon.

Bulk-konduktansen av testvolumet kan måles på en rekke måter. I en foretrukket utgave blir konduktant målt med elektroder som er i kontakt med en elektrolytt, ved å bruke en null-strøm, fire-elektrode-målingsteknikk. I denne metode blir to elektroder, kalt strømelektroder eller kraftelektroder, brukt for å gi en strøm som passerer gjennom -testvolumet, hvis konduktans blir målt, og to andre elektroder, kalt spenningselektroder eller arbeidselektroder, blir brukt for å måle det resul-. terende spenningsfall over testvolumet. Spenningselektrodene er del av en krets med bortimot uendelig impedans, slik at faktisk null netto-strøm flyter gjennom spenningselektrode-over-flåtene, derfor navnet null-strøm, fire-elektrodeteknikk. Dette tenderer til å redusere problemene assosiert med fenomener ved elektrodeoverflater, slik som polariserings-impedans; spenninger assosiert med tilstedeværelse av en polariserings-impedans må være små, siden ingen netto-strøm flyter over impedansen. En videre diskusjon av denne metode er gitt i Introduction to Bioinstrumentation, av C. D. Ferris, Humans Press, Clifton,NJ, USA, sidene 109-116 (1978), referert til her.

Fortrinnsvis blir spenningselektrodene inntrukket fra den elektriske strøm og strømelektrodene blir inntrukket fra test-volumet for å redusere problemer som er assosiert med polariseringsimpedans. Spesifikk apparatur som inkorporerer disse prin-sipper, er beskrevet nedenfor. Andre inntrukne fire-elektrode-konduktivitetsceller er beskrevet i US-patentene nr. 3 963 979 og 3 939 408, som referert til her.

To-elektrodemetoder kan også brukes for å måle konduktans.

(Se Pederson og Gregg, IEEE Journal on Ocean Engineering, vol. OE-4, nr. 3 (1979)). Disse krever generelt høyere frekvens for å oppnå høy nøyaktighet.

En annen metode for måling av konduktans involverer anvendelse av elektroder belagt med et isolerende materiale for å unngå elektrolytt-elektrodegrenseflate-effekter. De belagte elektroder er kapasitativt koblet til elektrolytten gjennom et tynt isolerende belegg. Denne metode krever generelt enda høyere frekvenser. (Se Huebner, G.L., "Notes on radio frequency salinity measuring equipment at Texas A and M College", publ. 600, Nat. Acad. of Sei. National Research Council, 1958, som referert til her.)

Ved enda høyere frekvenser, for eksempel, gigahertz-frekvenser, er det mulig å måle de dielektriske egenskaper av en fluid-prøve heller enn de ledende egenskaper.

En annen teknikk som unngår den direkte kontakt av.elektroder med elektrolytt er induktiv kobling. Et induktivt salino-meter er beskrevet i en artikkel av Brown og Hanson i Deep Sea Research, 8, 65-75, (1971). Også kommersielle induktive salino-metere blir laget av Beckman Instruments (Fullerton, CA, USA;

og Aanderaa Instrumentet (Bergen, Norge) blant andre. En (isolert) sløyfe kan brukes for å produsere en strøm på en induktiv måte i testvolumet; størrelsen av denne strømmen som er et mål for konduktansen av testvolumet, påvises på en induktiv måte av en annen, pickup, sløyfe. Denne metode krever generelt større testvolumer. Videre er sløyfer vanskelig å lage i minia-tyr .

Det bør forståes at en rekke instrumenter kan brukes sammen med de forskjellige fremgangsmåter beskrevet ovenfor, for å gi signaler fra en spesiell konduktivitets-sensor eller sett av sensorer. Instrumenter av spesiell nnvendbarhet med null-strøm-men, inntrukne fire-elektrodemetoder, apparatur og sensorer beskrevet her, er illustrert i eksemplene 8 og 9 nedenfor. En enk-lere, analog krets for å lage null-strøm, fire-elektrodemålinger som kan modifiseres for anvendelse med den foreliggende oppfinnelse, er illustrert på side 115 av Ferris, supra.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det også gitt et apparat for påvisning av tilstedeværelse av en ligand i en fluidprøve. I sin enkleste konfigurasjon har apparatet tre grunnkomponenter, idet hver av dem utfører en spesifikk funksjon i bestemmelse av tilstedeværelse av en ligand i en fluidprøve. Disse er: midler for lokalisering av ligand eller antiligand somøver vekselvirkning med ligand i et forhåndsbestemt område av apparatet (de "lokaliserende midler"); midler for å bringe fluid-prøven i kontakt med de lokaliserende midler (de "kontaktbringende midler"); og midler for måling av bulk-konduktansen av et testvolum som i det minste delvis inneholder det forhåndsbestemte område (de "målende midler"). De lokaliserende midler.og de målende midler omfatter tilsammen sensoren.

Idet det nå refereres til figur 5A, er det vist en diagrammatisk representasjon av et typisk apparat anvendt i påvisning av tilstedeværelse av en ligand i en fluidprøve ved å måle bulk-konduktansen av et testvolum. Testvolum 109 inneholder i det minste delvis et forhåndsbestemt område 108 som selv inneholder midler for lokalisering av antiligand"somøver vekselvirkning med liganden av interesse. Konduktansen av dette testvolum sammenlignes med konduktansen av et kontrollvolum 111, som inneholder et kontroll-predeterminert område 110 for å øke følsom-heten av målingen. Fig. 5A illustrerer det fysiske arrangement av apparatet, og fig. 5B viser den elektriske ekvivalent.

Fig. 5C og 5D viser variasjoner av de målende midler og kontaktbringende midler.

Fortrinnsvis omfatter de lokaliserende midler et matriks-materiale som tillater fluid å flyte gjennom det og som inneholder antiligand som er immobilisert på det. Lokaliseringen av denne matriks definerer forhåndsbestemt område 108 av testvolum 109 (fig. 5A). Likeledes definerer lokaliseringen av en matriks som inneholder et molekyl immobilisert på seg som er lik antiligand, men som stort sett er fri for spesifikke vekselvirkninger som påvirker konduktans, forhåndsbestemt område 110 av kontrollvolum 111. Antiligand i predeterminert område 108 binder liganden av interesse idet fluidprøve flyter gjennom matriksen, forandrer konduktansen av forhåndsbestemt område 108 og test-volumet 109.

Typiske matriksmaterialer brukt som lokaliserende midler

i flere utgaver diskutert nedenfor, er mikroporøse filtere laget av nitrocellulose eller blandete estere av nitrocellulose og celluloseacetat (Millipore Corp., Bedford,. MA, USA eller Schleicher&Schuell, Keene, New Hampshire, USA). Disse filtere har porestørrelser som varierer fra 0,2 [ im eller mindre opp til 12 Mm. Mindre porestørrelser binder generelt mere antiligand pr. enhetvolum, men har langsommere strømhastigheter. Spesielle krav, for eksempel vedrørende strømhastighet, bindingskapasitet og mengde av ikke-spesifikk binding som kan tolereres for et eksperiment, må tas i betraktning i valget av en passende matriks.

Nitrocellulosefilter har lenge vært kjent for å være et ut-merket materiale for å adsorbere proteiner (Kuno og Kihara, Nature 215: 974-975; se også "Millititer Methods", publisert av Millipore Corp.). Både proteiner og nukleinsyrer binder seg til det øyeblikkelig, så immobilisering er lett. Denne og andre immobiliseringsprosedyrer er vel kjent for fagmenn på området (se for eksempel Science, 223, 474-476 (1984), som.referert til her.

Selv om vi ikke ønsker å være bundet av teori, vil den om-trentlige forandring i konduktans forventet fra maksimal binding av ligand til en matriks laget av nitrocellulosefilter og fylt med antiligand som beskrevet i eksempel 1, nå bli beregnet.

Nitrocellulosefiltere, slik som HA Millipore (Millipore Corp.) binder ca. 1 ug protein pr. mm 2 område, gitt typiske kommersielt tilgjengelige filtere som er omtrent 0,15 mm tykke (dette tilsvarer et filtervolum på ca. 0,15 mm 3, eller 0,15 ul/pr. mm 2 område). Også HAMillipore er 79 % tomromsvolum, med den gjenværende 21 % bestående av fast matriks-materiale. Således er volumet av matriksen som er tilgjengelig for fluid-strøm, elektrisk strøm eller antiligandbinding omtrent 0,12 ul pr. mm 2 av matriksområdet. Det partielle molare volum av de fleste hydrerte proteiner, inkludert antistoffer, er omtrent 0,7 cc/g. (De fleste organiske molekyler har partielle molare volumer og tettheter rundt 1). Således okkuperer 1 ug protein ca. 0,7 x 10 —6 cc, eller ca, 0,7 nanoliter. Den forventede nedgang i konduktans forårsaket av immobilisering av 1 ug av et protein antiligand pr. mm 2 matriks-område er således av størrel-sesorden 1 %, siden 0,7 nanoliter/O,12 ul = 0,0007 nl/0,12 m1 - 0,6 %.

Denne konsentrasjon tilsvarer en lokal konsentrasjon av antiligand i det forhåndsbestemte område av størrelsesorden på 10 -4M for en protein-antiligand av typisk størrelse på ca.

100 000 dalton, for eksempel et antistoff på 150 000 dalton.

Hvis hvert immobiliert antiligand-molekyl selv binder omtrent et ligandmolekyl av omtrent samme størrelse, slik som et annet protein, skulle den ligand-spesifikke konduktansforandring assosiert med maksimal ligandbinding også være omtrent 1 %.

I noen tilfeller vil antiliganden..ha. multiple, bindingssteder (for eksempel, se eksempel 1, hvor antiliganden er et forlenget antigen med flere antigene determinanter, og liganden er en polyklonal antistoff-populasjon fra et immunisert dyr).

Den forventede maksimale signalstyrke vil.da være høyere, siden flere volumer av ligand vil binde seg pr. volum av immobilisert antiligand, og den maksimale, konsentrasjon av bundet ligand vil også være høyere. Omvendt, hvis liganden.er et lite molekyl, vil den forventete signalstyrke være lavere fordi selv om den maksimale konsentrasjon av bundete ligandmolekyler kan være,la

-4

oss si 10M, er volumet okkupert av hvert bundet ligandmolekyl lite.

Selv om vi ikke ønsker å være bundet av teori, er det generelt forventet at den observerte forandring i konduktansforhold C vil være proporsjonal både med den molare konsentrasjon . b. av bundet ligand og med det partielle molare volum v av liganden: C = s b v, hvor s er en proporsjonalitetskonstant relatert til signalstyrken. s selv vil avhenge av en rekke faktorer, slik som effektiviteten E av den anvendte sensor; den kan bestemmes fra en kalibreringskurve slik som den i fig. IB.

Andre matriksmaterialer kan brukes like gjerne som nitrocellulose. For eksempel anvender kolonnesensoren i eksempel 4 cyanogen-bromid-aktiverte Sepharose-kuler som matriksmateriale (Pharmacia Corp., Piscataway, New Jersey, USA). Dette matriks-materiale binder også ca.. 1 % i vekt eller volum av mange antiligander, og bindingen er lett som beskrevet i detalj av Pharmacia Corp., publikasjon Affinity Chromatography Principles and Methods, 19 79. Det faktum at for mange matriksmaterialer, er den maksimale konduktansforandring av størrelsesorden på 1 % hvis forsterkende metoder ikke blir brukt, påpeker nytten av metoder og apparatur som tillater nøyaktig måling og som bruker negative kontroller som beskrevet ellers for å hjelpe til å unngå forringing av signalet ved ikke-spesifikke virkninger.

Det spesielle matriksmateriale som blir valgt, vil avhenge av mange karakteristika, slik som. bindingskapasitet, letthet for binding, letthet i håndtering, størrelse og form av ønskede forhåndsbestemte områder og assosiert apparatur, ønsket strømhastig-het, ønsket hastighet og følsomhet, etc.

Mens den 1 % lokaliserte konsentrasjon av mange antiligander som er lett oppnåelig ved å bruke egnete lokaliserende midler, slik som beskrevet ovenfor, kan være lav ut fra den konduktans-forandring den skaper, er den faktisk nokså høy for mange påtruf--4 ne biologiske molekylpreparater, som er av størrelsesorden 10 M for en antiligand av 100 000 dalton-størrelse, som nevnt ovenfor. Mange ligander av interesse er til stede med mye lavere konsentrrasjoner, for eksempel 10 M eller lavere, i fluidprøv-er av interesse, slik som serum, urin etc. Således kan all lig-ganden i en slik 1 ml's prøve konsentreres og bindes i et lokaliserende middel på 0,1 ul volum som er på 10 ^ M i bind-ingsstedkonsentrasjon. Ved å bruke apparatene beskrevet her, tillater man fluidprøven å komme i intim kontakt med et predeterminert område som inneholder slike lokaliserende midler ved å tillate fluidet å flyte gjennom området. Denne type apparat gir således en potensiell ligand-konsentrasjonfaktor på

En slik konsentrering av ligand i det forhåndsbestemte område er en grunn som tillater fremgangsmåtene og apparaturen av den foreliggende oppfinnelse å oppnå betraktelig følsomhet uten å kreve markør, og enda større følsomhet med en markør.

Idet det nå igjen henvises til fig. 5A, er det vist et reservoar 102 fylt med en elektrolyttløsning 100. To kanaler henholdsvis 104 og 106 gir veier hvorigjennom elektrolyttløs-ningen kan flyte gjennom reservoaret, gjennom test- og kontroll-forhåndsbestemte områder 108 og 110, gjennom to utgangskanaler og 112 og 114, og eventuelt til en spillbeholder (ikke vist). Fluidstrømmen er illustrert ved piler 120. Strømmen gjennom kanaler 104 og 106 kan drives ved vekt, pneumatisk eller hydraulisk trykk, eller andre måter. Hvis ønsket kan reservoaret inneholde en magnetisk rørestav eller andre midler for å hjelpe til å oppnå homogen sammensetning og temperatur i elektrolytten. Materialet hvorfra reservoaret og kanalene er utformet, er ikke-konduktive.

Målemidler er gitt ved inntrukne strøm- og spenningselektroder ved å bruke null-strøm, fire-elektrodemetoden nevnt tidligere. En første strømelektrodé 116 i kanal 112 og en annen strøm-elektrodé 118 i kanal .114 :er henholdsvis -forbundet med terminaler Cl og C2. En signalgenerator er forbundet med-terminaler Cl og C2, som forårsaker at en strøm flyter fra strømelektrodé 116 gjennom kanal 112,.test-forhåndsbestemt område 108, kanal 104, reservoar 102, kanal 106, kontroll-forhåndsbestemt område 110 og kanal 114 til elektrode 118. Denne elektriske strøm forårsaker et spenningsfall over test- og kontroll-forhåndsbestemte områder 108 og 110 som kan måles for å påvise tilstedeværelse av

en spesiell ligand i elektrolytten.

To spenningselektroder 122 og 124 er forbundet med terminaler VI og V2 og kontakter elektrolyttløsningen på hver side av test-forhåndsbestemt område 108. Ved å måle spenningen mellom terminaler VI og V2 kan ledningsevnen av predeterminert område 108 måles. På samme måte er spenningselektroder 126 og 128 forbundet med terminaler V3 og V4 for å gi en metode for måling av spenningsfallet over kontroll-predeterminert område 110.

Spenningselektroder 122, 124, 126 og 128 er inntrukket fra kanaler 104, 106, 112 og 114 hvorigjennom elektrolytten og den elektriske strøm flyter. Kanaler 130 i fig. 5A representerer denne inntrekning.

Inntrekning reduserer feil som er forårsaket av virkningene av forandring av egenskaper av elektrode-elektrolytt-grenseflaten, slik som polariseringsimpedans. Polariseringsimpedans kan repre-senteres som en variabel kapasitans og motstand assosiert med grenseflaten. Spenninger utviklet over denne kompliserte og of-te skiftende impedans kan resultere i signifikante feil i den målte verdi av potensialet ved elektroden. Hvis elektroden blir fjernet (dvs. inntrukket) fra elektrolyttvolumet, hvor hele eller det meste av strømmen går, går det lite eller ingen strøm nær eller gjennom denne grenseflate. Det er således lite eller ikke noe spenningsfall over grenseflaten, og således lite eller ingen virkning av forandring av egenskaper av grenseflaten på spenningen målt ved elektroden.

Selv om vi ikke ønsker å være bundet av teori, vil den føl-gende modell være hjelpsom i forståelsen av hvordan spenningselektroder 122 og 124 måler konduktansen av test-forhåndsbestemt område 108 og spenningselektroder 126 og 128 måler. konduktan-: sen av kontroll-forhåndsbestemt område 110.

Spenningselektroder 122, 124, 126 og 128 måler et potensial som er omtrent likt det som er ved munningene av deres tilsvarende inntrukne kanaler 130. Det målte potensialet er et gjennomsnitt av potensialet over munningen av den inntrukne kanal. Typisk kan dette potensial sees på som det som erfares ved et punkt halvveis over munningen kalt spenningsekvivalenspunktet; dvs. at elektroden og spenningsekvivalenspunktet ligger på samme ekvipotensial. Punktene 131,133,135 og 137 representerer spenningsekvivalenspunktene. Punkt 131 erfarer samme potensial som elektrode 124, punkt 133 samme potensial som elektrode 122, punkt 135 samme potensial som elektrode 126 og punkt 137 samme potensial som elektrode 128. De tilsvarende typiske ekvipotensialer er angitt ved de stiplete linjer henholdsvis 125,123,127 og 129.Innen volumet mellom ekvipotensialer 123 og 125 påvirker en lokal konduktansforandring spenningsfallet målt ved spenningselektroder 122 og 124, sterkt, mens langt utenfor dette volumet tenderer slike forandringer til å ha liten eller ingen virkning. Således hjelper ekvipotensialer 123 og 125 til med å lokalisere testvolum 109, volumet hvis konduktans blir målt for å påvise forekomsten av ligand/antiligand-vekselvirkning i det forhåndsbestemte område 108. På samme måte hjelper volumet mellom ekvipotensialet 127 og 129 til å lokalisere kontrollvolum III. Idet ligand binder seg til antiligand som er immobilisert i forhåndsbestemt område 108 og forandrer konduktansen av dette område, forandres også konduktansen av testvolum 109, siden testvolum 109 i det minste inkluderer det forhåndsbestemte område 108.

Strømelektroder 116 og 118 er inntrukne nede i kanaler 112 og 114 fra inntrukne kanaler 130 som bestemmer posisjonene av test- og kontrollvolumer 109 og 111. Slik inntrekning reduserer feil som er forårsaket av forandring av strømfordeling som resulterer fra forandringer ved overflatene av strømelektroder 116 og 118, siden den tillater strømtettheten å bli uniform eller nesten uniform ved den tiden den når test- og kontrollvolumene, uten hensyn til lokale variasjoner i strømtetthet ved strøm-elektrodeoverflaten.

For effektiv inntrengning av både strømelektroder og spenningselektroder blir elektroden fortrinnsvis inntrukket tre eller flere ganger bredden av munningen av den tilbaketrukne kanal.

Trinnene ovenfor eller ekvivalente trinn gir måleapparatet potensiell høy nøyaktighet. Uten disse trinn er en nøyaktighet på 1 del av 10 000 vanskelig eller umulig å oppnå.

Den delen av apparatet som tilsvarer et spesifikt test- eller kontrollvolum er kalt en "celle". For eksempel omfatter testcellen i fig. 5A forhåndsbestemt område 108, .kontaktkanaler 104 og 112, spenningselektroder 122 og 124 med deres henholds vise inntrukne kanaler 130, og det tilsvarende testvolum 109. Kontrollcellen omfatter forhåndsbestemt område 110, kontaktkanaler 106 og 114, spenningselektroder 126 og 128 med deres henholdsvise inntrukne kanaler 130, og det tilsvarende kontrollvolum 111. Strømelektroder 116 og 118 og reservoarl02 er van-lige komponenter som trenges for at både test- og kontrollceller i denne utgave skal virke.

Et eventuelt strømmålingsapparat kan gis for å måle strøm-men av elektrolytten. I fig. 5A er to varmelednings-strømsen-sorer 132 og 134 vist i utgangskanaler 112 og 114.. Krets 136 passerer en strømledning gjennom sensorene og måler varmen som er ledet bort fra sensorene ved hjelp av væskestrømmen for å gi en måling av strømhastighetene gjennom testvolum 109 og kontrollvolum 111. Andre måter kan også brukes for å bestemme strømhas-tighet. For eksempel kan Flow-metere eller fluid-resistorer 133 og 135 plasseres i utgangskanaler 112 og 114 for å regulere fluidstrøm.

Fig. 5B er en forenklet elektrisk modell representativ for noen av de elektriske karakteristika av arrangementet i fig. 5A. I fig. 5B er R en motstand som representerer motstanden av testvolum 109. (Enten motstand eller konduktans kan måles som det passer, siden hver er den reciproke av den andre.) På samme måte representerer R c motstanden av kontrollvolum 111. Test-motstanden Rx inkluderer ikke bare motstanden av test-forhåndsbestemt område 108, men også motstanden assosiert med de delene av innløpskanal 104 og utløpskanal 112 som ligger mellom testområdet 108 og inntrukne kanaler 130. På samme måte inkluderer motstand Rcmotstanden assosiert med hele kontrollvolumet 111. Helt ty-delig vil den mest effektive sensor av denne type være en hvor motstanden av forhåndsbestemt område 108.er en så stor fraksjon som mulig av motstanden av hele testvolumet 109, dvs. hvor effektiviteten E, definert som E = motstanden av forhåndsbestemt område 108/motstanden av testvolum 109, nærmer seg 100 %.

Resistorer R2, R3, R5 og R6 representerer motstanden av elektrolyttløsningen i inntrukne kanaler 130. Resistorer Ri og R7 representerer resistansen av elektrolyttløsningen mellom strømelektroder 116 og 118, og test- og kontrollvolumer 109 og 111. Resistor R4 representerer resistansen mellom test- og kontrollvolumene 109 og 111, hvilket inkluderer motstanden av elektrolytten i reservoaret.

Det bør forståes at modellen vist i fig. 5B bare er en forenklet modell. (For eksempel er polarisasjons-impedansen assosiert med hver elektrode, blitt utelatt. Hvis ønsket kan pola-risas jons-impedansene angis eksplisitt ved å sette en impedans i serie med hver av motstandene Ri - R7.) Imidlertid kan denne modellen være til hjelp i forståelsen av den elektroniske krets som måler konduktans (eller motstand) forandringer i test- og kontrollvolumer 109 og 111, hvorav en foretrukket utgave er beskrevet i eksempel 8.

Som nevnt ovenfor, forårsaker tilstedeværelsen av en spesiell ligand i elektrolytten at konduktansen av testvolumet forandrer seg. For kort å beskrive fremgangsmåten hvorved dette gjøres, inneholder test-forhåndsbestemt område 108 en matriks som inkluderer immobiliserte reseptorer eller antiligander for påvisning av tilstedeværelsen av valgte ligander. Disse antiligander binder ligandmolekylene innen predeterminert område 108 idet elektrolytt strømmer gjennom området. Selv om vi ikke ønsker å være bundet av teori, er det trodd at idet mengden av ligand bundet innen test-predeterminert område 108 øker, så er den tilsvarende nedgang i det tilgjengelige volum hvorigjennom elektrisk strøm kan gå, hvilket resulterer i en nedgang i konduktansen av det test-forhåndsbestemte område 108 og således av hele testvolumet 109. På samme måte er det en økning i motstanden R x mellom terminaler VI og ^ V2.

Forandringer i konduktansen av testvolum 109 kan brukes i påvisning av tilstedeværelse av en ligand i en fluidprøve som beskrevet i fremgangsmåtene i mere detalj. Typisk blir det etablert en strøm av ren elektrolyttløsning gjennom testcellen inntil en stabil tilstand er nådd, og konduktansen blir målt. Fortrinnsvis blir konduktiviteten av elektrolytten tilpasset til konduktiviteten av fluidprøven som skal undersøkes, for tilstedeværelse av ligand. Deretter blir fluidprøven tilsatt til elektrolytten i reservoaret, og forandringen i konduktans med tiden av testvolum 109 blir målt, som også strømhastigheten blir det. Den observerte forandring i konduktans sammenlignes med en standardkurve slik som den i fig. IB for å bestemme konsentrasjonen

av ligand i fluidprøven.

Kontaktmidlene kan inkludere en prøvesløyfe for prøve-fluidinjeksjon istedenfor et reservoar. I dette tilfelle blir en blind-løsning, eller rennende buffer, med konduktivitet lik fluidprøvens konduktivitet, i utgangspunktet kjørt gjennom prø-vesløyfen, innløpskanaler og predeterminerte områder via en fluid-innløpsåpning. Så ved å bruke kommersielt tilgjengelige svingeklaffer i vanlig bruk (i væskekromatografi, for eksempel tilgjengelig fra Rainin Instruments, Woburn, MA), blir fluid-prøven istedenfor blind-løsningen injisert inn i fluidinnløps-åpningen. Ligand-spesifikke forandringer i konduktans kan så måles enten ved å notere hastigheten 13 hvorved konduktansfor-andringene forekommer eller for størrelsen 14 av den totale kon-duktansf orandring etter at fluidprøven har passert helt gjennom sensoren. (Se fig. 2B). Bruk av klaffer til å regulere inn-gangen av fluidprøve har en potensiell tilleggsfordel: slik klaffe-teknologi er høyt utviklet og i stand til å bli automatisert under computerkontroll. Således kan skjemaet for sensor-kontakt med en fluidprøve eller sett av fluidprøver kontrolleres automatisk.

Mange faktorer kan påvirke resistansen mellom terminaler VI ogV2, i tillegg til forandringen i konduktans av materialet i det test-forhåndsbestemte område 108. Fluidprøven selv kan ha en konduktivitet som er forskjellig fra konduktiviteten av den rennende buffer, selv om dens konduktivitet fortrinnsvis blir justert til å være lik ledningsevnen av den rennende buffer.

Små forandringer i temperatur, sammensetningsforandringer på grunn av fordampning, ikke-spesifikk binding av fluidkomponen-ter til matriksen, etc, kan også påvirke konduktansen av matriksen eller konduktansen av testvolumet som et hele."

En annen celle, kontrollcellen.vist i fig. 5A, er gitt for

å hjelpe til å korrigere for disse feil. Fortrinnsvis er dens kontroll-forhåndsbestemte område 110, spenningselektroder 126

og 128 og assosierte kanaler 130, og innløps- og utløpskanaler 106 og 114 konstruert identisk til de som er i testcellen. Kontroll-forhåndsbestemt område 110 inkluderer matriksmateriale lik det som er i testområdet 108 bortsett fra at kontrollcelle-matriksen ikke inneholder antiligandmateriale, og således er

JO

nærmest fri for ligand-spesifikke vekselvirkninger, hvis virkning forandrer seg i bulk-konduktans. Ved å måle konduktansen av testvolum 109 relativt til konduktansen av kontrollvolumet 111, er det mulig å redusere eller eliminere variasjon i konduktans fra andre virkninger enn spesifikk binding av ligand til antiligand-steder i det test-forhåndsbestemte område 108.

I fig. 5A og 5B er test- og kontrollcellene elektrisk bundet i serier via en enkelt strømvei, selv om de er hydraulisk bundet i en slags delvis parallell, idet hver celle har sin egen fluid-vei. Imidlertid kan andre elektriske konfigurasjoner brukes til å danne og så måle et spenningsfall over test- og kontrollcellene. For eksempel har i fig. 5C hver celle sin egen strøm-vei, hvor de to cellene har felles strømelektrodé 144. I fig.

5D har hver celle sin egen strømvei, og i tillegg har hver celle sitt eget par strømelektroder.

Idet vi refererer til fig. 5C, er en enkelt generator forbundet med terminaler Cl av elektrode 140 og C2 av elektrode 144, som forårsaker at en strøm går inn gjennom testcellen, fra strømelektrodé 140 gjennom kanal 112, det test-forhåndsbestemte område 108 og testvolumet 109, kanal 104 og reservoar 102 til strømelektrodé 14 4 inn i reservoaret. På samme måte er en enkelt generator forbundet med terminaler Cl av elektrode 142 og C2 av elektrode 144 som får en strøm til å gå gjennom kontroll-cellen, fra elektrode 142 gjennom kanal 114, kontroll-predeterminert område 110 og kontrollvolum 111, kanal 106, og reservoar 102, deretter også til elektrode 144. Elektrode 144 er således en felles elektrode til de to cellene. Spenningselektroder 122, 124, 126 og 128 og spenningselektrode-inntrukne kanaler 130 virker som i fig. 5A til å måle spenningsfallet, og således motstanden, over testvolum 109 og kontrollvolum 111 dannet av strømmen. Kretsen som måler motstandsforandringene i test- og kontrollvolumene av apparaturen i fig. 5C, er beskrevet i eksempel 9 .

Idet vi refererer til fig. 5D, istedenfor at det der er en strømelektrodé i et reservoar som er felles for test- og kontrollcellene, har hver celle en strømelektrodé i sin innløpskanal (eller i en inntrukket kanal som er i elektrisk kontakt med dens innløpskanal) og en strømelektrodé i dens utløpskanal (eller i en inntrukket kanal som er i elektrisk kontakt med dens ut-løpskanal). Spesifikt, i fig. 5D har testcellen en strømelekt-rodé 148 i elektrisk kontakt med innløpskanal 104 via strøm-elektrode-tilbaketrukket kanal 131 og en strømelektrodé 146 i elektrisk kontakt med utløpskanal 112 via dens tilsvarende strøm-elektrode-inntrukne kanal 131. På samme måte har kontrollcellen en strømelektrodé 152 i elektrisk kontakt med innløpskanal 106 og en strømelektrodé 150 i elektrisk kontakt med utløpska-nal 114, også via inntrukne kanaler 131. En signalgenerator forbundet med terminaler Cl av elektrode 146 og C2 av elektrode 148 får en strøm til å gå fra elektrode 146 gjennom kanal 112, det test-forhåndsbestemte område 108 og testvolum 109, kanal 104,

til strømelektrodé 148. På samme måte får en signalgenerator forbundet med terminaler Cl av elektrode 150 og C2 av elektrode 152 en strøm til å gå fra elektrode 150 gjennom kanal 114, kontroll-forhåndsbestemt område 110 og kontrollvolum 111, kanal 106 til strømelektrodé 152. Spenningselektroder 122, 124, 126

og 128 og spenningselektrode-inntrukne kanaler 130 virker som i fig. 5A til å måle spenningsfallet over testvolum 109 og kontrollvolum 111 dannet ved strømmen.

Et felles fluidkildeinnløp 153 er forbundet med innløps-kanaler 104 og 106 via forbindende kanaler 105 og 107 istedenfor via et felles reservoar. Innløp 153 selv forbinder seg på en typisk måte med en prøvesløyfe som inneholder en kjent mengde av fluidprøve.

Kretsen som måler motstands-forandringene i test- og kontrollvolumene av apparaturen i fig. 5D er beskrevet i eksempel 9.

Idet vi nå refererer til fig. 6, er det vist en diagrammatisk representasjon av en annen apparatur brukt i påvisning av tilstedeværelsen av en ligand i en fluidprøve, hvor tilstedeværelsen av flere forskjellige ligander kan bestemmes på én gang. Fig. 6A illustrerer et arrangement med multiple celler hvor hver celle har sin egen elektriske strøm og fluidvei på måten illustrert i fig. 5D. Fig. 6B illustrerer et arrangement med multiple celler hvor celler er forbundet elektrisk og hydraulisk i serie, idet alle celler har en felles elektrisk og fluid vei.

Idet vi refererer til fig. 6A inkluderer hver av cellene 152, 154, 158 og 160 fortrinnsvis et lokaliserende middel som omfatter en matriks med antiligand immobilisert på seg i det forhåndsbestemte område henholdsvis 162, 154, 158 eller 160.

En celle, for eksempel celle 156, inkluderer typisk i det minste en del av et forhåndsbestemt område 166 som ikke inneholder antiligand kjent for å reagere spesifikt med noen komponent av fluidprøven for å tjene som negativ kontroll. Målende midler for hver celle omfatter to inntrukne strømelektroder forbundet med terminaler Cl og C2 og to inntrukne spenningselektroder for-bunde med terminaler Vi og V2, på måten illustrert i fig. 5D. Spenningsfallet over testvolumet av hver celle blir sammenlignet med spenningsfallet over testvolumet av kontrollcelle 156 eller en hvilken som helst annen størrelse ved å forbinde en signalgenerator til strømelektrodene av de toønskede cellene for å danne en elektrisk strøm som passerer gjennom cellene. Omkoblingsinnretninger er gitt for å tillate hurtig sammenligning av forskjellige cellepar. Forhåndsbestemt område 162 av testcelle 152 kunne for eksempel inneholde antiligand som binder seg til en første ligand av interesse i fluidprøven, mens forhåndsbestemte områder 164 og 168 av testceller 154 og 158 kunne inneholde sekundære og tertiære immobiliserte antiligander som binder seg henholdsvis til sekundære og tertiære ligander av interesse i fluidprøven. Et annet predeterminert område, for eksempel område 170 av celle 160, kan inneholde immobilisert antiligand som binder seg til en ligand av kjent konsentrasjon i fluidprøven og kan tjene som positiv kontroll. Et arrangement slik som det i fig. 6A tillater samtidig påvisning av multippel-ligander i en fluidprøve og samtidig sammenligning av testceller med negative kontroller, positive "kontroller eller hverandre.

I en beslektet type apparat har hver celle sin egen fluid-vei på måten vist i fig. 6A, men den har felles elektrisk vei med cellen som den blir sammenlignet med, på måten vist i fig. 5A og B. Dvs., de to cellene som blir sammenlignet, er plassert i serie med hverandre, som i fig. 5B. Dette blir utført ved å forbinde en signalgenerator til Cl-strømelektrdde-terminalene av de to cellene for å danne en strøm som passerer gjennom cellene. Idet vi refererer til fig. 6B er det vist et apparat hvori en rekke celler spesifikke for forskjellige ligander av interesse er forbundet både elektrisk og hydraulisk i serier. Typisk inkluderer hver celle en matriks med antiligand immobiliert på seg i et forhåndsbestemt område 200, 202, 206 eller 208, med unntak igjen av en negativ kontrollcelle hvis forhåndsbestemte område 204 ikke inneholder antiligand kjent for å reagere spesifikt med noen komponent i fluidet. En felles innløps-kanal 175 og utløpskanal 173 til alle cellene gir veier hvorved elektrolyttløsning 100 kan strømme fra felles reservoar 102, gjennom cellene og deres forhåndsbestemte områder 200, 202, 206, 204 og 208 og deres henholdsvise testvolumer 190, 192, 196 eller kontrollvolumer 194, 198 til en spillbeholder (ikke vist). Målende midler for hver celle er gitt ved to inntrukne spenningselektroder på hver side av hvert predeterminerte område,-mens alle cellene har to strømelektroder 172 og 174 felles. Den felles første strømelektrodé 172 i eller utenfor kanal 173 og felles andre strømelektrodé 174 i eller utenfor kanal 175 er henholdsvis forbundet med terminaler Cl og C2. En signalgenerator er forbundet med terminaler Cl og C2 som får strøm til å gå fra strømelektrodé 172 inn i utløpskanal 173, gjennom forhåndsbestemte områder 200, 202, 204, 206 og 208 inn i innløpskanal 175, til strømelektrodé 174. Denne strømmen forårsaker spenningsfall over testvolumer 190, 192, 196 og kontrollvolumer 194, 198, som kan måles for å påvise tilstedeværelse av ligander av interesse i elektrolytten. Strømelektrodekammer 171 kan gis for å senke polarisasjons-impedansen av strømelektrodé 172.

Arrangementet ovenfor sørger for at den samme elektriske strøm og den samme fluidstrøm flyter gjennom alle cellene. Dette kan hjelpe til å forenkle utformingen av det elektriske \ instrument og av måleapparatet for fluidstrømmen. (Faktisk, siden signalutvikling vil starte i"forskjellige sensorer på forskjellige tider, kan observering av slike tidsforskjeller selv brukes for å måle strømhastighet). Imidlertid øker serie-tilnærmingen det totale trykk som trengs for å få fluid til å strømme ved en gitt hastighet. Hvilke betraktninger som domi-nerer avhenger av betingelsene som kreves for et spesielt eksperiment.

Spenningselektroder 176, 178, 180, 182, 184 og 186 er forbundet med terminaler VI-V6 henholdsvis og er i kontakt med elektrolytten på hver side av de forhåndsbestemte områder 200, 202, 204, 206 og 208. Ved å måle spenningen mellom hvem som helst av to tilstøtende spenningselektrodeterminaler Vnog Vn+1kan konduktansen av det predeterminerte område og test-eller kontrollvolumet inkludert mellom de tilsvarende spenningselektroder, måles. Som i tidligere arrangementer er spenningselektroder 176, 178, 180, 182, 184 og 186 inntrukket av kanaler 173 og 175, hvor elektrolytt.og elektrisk strøm flyter via spenningselektrode-inntrukne kanaler 188. Midtpunktene av munningene av tilstøtende inntrukne kanaler 188 definerer posisjonene av testvolumer 190, 192, 196 og kontrollvolumer 194, 198 inkludert mellom tilstøtende inntrukne kanaler. Også strøm-elektroder 172 og 174 er typisk inntrukne nede i kanalene 173

og 175 fra testvolumene.

Som med apparatet i fig. 6A inneholder de forhåndsbestemte områder 200, 202, 204, 206, 208 av apparatet i fig. 6B antiligander til flere forskjellige ligander av interesse i en fluidprøve, og også positive og negative kontroller.

Grupper av celler i serier, av typen vist i fig. 6B,

kan selv plasseres slik at hver gruppe celler har sin egen elektriske strøm og fluidvei på måten illustrert i fig. 6A for å øke det totale antall testvolumer som kan måles samtidig.

Et arrangement av celler forbundet i serier kan gjøres tynnere enn det som er vist i fig. 6B, ved å forbinde flere celler i serier (hydraulisk såvel som elektrisk) som er modifisert fra typen vist i fig. 5A, hvor reservoaret er erstattet av en kanal, og fluidutløpet i én celle er forbundet med et fluidinnløp av det neste. Dette tillater at hver spenningselektrode er på et av de to nivåer, uansett hvor mange celler det er i seriene, med fluid og elektrisk strøm bølgende frem og-tilbake mellom de. to nivåer.

Idet vi nå refererer til fig. 7, er det vist ennå et annet apparat som er anvendt i påvisning av tilstedeværelsen.av en ligand i en fluidprøve ved å måle forandringen i bulk-konduktans av et testvolum idet ligand øver vekselvirkning med antiligand lokalisert i et predeterminert område som i det minste delvis er innen testvolumet. I denne utgave ligger de målende midler i et plan, på samme side av de lokaliserende midler. I fig. 7A er det vist et arrangement hvor de lokaliserende og målende midler ligger i bunnen av en brønn som inneholder elektrolytt.

I fig. 7B er det vist et lignende arrangement, med unntak av

at de lokaliserende og målende midler er montert på en støtte-anordning som dyppes inn i en brønn, et testrør, eller et an-

net rom som inneholder elektrolytt. Arrangementet i fig. 7A tillater lett injeksjon av en fluidprøve på sensorer. Arrangementet i fig. 7B tillater lett innføring av sensorer i en fluid-prøve .

Idet vi refererer til fig. 7A, er det vist (ikke i målestokk) en brønn 215 konstruert fra ikke-ledende materiale fylt med elektrolytt 210. Test-forhåndsbestemt område 214 og kontroll-forhåndsbestemt region 216 ligger på bunnen av brønnen. Fortrinnsvis inneholder det test-forhåndsbestemte område 214 lokaliserende midler som omfatter en matriks som har immobilisert på seg antiligand som øver vekselvirkning med liganden av interesse eller lokaliserende midler som omfatter en semipermeabel membran som inneholder en slik antiligand. Kontroll-forhåndsbestemt område 216 er konstruert på samme måte for å teste predeterminert område 214, men inneholder ikke slik antiligand og er hovedsakelig fri for spesifikke vekselvirkninger som forårsaker forandringer i bulkkonduktans. Ligand går inn i de forhåndsbestemte områder 214 og 216 ved diffusjon. Rørepropell .212 eller andre midler for å få bulk-fluidstrøm brukes hvis ønskes for å hjelpe til å få kontakt mellom fluidet og de predeterminerte områder.

Målende midler for testcellen er gitt ved strømelektroder

218 og 2 20 forbundet med terminaler Cl og C2 og spenningselektroder 226 og 228 forbundet med terminaler Vi og V2. Målende midler for kontrollcellen er gitt ved strømelektroder 222

og 22.4 forbundet med terminaler Cl og C2 og spenningselektroder 230 og 232 forbundet med terminaler VI og V2. De målende midler ligger på bunnen 211 av brønn 215 i ikke-ledende materiale 234, under de forhåndsbestemte områder 214 og 216.

For å måle konduktansen av testcellen, er en signalgenerator forbundet med terminaler Cl og C2 av elektroder 218 og 220, hvilket får en strøm til å gå fra elektrode 218,.gjennom det test-forhåndsbestemte område 214, inn i elektrolytt 210, tilbake gjennom det forhåndsbestemte område 214, til elektrode 220.

En slik strømvei er illustrert ved den stiplete linje og piler 23 7. Noe strøm forblir også helt innen det forhåndsbestemte område 214. En slik strømvei er illustrert ved den stiplete linje og pil 239. Strømmen blir korrelert med et spenningsfall langs strømveiene. Siden i det minste en del av hver strømvei passerer gjennom testpredeterminert område 214, vil i det minste en del av spenningsfallet være influert av konduktansen i dette område. Ved å måle spenningen mellom terminaler VI og V2 forbundet med elektroder 226 og 228 kan konduktansen av testpredeterminert område 214 måles.

På samme måte, for å måle konduktansen av kontrollcellen, blir en signalgenerator forbundet med terminaler Cl og C2 av elektroder 222 og 224, hvilket får en strøm til å gå fra elektrode 222, gjennom kontroll-predeterminert område 216, inn i elektrolytt 210, tilbake gjennom området 216, til elektrode 224, som illustrert ved den stiplete linje og piler 241. Noe strøm forblir også helt innen kontroll-lokaliserende midler 216, som illustrert ved den stiplete linje og pil 243. Strømmen er korrelert med spenningsfall langs strømveiene. Ved å måle spenningsfallet mellom terminaler VI og V2 forbundet med elektroder 230 og 232, kan konduktansen av kontroll-predeterminert område 216 måles.

Fortrinnsvis, som i andre utgaver, er spenningselektrodene og strømelektrodene inntrukne. For eksempel, som illustrert i fig. 7A, er elektrodene inntrukne ned i kanaler 235 i en avstand som er 3 eller flere ganger bredden av kanalene.

Strømmen er tettest i et volum hvis radius er av størrel-sesorden lik avstanden mellom strømelektrodene. For en celle med en konfigurasjon slik som den i fig. 7A, kan testvolumet sees på som utstrakt ovenfor bunnen av brønnen ovenfor denne distansen eller litt mer, dvs. den effektive cellestørrelse kan sees på som å være av størrelsesorden lik distansen mellom strøm-elektrodene. Som en anvendbar illustrasjon, kan testvolumet sees på som å være volumet innen den stiplete feltlinje 237,

og kontrollvolumet kan sees på som å være volumet innen den stiplete feltlinje 241; dvs. spenningselektroder 226, 228, 230 og 2 32 vil typisk føle svak eller ingen konduktansforandringer som forekommer utenfor dette område.

Effektiviteten av en plan, tilbaketrukket celle, som for cellene tidligere diskutert, kan defineres som E =r motstand av forutbestemt region/motstand av testvolum. Typisk, hvis tykkelsen av den forutbestemte region er av størrelsesorden av celle-størrelsen, vil cellen være effektiv. På den annen side, hvis den forutbestemte region er tykkere enn ca. 0,1 mm, blir diffusjon veldig langsom. Således, for å konstruere sensorer som er effektive og som også svarer raskt på tilstedeværelsen av ligand, bør både testvolumet og volumet av forutbestemt region være lite, for eksempel < 0,5 ran tykt for testvolumet og <_ 0,1 mm tykt for den forutbestemte region. Dette krever konstruksjon av nær plasserte strøm- og spenningselektroder, som kan gjøres på en rekke måter, inkludert tykkfilmprosesser, tynnfilmproses-ser og silikon-brikketeknologier.

Forandringer i konduktansen av testvolum 214 blir sammenlignet, for eks. ratiometrisk, med forandringer i konduktansen av kontrollvolum 216, og det vekslende konduktansforhold C brukes for å påvise tilstedeværelse og konsentrasjon av en ligand i en fluidprøve. Typisk blir ren elektrolytt injisert ned i brønn 215 og rørt inntil konduktans-forholdet C blir stabilt. Fortrinnsvis blir konduktiviteten av elektrolytt 210 tilpasset til konduktiviteten av fluidprøve som skal undersøkes av ligand. Deretter blir fluidprøven tilsatt til elektrolytt 210 i brønn 215, og forandringen i konduktansforhold C med tiden blir målt.

Forandringen i konduktansforholdet observert i løpet av et spesielt eksperiment, avhenger av en rekke faktorer, slik som tykkelse av de forutbestemte regioner, affinitet av antiligand for ligand, diffusjonskonstant av liganden, konsentrasjon av ligand etc. Derfor er en standardkurve for liganden av interesse konstruert under kjente eksperimentelle betingelser. Den observerte forandring i konduktansforhold, utviklet under de samme betingelser, blir sammenlignet med standardkurven for å påvise konsentrasjonen av ligand i fluidprøven.

Matriks av de forutbestemte regioner 214 og 216 vil ekslu-dere partikler som er større enn porestørrelsen av matriksen. Dette kan være til hjelp i måling av fluidprøver med en stor mengde uønskede partikler, selv om slike partikler kan gå inn i testvolum 237 og kontrollvolum 241, for eksempel hvis røring holder partiklene homogent fordelt. Forutbestemte regioner 214

og 216 kan selv fåes til å ekskludere partikler fra volum 237

og 241 hvis de er mye tykkere enn disse volumer. Alternativt kan et lag eller flere lag legges over de forutbestemte regioner 214 og 216. Hvis dette lag er impermeabelt for partikler til stede i elektrolytten, og hvis den samlete tykkelse av den forutbestemte region og dette laget er større enn tykkelse av test-og kontrollvolumene, da vil dette laget ekskludere partikler fra testvolumet, som nevnt tidligere. Innretningene ovenfor og variasjoner av disse kan være anvendbare for å tillate måling av ligand som er til stede i fluider som inneholder partikler som ellers ville forårsake forstyrrelse i målingen. Plane tilbaketrukne celler slik som de som er i apparatet på fig. 7A, kan brukes for å måle den spesifikke binding av partikkel/ligand-komplekser til overflaten (eller innvendig) av en forutbestemt region 214.

I denne situasjonen er testvolumet bevisst gjort større enn tykkelsen av den forutbestemte region 214 for å inkludere overflaten av området.Testvolumet strekker seg så inn i rommet ovenfor overflaten av regionen. Idet partikkel/ligand-komplekser binder seg til antiligand på overflaten av den forutbestemte region 214, okkuperer de en del av testvolum 237 ovenfor overflaten, og minker således konduktansen av testvolumet. Et lignende arrangement brukes for å måle den spesifikke binding av celler, vesikler, membranfragmenter eller andre strukturer som bærer spesielle ligander på overflaten, og således for å påvise deres tilstedevør-else og konsentrasjon i en fluidprøve.

For å øke effektiviteten av en inntrukken planar sensor hvis testvolum er mye større enn dens forutbestemte region, blir en motstående vegg av ikke-ledende materiale brakt nær overflaten av den forutbestemte region for å avgrense det elektriske felt, og således redusere testvolumet. Alternativt.kan et modulerende lag, som er permeabelt for ligand, men hvis konduktivitet er lavere enn ledningsevnen til den forutbestemte region, slik som porøst polykarbonatfilter fra Nuclepore (Pleasanton, CA), legges over den forutbestemte region. Dette.vil tendere til å avgrense det elektriske felt slik at strømtettheten i den delen av den forutbestemte region som er i nærheten av det modulerende lag, vil økes. Spenningsfallet som forekommer i denne del av den forutbestemte region, vil også øke, og således øke effektiviteten av sensoren.

Idet det henvises til fig. 7B er det vist (ikke i målestokk) et testrør eller et annet fluidinneholdende rom 209

som inneholder elektrolytt 210. Sensorene i dette arrangement er tilsynelatende identiske med sensorene i fig. 7A, som vist ved identisk nummerering av tilsvarende -elementer :; bare kontaktmidlene er forskjellige.

Lokaliserende midler som omfatter en matriks, definerer lokaliseringen av test-forutbestemt region 214 og kontroll-forutbestemt region 216 som i fig. 7A. Regioner 214 og 216 er montert på et ikke-ledende lag 234 som selv kan monteres på en støtteanordning 24 7. Dette apparat er utformet for å muliggjø-re lett innføring av sensorer i fluid 210.

Målende midler ligger under de lokaliserende midler i de forutbestemte regioner 214 og 216. Rørestav 213 eller andre midler som forårsaker bulk-fluidstrøm, brukes hvis det er ønsket for å hjelpe til med å få kontakt mellom fluid 210 og overflatene av de forhåndsbestemte regioner 214 og 216.

En rekke strukturer, eller biolag, kan brukes for å fiksere et sett lokaliserende midler fast og godt i en posisjon over de målende midler. Dette muliggjør at man kan ta en måling, så fjerne de anvendte lokaliserende midler og fiksere et nytt sett i stedet, men som bruker de samme målende midler. For eksempel kan de lokaliserende midler monteres på en holder som passer over blokk 234. Andre biolag-variasjoner er diskutert nedenfor.

Multiple testceller og positive såvel som negative kontroll-celler kan plasseres i brønner slik som de i fig. 7A eller på neddypningssensorer slik som de i fig. 7B. For å unngå interferens mellom celler, bør naboceller være langt fra hverandre; det vil si, avstanden mellom dem bør være betraktelig større enn avstanden mellom strømelektrodene av en enkelt celle. Således kan inntrukne plane sensorer av denne type utformes til mikrotiter-plater eller neddyppingsprøver hvor flere assays blir utført.i hver brønn eller på hver prøve. Prøver kan også utformes til sensorer for iboende katetere, eller sensorene kan ligge på overflaten eller på innsiden av en kanal hvorigjennom fluid-prøve flyter.

Et praktisk<r>testapparat og instrument bør være i stand til å utføre påfølgende tester på forskjellige løsninger raskt og billig. Fortrinnsvis bør de forhåndsbestemte regioner i test- og kontrollcellene være lette å erstatte. Også, som diskutert tidligere, har hver sensor fortrinnsvis et lite forutbestemt område, for eksempel mindre enn 1 \ il eller enda mindre enn 0,1 ul, for å tillate økt følsomhet. Videre er effektiviteten E av sensoren fortrinnvis høy, selv når den forhåndsbestemte region er liten.

To foretrukne konfigurasjoner som gir rom for egenskapene ovenfor, er illustrert (ikke i målestokk) i fig. 8 og 9. Apparatet vist i fig. 8, kalt "IVEP" (indre spennings-ekvivalens-punkt) sensorapparat tillater nøyaktig måling av konduktansen av veldig tynne, laglignende forutbestemte regioner (fig. 8A, 256-259) og testvolumer (fig. 8B, 307), av størrelsesorden på 0,1 mm tykke og 0,1 [ il i volum, eller enda mindre. Dette apparat vist i fig. 9A, kalt "EVEP" (ytre spenningsekvivalenspunkt) sensorapparat, tillater lettvint måling av ting som forekommer nær såvel som i de forutbestemte regioner, og har et potensielt veldig enkelt biolag.

Idet det refereres til fig. 8A, er det vist et IVEP-sensorapparat som omfatter en frontseksjon 250 og en bakre seksjon 252 laget av ikke-ledende materiale, slik som akrylplastmateriale. Seksjoner 250 og 252 kan adskilles langs et plan betegnet ved midtlinje 254. Et midtre lag 261, kalt biolaget, består av test-forutbestemte regioner 256 og 257 og kontrollcelle-forutbestemte regioner 258 og 259 montert på isolerende lag 260. Biolag 261 er innfelt mellom front og bakre seksjoner 250 og 252 under operasjonen av apparatet. Lokaliserende midler omfatter fortrinnsvis matriksmateriale som består av et tynt, porøst lag av nitrocellulose eller annet porøst filtermateriale, som definerer forutbestemte områder 256-259. De forutbestemte regioner av biolaget kalles bio-regioner. Fortrinnsvis blir selve det isolerende lag montert på en fast bærer (ikke vist) for å være.til hjelp i håndtering og plassering av biolaget.

Fig. 8A viser IVEP-sensoren i sin "åpne posisjon", med front og bakre sensorblokker 250 og 252 adskilt nok (typisk nok 1,56 cm) til å tillate lett innføring av biolag 261. Fig. 8B viser en detalj av sanseområdet av testcellen, med sensorblokker 250 og 252 lukket over biolag 261, som klemmer øvre og lavere bioregioner 256 og 257 i kanaler 266 og 268 dannet mellom overflater 291 av frontsensorblokk 250, isolerende lag 260

og overflate 293 av bakre sensorblokk 252.

Apparatet i fig. 8A opererer på en måte som er lik den i fig. 5A. (Imidlertid bør det nevnes at et IVEP-sensorapparat kunne lages like godt med arrangementene i fig. 5C eller 5D). Test- og kontroll-celler er forbundet i serie og test- og kontrollcelleveiene er symmetriske. Idet det vises til fig. 8A, er reservoar 102 fylt med elektrolyttløsning 100. To kanaler 104 og 106 gir veier hvorved elektrolyttløsning 100 kan flyte fra reservoar 102, gjennom test-forutbestemte regioner 256 og 257 og kontroll-f orutbestemte områder 258 og 259 , gjennom to ut-^ løpskanaler 112 og 114, og eventuelt til en spillbeholder (ikke vist). Fluidstrømmen er angitt ved piler 120. Strømmen kan drives ved vekt, pneumatisk eller hydraulisk trykk, eller andre midler.

For testcellen, går fluid fra fluidinnløpsport 262 og reservoar 102 gjennom kanal 104, øvre test-bioregion 256, åpning 264 gitt i isolerende lag 260, lavere test-bioregion 257, og går så ut gjennom kanal 112. For kontrollcellen går fluid fra fluid-innløpsport 262 og reservoar 102 gjennom kanal 106,' øvre kontroll-bioregion 258, åpning 265 gitt i isolerende lag 260, lavere kontroll-bioregion 259, og går så ut gjennom kanal 114.

De målende midler omfatter inntrukne spennings- og strøm-elektroder. En første strømelektrodé 116 i kanal 112 og en annen strømelektrodé 118 i kanal 114 er henholdsvis forbundet med terminaler Cl og C2. En signalgenerator er forbundet med terminaler Cl og C2 og får en strøm til å gå fra strømelektrodé 116 gjennom kanal 112, lavere test-bioregion 257, åpning 264, øvre test-bioregion 256, kanal 104, reservoar 100, kanal 106, øvre kontroll-bioregion 258, åpning 265, lavere bioregion 259 og kanal 114 til elektrode 118. Denne strømmen forårsaker et spenningsfall mellom topp- og bunn-bioregionene av hver celle, som kan måles for å påvise tilstedeværelse av en spesiell ligand i elektrolytten.

To fluidkanaler 266 og 268 over og under det'isolerende lag 260 fylles med elektrolytt. Dette kan på en enkel måte gjøres ved å holde begge sensorblokkene 250 og 252 nedsenket i et elektrolyttbad (se fig. 9B). Kanaler 266 og 268 er ekvivalente med inntrukne kanaler 130 vist i fig. 5A. Som. vist klart i fig. 8B, gir inntrukket kanal 266 en elektrisk forbindelse mellom den flytende elektrolytt og spenningselektrode 122 forbundet med terminal V2. Inntrukket kanal 268 gir en elektrisk forbindelse mellom elektrolytten og spenningselektroden 124 forbundet med terminal VI. Kontroll-cellen opererer på samme måte, med inntrukne kanaler 270 og 272 som henholdsvis gir elektriske veier mellom elektrolytten og spenningselektroder 126 og 128, forbundet med terminaler V3 og V4. 0-ringer 274 til 281 gir forsegling for å isolere fluidene i test- og kontrollcellene og forhindrer elektrisk lekkasje. Overflater. 290, 292, 294 og 296 bestemmer dimensjonene av cellene ved å støte mot isolerende lag 260. Overflater 298, 300, 302 og.304 kan også tjene denne funksjon. Alle inntrukne kanaler, spenningselektroder og 0-ringer er sirkulære og symmetriske rundt innløps- og utløpskanaler 104 og 112 (for testcellen) og 106 og 114 (for kontrollcellen). Spenningselektroder 122, 124, 126 og 128 er videre inntrukket ved at de er plassert i inntrukne kammere 273 forbundet med inntrukne kanaler 266, 268, 270 og 272, som.tillater elektrodene å være store og ha lav-polariseringsimpedans.

Under funksjonen blir strukturen i fig. 8A åpnet langs midtlinje 254 og et nytt biolag 261 blir innført med ferske test- og kontrollcelle-bioregioner. Front- og bakre seksjoner 250 og 252 blir så gjenforenet med 0-ringer 274-281 som sørger for forsegling av hver celle. Denne tre-del-strukturen tillater enkel og billig utskifting av biolag.

Forseglingen gitt av 0-ringene er imidlertid ikke alltid perfekt, og lekkasje av elektrolytt og ved 0-ringene kan forekomme. Idet vi refererer til fig. 8A, hvis det er lekkasje over for eksempel 0-ringer 274, 275, 276 og 277, kan en lednings-vei mellom test- og kontrollcellene resultere i feil i målingene av cellekonduktansene. For å redusere eller eliminere feil forårsaket av slik lekkasje er det gitt vaktelektroder 282, 284, 286 og 288 forbundet med terminaler Gl til G4 , om ønsket, mellom hver av spenningsterminalene V1-V4 og deres tilhørende 0-ringfor-seglinger. Operasjonen av disse vaktringer er diskutert mer detaljert i eksempel 8 og 9.

Idet vi igjen refererer til fig. 8B, er det vist sanseregio-ner av testcellen i nærbilde, med IVEP-sensorapparatet i den lukkete posisjon. Bioregion-matriksmaterialet av test-forutbestemt regioner 256 og 257 fyller inntrukne kanaler henholdsvis

266 og 268. På samme måte, selv om det ikke er vist her, fyl-

ler bioregion-matriksmaterialet av kontroll-forutbestemte regioner 258 og 259 inntrukne kanaler 270 og 272. Dette oppnås ved å forsikre seg om at overflatene 291, 293, 295 og 297 som former inntrukne kanaler 266, 268, 270 og 272, ligger i en avstand under overflater 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302 og 304 (fig. 8A) 1 samme plan, som er mindre enn tykkelsen av de spesielle anvendte biolag. Med bioregioner 0,125-0,150 mm tykke er denne avstand typisk 0,1 mm. Ved å fylle inntrukne kanaler 266, 268,

270, 272 med matriksmateriale minimaliseres støy og avvik på

grunn av bobledannelse og konveksjon av fluid fra inntrukne kanaler inn i testvolumet. Dette hjelper også til å sikre at kanalene forblir ledende og ikke blokkeres, for eksempel ved bobler, selv om de er meget tynne.

Idet vi nå igjen refererer tii^fig. 8B, tillater strukturen av IVEP-apparatet spenningene målt ved spenningselektroder 122

og 124 ved munningene av inntrukne kanaler 266 og 268 å ligge ikke bare nær, men faktisk innenfor test-forutbestemte regioner 256 og 257, som vist ved spenningsekvivalenspunkter 306 og 308; således betegnelsen "indre spenningsekvivalenspunkt", eller "IVEP"-sensor. Spenningsekvivalenspunkter 306 og 308 hjelper til å lokalisere testvolum 307 hvis konduktans måles for å påvise forekomst av ligand/antiligand- vekselvirkning i forutbestemte regioner 256 og 257. I denne enkle modell kan testvolum 307 sees på som om det omfatter halvparten av tykkelsen av øvre inntrukne kanal 266 pluss tykkelsen av det isolerende lag 260 pluss halvparten av tykkelsen av nedre inntrukne kanal 268. På samme måte, for kontrollcellen, tillater spenningen målt ved spenningselektroder 126 og 128 ved munningene av inntrukne kanaler 2 70 og 272 (fig. 8A)_, at spenningsekvivalens-punktene for kontroll-sensoren ligger innenfor kontroll-forutbestemte regioner 258 og 259, idet de definerer et. tilsvarende tidsvolum (ikke vist) som omfatter halvparten av tykkelsen av øvre inntrukne kanal 270, pluss tykkelsen av isolerende lag 260, pluss halvparten av tykkelsen av nedre inntrukne kanal 272.

IVEP-sensorapparatet viser at lokaliseringen og størrelsen

av spenningselektrodene effektivt kan frakobles fra spenningselektrodene i det volumet hvis konduktans de måler, gjennom anvendelse av inntrukne kammere og kanaler. Fleksibili-teten i sensorutforming som således oppnås, er en viktig fordel

ved den foreliggende oppfinnelse.

Idet vi igjen refererer til fig. 8A, kan evnen til å konstruere et tynt testvolum sees å være begrenset bare ved til-gjengeligheten av tynne matriksmaterialer for de forutbestemte regioner 256-259, et tynt isolerende lagmateriale 260, og nøyak-tigheten av teknikker som er tilgjengelige for å plassere overflatene 291, 293, 295 og 297 som danner inntrukne kanaler 266, 268, 270 og 272 i en liten avstand under overflatene 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302 og 304.

Som nevnt tidligere, tillater et tynt testvolum at test- og kontrollvolumene kan være veldig små, hvilket er en viktig fordel med denne IVEP-utgave. Testvolumene er utformet ved å bruke nitrocellulose-matriksmateriale fra Millipore Corp. (Bedford, MA), som er 135-150 Mm tykt, inntrukne kanaler 100 Mm tykke, et isolerende lag av leksan fra General Electric (Schenectady N.Y.) 7 5 pm tykt og en åpning i det isolerende lag 0,8 mm i diameter. Dette gir en avstand mellom spenningsekvivalenspunktene på halvparten av tykkelsen av øvre inntrukne kanal pluss tykkelsen av det isolerende lag, pluss halvparten av tykkelsen av nedre inntrukne kanal, eller totalt 175 Mm. Siden området av åpningen er omtrent 0,5 mm 2, er en estimert størrelse for testvolumene 0,09 mI.

Selv mindre testvolumer kan konstrueres. Som eksempel kan en matriks som er ca, 25 eller 30 Mm tykk og inntrukne kanaler som er 25 Mm tykke, brukes sammen med et isolerende lag som er ca. 25 Mm tykt. Også hvis et halv-millimeters diameter hull i det [isolerende lag av biolaget brukes, vil dets areal være 3/16 mm 2. Avstanden mellom spenningsekvivalenspunktene er totalt på 0,05 mm. Således ville det totale testvolum være ca. 9 nanoliter eller 0,009 mI.

Sensorer med enda mindre, dimensjoner kan bygges opp ved å bruke tynne lag av isolerende materiale av passende tykkelse og instrumentstyrte maskineringsteknikker, sprøytestøpte deler, tykk-film- eller tynnfilm-teknikker, silisiumbrikke-teknologi eller andre teknikker kjent for fagmenn på området. Ved å bruke slike teknikker er.det mulig å konstruere IVEP-sensorer hvor bredden av åpningen av de inntrukne kanaler varierer fra 10 Mm til omtrent 5 Mm eller enda mindre, og hvor disse åpninger er 10 Mm fra hverandre i forhold til hverandre eller mindre, hvilket gir et enda mindre testvolum.

Biolag 261 kan varieres på mange måter. For eksempel kan enten den øvre eller nedre forutbestemte region 256 eller 257 elimineres, med substitusjon av en matriks som ikke lokaliserer antiligander eller uten noen matriks i det hele tatt. Åpning 264 i det isolerende lag kan fylles fullstendig med lokaliserende midler matriks ved kompresjon eller ved å støpe nitrocellulose eller annet matriksmateriale direkte inn i åpningen. På-fyllingsåpning 264 med lokaliserende midler matriks tillater konstruksjon av en sensor med nesten 100 % effektivitet, hvor bortimot hele testvolumet inneholder lokaliserende midler. Også

i en slik sensor er så å si hele testvolumet inkludert innen de lokaliserende midler.

Idet vi refererer til fig. 9A er det vist et typisk IVEP-sensorapparat som delvis består av frontseksjon 350 og bakre seksjon 352 som er laget av ikke-ledende materiale slik som akryl-plast og som kan adskilles langs et plan betegnet ved midtlinje 354. Et midtre lag, biolag 355,.omfatter test-forutbestemt region 356 og kontroll-forutbestemt region 358 montert om ønsket på et isolerende underlag 360 for lettvint håndtering. Biolag 355 er innfelt mellom front- og bakre seksjoner 350 og 352.

I denne utgaven omfatter de lokaliserende midler et matriks-materiale som består av et tynt, porøst lag av nitrocellulose eller annet porøst filtermateriale, som definerer forutbestemte regioner 356 og 358.

Apparatet i fig. 9A virker på en måte som er lik apparatet

i fig. 5C. (Imidlertid bør det nevnes at EVEP-sensorapparatet kan lages like godt med arrangementer slik som de i fig. 5A eller 5D eller i en serie strømkonfigurasjon slik som det , i- fig. 6B). En testcelle og en kontrollcelle har hver sin egen strøm-vei hvor de to cellene har felles strømelektrodé, og test- og kontrollcelleveiene er symmetriske. Idet vi refererer til fig. 9A, blir reservoar 102 fylt med en elektrolyttløsning 100 via fluidinnløp 349. To kanaler, henholdsvis 104 og 106, gir veier hvorved elektrolyttløsningen flyter fra reservoar 102, gjennom test-forutbestemt region 356 og kontroll-forutbestemt region 358, gjennom to utløpskanaler 112 og 114, og eventuelt til en spillbeholder (ikke vist). Fluidstrømmen er angitt ved piler

120. Strømmen kan være drevet av vekt, pneumatisk eller hydraulisk trykk eller ved andre midler.

For testcellen går fluid fra reservoar 102 gjennom kanal 104, gjennom forutbestemt region 356, gjennom åpning 362 i isolerende lag 360 av biolag 355, og går så ut gjennom kanal 112. På samme måte, for kontrollcellen, går fluid fra reservoar 102 gjennom kanal 106, gjennom kontroll-forutbestemt region 358, gjennom åpning 364 i isolerende lag 360 av biolag 355 og går så ut gjennom kanal 114.

De målende midler omfatter inntrukne spennings- og strøm-elektroder. En signalgenerator er forbundet med terminaler Cl av elektrode 140 og C2 av ringformet eller bueformet elektrode 144 som får en strøm til å gå fra elektrode 140 gjennom kanal 112, åpning 362, test-forutbestemt region 356, kanal 104 og reservoar 100, til elektrode 144. På samme måte er en signalgenerator forbundet med terminaler Cl av elektrode 14 2 og C2 av elektrode 144 som får en strøm til å gå fra elektrode 142, gjennom kanal 114, åpning 364, kontroll-forutbestemt region 358, kanal 106 og reservoar 102, så også til elektrode 144. Elektrode 144 er således en felles elektrode for de to cellene. Strøm-men forårsaker spenningsfall over de forutbestemte regioner og testvolumer (se nedenfor) av hver celle som kan måles for å påvise tilstedeværelsen av en spesiell ligand i elektrolytten.

Fluidkanaler 366 fylles med elektrolytt og gir elektriske veier til inntrukne spenningselektroder 368, 370, 372 og 374. Disse kanaler er ekvivalente med spenningselektrode-inntrukne kanaler 130 vist i fig. 5A, og de tilsvarende kanaler vist i fig. 5C. Punkter 374 og 376 i kanaler 366 er spenningsekvivalenspunktene i testcellen, og punkter 378 og 380 er spenningsekvivalenspunktene i kontrollcellen. Disse hjelper til å definere posisjonen av testvolum 357 og kontrollvolum 359 hvis konduktans vil bli målt. Spenningselektroder 368 og 370 forbundet med terminaler Vi og V2 måler spenningsfallet mellom spenningsekvivalenspunkter 374 og 376. Det bør nevnes at i EVEP-konfigurasjonen inkluderer testvolumet mellom spenningsekvivalenspunktene 374 og 376 og således typisk testvolumet 357, helt den forutbestemte region 356. Likeledes måler spenningselektrodene

372 og 374 forbundet med terminaler VI og V2 spenningsfallet mellom spenningsekvivalenspunkter 378 og 380 som hjelper til å

definere kontrollvolum 359.

Spenningselektrode-inntrukne kamre 38 2 trekker spenningselektrodene inn enda mer, og tillater dem å. være store, hvilket reduserer deres polariserings-impedans. Strømelektrode-inntrukne kamre 383 virker på samme måte for strømelektrodene. Fluid-utløp 384 fra spenningselektrode-inntrukne kamre 382 tillater gjennomspyling av kamrene med elektrolytt om ønsket, mens fluid-utløp 385 fra strømelektrodekamrene tillater fjerning av elektrolytt til spillbeholdere.

I tillegg eller som et alternativ til spenningselektrode-inntrukne kammerutløp 384, er inntrukne kanaler 366 fylt med en ledende matriks slik som porøst papir eller en gel for å redusere forstyrrelser på grunn av bobler eller innløp av innhold fra kamre 382 inn i test- og kontrollvolumer 357 og 359, for eksempel, ved konveksjon. Likeledes kan fluidinnløps- og utløpskana-ler 104, 106, 112 og 114 inneholde en porøs matriks av lignende grunner så lenge som denne ikke interfererer på en uakseptabel måte med fluidstrømmen.

Spenningsekvivalenspunktene i apparatkonfigurasjonen i fig. 9A er utenfor forutbestemte regioner 356 og 358; således navnet ytre spenningsekvivalenspunkt (EVEP) (External Voltage Equivalence Point)-sensor.

0-ringer 386 og 388 gir forsegling for å isolere fluidene i test- og kontrollcellene og forhindre elektrisk lekkasje.

Biolagkonfigurasjonen muliggjør lett håndtering og plassering av matriksene som definerer de forutbestemte regioner 356 og 358. Biolag 355 omfatter de forutbestemte regioner 356 og 358

og avstandslag 390 montert på isolerende underlagslag 360. Avstandslag 390 er svakt tynnere (av størrelsesorden 0,1 mm)

enn de forutbestemte regioner 356 og 358 (av størrelsesorden 0,135-0,150 mm) slik at biolag 355 vil holdes fast når sensoren blir lukket. Avstandslag 390 og isolerende lag 360 klemmes mellom overflater 392 og 394 for å forsegle 0-ringene og bestemme dimensjonene av test- og kontrollcellene.

Figur 9B beskriver et fluidbad som kan brukes enten for IVEP- eller EVEP-sensoren for å opprettholde temperatur-likevekt av test- og kontrollcellene, for å væte biolaget mens det er innfelt, og for å holde kanalene av sensoren fylt med fluid.

Mere spesifikt er det vist et bilde sett ovenfra av fluidbad 396 som inneholder elektrolytt 398. Frontblokk 350 og bakre blokk 352 av en EVEP-sensor er i et typisk tilfelle montert i fleksible vegger 400 og 402 av fluidbad 396 ved å bruke skruer 404 og de påmonterte stykker 406 og 408 eller andre midler. Blokkene er i en høyde som plasserer de målende midler (ikke vist) i blokkene neddykket til alle tider slik at når biolagene er innfelt eller fjernet vil kanalene i sensoren forbli fylt med fluid. Som nevnt ovenfor, hjelper fluidbadet til å opprettholde temperaturlikevekt i test- og kontrollcellene og væter biolaget når det er innfelt. De påmonterte stykker 406 og 408 hjelper også til å opprettholde temperaturlikevekt ved å holde sensorblokker 350 og 352 borte fra vegger 402 og 404 av badet. Generelt trengs det ingen tilleggstemperatur-regulering, selv for konduktansmålinger som er følsomme for 100 deler pr. million eller bedre.

Arrangementet i fig. 9B holder sensorblokker 350 og 352 fast og tillater lettvint innføring av biolag. Etter at biolag er blitt innført, klemmer klemme 410 eller andre midler veg-gene av badet sammen, og klemmer således sammen biolaget mellom sensorblokker 350 og 352, og isolerer test- og kontrollcellene fra hverandre elektrisk og hydraulisk, via virkningen av 0-ringene nevnt supra.

EVEP-type-sensoren kan modifiseres på en rekke måter. Et enkelt sløyfesystem kan brukes for fluidprøve-injeksjon, med eller uten et reservoar. Om ønsket kan åpning 362 i isolerende lag 390, som vist i fig. 9A, gjøres mindre enn diametrene av kanaler 104, 106, 112 og 114. Dette har den virkning a;> detøker det relative bidrag til den totale motstand (mellom spenningsekvivalenspunktene) av regionen i den umiddelbare nærhet av åpning 36 2 - en delvis Jones-celletype-effekt. Det meste av motstanden assosiert med den sammensnørte åpningen opptrer innen et volum assosiert med selve åpningen og området på hver side av åpningen innen en diameters avstand. Denne tilnærming kan forbedre effektiviteten av selv en ueffektiv EVEP-sensor med 30 til 50 % hvis tykkelsen av den forutbestemte region 356 er sammenlignbar med eller større enn både tykkelsen av det isolerende lag 360 og diameteren av åpningen 362, dvs. selv om spenningsekvivalenspunkter 374, 376, 378 og 380 er langt unna.

En annen måte å øke effektiviteten av en EVEP-sensorkon-figurasjon på, er å bringe spenningsekvivalenspunkter 374, 376, 378, 380 nærmere til sine forutbestemte regioner ved å innføre hule, turbulære filtere ned gjennom innløps- og utløpsåpningene av kontaktmidlene, som delvis blokkerer de inntrukne kanaler 366 til spenningselektrodene og skyve spenningsekvivalenspunktene nærmere biolaget. Et eksperiment som bruker denne "hylstrete kolonne"-konfigurasjon av EVEP-sensoren, er vist i eksempel 3.

Effektiviteten av EVEP, IVEP og andre utgaver kan økes ved

å plassere et strømmodulerende materiale nær et lokaliserende middel, hvori dette materiale har et ledende areal i tverrsnitt mindre enn det ledende areal i tverrsnitt assosiert med de lokaliserende midler. Et eksempel på et slikt materiale er Nuclepore-filter, et strålingsutsatt, alkali-digestrert porøst polykarbonat, kommersielt tilgjengelig fra Nuclepore Corporation, (Pleasanton, CA). Dette materiale består av 90 % ikke-ledende faststoff og 10 % ledende porer. Det kan sees på som å danne en mikroporøs, delvis Jones-celle-effekt lik effekten av.deri sammensnørende åpning 362 i isolerende lag 390. Siden elektrisk strøm må konsentreres i det modulerende materiale for å passere gjennom et ledende område som er mindre enn det assosiert med de lokaliserende midler, vil et større spenningsfall forekomme her på grunn av den større strømtetthet og lokal motstand. I den utstrekning at de lokaliserende midler er nær nok til det strømmodulerende materiale til å være i det minste delvis i området med høyere strømtetthet, vil enhver spenningsforandring assosiert med vekslende konduktans av de lokaliserende midler som forekommer i dette område som et resultat av ligand-antiligand-virkning, være større.

Det lokaliserende middel kan selv ha karakteristika som

gjør det til et strøm-modulerende materiale. Nuclepore, for eksempel, kan selv binde protein; det tjener da både som lokaliserende middel og som et strøm-modulerende middel. HvisNuclepore brukes i en IVEP-type av sensor, blir.et tilleggsleden-de lag lagt oppå. Nuclep.ore-laget, siden Nuclepore-strukturen ikke leder elektrisitet i en retning parallell med dets overflate.

Det bør nevnes at apparat av den ovenfor nevnte type klart kan konstrueres, hvor de forutbestemte regioner inneholder lokaliserende midler med immobilisert ligand (eller lokalisert

andre steder) istedenfor antiligand.

Denne oppfinnelse inkluderer spesifikt forestillingen om å konstruere et biolag som omfatter en kombinasjon av et eller flere lokaliserende midler og passende støtteanordning som er utformet for lett innføring eller plassering av de lokaliserende midler inn i eller oppå resten av det følsomme apparat. Biolaget kan være til engangsbruk. Det kan være separabelt fra de målende midler. Evnen til å fremstille et slikt modifisert lokaliserende middel atskilt fra de målende midler er en viktig fordel med denne oppfinnelse. I noen situasjoner kan biolaget inkludere målende midler slik som elektroder. De lokaliserende midler kan omfatte bundete antiligand-molekyler. Biolaget kan omfatte i det minste ett isolerende lag, hvortil de lokaliserende midler kan være festet. Det isolerende lag kan modulere den elektriske strømmen. Passende biolag kan brukes med alle apparatene beskrevet ovenfor. Spesielt, der hvor apparatet er utformet for differensielle eller multiple målinger, kan biolaget omfatte to eller flere lokaliserende midler.

EKSEMPEL 1

I dette eksperiment ble tilstedeværelse av et spesifikt antistoff, geite-anti-(kaningammaglobulin)-antistoff, eller GAR, påvist i en fluidprøve ved å måle konduktansforandring av et bio-område som inneholdt et immobilisert antigen, kanin-gammaglobulin, eller RAX (forkortelse for "kanin anti-X").

Et IVEP-apparat av typen vist i fig. 8 ble brukt, med unntak av at test- og kontrollcellene her hadde sin egen strømvei og strøm-elektroder som i fig. 5D, og fluidprøve ble tilsatt via en prø-vesløyfe til en fluidinnløpsåpning, uten noe reservoar, også som i fig. 5D. Apparatet ble forbundet med en konduktansbro av typen beskrevet i eksempel 9.

Test- og kontroll-bioregioner ble konstruert ved å bruke 3,5 mm diameter plater trykket ut av 150 Mm tykt nitrocellulosefilter (anskaffet av Schleicher og Schuell, Keene, N.H., 5,0 Mm porestørrelse), montert direkte over 0,8 mm hull lokalisert i en 0,07 5 mm plate av lexan (polykarbonat, fra General Electric).

50 Ml av en 2,5 mg/ml løsning av geite-IgG ("GAX", forkortelse for"géite-anti-X", Sigma Chemical Co., St. Louis, NO) ble tilsatt til kontroll-bioregionen.som en negativ kontroll. Dette ble inkubert ved romtemperatur i omtrent 10 minutter for å tillate protein å binde seg til nitrocellulose. På samme måte ble 50 pl av en 2,5 mg/ml løsning av kanin IgG ("RAX", Sigma) tilsatt til testbio-området. (Selv om RAX selv er en antistoff-fraksjon, virker det her som et antigen for å tillate testing for tilstedeværelse av GAR). Biolaget som inneholder de to pro-teinbelagte bioregioner, ble så vasket med rennende buffer (0,2 M NaCl, 0,02 M NaP04, pH 7,0) og plassert i sensorkammeret.

Påvisning av spesifikt GAR-antistoff ble påbegynt ved å la avluftet rennende buffer flyte gjennom hvert biolag i en hastighet på omtrent 60 ul pr. min, mens man målte konduktansforholdet. Denne prosedyre etablerte en stabil baselinje. En.sammenfallbar pose som inneholdt rennende buffer lokalisert omtrent 30" ovenfor sensoren, opprettholdt et trykkhode som gav tilstrekkelig strøm under forløpet av eksperimentet. 50 ug bovinserumalbumin (BSA, Fraction V fra Sigma), på 12 ug biotinylert GAR (Sigma), så 50 Mg avidin (Sigma) ble tilsatt sekvensielt som angitt i fig. 10, mens konduktansen fortsatte å bli målt. Hver prøve ble tilsatt i et 100 mI volum via en 100 ul prøvesløyfe. Resultatene (fig. lo) viser følgende: 1) Et ikke-spesifikt protein, BSA, forår-sakte bare svak avvikelse av baselinjesignalet. Imidlertid,

når biotinylert GAR ble tilsatt, forårsaket det en negativ avvikelse på omtrent 5000 deler pr. million (ppm) i konduktansforholdet, C, eller 0,5 %, og dette gjorde det i mindre enn 1 min.

En partikkel som bestod av det tetramere protein avidin, ble brukt for å forsterke signalet ovenfor. Avidin har høy affinitet til biotin; således skulle avidin binde seg til det immobiliserte, biotinylerte GAR. Som det sees i fig. 10, resul-terte tilsetning av avidin i en forsterkning på 3000-4000 ppm, eller nesten en faktor på 2. Tilsetning av større partikler, for eksempel polyavidin-polymerer, laget ved kryssbinding'av avi-dinmolekyler med glutaraldehyd, ville produsere et enda større signal. Det bør nevnes at dette forsterkningseksempel er en variasjon av sandwich-assayen. Den første immobiliserte antiligand varRAX, liganden var biotinylert GAR, og den andre, ikke-interfererende antiligand var avidin.

EKSEMPEL 2

I dette hypotetiske eksempel blir tilstedeværelsen av to testligander, GAR og Ø-galaktosidase, og en positiv kontroll- ligand, DNP-ovalbumin, påvist samtidig i samme fluidprøve. Konduktansene av test- og positive kontroll-bioregioner sammenlignes med konduktansen i en negativ kontroll. Således inneholder apparatet 4 celler alt i alt. Et multippelt IVEP-sensorapparat blir brukt, hvori hver celle har en separat fluidvei som i fig. 6A, men har felles elektrisk vei med cellen hvormed den sammenlignes, på måten beskrevet i fig. 5A og 5B. Dvs., hver test-eller positive kontrollceller plasseres elektrisk i serie med den negative kontroll under en måling som beskrevet supra. Apparatet er forbundet med en konduktansbro av typen beskrevet i eksempel 8 for å måle konduktansforandringer.

Som i det tidligere eksempel blir GAX og RAX tilsatt til kontroll- og test-bioregioner. 50 ul av en 2,5 mg/ml løsning av anti-DNP-antistoff tilsettes til en tredje bioregion, som tjener som positiv kontroll. 50 ul av en 2,5 mg/ml løsning av antistoff mot enzymet/3-galaktosidase tilsettes til en annen bioregion, som tjener som en sekundær bioregion.

Biolaget som inneholder de fire protein-belagte bioregioner vaskes som i eksempel 1 og plasseres i sensoren. Man lar rennende buffer flyte gjennom hvert biolag som i eksempel 1 ved en hastighet på omtrent 50 pl pr. minutt, og konduktansen i hver test eller;>positive kontrollcelle blir videre målt, etter tur, omtrent én gang hvert sekund. Når konduktansforholdene har stabilisert seg, blir 100.mI av en fluidprøve injisert inn i sensorapparatet via en 100 pl prøvesløyfe. Prøven inneholder rennende buffer og i tillegg 12 ug GAR, 6 ug 3-galaktosidase og 3 Mg ovalbumin, høyt substituert med DNP. Fig. 11 viser responsen som er forventet for hver sensor. Sensoren som inneholder anti^Ø-galaktosidase, svarer spesifikt på/3-galaktosidase ved samme tid som sensoren som inneholder immobilisert.RAX,.svarer spesifikt på GAR. Den positive kontroll kan tjene både til å estime-re strømhastigheten gjennom sensorene og til å kalibrere sensorene. Dette hypotetiske eksperiment viser måten hvorved den foreliggende oppfinnelse samtidig kan måle multippel-ligander i den samme fluid, og også teste for den korrekte virkning og detalj-erte funksjon av apparatet gjennom bruk av en positiv kontroll.

EKSEMPEL 3

I dette eksperiment ble tilstedeværelsen av GAR-anti-

stoff igjen påvist i en fluidprøve. EVEP-apparatet i fig. 9

ble brukt, med unntak av at det ikke var noe isolerende lag 360 eller biolag 355 som sådan, idet test og kontroll-bioregionene var plassert individuelt i sensorapparatet. Apparatet ble forbundet med en konduktansbro av typen beskrevet i eksempel 9.

Lokaliserende midler som omfattet plater på 5 mm i diameter og 150 [ im tykke, ble trykket ut av HA-typefiltere (0,45 nm pore-størrelse) som bestod av blandete estere av nitrocellulose, forhandlet fra Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts.

Slike plater hadde således et areal på 19,6 mm 2, og et volum

på 2,9 mm 3, eller omtrent 3 ul. Det aktive matriks-areal hvorigjennom fluidprøve flyter, ble bestemt ved tverrsnittsarealet av innløps- og utløpsåpningene (1 mm i diameter) og var ca. 0,75 mm 2. Således var den forutbestemte regions volum omtrent 0,11 pl eller 110 nanoliter.

Hver 5 mm i diameters plate kan binde omtrent 20 ug protein; til hver plate ble 100 ug protein tilsatt, slik at filteret ville bli fullstendig mettet. Platene ble tillatt å stå i 5 minutter ved romtemperatur (under dekke for å unngå kraftig av-damping) , så vasket i 1 ml fosfat-bufret saltvannsløsning (PBS, 0,60 M NaCl, 0,01 M NaP04, pH 8,3, 0,1 % natriumazid) og lagret i denne saltvannsløsning inntil de var ferdige til bruk. Spesifikt ble det til testplaten tilsatt 10 mI av en løsning av RAX (innkjøpt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri), justert til å være 10 mg/ml i RAX, 0,60 M i NaCl, 0,01 M i NaPO^, pH 7,3 og 0,1 % i natriumazid. Til den negative kontroll-plate ble det tilsatt 10 ul av en løsning av geite-IgG (GAX), også forhandlet fra Sigma og justert til å være 10 mg/ml i GAX, 0,60 M i NaCl, 0,01 M i NaP04, pH 7,3 og 0,1 % i natriumazid.

Platene ble innført i apparatet i fig. 9. Apparatet ble montert, og 50 ul av hver av BSA, GAX og GAR i PBS ble tilsatt sekvensielt til et reservoar-kammer som inneholdt 5 ml PBS, for å gi sluttkonsentrasjoner i reservoaret på henholdsvis 100, 100 og 36 ug/ml. Resultatene i fig. 12 viser at disse sensorer på-viste en spesifikk nedgang i konduktans i RAX-bioregionen som et resultat av RAX/GAR-kompleksdannelse..Selv om det ikke er vist her, fortsatte nedgangen i konduktans i flere minutter til, før de nådde et platå på omtrent -20 000 ppm eller 2 % total nedgang i konduktans i bioregionen.

EKSEMPEL 4

I dette eksperiment ble tilstedeværelse av et antigen, human gamma-globulin ("HAX", forkortelse for "human-anti-X"), påvist ved å måle forandringen i konduktans i en bioregion som inneholdt immobilisert antistoff, geite-anti-(human-y-globulin)-antistoff, eller "GAH". Et apparat av typen vist i fig. 5C ble brukt. Apparatet ble forbundet med en differensiell konduktivi-tetsbro konstruert av Neil Brown ved å bruke to konduktivitets-kretser av typen beskrevet i US-patentsøknad nr. 4 23 281, innlevert 24. september 1982, med tittelen: Automatic Temperature Measuring Circuitry, som referert til her. Disse to kretser ble sammenlignet ved å bruke en manuelt-skiftet presisjonsforholds-transformator (Dekatran dekade-transformator fra Electroscienti-fic Instruments, Portland OR) i konjunksjon med en påvisnings-krets som bestod av følgende: En for-forsterker med høy virkningsgrad, et båndpasseringsfilter med null-faseforandring ved operasjonsfrekvensen, og en fase-sensitiv detektor hvis uttak var forbundet med en strimmelkort-recorder.

Test og kontrollvolumer omfattet kolonner på 1 mm i diameter og 10 mm lange laget ved å drille hull i ikke-ledende akryl-.... plast, og fylt med CNBr-aktiverte kulepreparater (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.), som tjente som de lokaliserende midler. Disse kuler binder kovalent proteiner eller andre molekyler som inneholder frie NH2~grupper. HAX forhandlet fra Sigma Chemical Compan (St. Louis, MO) ble kovalent bundet til gelkuler av CNBr-aktivert Sepharose 4B i henhold til standard-teknikker publisert av Pharmacia (se' Affinity Chromatography, Pr-inciples and Methods, 1979) for å gi en kulesuspensjon som inneholdt 9 mg HAX pr. ml av pakkede kuler. Disse kuler, 0,9 % i HAX (vekt/volum), ble fylt inn i kontrollbioregionen. (I dette eksempel tjener HAX selv som negativ kontroll). På samme måte

ble fluorescerende geite-anti-(human-gamma-globulin) IgG (GAH) forhandlet fra Antibodies, Inc., Davis, CA) som et 56 % rent preparat, kovalent bundet til CNBr-aktivert Sepharose 4B-kuler for å gi en suspensjon som inneholdt 9 mg protein og 5 mg GAH

pr. ml pakkete kuler =0,5 % GAH (vekt/volum). GAH-kulene ble fylt inn i test-bioregionen.

De følgende proteinløsninger ble tilsatt i rekkefølge til

1 ml fosfat-bufret saltvannsløsning (PBS, 0,60 M NaCl, 0,01 M NaP04, pH 8,3, 0,1 % eller 0,05 % NaN^) i reservoaret:

(1) Bovinserumalbumin (BSA), 100 ul/ved en konsentrasjon

på 15 mg/ul i PBS; (2) GAX, 100 pl, ved samme konsentrasjon i PBS;

(3) HAX, 100 ul i ved samme konsentrasjon i PBS.

Resultatene, illustrert diagrammatisk i figur 13 viser at

det var en forandring i konduktansforhold etter tilsetning til prøvefluidet av liganden HAX, som er bundet spesifikt ved det im-mobilierte GAH-antistoff, men ikke etter tilsetning av GAX, som er et beslektet IgG, heller ikke etter tilsetning av BSA, et typisk protein. I dette eksperiment bør det nevnes at:

(a) Et antistoff ble immobilisert denne gangen, heller

enn et antigen som i eksemplene 1 og 3. Dette støtter det as-pekt av den foreliggende oppfinnelse, som sier at den er generell med hensyn til binding av hver komponent av et ligand/antiligand-kompleks . (b) Immobilisert antigen ble selv brukt til å fremstille null-sensoren. Så lenge som den negative kontrollsensor fremstilles på en slik ruåte at den er fysisk og kjemisk lik testsensoren (med unntak av de spesifikke bindingskarakteristika for testsensoren, selvfølgelig), og så lenge som det negative kontroll-immobiliserte stoff stort sett er fritt for spesifikke vekselvirkninger som påvirker forandringer i bulk-konduktans,

kan det tjene som en kontroll for ikke-spesifikk binding.

(c) Den positive respons mot HAX ble ikke forstyrret ved tilstedeværelsen av andre proteiner (GAX cg BSA) i fluidprøven under målingen.

EKSEMPEL 5

Siden målingen av ligand/antiligand-binding i henhold til

den foreliggende oppfinnelse er basert på forandringer i den elektriske konduktans (eller motstand) av en sensors testvolum, vil ethvert spesielt ikke-ledende stoff som samler seg i test-volumet på grunn av spesifikk ligand/antiligand-binding forandre konduktansmålingen. Partikler slik som erytrocytter, lateks-kuler, plastkuler, eller glasskuler kan påvises eller kan brukes

som forsterkningsstoffer for å tillate påvisning av andre spesier. Imidlertid kan bruk av partikler som forsterkningsstoffer forårsake ikke-spesifikk filter-tilstopping under noen omstendigheter.Envstrategi hvor uløselige partikler eller, andre ikke-ledende volumer blir dannet fra fullstendig løselige reagenser, som et resultat av ligand/antiligand-binding kunne løse dette problem.

Som eksempel er enzymet katalase kovalent bundet til geite-anti- (kanin-gamma-globulin) -antistoff (GAR) ved standardmetoder slik som kryssbinding med glutaraldehyd. Dette kompleks brukes for eksempel som et sekundært antistoff for å teste for.binding av primært kanin-antistoff til en ligand i en fluidprøve som er blitt bundet til en bioregion, for eksempel under en sandwich-assay. For å påvise tilstedeværelse av bundet GAR/katalase-kompleks, og således tilstedeværelse av bundet ligand lar man hydrogenperoksyd (0,01 %) passere gjennom sensoren, og det blir omdannet til 0^ og H^O via den enzymatiske aktivitet av enzymet. Den utviklete 02danner bobler i eller nær bioregion-matriksen, og disse bobler, som er ikke-ledende, forårsaker nedsatt elektrisk konduktans som blir målt ved apparatet. Elektroder med gull-svart eller karbonoverflater brukes for å minimalisere ikke-spesif ikk katalyse av H202~nedbrytning som forekommer når platina-elektroder brukes.

Denne metode tillater potensielt en økt sensitivitet av påvisning av ligand/anti-ligandbinding av flere størrelsesorden-er som sammenlignes med uforsterket måling. Den totale tid som kreves for å oppnå denne måling bør være kort (omtrent 2 minutter) . Metoden kan også utformes slik at den bruker billige, urisikable kjemikalier. En rekke andre enzymer som produserer gasser, kan på samme måte brukes, og også enzymer som. produserer uløselige presipitater.

EKSEMPEL 6

Hybridisering av prøve-nukleinsyrer (enten RNA eller DNA) til komplementære nukleinsyrer immobilisert på en uløselig matriks, er en vanlig laboratorieprosedyre. Selv om denne prosedyre er høyt spesifikk og følsom, er den relativt vanskelig å utføre, dyr og langvarig, og den kan kreve store mengder av radioaktive reagenser. Påvisning av nukleinsyre-hybridisering ved måling av konduktansforandringer kunne således være anvendbar hvis den kunne utføres hurtig og uten anvendelse av radioaktive markører. I det hypotetiske eksempel nedenfor blir syntetiske homopolymerer av adenylsyre og uridylsyre brukt i modellsystem for å demonstrere dette generelle prinsipp.

Kontroll og test-bioregioner som omfatter nitrocellulose-filtre (5 nm porestørrelse) blir behandlet med henholdsvis poly-uridylsyre og polyadenylsyre. Ureagerte bindingssteder blir blokkert ved tilsetning av 50 Mg BSA eller kalvetymys-DNA til hver bioregion. Et biolag som inneholder bioregionene, blir plassert i IVEP-sensoren, og en strøm av rennende buffer på 60Ml/minutt gjennom hver sensor blir initiert til å etablere en baselinje, ved å bruke passende hybdridiseringsbetingelser av saltkonsentrasjon og temperatur for de spesielle sekvenser og prosesser som skal studeres. En prøve på 1 Mg av polyuridyl-syre i 100 mI rennende buffer blir så tilsatt til apparatet.

En spesifikk nedgang i konduktans i test-bioregionen idet poly-uridylsyre binder seg til den immobiliserte polyadenylsyre, indi-kerer forekomst av hybridisering.

EKSEMPEL 7

I dette hypotetiske eksperiment blir tilstedeværelsen og konsentrasjonen av en spesifikk aminosyre, fenylalanin, på-

vist i en fluidprøve ved å bruke en likevekt, heller enn en kinetisk metode. En "neddyppings"-type av sensorapparat blir brukt, slik som det som er vist i fig. 7B. Apparatet er forbundet med en konduktansbro som den.som er beskrevet i eksempel 9.

Test- og kontroll-bioregionene blir konstruert som følger. For testbioregionen blir Whatman-filterpapir nr. 54 (Whatman Limited, England) aktivert til å binde protein ved behandling med cyanogenbromid. Det CNDr-aktiverte papir blir montert på

en passende holder eller bærer, så utsatt'for én Løsning av"et protein som 1) binder fenylalanin med en affinitetskonstant K som er lik i størrelse med konsentrasjonen av fenylalanin som skal påvises, og som 2) ikke metaboliserer fenylalanin (for eksempel man kunne bruke en fenylalanin-hydroksylase som er blitt mutert for å inaktivere enzymet og, hvis ønsket, for å forandre dets affinitetskonstant). For kontroll-bioregionen blir CNBr-aktivert papir montert i holderen, utsatt for en løsning av et protein som ikke binder eller metaboliserer

fenylalanin (for eksempel kan fenylalanin-hydroksylase som er blitt mutert til hverken å binde eller metabolisere fenylalanin,brukes). Begge bioregioner blir vasket, så blir holderen plassert slik at bioregionene ligger over de sansende midler av apparatet, som danner sensoren. Sensoren blir dyppet inn i 1 ml av en bufret saltvannsløsning, hvis konduktivitet er tilpasset til konduktiviteten i fluidprøven som skal testes, for tilstedeværelse av fenylalanin, og konduktansforholdet av test- og kontrollbioregionene blir målt. Etter at verdien av forholdet er stabilisert, blir 0,1 ml av fluidprøven tilsatt under irøring, og forandringen i konduktansforholdet blir notert. Med én gang forholdet er blitt stabilisert igjen, blir forandringen sammenlignet med en standard-kurve for å tillate bestemmelse av konsentrasjonen av fenylalanin i fluidprøven.

EKSEMPEL 8

En foretrukket utgave av et instrument for måling av den relative konduktans i et testvolum og et kontrollvolum er beskrevet nedenfor. Denne utgave blir brukt når test- og kontrollcellene er elektrisk i serier.

Spesifikt inkluderer instrumentet en krets for måling av den relative forandring i konduktivitet mellom to celler som inkluderer en test-bioregion og en kontroll-bioregion, idet testcelle-bioregion-konduktiviteten forandrer seg som et resultat av ligandmolekyler som binder seg til antiligandsteder i dets bioregion. Instrumentet inkluderer en krets for å drive en strøm gjennom hver av cellene og for måling av spenningsfall over test-og kontrollcellene som funksjon av tiden. Instrumentet er i stand til å måle en forandring på 10 -4 i den relative konduktivitet mellom de to cellene med en nøyaktighet på omtrent 1 %.

Instrumentet inkluderer en to-trinns A.C. analog-til-digital-omformingskrets hvor de initiale konduktiviteter måles via

en suksessiv tilnærmingsprosess, mens de relative konduktiviteter måles i løpet av et testintervall via en ettersporingsteknikk. Kretsen blir kontrollert av en digital-kontrollør som kan variere parametrene av målingsprosessen til å gjøre kretsen tilpasset til måling av en lang rekke stoffer som bruker forskjellige cellekonfigurasjoner og/eller elektrolytter. Dyr kalibrering og diagnostiske egenskaper er gitt for å sikre nøyaktigheten av målingene.

Fig. 14 er et skjematisk diagram av en krets som kan

måle den relative forandring i konduktivitet mellom test- og kontrollcellene. Som i fig. 5B, er motstandene i test- og kontrollcellene representert ved resistorer R x og R c; terminaler V, - er spenningsmålings-terminalene, terminaler C-^ og C2er strøminntaksterminalene, og resistorer Ri - R7 representerer impedansene av fluidkanalene som inkluderer bidrag av fluidimpe-danser, polariseringsimpedanser og andre effekter.

I fig. 14 gir en signalgenerator 2200 et veldig rent sinus-kurve-utgangssignal ved en frekvens på 384 Hz. Mens en høyere frekvens ville gjøre utformingen av målingskretsen mer enkel, blir problemer med opprettholdelse av nøyaktigheten av fire-terminale målinger som kan resultere fra kapasitative effekter og andre feilkilder, minsket med anvendelsen av lavere frekvenser.

Signalgenerator-uttakssignalet blir tilført til terminal

C-^gjennom en av resistorene 2202, 2204 eller 2206, som valgt ved en bryter 2208. I den beskrevne utgave har resistorer 2202,

2204 og 2206 verdier på 5K, 10K og 15 K ohm. Bryter 2208 og resistorer 2202-2206 brukes for å tilpasse uttakssignalet til impedansen til test- og kontrollcellene, avhengig av den anvendte elektrolytt og cellekonfigurasjonen. Selv om bryter 2208 er vist som en manuelt operert bryter i fig. 14, kunne den kontrolleres av en digital-prosessor i alternative utgaver. Signalet ved terminal C]_ blir også tilført til en enhets-vinningsbuffersterker 2210 som gir et bufret uttakssignal EC-^som er likt spenningen ved terminal .

Terminal C2blir drevet ved uttaket av en forsterker 2212. Som diskutert i mere detalj nedenfor driver forsterker 2212 terminal C2slik at spenningen ved C2er lik i størrelse, men motsatt i fase i forhold til spenningen ved terminal C-^hvilket forårsaker at en strøm går fra terminal C, gjennom test- og kontrollcellene til C2, som beskrevet ovenfor i beskrivelsen av fig. 5A og 5B. Støyopptak blir minimalisert ved å gi en "balansert" drivkraft til strømterminalene C-^ og C2.

Spenningen mellom terminaler V-^og V2blir tilført til en høy-inntaks-impedans, differensiell forsterker 2213 bestående av forsterker 2214 og transformatorer 2216 og 2218. Denne krets er diskutert mer detaljert nedenfor i forbindelse med fig. 16. Spenningen over terminaler V3og V"4 blir tilført til en lignende forsterkerkrets 2215, inkludert transformatorer 2236 og 2238 og forsterker 2240. Operasjonen av forsterkerkrets 2215 er lik den til forsterkerkrets 2213. I praksis kan apparatet som inneholder test- og kontrollceller, være i noen avstand borte fra den elektroniske målingskrets. Signalene fra terminaler V, - V4blir tilført til de differensielle forsterkere 2213 og 2215 gjennom skjermete kabler 2220, 2222, . 2232 og 2234.

Terminal er forbundet med signalet eller senterkonduktor av kabel 2220, og signalet ved terminal V-^ blir tilført til en side av den primære vinding av transformator 2216. Signalet på senterkonduktor av kabel 2220 blir tilført til input av en høyimpedans, bufferforsterker 2224 med enhetsvirkning,

som er fysisk lokalisert nær til den elektroniske målekrets. Uttaket av forsterker 2224 er forbundet med skjermingen av kabel 2220 og opprettholder spenningen på skjermingen ved samme nivå som signalet på signalkonduktoren i kabel 2220. Som vist i fig. 14, driver uttaket av forsterker 2224 også en skjerming rundt den primære vinding av transformator 2216 og en avskjerming rundt ledningen som forbinder vindingene av transformatorer 2216 og 2218. Input-bufferforsterker med enhetsvirkning 2226 er forbundet med signallederen av kabel 2222 nær dens forbindelse med transformator 2218. Uttaket av forsterker 2226 driver avskjermingen av kabel 2222. Ved å gi en.aktiv drift for avskjermings-lederen reduseres støyopptak og tap forårsaket av ■ -kåpasitativ lekkasje i kabler 2220 og 2222, minimaliseres.

Avskjermingslederne av kabler 2220 og 2222 kan forbindes med vaktringer i testcellen for å gi videre reduksjon av feil. Dette kan forstås bedre ved å referere til diagrammet av test-og kontrollcelle-konfigurasjonen vist i fig. 8A. Som diskutert ovenfor kan fluid-lekkasje rundt 0-ringforseglingene resultere-

i resistive lekkasjeveier som vil forårsake feil i konduktivi-tetsmålingene. Vaktelektrodene Gl - G4 reduserer eller eliminerer slike feil. Vaktelektrodene blir drevet av signalene på avskjermingen av kablene til hver av terminalene. Motstanden av elektriske veier produsert av lekkasje rundt o-ringene vil være relativt høy. Siden vaktelektrodene opprettholdes ved en spenning som er lik spenningen av de assosierte terminaler V^- V^ved den lave output-impedans av forsterkere 2224 - 2230, vil enhver strøm som går mellom de to cellene, prinsipielt bli gitt

av vaktelektrodene. Dette reduserer eller eliminerer feil som ellers ville være forårsaket av elektrisk lekkasje langs veiene resulterende fra fluidlekkasje rundt o-ring-forseglingene.

Signaler E, og E~fra uttakene av forsterkere 2224 og 2226 er bufrete signaler lik eller omtrent lik spenningene ved terminaler og V,,. Signaler GL^og GI^blir tilført til forsterkere 2224 og 2226 under diagnostiske rutiner for å gjøre lekka-sjestrømmen fra avskjermings- og vaktelektrode-kretsen for hver forsterker i stand til å bli målt, som diskutert nedenfor.

Spenningen over terminaler V., og blir opprettet ved en krets som er lik kretsen beskrevet ovenfor forbundet med terminaler V-j_ og v2>Signalene på terminaler V-, og er forbundet med de primære vindingene av transformatorer 2236 og 2238 ved av-sk jermete kabler ved 2232 og 2234. Signalene på senterlederne av kabler 2232 og 2234 blir tilført til forsterkere 2228 og 2230 som opprettholder avskjermingene av kablene ved et potensial som er lik signalet på den assosierte terminal og som gir bufrete signaler E^ og E^lik spenningene ved terminaler V^og .

Forsterkere 2228, 2230 og 2240, transformator 2238 og den primære vinding av transformator 2236 er i det vesentlige identisk med den tilsvarende krets forbundet med terminaler og V"2med unntak av at terminaler og Vjer forbundet med denne krets med den motsatte polaritet. Med andre ord vil uttakssignalene fra transformatorer 2216 og 2236 produsert av en strøm som går gjennom test- og kontrollcellene, være motsatte i fase fra hverandre.

Som beskrevet ovenfor, er detønskelig å anvende en spenning på terminal C2som forårsaker at signalene ved V-^og V. blir like i størrelse, men motsatte i polaritet. Dette gjøres ved hjelp av en negativ feedback-sløyfe gitt ved forsterker 2212. E^-signalet blir tilført via en resistor 2248 til inntaket av forsterker 2212. E^-signalet blir på samme måte anbrakt på inntaket av forsterker 2212 via en resistor 2250. Forsterker 2212 er en inverterende, AC-forsterker med relativt høy virkningsgrad. I den beskrevne utgave har forsterker 2212 en virkningsgrad på ca.

10 000 ved den opererende frekvens på 384 Hz. E-^og E^-input-signaler tilført til forsterker 2212 er en funksjon av strømmen som blir drevet gjennom test- og kontrollcellene ved forsterker 2212, og kretsen danner en lukket sløyfe-feedback-krets som tvinger signal-nivået ved inntaket av forsterker 2212 til null eller jordpotensial. For at dette skal forekomme måE^-signalet være likt og motsatt E^-signalet, som er denønskede be-tingelse .

Hver av signallederne av kablene kan selektivt forbindes med brytere 2246 og resistorer 2242 til et felles forbindelses-punkt 2244. Selv om det ikke er vist i fig. 14, bør forbindelsen av brytere 2246 til kablene være fysisk nær til inntakene av bufferforsterkere 2224-2230. I den beskrevne utgave har resistorer 2242 hver en verdi på 1 kiloohm. Brytere 2246 er elektronisk kontrollerte brytere. De fire brytere 2246 blir henholdsvis kontrollert av signaler SE, Sp, SGog SH fra digitalkontrol-løren. Brytere 2246 kan selektivt lukkes under diagnostiske rutiner for å gi en kjent resistans mellom signallederne av kablene. Ved å sammenligne spenningene ved terminaler V^- V^med brytere 2246 åpen og lukket, kan lekkasjeveier mellom terminalene bestemmes, som diskutert mer i detalj nedenfor.

Uttaksvinding 2270 av transformator 2216 har 128 omdreininger og har et signal som er proporsjonalt med spenningsfallet over testcellen. Transformator 2236 har multiple uttaksvindinger, hvorav hver gir et signal som er proporsjonalt med spenningstap-et over kontrollcellen. Ved selektivt å forbinde vindingene av transformator 2236 i serier kan uttaket av transformator 2236 måles i forhold til uttaket av transformator 2216.

Transformator 2236 har en 64-omdreinings-uttaksvinding 2272 hvis ene ende er jordet. Den andre ende av 64-omdreinings-vinding 2272 er forbundet med den ene enden av uttaksvinding 2270 av transformator 2216. Transformator 2236 har i tillegg seks binær-belastede vindinger 2274 - 2284 som henholdsvis har 64, 32, 16, 8, 4 og 2 omdreininger. Brytere 2275 til 2285 er enkelt-pol-dobbelttvunnete brytere og er typisk lavstøy FET-brytere som er elektronisk kontrollert. I den foreliggende utgave blir seks signaler S-^- Sg tilført til brytere 2275-2285 ved hjelp av digitalprosessoren for å kontrollere tilstanden av bryterne". Disse brytere blir forbundet med vindinger 2274 - 2284 som vist i fig. 14, slik at enhver kombinasjon av vindingene kan forbindes i serie avhengig av innstillingene av signalene S^-Sg. Således, ved å innstille bryterne S^ - Sg på en passende måte kan et like antall omganger fra 2 til 126 forbindes i serie for å gi et

*1~ ;uttaks-signal som er proporsjonalt med spenningsfallet over kontrollcelle-biolaget og som kan måles over et område på ;1:126. ;Signalene fra de forskjellige uttaksvindingene av de to transformatorer 2216 og 2236 er summert på følgende måte. En ende av 64-omdreiningsvinding 2272 på transformator 2236 er jordet. Den andre ende av vinding 2272 er forbundet med en ende av den enkle uttaksvinding 2270 på transformator 2216. Vindingene er forbundet slik at de to vindingene er forbundet i serie og med samme fase. Den andre ende av vinding 2270 er forbundet med den felles terminal av bryter S.^slik at de valgte vindinger av de binær-belastede vindinger 2274-2284 er forbundet i serier med vindinger 2270 og 2272. Uttaket fra vindinger 2274-2284 er også ;i fase med uttaket fra vinding 2270. Siden, som beskrevet ovenfor input-signalene til transformatorer 2216 og 2236 er motsatte i fase, er uttakssignalene fra de to transformatorer også motsatte i fase. ;Netto-effekten av den ovenfor beskrevne forbindelse er at signalet fra uttaksvinding 2270 er forbundet i serie, og således subtrahert (på grunn av motsatt-fase-uttakene) fra uttakssignalet fra 64 til 190 omdreininger av transformator 2236, avhengig av innstillingene av brytere S-^Sg . Med andre ord, ved å innstille brytere S-^-Sg, på riktig måte, kan uttakssignalet fra transformator 2236 regnes ut slik at det er omtrent likt uttakssignalet fra transformator 2216 for spenningsfall over testcellen som varierer fra ca. 50 til 150 % av spenningsfallet over kontrollcellen. Signalet på linje 2290 representerer den nøyaktige forskjell mellom uttakssignalene fra transformatorer 2216 og 2236. ;Uttaket fra 64-omdreiningsvindingen 2274 blir anbrakt via ;en bufferforsterker 2294 med enhetsvirkning til det analoge inntak av en 14-bit, multipliserende digital-til-analog-omformer (DAC) 2296. DAC 2296 kan være forsynt med, for eksempel, en ICL 7134 integrert krets. 14 digital-inntakssignaler E^-D^ blir tilført til DAC ved digitalprosessoren. I respons til signaler fra digitalprosessoren kan uttaket fra vinding 2272, som er proporsjonal med spenningsfallet over kontrollcellen, måles over et område på 2<14>. Uttaket fra DAC 2296 føres til en motstand 64-til-1-deler laget av resistorer 2298 og 2299. Denne deler måler ;uttaket av DAC slik at én MSB av DAC er ekvivalent med uttaket fra én omdreining av vindingene på transformator 2236. På denne måte tillater de selekterbare uttaksvindinger av transformator 2236 og DAC 2296 at uttaket fra kontrollcellen måles over et 220-bit-område. ;Uttaket fra motstandsdeler 2298-2299 føres til et inntak av en komparator 2292. Det andre inntak til komparatoren velges ved brytere 2287-2290. Disse brytere blir henholdsvis kontrollert av signaler SA~SDfra digitalprosessoren. Ved å stenge bryter SA, forbindes det andre inntak til komparator 2292 til jord; bryter S_, forbinder inntaket til uttaket av 64-omdreinings-vinding 2272; S^til uttaket av to-omdreinings-vinding 2286 og bryter SD til uttaket av serieforbundete vindinger 2270, 2272 ;og 2274-2284, som bestemt ved innstillingene av brytere S-^-Sg. Brytere SA~SCbrukes under kalibrering, og operasjonen av disse brytere er diskutert i detalj i forbindelse med fig. 20-22. ;Under konduktivitetsmålinger er bryter SD stengt for å forbinde det andre inntak til komparatoren til de serieforbundete vindinger 2270, 2272 og 2274-2284. På denne måte blir testcelle-uttakssignalet fra 128-omdreinings-vinding 2270 effektivt subtrahert fra kontrollsignalet som målt over et område på omtrent 0,5 til 1,5, avhengig av signalene S-^-Sg , tilført til. de selekterbare vindinger 2274-2284 . S-^-Sg-signalene blir innstilt av digitalprosessoren slik at kontrollcelleuttaket fra vindingene av transformator 2236 nærmer seg så nær som mulig testcelleuttakssignalet fra transformator 2216. Det første inntak til komparatoren er gitt ved DAC 2296 målt av 64:l-deler 2298,2299. Maksimums uttak fra deleren er lik halvdelen av den minste økning gitt ved innstillingene av bryterne S-^-Sg . ;Således gir kombinasjonen av de seks MSB gitt ved transformator-vindingsbryterne S-^-Sg og 14 LSB gitt ved DAC, en 220-bit omforming av testcellesignalet på en effektiv måte ved å bruke kohtrollcellesignalet som referanse-spenning for omformingen. ;Den beskrevne krets drar fordel av den høye nøyaktighet av presisjonsforhold-transformatoren i bestemmelse av de mest signifikante bit, som ikke forandrer seg ofte, mens de tillater rask oppsporing av det skiftende testcellesignal ved å bruke den multipliserende DAC 2296 for å gi de minst signifikante bits. ;Fig. 15 viser komparatorkretsen i mere detalj. De to inputs til komparator 2292 blir tilført til to, bufferforsterkere 2300 og 2302 med enhetsvirkning, hvis uttak blir tilført til en presisjonsdifferensial-forsterker 2304. Uttaket av forsterker 2304 blir direkte tilført til et inntak av en multiplekser 2324. Uttaket av forsterker 2304 blir også tilført til multiplekser 2324 via to forsterkernivåer 2306 og 2308, hvorav hver har en virkningsgrad på 8 for en total virkningsgrad på 64. ;Et virkningsgrad-kontrollsignal GCl blir tilført til multiplekser 2324 ved digitalprosessoren for å velge en virkningsgrad på 1 eller 64 for uttakssignalet fra forsterker 2304. ;Forsterkernivåer 2306 og 2308,lages av op-amps 2320 og ;2322 forbundet som inverterende forsterkere som vist i fig. 15. Resistorer 2310-2316 velges for å gi en gain på 8 for hvert forsterkernivå. Motsatte dioder 2318 blir forbundet i parallell over feedback-resistoren til det første forsterkernivå 2306 for å begrense uttakssignalamplityden. Selv om det bør velges en virkningsgradverdi som holder operasjonen av forsterkernivåene 2306-2308 og den følgende krets i den lineære region, kan støy-topp være til stede. Hvis slike topper skulle drive noe av kretsen i komparator 2292 til metning, kunne det resultere i store feil. Dioder 2318 tjener til å undertrykke enhver slik støytopp. ;Uttaket av multiplekser 2324 blir tilført via bufferforsterker 2326 til en AC-båndpass-filterkrets. Det er viktig at filterkrets 2328 har en høy svekking av frekvenser som er fjernet fra signalfrekvensen på 384 hZ, mens den opprettholder en veldig flat fasekarakteristikk. Én krets som er egnet som tilbehør til filter 2328 er bi-kvad-forsterkerkretsen beskrevet i en søk-nad for "Bandpass Amplifier Filters" (innlevert 24. september 1982, søknad nr. 422 732 av N. Brown. Andre kretser kjent for fagmenn, på området kan .også brukes som tilbehør til filter 2328. ;Uttaket av filter 2328 blir tilført til et inntak av en multiplekser 2330. Andre signaler tilført til multiplekser 2330 inkluderer E1- E4~signalene, representative for spenningene ved terminaler V-^- V"4, EC^og EC^-signalene, representative for spenningene ved strømterminaler C-^ og C2/ Fl og F2-signalene, representative for strømmen i hver av test- og kontrollcellene, ;og jord. Multiplekser 2330 forbinder normalt uttaket av filter 2328 til inntaket av forsterkernivået 2334 når kretsen måler ;konduktansen av test- eller kontrollcellene. Digitalprosessoren gir det passende SEL-inntak til multiplekser 2330 for å måle de andre signaler tilført til multiplekseren for kalibrerings-og diagnostiske formål, som diskutert nedenfor. Det bør nevnes at signalene tilført til multiplekser 2330 er AC-signaler som må demoduleres før de måles. ;Uttaket av multiplekser 2330 blir tilført til ikke-inverterende input av en op-amp 2332 av forsterkernivå 2334. En feedback-resistor 2336 blir forbundet mellom uttak og inverterende inntak av op-amp. En annen resistor 2338 blir forbundet med det inverterende inntak av op-amp og blir også selektivt forbundet med jord gjennom en bryter 2340. Forholdet mellom motstandene 2336 og 2338 er 8 til 1. Ved å stenge bryter 2340, kan en virkningsgrad på 1 eller på 8 velges for forsterkernivået 2334. Bryter 2340 er typisk en lavstøy FET-bryter som kontrolleres av et signal GC2gitt av digitalprosessoren. ;Uttaket fra forsterker 2334 blir tilført til et inntak av en demodulatorkrets 234 2 direkte, og til et annet inntak av demodulatoren via et inverterende forsterkernivå 2344 med enhetsvirkning, laget av op-amp 2350.og resistorer 2346 og 2348. Demodulator 2342 kan for eksempel utstyres med en AD-534L balansert multiplier-krets. Inverterende forsterker 2344 gir et signal som er likt signalet fra forsterker 2332, men 180 grader ute av fase. Dette signal blir tilført til det andre inntak av den balanserte demodulator. Det er ønskelig å bruke en balansert ty-pe demodulator for å gi et så stabilt signal som mulig ved de-modulatoruttaket. Uttakssignalet fra demodulatoren representerer verdien av forskjellen mellom test- og kontrollcellespenningene. ;Referanse-inntakssignalet til demodulator 2342 blir valgt ved en multiplekser 2352. Signalet fra multiplekser 2352 er et referanse-klokkesignal fått fra signalgenerator .2200 som brukes for å demodulere AC-signalet tilført til de balanserte inntak til demodulatoren. Et 0-grad-referansesignal tatt direkte fra signalgeneratoren, blir tilført til et inntak av multiplekseren. Dette signal blir normalt brukt for å demodulere inntaket til demodulatoren, som diskutert nedenfor, når konduktiviteten av kontroll- og testcellene blir målt. ;Selv om i teorien signalene tilført til komparatorkretsen 2292 bør være nøyaktig i fase med uttakssignalet fra signalgenerator 2200, kan små faseforskyvningsfeil innføres ved ved-heftende impedanser i kretsen og andre feilkilder. Disse fase-feil kan forårsake feil i amplityden av det demodulerte signal, siden referansesignalet ikke lenger vil være nøyaktig i fase med signalet som skal demoduleres. To andre referansesignaler kan velges ved multiplekser 2352 som tillater at slike feil blir målt slik at det kan gjøres en god kompensasjon. ;Et annet signal blir tilført til multiplekseren ved å begrense forsterker 2354. Dette signalet er utformet som det tilfeldige referansesignal, siden dets faseforhold til klokke-signalet ikke er nøyaktig kjent. Uttaket fra multiplekser 2330, som er signalet som skal demoduleres, blir tilført via kondensator 2360 og resistor 2358 til et inntak av en op-amp 2354. ;To motsatte dioder 2356 er forbundet mellom inntaket av op-amp og jord for å begrense inntaksspenningen til op-amp. op-amp blir operert på en åpen sløyfe-måte og gir ved sitt uttak et kvadratisk bølgesignal i fase med uttaket fra multiplekser 2330. Ved å demodulere uttaket fra multiplekser 2330 med dette signal, kan magnityden bestemmes uavhengig av alle ukjente faseforskyv-ninger som den forrige kretsen kan ha innført. ;Et tredje signal blir tilført til multiplekser 2352 fra ;en 90-grads faseforskyvningskrets 2362. O-gradsreferansen blir tilført til inntaket av 90-grads-faseforskyvningskrets 2362. Faseforskyver 236 2 gir en nøyaktig 90-graders faseforskyvning til 384 Hz-inntakssignalet og gir et referanse-klokkesignal i fasekvadratur til O-grads-signalet. I løpet av diagnostikk kan inntaket til demodulatoren demoduleres ved å bruke de. tilfeldige og 90-graders-referansesignaler såvel, som O-graders-referansen for å påvise nøyaktig den kvadratiske komponent introdusert til signalet som skal måles fra test- og kontrollcellene. Digitalprosessoren kan bruke denne informasjon for å sikre at den kvadratiske feil ikke er så stor at den resulterer i feilaktige målinger og eventuelt til å korrigere den målte konduktivitetsverdi, hvis slike korreksjoner trengs. ;Uttaket fra demodulatoren blir tilført til en presisjons-tilbakestillings-integratorkrets 2364. Integrator 2364 blir utstyrt ved å bruke en presisjonsforsterker 2372 med høy virk ningsgrad, inntaksresistor 2368 og integrerende kondensator 2366. Kondensator 2366 bør være en polypropylen eller en annen lignende type kondensator som har høy stabilitet. Typiske verdier for resistor 2368 og kondensator 2366 er 100 kilo-ohm og 1,0mikrofarad. En elektronisk bryter 2370 er forbundet over kondensatoren og kontrolleres ved hjelp av et integratortilbake-stillingssignal IR. ;En annen bryter 2378 er forbundet i serie med inntaket til integratoren og kontrolleres ved hjelp av et invertert IR-signal fra en omformer 2380. Således, når IR-signalet er inaktivt, er bryter 2370 stengt for å tilbakestille integratoren mens bryter 2378 kobler ut inntakssignalet til integratoren.. Når IR-signalet blir aktivt, blir inntakssignalet tilført til integratoren og tilbakestillingsbryteren 2370 blir åpnet, hvilket gjør det mulig for integratoren 2364 å integrere og filtrere uttakssignalet fra demodulatoren. ;Uttakssignalet fra demodulatoren blir koblet til inntaket av en A/D-omformer 2376. Omformer 2376 kan utstyres for eksempel ved hjelp av en AD574AJD 12-bit-bipolar A/D-omformerkrets fabri-kert av Burr Brown. Denne omformer utfører en omforming på omtrent 25 mikrosekunder, som er så å siøyeblikkelig i forhold til forandringsgraden av uttaket fra integrator 2364. A/D omformer 2376 kontrolleres av signaler til og fra digitalprosessoren, representert ved CTL signalene til og fra omformeren 2376 i fig. 15. Digitaluttaksverdiene blir avlest ved hjelp av digitalprosessoren etter at hver omforming er utført. ;Som vil bli mere klart etter å ha lest diskusjonen av mål-ingsprosedyrene forklart nedenfor i sammenheng med fig. 20-23, tillater den foreliggende oppfinnelse at det gjøres en veldig støymåling av test- og kontrollcelle-konduktivitetene som bruker en metode som i det vesentlige ikke krever noen innstillings-tid i løpet av perioden hvor kretsen måler forandringen i konduktivitet i testcellen. Videre gir den endelige tidsintegrering gitt ved integratorkrets 2364 , nær til optimal filtrering av støy som kan være til stede i signalene fra cellene. ;Fig. 16 viser videre detaljer av inntaksforsterkerkrets 2213 forbundet med terminaler V., og V2. Operasjonen av f orster-kerkrets 2215 forbundet med terminaler V3 og V4er ..lik, med unntak av at transformator 2236 har multiple sekundære vindinger, mens transformator 2216 har en enkelt sekundær vinding, som diskutert ovenfor. For å opprettholde nøyaktighet er det viktig at uttakssignalene fra transformator 2216 har et nøyaktig forhold til signalene fra transformator 2236. Veid å bruke presi-sjons-forhold-transformatorer for transformatorer 2216 og 2236 kan uttaksspenningene fra de forskjellige vindinger gjøres nøy-aktig til bedre enn én del av 10 . ;I fig. 16 har transformator 2218 en inntaksvinding med to elektriske inntak for å gi tre vindingssegmenter 2402, 2404 og 2406 som har henholdsvis 165, 125 og 235 omdreininger, og en enkelt 1650-omdreiningsuttaks-vinding 2408. Transformator 2216 er en presisjonsforhold-transformator og har en 224-omdreiningsinntaksvinding 2424, en 128-omdreinings-uttaksvinding 2410, diskutert ovenfor i forbindelse med fig. 14, og tre enkelt-omdreinings-uttaksvindinger 2412, 2414 og 2416. En ende av vinding 2416 er forbundet med det nedre elektriske inntak av transformator 2218 via en bryter 2422. På samme måte er de to elektriske uttak til forbindelsene mellom vindinger 2412 og 2414 selektivt forbundet med de to inntak på vinding 2218 via brytere 2418 og 2420. En av bryterne 2418 til 2422 er stengt under operasjonen for å velge virkningsgrad av forsterkernivået. Impedansen over vindingene av transformator 2218 er mye større enn impedansen over enkelt-omdreiningsvindinger 2412-2416, og transformator 2218 sikrer at en høy nok impedans blir gitt til sensorene. Transformator 2218 tjener også til å isolere de fire elektroder fra den analoge jord. ;De sekundære vindinger av transformator 2218 er forbundet med inntaket av en AC-forsterker 2214. Forsterker 2214 har en veldig høy virkningsgrad ved operasjonsfrekvensen på 384 Hz, typisk av størrelsesorden 100,000, mens den opprettholder en veldig stabil faseforskyvning. Uttaket av forsterker 2214 er forbundet med inntaksvindingen 24 24 som har 224 omdreininger, på transformator 2216. Inntaket av forsterker 2224 er forbundet med linjen som går til terminal V^. Dens uttak er forbundet med avskjermingene av kablene som gir inntaket til transformator 2218. Disse avskjerminger inkluderer avskjermingen av linje 2220 og avskjermingene av hver av enkelt-omdreiningsvindingene 2412-2416. Avskjermingen av linje 2222 til terminal V2 er på samme måte drevet av forsterker 2226, ikke vist i fig. 16. ;I ! I ;Inntaksvindingene 402-406 av transformator 2218 er avskjermet, ;og denne avskjerming er også forbundet med og drevet av forsterker 2226 . ;Forsterker 2213 tjener til å gi en høy impedans over terminaler V-^ og V"2 og gir også en relativt høy impedans til inntaket av forsterker 2214. Virkningsgraden av forsterker 2213 bestemmes ved hjelp av forholdet mellom enkelt-omdreiningsvindinger 2412-2416 til uttaksvindinger 2410, og er således veldig nøyaktig og stabil. Dette gjøres på følgende måte. ;Forbindelsen fra uttaket av forsterker 2214 gjennom transformatorer 2216 og 2218 tilbake til inntaket av forsterker 2214 gir negativ feedback. På grunn av den høye virkningsgrad av forsterker 2216 gjør den negative feedback input til forsterker 2214 til en virkelig jord. Spenningen over uttaksvindingen av transformator 2218 må derfor være så å si null, og således må spenningen over den valgte inntaksvinding av transformator 2218 også være null. Siden spenningsfallet over inntaksvinding 2402-2406.til transformator 2218 og enkelt-omdreiningsvindingene 2412-2414 må være lik spenningen over terminaler V^og V2, viser så å si hele spenningsfallet over V^og V2seg over enkelt-omdreiningsvindingene 2412-2416. Virkningsgraden fra linjer 2220 og 2222 (forbundet med inntakene til forsterker 2213) til uttaksvinding 2410 blir hovedsakelig bestemt bare ved forholdet mellom antall vinninger valgt av brytere 2418-2422 og 128-omdreinings-uttaksvinding 2410. Ved selektivt å stenge bryterne 2418-2422 kan virkningsgraden av 128, 128/2 og 128/3 bli valgt. Brytere 2418-2422 og de forskjellige uttak på transformatorer 2216 og 2 218 muliggjør at en relativt konstant inntaksimpedans til forsterker 2214 kan opprettholdes når forsterkervirkningsgraden forandres. ;Fig. 17 viser en krets som er egnet for forsterkere 2224, 2226, 2228 og 2230 som driver avskjermingene av.kablene til terminaler V^-V^og vaktelektrodene. Inntakssignalet blir tilført til det ikke-inverterende inntak av en op-amp 504. gjennom en kondensator 502. op-amp 504 kan utstyres med LF356-forsterkere. Uttaket av op-amp 504 er forbundet med dens inverterende inntak for å gi en enhets-virkningsgradforsterker. To høyverdi-resistorer 506 og 508 er forbundet i serie mellom det ikke-inverterende inntak til op-amp og jord for å gi et DC-referansenivå ved inntaket. En kondensator 508 forbinder forbindelsen av resistorer 506 og 508 med op-amp-uttaket. ;Uttaket fra op-amp er forbundet gjennom en kondensator 512 og en resistor 510 i parallell med bryter 514 for å gi forsterkernivå-uttaksignalet. Resistor 510 er typisk 1 kilo ohm. Bryter 514 er en elektrisk kontrollert bryter slik som FET-bryter og er normalt stengt under konduktivitetsmålinger. Under diagnostiske rutiner gir prosessoren et vaktlekkasjemålings-signal GL som åpner bryter 514, idet det setter resistor 510 i serie med uttakssignalet til avskjermingene og vaktelektrodene. Hvis det ikke er noen lekkasjestrøm som- flyter fra vakt- og av-sk j ermingskretsen, vil E-j^ til E^spenninger forbli den samme når bryter 514 er stengt. Hvis det er noen signifikant lekkasje-strøm, vil lekkasjestrømmen forårsake et spenningsfall over resistor 510. Ved å måle E, til E^spenninger med brytere 514 stengt og åpne, kan lekkasjestrømmen i hver avskjermings- og vaktelektrodekrets bestemmes. ;Fig. 18 er et skjema over en AC-forsterkerkrets som kan brukes for AC-forsterker 2212. Kretsen består av fire 5532 op-amps 641-644 forbundet som et bi-kvad-forsterker/filter som vist i fig. 18. Denne forsterker-konfigurasjon er beskrevet mer helhet-lig i en søknad for. "Bandpass Amplifier Filters", innlevert 24. september 1982, nr. 4 22 732. Kretsen gir en åpen-sløyfe-virkningsgrad på ca. 30 000, mens den opprettholder en veldig stabil null-faseforskyvning, karakteristisk rundt operasjonsfrekvensen på 384 Hz. Typiske verdier for komponentene vist i fig. 18 er som følger: 602 100 ohm 618 4,99 K ;604 10 K 630 0,0082 mft ;606 150 K 632 . 0,002 mft ;608 10 K 634 2,2 mft 610 1 K 641 5532 ;612 10 K 642 5532 ;614 51 K 643 5532 ;616 49,9 K 644 5532 ;Kretsen med AC-forsterkere 2214 og 2240 kan utstyres ved hjelp av en to-trinns bi-kvad-forsterkerkrets. En slik krets som er egnet for anvendelse med den beskrevne utgave og som inkluderer kompensering for DC-balanserte feil, er vist i den ovennevnte patentsøknad for "Bandpass Amplifier Filters" i fig. ;8 og 9 i denne. ;Fig. 19 er et skjematisk diagram over en krets for utstyret av den 90 graders faseforskyver 2362. Inntakssignalet til fa-seforskyvningskretsen blir tilført gjennom serie-forbundet kondensator 708 og resistor 702 til det omformende inntak av en op-amp 714. Det inverterende inntak av op-amp er jordet. En resistor 704 og kondensator 712 er forbundet i parallell mellom uttaket og det inverterende inntak til op-amp 714. En op-amp 716 er forbundet som en bufferforsterker med enhetsvirknings-grad. Uttaket av op-amp 714 blir tilført til inntaket av den sekundære op-amp 716 via en resistor 706. En kondensator 710 er forbundet mellom inntaket til op-amp 716 og jord. Typiske verdier for komponentene i fig. 19 er som følger: ; Fig. 20 til 22 er strømdiagrammer som viser trinnene og metodene utført ved digitalprosessor-kontrollapparatet for å ut-føre en konduktivitetsmåling. Det blir antatt at cellene og reservoaret i apparatet i starten er fylt med elektrolytt, at løs-ningen flyter gjennom systemet og at materialet som skal analyseres ennå ikke er blitt tilsatt til elektrolytten. Fig. 20A viser de start-diagnostiske rutiner utført av instrumentet før den gjør konduktivitetsmålinger. Først star-ter prosessoren opp maskinen hvilket inkluderer innstilling av alle brytere og hvis strømmen, er under kontroll av prosessoren, ;blokk 801. Brytere S_ - *-S„ blir alle satt i sin åpne posisjon.

Ej ti

Bryter GC2blir satt til høyvirkningsgrad-posisjonen og det tilfeldige referansesignal blir valgt ved multiplekser 2352 for ut-gangsmålingene hvorunder størrelsen av forskjellige signaler blir målt.

Deretter måler instrumentet verdiene av EC^og EC2/og gjennom E^. Digitalprosessoren gjør dette ved å sende signaler til multiplekser 2330 som sekvensielt tilfører hvert av disse signaler til inntaket av forsterker 2332 og så måles spenningen, blokk 803. For hvert signal sjekker prosessoren for å sikre at hver av disse spenningene er innen de forutbestemte grenser, blokk 805. Hvis ikke går prosessoren til en feilrutine, av-merket ved grenpunkt E, hvor et passende feilbudskap blir ført ut til operatøren og målingsprosessen blir avbrutt.

Fig. 20B er et kort flow-diagram over hvordan spennings-målingene lages under den diagnostiske rutine, slik som de som blir utført i blokk 803. Først blir multiplekser 2330 beordret til å velge det egnete signal blokk 813. Deretter blir IR-signalet satt høyt for å tilbakestille integratoren, blokk 815. Prosessoren venter i minst 1 millisekund for å tillate at inte-gratorkondensatoren utlader fullstendig. IR-signalet blir så satt lavt for å starte integreringen av det demodulerte signal, blokk 817. Prosessoren venter i en forutbestemt tid, blokk 819, og befaler så A/D-omformeren å omforme og måle uttaksspenningen fra integratoren, blokk 8 21.

Idet vi går tilbake til fig. 20A, hvis spenningene målt under blokk 805 er innen de riktige grensene, går prosessoren videre med å bestemme strømmen gjennom cellene. Dette gjøres ved å måleECspenningen ved uttaket av signalgenerator 2200,

0

blokk 821. Prosessoren regner sa ut verdien av cellestrømmen fra verdiene av EC^, ECQog signalgenerator-motstanden valgt av SD, blokk 823.

Deretter sjekkes prosessoren impedansene mellom terminaler V-^og V 2~ Dette blir begynt ved å stenge brytere SE og Sp, blokk 831, som forbinder de to 1-kilohm resistorer 224.2 mellom terminaler V-j^ og V"2. Deretter blir E1og E2målt, blokk 833. Fra den tidligere utregnete verdi av strømmen og verdiene av E^og med og uten resistorerie 2242 forbundet,.blir impedansen mellom terminaler V, og V"2regnet ut, blokk 835.. Denne verdien blir så sjekket mot dens grenseverdier, blokk 837.

Hvis impedansen er innen grensene, blir brytere SE og SF åpnet, blokk 839, og prosedyren ovenfor blir gjentatt for å må-le impedansen mellom terminaler. V2og V"3, blokk 841-849, og mellom V'3og V4, blokk 851-859.

Deretter blir vaktelektrode-lekkasjestrømmene sjekket, blokk 871-877. Først blir brytere GL^til GL^ stengt, blokk 871, og spenninger E-j^til E^blir målt med resistorene 510 vist i fig. 17 i serie med vaktelektroden. Fra forandringen i hver av spenningene til E^med og uten resistorer 510 i serie med vaktelektrodene, blir lekkasjestrømmen for hver av de fire linjene regnet ut, blokk 875, og sammenlignet mot gren-severdiene, blokk 877.

Hvis strømhastigheten blir sjekket, gjøres dette deretter, blokk 881-887. Hvis nødvendig blir strømmålingsapparatet i-standsatt ved FE-signalet, blokk 881. Strømsignaler Fl og F2 blir så målt, blokk 883-885, og sjekket mot sine grenseverdier, blokk 887.

For å avslutte den diagnostiske rutine blir det laget en sjekk for å sikre at signalene fra cellene er i riktig fase, blokk 891-899. Denne sjekk sikrer at en kort eller annen mål-funksjon ikke har forskjøvet fasen til et av signalene fra terminaler Vi-V4"De tidligere målinger av E-^-E^ble gjort med den tilfeldige referanse valgt av multiplekser 2352 for demodu-leringen. Først befaler prosessoren multiplekseren 2352 å velge O-gradsreferanse-signalet, blokk 891. Verdiene av E^-E^blir såmålt, blokk 893. Multiplekseren blir så befalt å velge 90-graders referansen, blokk 895. Verdiene av E^-E^blir så målt, blokk 897. Til slutt blir de målte verdier sjekket for å sikre at signalene fra terminaler er innen tillatte grenser, blokk 899. Hvis så, fortsetter prosessoren videre til kalibreringsrutinene, blokk 900.

Fig. 21 viser kalibreringsrutinene. Først blir null-balansefeilen til DAC 2296 målt, blokk 901-915. Først blir multiplekser 2330 befalt å velge EM-signalet for måling, blokk 901, og multiplekser 2352 blir befalt å velge 0-gradklokke-signalet som det demodulerende signal, blokk 903. Begge virk-ningsgradkontrollsignaler GC-^og GC2blir innstilt til høyvirk-ningsgradnivå, blokk 905. Bryter SA blir stengt for å gi en jord-referanse til ett inntak av komparator 229 2, blokk 907. Deretter blir alle digitalinntakene D1~D14til DAC 2296 innstilt til null, blokk 909. Den differensielle inntaksspenning til komparator 2292 ved dette punkt er forskjellen mellom jord og null-uttaksspenning fra DAC 2296. Denne spenning blir målt, blokk 911, og null-balansefeilen fra DAC 2296 blir regnet ut, blokk 913. Denne verdi blir sjekket mot dens grenseverdi, blokk 915. Hvis feilen er innen akseptable grenser, blir den balanserte feilverdi lagret og brukt til å korrigere senere målinger.

Deretter blir. A/D-omformeren kalibrert til å bestemme uttaket fra A/D-omformeren som er ekvivalent med 1 omdreining av de sekundære vindinger på transformator 2236. Med virkningsgraden fortsatt på høy og DAC-uttaket fortsatt på 0, blir bryter SA åpnet og bryter Sc stengt for å forbinde uttaket fra de to omdreiningsvindingene 2286 til målingskretsen, blokk 921. Spenningen blir målt, blokk 923, og virkningsgraden fra inntaket av komparator 2292 gjennom A/D-uttaket blir regnet ut, blokk 925.

Deretter blir reduksjonsfaktorene for virkningsgraden kontrollert av GC-^ og GC2, regnet ut. Først blir bryter Scåpnet og bryter SB stengt, blokk 927. Inntaket til komparatoren er nå nøyaktig 32 ganger større, på grunn av nøyaktigheten av uttakene fra transformator 2236. Prosessoren innstiller så GC-^

og GC2signalene til å velge høy virkningsgrad, blokk 9 29. Spenningen blir målt, blokk 931, og forholdet mellom de to virk-ningsgradinnstillingene blir regnet ut og lagret, blokk 935.

Virkningsgraden av DAC 2296 og motstandsdeler 2298-2299

blir så kalibrert. Bryter S B blir åpnet og bryter S_ blir stengt for å forbinde 2-omdreiningsvinding 2286 til komparator, blokk 943. Prosessoren innstiller alle D^-D^ inntak til DAC 2296 høyt, blokk 945. Spenningen blir så målt, blokk 947.

Ved å sammenligne denne spenningen med spenningen målt i blokk 923, kan virkningsfaktoren av DAC og 64:1 motstandsdeléren regnes ut, blokk 949. Dette fullfører kalibreringsrutinen. De forskjellige korreksjonsfaktorer bestemt under kalibreringen blir brukt til å bestemme de aktuelle spenninger fra de målte spenninger i målingsrutinene beskrevet nedenfor.

Figurene 22A og 22B viser rutinen hvorved konduktivitets-forandringene måles. Først blir en startrutine, vist i fig.

22B, utført for raskt å innstille bryterne S-^-Sg og DAC til deres startverdier. For å gjøre dette blir bryter Scåpnet og bryter SD blir stengt for å måle spenningen fra serieforbindel-sen av vindinger 2270, 2272 og 2274-2284, blokk 1001. Di~ Di^ inntakene til DAC blir innstilt på null, blokk 1003, og brytere S,-S, blir innstilt til å deselektere alle seks av de selekterbare Ib

vindinger av transformator 2236, blokk 1007.

Ved dette punktet er signalet som er tilført til målekret-sen forskjellen mellom test- og kontrollcelle-spenningene.

Denne spenningen vil være en temmelig stor verdi på grunn av forskjellene mellom bioregionene med og uten antiligander i matriks, eller på grunn av andre forskjeller mellom symmetrien av de to fluidkanaler. På grunn av dette blir virkningsgraden innstilt på den lave verdi, blokk 1007, for å forhindre metning av målingskretsen. Spenningen blir så målt, blokk 1009. Fra denne måling, som korrigert ved faktorene bestemt under kalibrering, regner prosessoren ut de riktige innstillingene for brytere S^Sg og de to MSB av DAC 2296 , blokk 1011 og 1013.

S1~S60<3 MSB Dl og D2klir innstilt ved hjelp av prosessoren, blokk 1015 og 1017. Virkningsgraden blir innstilt på høy, blokk 1019, og spenningen blir igjen målt, blokk 1021. Prosessoren regner så ut verdien av de tolv LSB av DAC, blokk 1023, og prosessoren innstillerDAC-linjer D3~D^4til disse verdier, blokk 1025. Ved dette punkt bør forskjellen mellom spenningene til komparator 22 92 være mindre enn én LSB av DAC-uttaket. Prosessoren går så til ettersporingsrutinen vist i fig. 22B.

I begynnelsen av ettersporingsrutinen blir fluidprøven som skal analyseres, tilsatt til elektrolytten, blokk 1041. Dette kan gjøres under kontroll av prosessoren eller manuelt som svar på et signal fra prosessoren.. Så blir integratoren tilbakestilt. Først innstiller prosessoren IR-signalet på et høyt nivå for å tilbakestille integratoren, blokk 1045. Prosessoren venter en kort periode på omtrent 1 millisekund for å tillate at integrator-kondensatoren lader ut fullstendig, blokk 1045. Prosessoren innstiller så IR-signalet lavt, blokk 1047, for å begynne integreringen av spenningen som skal måles.

Integratoren tillates å integrere i en valgt tidsperiode, blokk 1049, fra 50 til 500 millisekunder. Ved slutten av inte-greringsperioden befaler prosessoren D/A-omformeren å gjøre en omforming, blokk 1051. Omformingen tar omtrent 225 mikrosekunder, som så å si er øyeblikkelig i forhold til hastigheten for forandring av integrator-output-signalet. A/D-digital-output blir lagret for senere prosessering, blokk 1053.

Deretter sjekker prosessoren for å se om A/D-omformeren

nærmer seg grensene for sitt dynamiske område, blokk 1055.

Hvis ikke går prosessoren tilbake til blokk 104 3, og prosessen ovenfor blir gjentatt. Hvis A/D nærmer seg grensene for sitt måleområde, regner prosessoren ut nye innstillinger for brytere S1~S6°9/eller DAC inntak Dx~Di4som vil9^ tilbake til spenningen målt av A/D omformeren til senteret av dets måleområde, blokk 1057, og disse verdier blir sendt til bryterne og DAC, blokk 1061. Prosessoren går så tilbake til blokk 1043 og prosessen ovenfor blir gjentatt.

EKSEMPEL 9

En annen utgave av kretsen av et instrument for

måling av den relative konduktans av et testvolum og et kontrollvolum er vist i fig. 23. Denne krets ble brukt til å lage målingene i flere av eksemplene fremsatt i den foreliggende patent-søknad, som nevnt. Kretsen i fig. 23 er i mange henseender lik kretsen i fig. 8, og forklaringen nedenfor vil peke på forskjellene mellom kretsen i fig. 23 og kretsen som allerede er diskutert .

Kretsen i fig. 23 er utformet til å arbeide med en test- og kontrollcellestruktur hvor hver celle har sin egen strømvei, slik som apparatet i fig. 5D, som gir individuelle strømelektro-depar for testcellefluidveien og kontrollcellefluidveien.

Disse elektroder er vist skjematisk i fig. 5D ved elektroder

146 og 148 for testcellen og elektroder 150 og 152 for kontroll-cellen. Kretsen i fig. 23 virker også med et apparat slik som det i fig. 5C, hvor test- og kontrollcellene har felles strøm-elektrodé 144.

I fig. 23 tilfører en signalgenerator 1200.et sinusbølge-signal til en inntaksvinding 1201 av en transformator 1202 via en kondensator 1203. I denne utgave er frekvensen av signalgenerator 1200 3 kHz. Transformator 1202 har to identiske uttaksvindinger 1204 og 1205. Vinding 1204 har fire elektriske uttak, og uttaket blir tatt fra et av disse punkter via en 4-pol-bryter 1206. Den primære vinding av transformator 1202 har 140 omdreininger på en supermalloy-toroidal-kjerne, og hvert av uttakene på sekundære vindinger 1204 og 1205 er enkeltomdrei-ningsvindinger. De to sekundære vindinger gir individuelle strømkretser for test- og kontrollcellene.

Uttaket fra et av punktene på vinding 1204 som valgt ved bryter 1206, blir tilført en ende av inntaksvindingen 1212 av en transformator 1210. Den andre enden av vinding 1212 er forbundet til den første spenningsmålingsterminal av testcellen. Test- og kontrollcellemotstander er betegnet med henholdsvis Rx og R . Den andre spenningsterminal V„ av testcellen er forbundet med den felles ende av vinding 1204.

Transformator 1210 har en 600-omdreinings sekundær vinding 1214 som driver en tonet AC-forsterker 1216 med høy virkningsgrad. Forsterker 1216 er lik AC forsterkeren vist i fig. 18, men modifisert til å virke ved 3 kHz-senterfrekvensen. Uttaket av forsterker 1216 driver en 112-omdreiningsinntaksvinding 1218 til transformator 1220. Transformator 1220 er en presisjons-forholdtransformator. En 64-omdreinings-feedback-vinding 1214 er forbundet i serie med en variabel resistor 1226 til de to strømelektrodene C^ og C2<En 64-omdreinings-uttaksvinding på transformator 1220 gir et uttakssignal.

Transformatorer 1210 og 1220 og forsterker 1220 er forbundet for å gi en negativ feedback-sløyfe. På grunn av den høye virkningsgrad av forsterker 1216 og den negative feedback gitt gjennom transformatorene, kan inntaket til forsterker 1216 be-traktes å være faktisk en kort krets, og spenningsfallet over vinding 1212 er så å si null. Således er spenningen over terminaler og V2nesten lik spenningen fra transformatorvinding 1204. Feedback-vinding 1224 driver en strøm gjennom resistor 1226 og testcellemotstanden Rx for å opprettholde spenningsfallet over spenningsterminalene V-^og V2lik drivspenningen fra vinding 1204. Strømmen gjennom og spenningen over testcellen er bestemt av innstillingen av bryter 1206 og verdien av variabel resistor 1226. Verdien av resistor.1226ier.mye større.enn testcelleimpedansen for å opprettholde et relativt konstant im-pedansnivå idet testcelleimpedansen forandrer seg. Resistor 1226 er av størrelsesorden 20-50 kilohm. Resistorer 1226 og 1246 er justert til å få et ønsket signalnivå.fra forsterkerne slik at den følgende krets ikke mettes og for å være tilpasset amplitydene av uttakene fra test- og kontrollcellene.

Kontrollcelle-spenningsterminaler V^ og V^og strømtermi-naler C^og C^er drevet av og forbundet med en krets som er identisk til kretsen beskrevet ovenfor i forbindelse med testcellen, inkludert transformatorvinding 1205 med elektrisk uttak, transformatorer 1230 og 1240 og forsterker 1236.

Transformatorer 1220 og 1240 er analoge med transformatorer 2216 og 2236 vist og beskrevet ovenfor i referanse til fig. 14. Transformator 1220 har en enkelt 64-omdreinings-uttaksvinding 1222 som gir et signal som er representativ for spenningsfallet over testcelleimpedansen. Transformator 1240 har en 32-omdreiningsvinding 1250 og seks binærbelastede vindinger 1252 som har henholdsvis 32, 16, 8, 4, 2 og 1 omdreining. Seks brytere 1254 forbinder selektivt vindinger 1252 i serie med en 64-omdreinings-uttaksvinding fra transformator 1220 og en fiksert 32-omdreinings-vinding 1250 på transformator 1240. Disse vindinger tillater kontrollcelleuttaket å bli målt over et område på omtrent 0,5 til 1,5 ganger testcelleuttaket, avhengig av innstillingen av bryterne 1252, med en presisjon på 6 bits.

Serieforbindingen og fasen av disse vindinger subtraherer effektivt kontrollcelle-uttakssignalet, som målt ved innstillingene av brytere 1254, fra testcelle-uttakssignalet. Dette differansesignal er over linjene 1253 og 1257 og blir tilført til komparatorkrets 1280 via en autotransformator 1278, som forklart nedenfor. Operasjonen av kretsen i komparator 1280

er lik komparatorkretsen vist og beskrevet i fig. 15.

Brytere 1254 gir seks bits av målingsområdet. 14 tilleggs-bits for måling er gitt ved en 14-bit multipliserende DAC 1260 på en måte lik den i fig. 14. DAC 1260 kan utstyres med en ICL 7134U unipolar D/A integrert krets. Uttaket fra en uavhengig 32-omdreiningsvinding 1256 blir tilført til inntaket av DAC 1260. DAC 1260 blir kontrollert ved digitalprosessoren, på samme måte som DAC 2296 i fig. 14. Uttaket fra DAC 1260 blir tilført via et motstandsnettverk inkludert resistorer 1262-1268 og en kondensator 1276 til en bufferforsterker 1270 med enhetsvirkning.

Uttaket fra buffer 1270 blir tilført til én ende av auto-transf ormator 1278. Den andre enden av auto-transformatoren 1278 er jordet. Omdreiningsforholdet av de to seksjoner av auto-transformatoren er 128 til 2. Dette måler uttaket av DAC 1260 ved en faktor på 64 slik at én MSB fra DAC er ekvivalent med uttaket fra en 1 1/2 omdreiningsvinding på transformator. 1240. Et 10 K potensiometer 1269 i konjunksjon med 2250 K resistor 1260 og en 10,2 K resistor 1262 tillater hele uttaket fra DAC å innstilles slik at den er nøyaktig lik 1 1/2 omdreining. Således gir brytere 1254 og DAC 1260 et 20-bit område som kontrollcelleuttaket kan regnes ut over for å etterspore testcelleuttaket.

En annen DAC 1282 er også drevet av vinding 1256. DAC

1282 kan forsynes med en ICL 7134B bi-polar D/A omformer integrert krets. Uttaket fra DAC 1256 blir tilført via en 90x faseforskyvningskrets 1284 og en 10 K resistor 1268 til bufferforsterker 1270. Således er det totale inntak til forsterker 1270 sammensatt av inn-fase og kvadratur-komponenter. I løpet av de diagnostiske og kalibrerings-faser måler digitalprosessoren kvadratur-komponenten i uttaket fra testcellen og innstiller digitalinntaket til DAC 128 2 slik at kvadratur-komponenten blir utelatt eller redusert for å forhindre metning av den følgende målingskrets.

Videre kvadraturkompensasjon kan eventuelt tilsettes ved hjelp av et potensiometer 1290 forbundet over uttaksterminalene av signalgenerator 1200 og en kondensator 1292 som forbinder visperen av beger 1290 til terminalV^. Typiske verdier for disse komponenter er 5 kilo-ohm og 100 pf. Innstillingen av potensiometer 12 90 kan justeres til å kompensere for små mengder kvad-raturfeil forårsaket av kapasitativ lagring.

Fremgangsmåtene som er fulgt i måling av konduktivitet ved

å bruke den alternative utgave vist i fig. 23, er lik dem som er beskrevet ovenfor og illustrert i fig. 20-22. En kildekode-liste over et program for utstyr til disse prosedyrer med utgaven av fig. 23 er festet hertil som Appendix A. Denne liste er skrevet i Basic og er for kontroll av en Hewlett-Packard Computer Model 984 5 for å utføre de beskrevne målinger.

Claims

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av tilstedeværelse av en ligand i en fluidprøve som omfatter: (a) å måle bulk-konduktans i et testvolum, idet test-volumet i det minste delvis inneholder minst én forhåndsbestemt region, idet nevnte forhåndsbestemte region blir eksponert for nevnte fluidprøve og også har lokalisert i seg antiligand som øver vekselvirkning med nevnte ligand; og (b) å bestemme forekomst av ligand-antiligand-vekselvirkning ved å påvise endringer i bulk-konduktansen til nevnte testvolum.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvor nevnte endringer i bulk-konduktans bestemmes ved å sammenligne bulk-konduktansen til nevnte testvolum med bulk-konduktansen til minst ett kontrollvolum.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvor nevnte lokalisering av nevnte antiligand i nevnte forhåndsbestemte region omfatter å immobilisere nevnte antiligand på en matriKS.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, hvor nevnte matriks bringes i kontakt med en flytende strøm av nevnte fluidprøve, idet nevnte kontaktbringelse omfatter å bringe nevnte fluid-prøve til å flyte gjennom nevnte matriks.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvor nevnte ligand velges fra gruppen som består av antigener, celleoverflateanti-gener, antigeniske determinanter, haptener, antistoffer, antistoff-fragmenter, enverdige antistoff-fragmenter, nukleinsyresekvenser, enzymer, kofaktorer, enzymsubstrater, genetisk eller kjemisk endrede proteiner, reseptorproteiner, molekyler bundet av et reseptorprotein, permease, andre transportproteiner, bindingsproteiner, molekyler bundet av en permease, transportproteiner eller bidningsproteiner, karbohydrater, lektiner, metallioner, metallbindings-proteiner eller andre metallbind-ingssubstanser.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, inklusive det trinn hvor det dannes et kompleks mellom en ligand som øver vekselvirkning med nevnte antiligand og en forsterkende substans.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, inklusive det trinn som går ut på å danne et kompleks mellom en antiligand spesifikk for nevnte ligand som skal bestemmes, og en forsterkende substans.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvor fire elektroder anvendes for å måle bulk-konduktansen til nevnte testvolum, hvor to av nevnte elektroder tilveiebringer en strøm gjennom nevnte testvolum hvis bulk-konduktans måles og to av nevnte elektroder måler spenningsfallet over nevnte testvolum.

9. Fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en ligand i en fluidprøve, omfattende: (a) å måle bulk-konduktansen til et testvolum, idet test-volumet i det minste delvis inneholder i seg minst én forhåndsbestemt region, idet nevnte forhåndsbestemte region blir eksponert for nevnte fluidprøve og også har lokalisert i seg en ligand, idet nevnte forhåndsbestemte region også blir eksponert for antiligand som øver vekselvirkning både med nevnte ligand i nevnte fluidprøve og nevnte lokaliserte ligand; og (b) å bestemme forekomst av ligand-antiligand-vekselvirkning ved å bestemme endringer i bulk-konduktansen til nevnte testvolum.

10. Fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en ligand i en fluidprøve, omfattende: (a) å måle bulk-konduktansen til et testvolum, idet nevnte testvolum er nær i det minste én forhåndsbestemt region, idet nevnte forhåndsbestemte region blir eksponert for nevnte fluid-prøve og også har lokalisert i seg antiligand som øver vekselvirkning med nevnte ligand; og (b) å bestemme forekomst av ligand-antiligand-vekselvirkning ved å påvise endringer i bulk-konduktansen til nevnte testvolum.

11. Fremgangsmåte for bestemmelse av nærvær av en ligand i en fluidprøve, omfattende: (a) å måle bulk-konduktansen til et testvolum, idet nevnte testvolum er i avstand fra minst én forutbestemt region, idet nevnte forutbestemte region blir eksponert for nevnte fluidprøve og også har lokalisert i seg antiligand som øver vekselvirkning med nevnte ligand; og (b) å bestemme forekomst av ligand-antiligand-vekselvirkning ved å påvise endringer i bulk-konduktansen til nevnte testvolum.

12. Apparat for bestemmelse av nærvær av en ligand i en fluidprøve, hvor apparatet omfatter: (a) i minst én forutbestemt region i nevnte apparat er det hjelpemidler for å lokalisere antiligand somøver vekselvirkning med nevnte ligand; (b) hjelpemidler for å bringe nevnte fluidprøve i kontakt med nevnte lokaliseringshjelpemidler; og (c) hjelpemidler for å måle bulk-konduktansen til et testvolum som minst delvis inneholder nevnte forutbestemte region.

13. Apparat som angitt i krav 12, hvor nevnte hjelpemidler for istandbringelse av kontakt omfatter en konstruksjon som har: (a) en innløpskanal for å bringe nevnte fluidprøve til nevnte lokaliseringshjelpemidler; og (b) en utløpskanal for å fjerne nevnte fluidprøve fra nevnte lokaliseringshjelpemidler.

14. Apparat som angitt i krav 13, hvor nevnte konstruksjon omfatter minst tre komponentdeler, idet første komponentdel omfatter nevnte innløpskanal, nevnte annen komponentdel omfatter nevnte utløpskanal, og nevnte tredje komponentdel omfatter nevnte lokaliseringshjelpemidler, idet første og andre komponentdel er festet på sandwich-måte rundt nevnte tredje komponentdel, idet nevnte tredje komponentdel kan innsettes mellom første og annen komponentdel.

15. Apparat som angitt i krav 13, hvor nevnte hjelpemidler for å måle bulk-konduktansen omfatter minst fire elektroder, hvorav to elektroder er holdt tilbake fra nevnte testvolum og tilveiebringer en strøm gjennom nevnte testvolum og to elektroder blir holdt tilbake fra nevnte strøm og måler fallet i spenning over nevnte testvolum.

16. Sensor for å bestemme nærvær av en ligand i en fluid-prøve, hvor sensoren omfatter: (a) hjelpemidler for å lokalisere antiligand som øver vekselvirkning med nevnte ligand; og (b) hjelpemidler for å måle bulk-konduktansen til et testvolum som delvis inkluderer nevnte lokaliseringshjelpemidler.

17. Biosjikt for innsettelse og anvendelse i apparatet i henhold til krav 12, hvor biosjiktet omfatter et eller flere lokaliserende hjelpemidler og en støttende fikstur.