NO854887L - Antistoffer mot humant interleukin-2 fremkalt av syntetiske polypeptider. - Google Patents

Antistoffer mot humant interleukin-2 fremkalt av syntetiske polypeptider.

Info

Publication number
NO854887L
NO854887L NO854887A NO854887A NO854887L NO 854887 L NO854887 L NO 854887L NO 854887 A NO854887 A NO 854887A NO 854887 A NO854887 A NO 854887A NO 854887 L NO854887 L NO 854887L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
amino acid
antibodies
polypeptide
interleukin
sequence
Prior art date
Application number
NO854887A
Other languages
English (en)
Inventor
Amnon Altman
Argyrios N Theofilopoulos
Richard A Lerner
Frank J Dixon
Original Assignee
Scripps Clinic Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Clinic Res filed Critical Scripps Clinic Res
Publication of NO854887L publication Critical patent/NO854887L/no

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869Interleukin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54Interleukins [IL]
    • C07K14/55IL-2
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244Interleukins [IL]
    • C07K16/246IL-2
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81Packaged device or kit
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975Kit
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808Automated or kit
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/823Immunogenic carrier or carrier per se
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/141Interleukin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Teknisk område
Foreliggende oppfinnelse angår (a) kjemisk syntetiserte polypeptider, polymerer av polypeptidene og konjugater av polypeptidene bundet til en bærer hvor hvert polypeptid innbefatter en aminosyrerestsekvens som hovedsakelig tilsvarer aminosyrerestsekvensen av en epitope eller determinantdel av et lymfokin, spesifikt, interleukin-2: (b) metoder for fremstilling og anvendelse av polypeptidene og antistoffene produsert derfra; og (c) diagnostiske systemer for måling av nærvær og mengde av interleukin-2 i en undersøkt prøve.
Bakgrunn
Immunresponsen innbefatter komplekse samvirkninger blant forskjellige effektor- og regulator-celler i det reticuloendoteliale system. Thymus-avledede lymfocytter eller T-celler, spiller en signifikant rolle i disse interaksjoner. T-celler formidler flere effektorfunksjoner slik som lyse av målceller med makrofager, og regulerer også humorale og celle-formidlede immunresponser. Så snart det ble fastslått at T-hjelpeceller deltar med B-celler i antistoff responser , begynte immunologene å forske etter løselige faktorer som formidler slike interaksjoner.
Dutton et al., Prog. Immunol., 1, 355 (1971) har beskrevet et løselig produkt eller faktor som virket som et signal mellom cellene som produserer faktoren og andre celler med de relevante akseptorseter. Denne undersøkelse demonstrerte en faktors evne til å øke antistoffrespons og ble etterfulgt av tallrike lignende studier. Det er nå vel dokumentert at løselige faktorer produsert i overveiende grad av aktiverte T-celler, har uttalt regulerende effekt på immunsystemet. Altman et al., Adv. Immunol., 3_3, 74
(1982) .
De løselige faktorer av lymfocytter som er ansvarlige for de multiple effekter av en cellulær immunreaksjon,
kalles lymfokiner. Inntil nylig ble lymfokinene definert
ved sin biologiske aktivitet i en bestemt bestemmelse, dvs.
Viktig informasjon
Av arkivmessige grunner har Patentstyret for denne allment tilgjengelige patentsøknad kun tilgjengelig dokumenter som inneholder håndskrevne anmerkninger, kommentarer eller overstrykninger, eller som kan være stemplet "Utgår" eller lignende. Vi har derfor måtte benytte disse dokumentene til skanning for å lage en elektronisk utgave.
Håndskrevne anmerkninger eller kommentarer har vært en del av saksbehandlingen, og skal ikke benyttes til å tolke innholdet i dokumentet.
Overstrykninger og stemplinger med "Utgår" e.l. indikerer at det under saksbehandlingen er kommet inn nyere dokumenter til erstatning for det tidligere dokumentet. Slik overstrykning eller stempling må ikke forstås slik at den aktuelle delen av dokumentet ikke gjelder.
Vennligst se bort fra håndskrevne anmerkninger, kommentarer eller overstrykninger, samt eventuelle stemplinger med "Utgår" e.l. som har samme betydning. funksjonalitet snarere enn ved bestemte biokjemiske og biologiske egenskaper. Denne problemstilling resulterte i et unøyaktig og ofte mangfoldig system av nomenklatur.
For å fjerne forhindringer forbundet med testavledede definisjoner ble et nytt system for beskrivelse av lymfokiner utviklet. Dette system er basert på et utall uavhengige samarbeidsstudier som klart demonstrerer at flere lymfokine aktiviteter i realiteten er forskjellige biologiske sider ved en enkel biokjemisk enhet. Se f.eks.Aarden et al., J. Immunol., 123, 2928 (1979). Uttrykket "Interleukin"
(betydning "mellom lymfocytter") ble valgt for å angi de lymfokiner som har evne til å virke som signaler mellom forskjellige populasjoner av lymfocytter.
Det lymfokin som spesifikt er av interesse her, er Interleukin-2 (IL-2), tidligere kjent som T-cellevekstfaktor (TCGF). En mekanisme for produksjon og virkning av IL-2
er blitt foreslått av Smith, Immunol. Rev., _51, 337 (1980). Ifølge denne modell aktiveres makrofager av et antigen for å produsere Interleukin-1 (IL-1). Antigenet kan være en bestemt substans til hvilken cellen er blitt sensibilisert eller ikke-spesifikt mitogen slik som fytohemagglutinin (PHA), Concanavalin A (Con A) eller kermsbær mitogen (PWM). Antigenet, sammen med IL-1, tilveiebringer et differensier-ingssignal til et sett av T-celler. Denne differensiering resulterer i IL-2-produksjon og sekresjon.
Samtidig stimulerer antigenet, med eller uten det makrofag-avhengige signal, et annet sett av T-celler til å være overflatereseptorer for IL-2. Interaksjoner mellom IL-2 og dets cellulære reseptorer resulterer i deling av T-celler som tilhører de forskjellige funksjonelle undersett. Således tilveiebringer IL-2 det universale signal for T-celledeling.
På grunn av dets essensielle rolle i immunresponser er det ikke overraskende at mangler i konsentrasjon og aktivitet av IL-2 er blitt oppdaget i et utall av sykdomstilstander. Altman et al., J. Exp. Med., 154_, 791 (1981), har rapportert at autoimmune murine stammer som utviser systemisk lupus erythematosus (SLE), har en uttalt defekt når det gjelder IL-2-produksjon og responsdyktighet. Disse observasjoner ble senere demonstrert på mennesker med SLE av Varela et al., J. Clin. Invest,, 69_, 1388 (1982) og Linker-Isreali et al.,
J. Immunol., 130, 2651 (1983).
IL-2-defekter er også blitt funnet i eldre mus og mennesker. Thoman et al., J. Immunol., 128, 2358 (1982) og Gillls et al., J. Clin. Invest. £7, 1981). Lignende defekter er blitt rapportert i barn som lider av primære immunmangler [Flomerberg et al., J. Immunol., 130, 2644
(1983)], i resipienter av allogene benmargtransplantater, [Warren et al., J. Immunol., 131, 1771 (1983)], og i parasitt-infiserte mus [Reiner et al., J. Immunol., 131, 1487 (1983)]. Slike defekter mistenkes også sterkt i ervervet immunsvekkelsessyndrom (AIDS), ondartede sykdommer og i visse viralinfeksjoner.
Enkelte av de biologiske effekter av IL-2 har mulig terapeutisk signifikans. Et eksempel er IL-2's evne til å fremkalle eller øke aktiviteten av flere typer av dreperceller innbefattende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) [Wagner et al., Immunol, Rev., 51, 215 (1980)], naturlige dreperceller (NK) [Henney et al., Nature, 291, 335 (1981)] og lymfokin-aktiverte dreperceller (LAK) [Grimm et al., J. Exp. Med., 155, 1823 (1982)]. Hver av disse dreperceller kan lyse tumor-målceller in vitro og er involvert som en in vivo effektorcelle ved bestemmelse og overvåkning av ondartethet.
Videre er det nylig blitt vist at renset IL-2 vil øke effektiviteten av sensibilserte T-celler og kjemoterapeutiske midler ved å bevirke regresjon av en etablert T-celle-leukemi i mus. Cheever et al., J. Exp. Med., 155, 968
(1982).
Reagenser som kan påvise nærvær av et lymfokin serolog-isk, i motsetning til overvåkning av dets biologiske effekt, vil være verdifull i diagnostisering av sykdommer og ved utvikling av immunoterapeutiske midler for T-celle-assosierte immunomangler. I særdeleshet kan antistoffer som er reaktive med IL-2, muliggjøre studier av IL-2 biologisk aktivitet, immunorensing, utvikling av IL-2 immunobestemmelser, identifisering av aktive seter av molekylet, og en oppstilling av in vivo studier for å bestemme den fysiologiske rolle av IL-2 i immunresponsen.
Nylige rapporter antyder at det er mulig å utvikle monoklonale antistoffer som er reaktive med IL-2. Hittil har hovedproblemet når det gjelder utvikling av disse antistoffer,, ligget i vanskeligheten med å akkumulere tilstrekkelig IL-2 protein i en renset og konsentrert form slik at immuniserings- og serologiske bestemmelser blir mulige.
Selv om det ikke er essensielt å immunisere med homogent IL-2 for å oppnå anti-IL-2-aktivitet, er det viktig å immunisere med minst mikrogramsmengder av IL-2-proteinet. Utviklingen av en immunobestemmelse som gjenkjenner anti-IL-2-aktivitet, krever imidlertid bruk av relativt rent IL-2.
Vanskeligheten med å oppnå rensede mengder av IL-2 gjenspeiler to mangler ved konvensjonelle IL-2 fremstillings-teknikker. For det første kan multiple lymfokiner utskilles av en,enkel klonet T-cellekilde. Dette gjør isoleringen av et bestemt lymfokin relativt vanskelig. For det andre innbefatter rensingsprosedyrene flere trinn og krever relativt store volumer av IL-2-holdige dyrkningsmedia.
Et ytterligere eksempel på den potensielle terapeutiske verdi av IL-2 er dets evne til å fremkalle, sammen med et antigen, funskjonell celle-formidlet immmunitet i atymiske, nakne mus. Wagner et al., Nature, 248, 278 (1980) . En atymisk, naken mus er en hårløs mus som medfødt mangler thymus og har en markert mangel på thymus-avledede lymfocytter (T-celler). Denne observasjon antyder enn videre at IL-2 kan ha et immunoterapeutisk potensiale i visse tilstander med T-celle-assosierte immunomangler.
Kort sammen drag av o ppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av antistoffer overfor humant interleukin-2 (IL-2) under anvendelse som immunogener av relativt korte syntetiske polypeptider med aminosyrerestsekvenser som hovedsakelig tilsvarer deler av aminosyrerestsekvensen av IL-2. I særdeleshet ble 8 polypeptider (se fig. 1 og 2) bestående av 13 til 15 aminosyrer, kjemisk syntetisert. Disse syntetiske polypeptider er her angitt som "IL-2-polypeptider".
IL-2-polypeptidene ble konjugert til en proteinbærer og ble anvendt for å immunisere både kaniner og mus. De resulterende immunsera ble analysert ved en fast fase, enzym-bundet immunosorbentbestemmelse (ELISA) med hensyn til reaktivitet overfor delvis renset tonsil-avledet humant IL-2. Antistoffer, spesifikt oligoklonale antistoffer, fremkalt
av 4 av de 8 polypeptider, ble funnet å reagere mot (bindes til) humant IL-2.
De syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen inneholder fra 6 til 40 aminosyrerester, fortrinnsvis fra 10 til 20 aminosyrerester, og innbefatter en aminosyresekvens som hovedsakelig tilsvarer en aminosyrerestsekvens av en antigenisk determinant av interleukin-2. Hvert syntetisk polypeptid har evnen alene, som en polymer eller som et konjugat bundet til en bærer når det injiseres i en vert i en effektiv mengde og i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel, til å fremkalle produksjon av antistoffer overfor en antigenisk determinant av IL-2.
Antistoffer fremkalt av følgende 4 polypeptider (tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden) ble i særdeleshet funnet å bindes til humant IL-2 ;
Et oligoklonalt antistoff som her definert, er et immunoglobulinprodukt av en immunrespons som fremkalles av og bindes til en epitope på et polypeptid med moderat lengde innbefattende 6 til 40 aminosyrerester. Oligoklonale antistoffer er vanligvis en blanding av reseptorer dannet av mere enn én celle. Således dannede oligoklonale reseptorer er vanligvis mere epitopisk spesifikke i sin binding enn polyklonale reseptorer dannet mot hele proteinmolekyler som kan ha epitopiske regioner gjennom lengden av proteinkjeden eller -kjedene. Dyr immunisert med polypeptidene som er anvendbare her, produserer sera inneholdende oligoklonale reseptorer (antistoffer).
Reaktiviteten av disse antistoffer med IL-2 ble bekreftet ved følgende studier: a) identiske profiler av IL-2 biologisk aktivitet og immunoreaktivitet ble observert etter tre påfølgende og uavhengige kromatografiske studier av uren IL-2 supernatant; b) anti-polypeptid og anti-IL-2-aktiviteter ble eluert i de samme fraksjoner fra en peptid-immunoaffinitetskolonne; c) affinitet-renset anti-IL-2 polypeptid-antistoffer bundet til elektroforetisk-rent humant IL-2 avledet fra Jurkat leukemisk T-cellelinje; og d) på natriumdodecylsulfat- (SDS) geler immunoutfelte et affinitetsrenset kanin-antistoff fremkalt av en at IL-2-polypeptidene (P84) et protein på 15.000-18.000 dalton som bestemt ved Western flekkanalyse.
Enn videre ble IL-2 biologisk aktivitet eluert fra en praktisk talt identisk posisjon i gelen. Affinitetsrenset anti-P84 antistoff farvet spesifikt cytoplasma av fytohemagglutinin (PHA9-stimulerte humane, perifere blodlymfocytter (PBL). Anti-IL-2-polypeptid-antistoffer bandt seg enn videre til rent rekombinant IL-2 (også kjent som rekombinant IL-2) ved en ELISA-prosedyre.
Foreliggende oppfinnelse angår også monoklonale antistoffer som er reseptorer dannet av kloner av en enkel celle kondensert fra en antistoff-produserende celle og en myeloma- eller annen selvbevarende cellelinje som utskiller bare ett reseptormolekyl. Slike reseptorer ble først beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 256, 495 (197 5), hvilken beskrivelse her innarbeides som referanse.
Som vist her, er oligoklonale og monoklonale antistoffer overfor syntetiske IL-2-polypeptider anvendbare prøver for undersøkelse av interleukin-2, og for utvikling av kvantitative bestemmelser for måling av konsentrasjoner av IL-2 i biologiske væsker og forbindelsen mellom slike konsentrasjoner og sykdommer.
En utførelsesform av oppfinnelsen angår i særdeleshet et diagnostisk system for bestemmelse av nærvær av en antigenisk determinant av interleukin-2. Dette system innbefatter en første pakke inneholdende oligoklonale eller monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. Når en på forhånd bestemt mengde av disse antistoffer blandes med en på forhånd bestemt mengde av en vandig sammensetning inneholdende IL-2, dannes et kompleks ved en immunologisk reaksjon. Nærvær av komplekset kan bestemmes ved et merke som fortrinnsvis er inneholdt i en andre pakke i systemet.
Ifølge en annen utførelsesform av oppfinnelsen utgjør de oligoklonale eller monoklonale antistoffer den aktive, bindende del av en affinitetssorbant anvendbar for binding og rensing av interleukin-2. Her er antistoffene bundet til en fast bærer som er kjemisk inert overfor IL-2 slik som agarose eller tverrbundet agarose. Den således fremstilte affinitetssorbant kan deretter blandes med en IL-2-holdig, vandig sammensetning under dannelse av et reversibelt antistoff -antigenkompleks som deretter kan dissosieres under dannelse av IL-2 i en renset form.
Ytterligere fordeler og anvendelser ved oppfinnelsen vil fremgå for fagmannen fra den etterfølgende detaljerte beskrivelse, eksempler og patentkrav.
Kort beskrivelse av tegningene
På tegningene som utgjør en del av foreliggende beskrivelse, illustrerer fig. 1 153 aminosyresekvensen av interleukin-2 som bestemt av Taniguchi et al., Nature, 302, 309 (1983) . Regioner av proteinet valgt for syntese ifølge oppfinnelsen, er indikert ved understrekninger. Bokstaven C Ved den ene eller annen ende av en understrekning indikerer adhesjon av et cystein som ikke finnes i den primære sekvens. Den etterfølgende enkeltbokstavs- og konvensjonelle trebok-stavskode (se fig. 2) svarer til de indikerte aminosyrer: A, Ala(L-alanin); C, Cys (L-cystein) ; D, Asp (L-asparagin- syre); E, Glu (L-glutaminsyre); F, Phe (L-fenylalanin);
G, Gly (Glycin); H, His (L-histidin); I, Ile (L-Isoleucin);
K, Lys (L-lysin); L, Leu (L-leucin), M, Met (L-methionin);
N, Asn (L-asparagin); P, Pro (L-prolin); Q, Gin (L-glutamin); R, Arg (L-arginin); S, Ser (L-serin); T, Thr (L-threonin);
V, Val (L-valin); W, Trp (L-tryptofan); og Y, Tyr (L-tyrosin). Fig. 2 illustrerer aminosyresekvensene av polypeptider betegnet som P81 (rest 18-32 med carboxy-terminalt cystein); P83 (rest 51-64 med carboxy-terminalt cystein); P10 (rest 65-78); P84 (rest 79-92); Pil (rest 94-108 med carboxy-terminalt cystein); P12 (rest 111-125); og P82 (rest 139-153) under anvendelse av den konvensjonelle tre-bokstavskode som ovenfor angitt for hver aminosyre. Hver av reststillingsnumrene er basert på stillingene tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxy-enden av IL-2-molekylet vist i fig. 1. Fig. 3 viser en serie av kurver (panel A, B og C) som illustrerer spesifisiteten av kanin anti-P82 serum i enzym-bundet immunosorbentbestemmelser (ELISA). Kanin anti-P8 2 serum (R«x. P82); det preimmune serum (normalt kaninserum) fra samme kanin (NRS); og et hyperimmunt kanin anti-hepatitis B polypeptid (R<»< P7 2) serum ble titrert på plater belagt med P82 (panel A), delvis renset tonsil IL-2-preparat (panel B) eller P81 (panel C). Verdier er angitt etter fratrekk av bakgrunnsreaksjoner på BSA-belagte plater. Fig. 4 viser inhibering av kanin anti-P84 serum-formidlet ELISA med løselige polypeptider. Affinitets-renset kanin anti-P84-serum ble inkubert i P84-belagte eller TCGF (IL-2)-belagte plater i fravær eller nærvær av økende konsentrasjoner av løselig P81 eller P84. Fig. 5 illustrerer ELISA-reaktiviteten av anti-P82-antistoffer mot renset Jurkat-avledet IL-2. Affinitets-renset kanin anti-P8 2 eller anti-humane IgG (kontroll) antistoffer ble titrert på IL-2-belagte eller BSA-belagte plater. Fig. 6 viser den biologiske aktivitet og ELISA-reak-tivitetsprofiler av AcA 44-fraksjonert tonsil-avledet IL-2.
Prøver av 20 ml fraksjoner ble anvendt ufortynnet for å belegge mikrotiterplater i ELISA eller ble testet ved en fortynning på 1:100 med hensyn til biologisk aktivitet. Fraksjoner av et falskt IL-2-preparat med manglende biologisk aktivitet ble testet parallelt ved ELISA-bestemmelsen. Affinitets-renset kanin anti-P84 (1:200) ble anvendt ved
ELISA.
Fig. 7 er Western flekkanalyse av urene, tonsil-avledede, IL-2-holdige supernatanter under anvendelse av affinitetsrenset anti-P84 antistoff. Elektroforetisk overførte proteiner fra en 100x-konsentrert supernatant ble omsatt med 5yug/ml affinitetsrenset kanin anti-P84 antistoff. Eluater av 2 ml tykke skiver av en parallellgel ble testet for IL-2-aktivitet ved en fortynning på 1:100. Fig. 8 er et fotomikrografisk bilde av immuno-fluorescensfarging av PHA-stimulert PBL av affinitets-renset anti-P84 antistoff. Anti-P84-antistoffet ble omsatt direkte med PBL (panel A) eller etter preinkubering med 20^ug/ml P84 (panel B).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
I. Introduksjon
Interleukin-2 (IL-2), også kjent som T-cellevekstfaktor (TCGF), er et T-celle-avledet glycoprotein. IL-2 er antatt å gi et universalt signal for deling av modne T-celler [Smith, Immunol. Rev., 51, 337 (1980)] via dets binding til spesifikke celleoverflatereseptorer [Robb et al., J. Exp. Med., 154, 1455 (1981)]. Opprinnelig ble IL-2 vist å under-støtte den langvarige vekst av lectin-aktiverte T-celler [Morgan et al., Science, 128, 821 (1976) og Ruscetti et al., J. Immunol-, 119, 131 (1977)]. Oppdagelsen av IL-2 førte til etablering av funksjonelle, antigen-spesifikke T-cellelinjer [Gillis et al., Nature, 268, 154 (1977)].
Nylig utvikling innen IL-2-forskningen har resultert
i utvikling av B-celle-hybridomaer som produserer monoklonale antistoffer overfor humant IL-2 [Smith et al., J. Immunol., _131, 1808 (1983); og Robb et al., Proe. Nati. Acad. Sei.
(USA), 80, 5990 (1983)]; og molekylær kloning av et humant
komplementært DNA (cDNA) som kan uttrykkes og translateres til et biologisk aktivt IL-2 [Taniguchi et al., Nature,
302, 305 (1983)].
Til tross for den hurtige utvikling innen dette område er struktur-funksjonsforholdet for IL-2 fremdeles ukjent idet de bestemte aminosyrerester som er involvert i de aktive seter, eksempelvis fremdeles ikke er kjente. Selv om en følsom og pålitelig IL-2 biobestemmelse som beskrevet i Gillis et al., J. Immunol., 120, 2027 (1978) er tilgjengelig, er denne bestemmelse ømfintlig overfor et utall av inhiberende materialer som kan utelukke den rutinemessige bruk for kvantifisering av IL-2 i biologiske væsker.
Nylige studier har vist at syntetiske polypeptider kan anvendes for å fremkalle antistoffer som er spesifikke for på forhånd bestemte primære aminosyrerestsekvenser i intakte proteiner slik som beskrevet i Lerner R.A., Nature, 299,
592 (1982) og Sutcliffe et al., Science, 211'260 (1983). Slike antistoffer kan dannes selv mot polypeptider som ikke er immunogene i sammenheng med det naturlige proteinmolekyl.
Anti-polypeptid-antistoffer er derfor nyttige verktøy for analyse av den fine struktur av komplekse proteiner. Foreliggende oppfinnelse anvender en slik metodologi når det gjelder dannelse av antistoffer overfor syntetiske polypeptider. Antistoffene dannes mot flere syntetiske polypeptider avledet fra den publiserte aminosyrerestsekvens av et humant IL-2-molekyl som beskrevet i Taniguchi et al., Nature, 302, 305 (1983). Også beskrevet er bestemmelsen av egenskapene av slike antistoffer, og det er vist at anti-polypeptid-antistoffene gjenkjenner og bindes til (reagerer med) humant IL-2.
Et syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen har en aminosyrerestsekvens av tilstøtende aminosyrer som hovedsakelig tilsvarer immunologisk aminosyresekvenser av en antigenisk determinant av interleukin-2. Polypeptidet inneholder fra 6 til 40 aminosyrerester, og fortrinnsvis fra 10 til 20 aminosyrerester. Når polypeptidet administreres alene eller som en polymer eller som et konjugat bundet til en bærer slik som albuskjell hemocyannin (KLH) eller lignende og innføres i en effektiv mengde i en fysiologisk akseptabel fortynningsbærer i et vertdyr, fremkaller det produksjon av anti-polypeptid-antistoffer i verten.
I foreliggende beskrivelse anvendes uttrykkene "peptid" og "polypeptid" om hverandre. Uttrykket "syntetisk polypeptid" angir en kjemisk oppbygget, i motsetning til en biologisk oppbygget og nedbrutt kjede, av aminosyrerester som er frie for naturlig forekommende proteiner og frag-menter derav. Slike syntetiske polypeptider kan fremkalle produksjon av anti-polypeptid-antistoffer i en vert.
Angivelsen "immunologisk tilsvarer hovedsakelig" i dets forskjellige grammatikalske former anvendes her og i de etterfølgende krav i forbindelse med polypeptidsekvenser for å angi at de beskrevne polypeptidsekvenser fremkaller produksjon av antistoffer som bindes til polypeptidet og til den antigeniske determinant.
Uttrykket "hovedsakelig tilsvarer" i dets forskjellige grammatikalske former anvendes her og i de etterfølgende krav i forbindelse med polypeptidsekvenser for å angi den beskrevne polypeptidsekvens pluss eller minus opp til 3 aminosyrerester ved den ene eller begge av amino- og carboxy-endene, og inneholdende bare konservative substi-tuenter i bestemte aminosyrerester langs polypeptidsekvensen.
Uttrykket "konservativ substitusjon" som ovenfor angitt, er ment å angi at en aminosyrerest er blitt erstattet med en annen, biologisk lik rest. Eksempler på konservative substitusjoner innbefatter substitusjonen av en hydrofob rest slik som Ile, Val, Leu eller Met med en annen, eller substitusjon av en polar rest med en annen slik som mellom Arg og Lys, mellom Glu og Asp eller mellom Gin og Asn, og lignende.
I enkelte tilfeller er erstatning av en ionisk rest med en motsatt ladet ionisk rest slik som Asp med Lys blitt angitt som konservativ ved at disse ioniske grupper antas å bare gi løselighetsmedvirkning. Da de her diskuterte erstatninger bare foretas på relativt korte syntetiske poly peptid-antigener, i sammenligning med et helt protein, vil generelt en erstatning av en ionisk rest med en annen ionisk rest med motsatt ladning her bli betraktet som å være en "radikal erstatning" slik som erstatninger mellom ikke-ioniske og ioniske rester, og store rester slik som Phe, Tyr og Trp og mindre store rester slik som Gly, Ile og Val.
Uttrykkene "ikke-ioniske" og "ioniske" rester anvendes her i den vanlige betydning for å angi de aminosyrerester som normalt enten ikke bærer noen ladning eller normalt bærer en ladning ved fysiologiske pH-verdier. Eksempler på ikke-ioniske rester innbefatter Thr og Gin, mens eksempler på ioniske rester innbefatter Arg og Asp.
Ifølge en metode ved oppfinnelsen behandles en egnet vert med en effektiv mengde av et syntetisk polypeptid i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel hvor polypeptidet har en aminosyrerestsekvens som immunologisk tilsvarer hovedsakelig en aminosyresekvens av en antigenisk determinant av interleukin-2, Anti-polypeptid-antistoffer produseres således som kan gjenkjenne og bindes til en antigenisk determinant av interleukin-2.
På denne måte har det resulterende "anti-polypeptid-antistoff" en på forhånd bestemt spesifisitet og har hovedsakelig samme konfigurasjon som et antistoff som bindes til den antigeniske determinant av IL-2. Antistoffer av denne type tilveiebringer et forbedret middel for å definere strukturen av antigeniske determinanter, såvel som å tilveiebringe midler for diagnose og terapi.
Ordet "reseptor" anvendes her for å angi et antistoff i hovedsakelig ren form slik som i serum av et immunisert dyr eller den idiotypeholdige polyamiddel av et antistoff (et antistoff-kombinerende sete) i hovedsakelig ren form. Reseptorer som her er anvendbare, bindes i det minste med en antigenisk determinant av interleukin-2 når de blandes dermed i vandig løsning eller fast fase, i det minste ved fysiologiske pH-verdier og ionestyrker. Fortrinnsvis binder reseptorene også til en slik antigenisk determinant innen et pH-verdiområde på fra 5 til 9, og ved ionestyrker slik som den av destillert vann til den av 1 molar natriumklorid.
Idiotypeholdige polyamiddeler av antistoffer er de deler av antistoffer som bindes til epitopen av det antigene molekyl. Slike deler innbefatter F ab-, Fabog F(ab')2~fragmentene fremstilt fra antistoffer etter velkjente enzymatiske splittingsteknikker. Se f.eks. US patentskrift 4 342 566 tilhørende Theofilopoulos og Dixon. Ettersom antistoffene fra hvilke de idiotypeholdige polyamider erholdes er beskrevet som dannet mot eller fremkalt av immunogener, vil idiotypeholdige polyamidreseptorer også bli diskutert som å være "dannet" eller "fremkalt" med den forståelse at et spllttingstrinn er nødvendig for å oppnå et idiotypeholdig polyamid fra et antistoff.
De oligoklonale reseptorer ifølge oppfinnelsen må skilles fra tidligere fremstilte polyklonale reseptorer som dannes mot et heterologt protein modifisert av et hapten. Disse reseptorer hadde typisk lav griskhet med hensyn til setet av haptenmodifikasjon, og mesteparten av antistoffene ble dannet mot den "non-seif", store proteinmolekylbærer.
Reseptorene kan også være monoklonale. Teknikker for fremstilling av monoklonale antistoffer er velkjent. Mon-klonale reseptorer anvendbare ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles under anvendelse av et polypeptid som et immunogen som beskrevet i Niman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80, 4949 (1983). Monoklonale antistoffer erholdes typisk fra hybridoma-vevkulturer eller fra ascites—væske erholdt fra dyr i hvilke hybridomavevet var innført.
Metoden ifølge oppfinnelsen gir antistoffer mot syntetiske polypeptider som gjenspeiler en antigenisk determinant av et naturlig forekommende protein og resulterer i at en stor fraksjon av de dannede sera blir reaktive mot det naturlige protein.
Ifølge en annen side ved oppfinnelsen kan metoden for dannelse av antistoffer mot syntetiske polypeptider anvendes for å danne antistoffer mot antigeniske determinanter som ikke er naturlig immunogene i verten. Dvs. at visse deler av et makromolekyl har evnen til å bli bundet av et anti stoff (dvs. er antigent), men fremkaller ikke produksjon av antistoffer (dvs. er ikke immunogene).
Anti-polypeptid-antistoffer fremstilt ifølge oppfinnelsen, har derfor flere distinkte fordeler i forhold til antistoffer produsert ved konvensjonell immunisering med et intakt proteinmolekyl.
Ordet "antigen" er blitt anvendt historisk for å angi en enhet som bindes av et antistoff og for å angi den enhet som fremkaller produksjonen av antistoff. Mere nylig bruk begrenser betydningen av antigen til den enhet som bindes av et antistoff, mens ordet "immunogen" anvendes for den enhet som fremkaller antistoffproduksjon. I enkelte tilfeller er antigenet og immunogenet den samme enhet slik som hvor et syntetisk polypeptid anvendes for å fremkalle produksjon av antistoffer som binder til polypeptidet. Imidlertid kan samme polypeptid også anvendes for å fremkalle antistoffer som også binder til et helt protein slik som immunoglobulin, i hvilket tilfelle polypeptidet er både immunogen og antigen, mens immunoglobulinet er et antigen. Hvor en enhet som diskutert her, er både immunogen og antigen, vil det generelt bli angitt som et antigen.
I et ytterligere trekk ved oppfinnelsen er det beskrevet diagnostiske systemer og metoder. Disse systemer og metoder utnytter et polypeptid ifølge oppfinnelsen i det diagnostiske system eller metode, eller utnytter dette polypeptid til å fremkalle produksjon av en reseptor ifølge oppfinnelsen som utnyttes direkte i det diagnostiske system eller metode.
En ytterligere side ved oppfinnelsen tar i betraktning affinitetssorbenter, Her utnyttes et polypeptid ifølge oppfinnelsen for å fremkalle produksjon av en reseptor ifølge oppfinnelsen slik som et antistoff. Denne reseptor kobles til en bærer slik som tverrbundet dextran under dannelse av affinitetssorbanten som kan anvendes for å oppnå og rense naturlig forekommende IL-2 fra kroppsprøver.
II. Produksjon av monoklonale reseptorer
For på en vellykket måte å fremstille monoklonale reseptorer som gjenkjenner både et immunogent polypeptid og IL-2-proteinliganden til hvilke aminosyrerestsekvensen dette polypeptid delvis tilsvarer, bør de etterfølgende trinn følges.
Et immunogent polypeptid eller konjugat av dette polypeptid bundet til en bærer, tilveiebringes. Dette polypeptid har en aminosyrerestsekvens av moderat lengde, slik som 6 til 40 aminosyrerester, og fortrinnsvis 10 til 20 rester. Aminosyrerestsekvensen'av det immunogene polypeptid svarer til en del av aminosyrerestsekvensen av et lymfokin slik som IL-2. Selv om det immunogene polypeptid kan anvendes i seg selv som en ligand, foretrekkes det å anvende polypeptidimmunogenet som et konjugat bundet til en bærer slik som albuskjell hemocyanin (KLH), albuminer slik som okseserumalbumin (BSA), humant serumalbumin (HSA), røde blodceller slik som saueerythrocytter, tetanus toxoid og edestin, såvel som polyaminosyrer slik som poly—(D-lysin;D-glutamlnsyre), og lignende.
Immunogenisiteten og antigenisiteten av polypeptidet kan testes ved å binde polypeptidet til en albuskjell hemocyaninbærer som et konjugat og deretter anvende konjugatet for å immunisere en mus. Et anvendbart polypeptid er tilstrekkelig immunogent og antigent til å fremkalle en 50% bindingstiter av det immuniserte museserum til polypeptidet som er minst en 1:400 fortynning etter tre immuniseringer i en 1-måneds periode, hvor hver immunisering inneholder minst lOyug, og fortrinnsvis minst 50yug av polypeptidet i konjugatet, og under anvendelse av Freunds fullstendige adjuvans for første immunisering og alun som adjuvans deretter.
Denne testprosedyre behøver ikke å utføres før anvendelse av et gitt polypeptid som immunogen, men det er fordelaktig å utføre denne som en forbestemmelsesteknikk for å bestemme hvilke polypeptider som vil være anvendbare ved fremstilling av de ønskede monoklonale reseptorer. Hvorvidt de anvendes ved en forbestemmelsesmetode eller ikke, vil polypeptidene som her er anvendbare som immunogener, tilveiebringe den ovenfor angitte titer under anvendelse av det ovenfor angitte immuniseringssystem.
Etter tilveiebringelse av det immunogene polypeptid hyperimmuniseres et dyr slik som en mus, kanin, geit, hest eller lignende, med det immunogene polypeptid eller konjugat av. dette polypeptid bundet til en bærer, under dannelse av et hyperimmunt serum hvis reseptormolekyler utviser en 50% bindingstiter til polypeptidet og minst en 1:400 fortynning. Således kan det samme dyr, en mus, i hvilken man ønsker å forteste immunogenisiteten av peptidet, anvendes for å danne Mabs.
Det skal bemerkes at immuniseringssystemet som er nød-vendig for å tilveiebringe en hyperimmun tilstand, er en funksjon blant annet av dyretype, dyrets vekst,immunogenisiteten og mengdene av polypeptid og bærer hvis slik anvendes, adjuvans hvis slik anvendes, og antall administrerte immuniseringer i et gitt tidsrom, hvilket er kjent innen faget. Det ovenfor beskrevne system for oppnåelse av en 50% bindingstiterfortynning på minst 1:400 tilveiebringer en hyperimmun tilstand i testmusen og kan anvendes som en proporsjonaliserbar basis for fremkalling av hyperimmune tilstander i andre dyr. Det skal enn videre bemerkes at tre immuniseringer ikke nødvendigvis er nødvendige for å tilveiebringe den hyperimmuniserte tilstand, men for et anvendbart polypeptid er tre slike immuniseringer i løpet av en måned tilstrekkelig for å fremkalle denne tilstand, eller polypeptidet er ikke tilstrekkelig immunogent for produksjon med høyt utbytte av hybridomas og deres monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen.
Serum-reseptormolekylene som således produseres i det hyperimmuniserte dyr, binder også den del av IL-2 til hvilken det immunogene polypeptid tilsvarer i aminosyrerestsekvens. Disse bindingsbestemmelser er beskrevet i avsnittet Materialer og metoder i det etterfølgende. Det skal bemerkes at en ren prøve av IL-2 ikke behøver å anvendes i disse bestemmelser, men snarere kan et celle ekstrakt eller vevpreparat slik som et mikroskopglass inneholdende IL-2, anvendes.
Det hyperimmuniserte dyr opprettholdes, dvs. holdes
i live uten administrering av ytterligere immuniseringer i et tidsrom på minst 30 dager etter administreringen av den immunisering som produserer en 50% bindingstiter på minst en 1:400 fortynning. Dyret immuniseres med andre ord først for å tilveiebringe en hyperimmunisert tilstand, hvoretter hyperimmuniseringen tillates å avta.
Nedsettelsen i bindingsaktivitet tar typisk 1 til
5 måneder for mus. Denne nedsettelse i bindingstiter er antatt å svare til en periode hvori de behandlede blast-celler blir i stand til å sette i verk en kraftig respons når immunogenet igjen innføres.
En forsterkningsimmunisering, slik som ved intravenøs injeksjon, under anvendelse av det immunogene polypeptid eller dets konjugat, administreres til dyret etter at opp-rettholdelsesperioden er fullført, f.eks. minst 30 dager etter den siste immunisering. Antistoffproduserende celler slik som miltceller eller lymfeceller i det forsterknings-behandlede dyr, kondenseres deretter med en myelomacellelinje fra samme eller forskjellig dyretype innen et tidsrom på fra 3 til 5 dager fra forsterkningsadministrer-ingen for å danne hybridomaceller. Forsterkningen er antatt å stimulere modningen av blastcellene til det punkt ved hvilket disse celler utskiller nærmest optimale mengder av oligoklonale antistoffer overfor polypeptidet.
P3x63 eller SP2/0, hypoxanthin-amino-pterin-thymidin(HAT)-følsom myelomacellelinje foretrekkes for anvendelse ved fusjon med muse-miltceller, selv om andre cellelinjer også kan anvendes. Hybridomacellene klones deretter ved begrensende fortynning fri for nærvær av, eller behov for, næringslag eller makrofager, for å redusere overvekst av ikke-produserende celler, og for å tilveiebringe en ut-velgelsesmetode for celler som vokser lett under in vitro-betingelser.
De således fremstilte hybridomaceller undersøkes deretter med hensyn til produksjonen (sekresjon) av monoklonale reseptormolekyler som bindes til en determinantdel av IL-2 til hvilken det immunogene polypeptid tilsvarer i aminosyrerestsekvens. Deretter dyrkes de hybridomaceller som produserer monoklonale reseptormolekyler som bindes til IL-2 ytterligere, for å fremstille ytterligere mengder av disse hybridomaceller og de monoklonale reseptorer ut-skilt av disse celler som bindes til IL-2. Typisk utføres en slik dyrkning ved begrensende fortynning, f.eks. til et gjennomsnitt på 1 celle pr. kultur-dyrkningsbrønn.
I foretrukket utøvelse undersøkes også de hybridomaceller som fremstilles med hensyn til produksjon av monoklonale reseptormolekyler som bindes til polypeptidimmunogenet såvel som til IL-2. Hybridomaceller som produserer monoklonale reseptormolekyler som bindes til både det immunogene polypeptid og til IL-2, er de celler som deretter fortrinnsvis dyrkes.
Hvor prøver av IL-2 er begrenset, er det hensiktsmessig først å analysere hybridomaene med hensyn til sekresjon av monoklonale reseptorer som bindes til det immunogene polypeptid. Hybridomakloner som utviser positiv binding til dette polypeptid, fryses deretter for lagring.
De subklones deretter ved begrensende fortynning for å sikre at virkelig monoklonale antistoffer produseres snarere enn at et flertall av monoklonale reseptorer produseres fra et flertall av forskjellige hybridomaceller. Disse subklon-ingskulturer ved begrenset fortynning utføres typisk igjen fri for næringslag eller makrofager, da slike ikke er nød-vendig.
De hybridomaceller som til sist produseres, kan dyrkes ved å følge vanlige in vitro vevdyrkningsteknikker for slike celler, hvilket er vel kjent innen faget. Fortrinnsvis dyrkes hybridomacellene i dyr under anvendelse av lignende velkjente teknikker hvor de monoklonale reseptorer erholdes fra den således dannede ascitesvæske. Dyrene anvendt for utvikling av ascitesvæsken, er typisk BALB/c mus opp-drettet i musekolonien ved Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, California, men når andre dyr enn mus anvendes for fremstilling av hybridomaene, anvendes mus eller denne dyretype for produksjon av ascitesvæske.
II. Diskusjon
De her presenterte data viser at antistoffer som er reaktive med naturlig humant IL-2, kan produseres i kaniner og mus som er immunisert med syntetiske polypeptider avledet fra den kjente aminosyrerestsekvens av et humant IL-2 molekyl. Denne sekvens ble utledet fra et nylig klonet cDNA som koder for humant IL-2 [Taniguchi et al., supra]
og ble bekreftet, i det minste delvis, ved direkte protein-sekvensanalyse [Smith et al., J. Immunol., supra og Robb et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), supra].
Flere bevis viser klart at de her beskrevne anti-polypeptid-antistof f er gjenkjenner naturlig humant IL—2.
For det første bindes anti-IL-2 polypeptidsera, men ikke preimmunserumet eller et hyperimmunt serum mot et irrelevant polypeptid, til delvis renset, tonsil-avledet IL-2 (såvel som til det immuniserende polypeptid). Anti—IL-2-polypeptidsera bindes imidlertid ikke til et ubeslektet polypeptid eller et falskt IL--2-preparat. Bindingen til IL—2 inhiberes enn videre spesifikt av det løselige immuniserende polypeptid.
I tillegg observeres en glimrende korrelasjon mellom profilene av biologisk aktivitet og immunoreaktivitet når urene IL-2-holdige supernatanter fraksjoneres ved flere uavhengige trinn basert på forskjellige separasjonsprin-sipper (dvs. AcA-44, Affi-gel blå eller DEAE-Sephacel<®>kromotografier).
Ytterligere bevis for at anti-polypeptid-antistoffene ifølge oppfinnelsen gjenkjenner naturlig humant IL-2, innbefatter følgende. (1) Anti-polypeptid- og anti-IL-2-aktivitet coelueres fra en peptid-immunoaffinitetskolonne. (2) Affinitetsrensedé anti-polypeptid-antistoffer bindes til elektrofokusert Jurkat-avledet IL-2 som betraktes å være hovedsakelig rent [Robb et al., J. Exp. Med., supra]. (3) IL-2 biologisk aktivitet og et immunoreaktivt protein (identifisert ved Western flekkanalyse) vandrer i en prak tisk talt identisk posisjon når en uren tonsil-avledet, IL-2-holdig supernatant separeres ved SDS-PAGE. (4) Et affinitetsrenset antistoff mot en av de humane IL-2-polypeptider produserer en spesifikk fargningsreaksjon på mitogen-aktiverte, humane, perifere blodlymfocytter. Anti-IL-2-polypeptider bindes til rent eller rekombinant IL-2 ved en ELISA-prosedyre. Sammenfatningsvis viser disse uavhengige observasjoner som forklares nærmere i avsnittet "Resultater", at de her beskrevne anti-polypeptid-antistoffer gjenkjenner humane IL-2-molekyler.
De affinitetsrensede antistoffer overfor polypeptid P12, P81, P82 eller P84 nøytraliserte interessant nok ikke den biologiske aktivitet av humant IL-2 og immunoutfelte ikke IL-2 fra en IL-2-holdig supernatant. Dette kan være fordi en aminosyrerestsekvens som er nødvendig for biologisk aktivitet, fullstendig eller delvis mangles i de fire polypeptider som fremkalte anti-IL-2-antistoffer. Det faktum at en spesifikk aminosyrerestsekvens kan være nød-vendig for å fremkalle antistoffer for viral beskyttelse eller for inhibering av proteinaktivitet, er tidligere blitt demonstrert ved munn- og klovsyken [Bittle et al., Nature, 298, 30 (1982)] og tyrosin-spesifikk kinaseaktivitet av det pp60src—omdannende protein [Gentry et al., J. Biol. Chem., 258, 11219 (1983)].
Enkelte av antistoffenes manglende evne til å inhibere IL-2-aktivitet eller til å reagere med IL-2 i løsning, kan på den annen side representere et affinitetsproblem. Det er f.eks. blitt vist at selv når det gjelder antistoffer dannet mot naturlig IL-2, er et stort overskudd av antistoff nødvendig for å nøytralisere IL-2-aktivitet. Dette skyldes sannsynligvis at affiniteten av interaksjon mellom IL-2 og dets cellulære reseptor [se Robb et al., supra] er flere størrelsesordener større enn affiniteten av interaksjon mellom IL-2 og dets respektive antistoff [Smith et al., supra]. Fremstilling av ytterligere antistoffer overfor andre IL-2-polypeptider ifølge den her beskrevne metode, kan klargjøre dette problem.
Tilveiebringelse av monoklonale hybridomaer som produserer antistoffer overfor humant Jurkat—avledet IL-2,
er nylig blitt rapportert. [Smith et al., supra og Robb et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 80, 5990 (1983)]. Som tidligere beskrevet, er et av de kritiske krav når det gjelder å sikre produksjonen av slike hybridomaer, anvendelse av tilstrekkelig store mengder av renset IL-2 for immunisering som således krever fremstilling og bearbeid-else av relativt store volumer av dyrkningssupernatanter [Smith et al., supra].
De tre monoklonale antistoffer som erkarakterisert
av Smith et al., syntes å reagere med distinkte epitoper på IL-2-molekylene, men disse epitoper er hittil ikke blitt identifisert. I studiet av Robb et al. syntes det monoklonale antistoff å reagere med en sukkerdel på IL-2-molekylet. Dette antistoff reagerte med Jurkat-avledet IL-2, men ikke med tonsil-avledet IL-2.
Foreliggende oppfinnelse angår derimot fremstilling
av antistoffer mot på forhånd bestemte primære aminosyrerestsekvenser av det humane IL-2 molekyl. Avgjørelsen om •
å anvende syntetiske polypeptider var basert på den relativt nylige forståelse at ved anvendelse av syntetiske polypeptider hensiktsmessig koblet til proteinbærere, er det mulig å fremkalle antistoffer til praktisk talt enhver region av et proteinmolekyl. Dette innbefatter de regioner som ikke er immunogene i sammenheng med det naturlige molekyl [Lerner, R.A., Nature, 291'592 (1982)].
Slike antistoffer medfører to viktige fordeler. For det første vil anvendelse av et lett-fremstilt, rent polypeptid eliminere behovet for fremstilling av et tilstrekkelig rent, naturlig antigen i de store mengder som er nød-vendige for immunisering. Da aminsyrerestsekvensen av det syntetiske polypeptid er kjent, kan for det andre polypeptidet fremkalle produksjon av antistoffer med på forhånd bestemt spesifisitet.
Da enn videre antistoffer kan dannes mot de syntetiske, primære aminosyrerestsekvenser som er antigent "stille" i sammenheng med det naturlige protein [Lerner, supra og Sutcliffe et al., Science, 219, 660 (1983)], kari oppstill-ingen av immunogene epitoper og dermed spektret av antistoffer overfor IL-2-molekylet, signifikant økes ved anvendelse av syntetiske polypeptider. En særlig viktig illustrasjon av verdien av IL-2-reaktive anti-polypeptid-antistoffer er deres anvendelse for å identifisere de poly-peptiddeler i IL-2-molekylet som formidler biologisk funksjon og/eller bindes til celleoverflatereseptorer.
Et signifikant eksempel er et nylig beskrevet antistoff mot et syntetisk polypeptid utledet fra den nucleo-tide sekvens av en klonet src-gen [Gentry et al., J. Biol. Chem., 258, 11219 (1983)]. Under anvendelse av dette antistoff var det mulig å identifisere et pentadecapeptid som er nødvendig for den biologiske aktivitet (spesifikt den tyrosin-spesifikke kinaseaktivitet) av den omdannende protein pp60src.
De observasjoner at anti-P84 antistoffer kan farve på en spesifikk måte cytoplasmaet av PHA-stimulert, humant PBL, antyder sterkt at disse antistoffer kan tjene som følsomt og pålitelig verktøy for å spesifisere IL-2-produserende celler i relasjon til sykdom. Denne bestemte observasjon er analog med den som er rapportert i en nylig undersøkelse under anvendelse av et monoklonalt antistoff dannet mot naturlig rotte IL-2 [Steinman et al., Science, 220, 1188
(1983)].
Forandringer i den primære aminosyrerestsekvens av IL-2 resulterende fra mutasjoner eller lignende og som fører til tap eller modifikasjon av biologisk aktivitet, kan i tillegg teoretisk forbindes med bestemte sykdommer. Hvis slike IL-2-varianter eksisterer, kan anti-polypeptid-antistof f er lette identifiseringen av disse varianter.
Den sterkt skjelnende evne av anti-polypeptid-antistoffer er blitt klart fastslått. Eksempelvis er slike antistoffer i stand til å skjelne mellom subtyper av hepatitis B virus-overflateantigenet [Gerin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), BO, 2365 (1983)], og mellom idiotype determinanter i den hypervariable region av to dextran- bindende myelomaproteiner [McMillan et al., Cell, J35, 859
(1983)]. IL-2's evne til å korrigere enkelte immunosvekkelses-tilstander [Wagner et al., Nature, 284, 278 (1980)] for å medhjelpe til tumorforkastelse in vivo [Cheever et al., J. Exp. Med., 155, 968 (1982)], og til å øke eller stimulere dannelse av CTL-, NK-og LAK-celler in vitro, har forårsaket stor interesse for dette lymfokin og har antydet at IL-2 kan utgjøre et immunoterapeutisk verktøy. Forbindelsen mellom IL—2—abnormaliteter og forskjellige sykdommer har enn videre understreket behovet for følsomme og pålitelige kvantitative immunobestemmelser for humant IL-2 i klinisk betydning. Den relativt enkle fremstilling av anti-IL-2-antistoffer ved anvendelse av syntetiske IL-2-avledede polypeptider indikerer at slike antistoffer er anvendbare ved forskjellige studier av IL-2, innbefattende etablering av mere nøyaktige lymfokinbestemmelser og spesifisering av lymfokin-produserende celler i friske og syke.
IV. Diagnostiske systemer og metoder
Det er ofte ønskelig å bestemme om et bestemt antigen er til stede i en biologisk prøve som et hjelpemiddel f.eks. ved en diagnose av en bestemt sykdom.
Eksempler på diagnostiske reagenssystemer innbefatter enzym-bundne immunosorbentbestemmelser (ELISA) hvori indika-torgruppen er et enzym slik som pepperrotperoxydase som er bundet til et antistoff, eller radioimmunobestemmelser hvori den indikerende gruppe er et radioaktivt element slik som 125
I tilstedeværende i enten et syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen eller antistoffet dannet dertil.
Ifølge oppfinnelsen omfatter et diagnostisk system
for bestemmelse av nærvær av en antigen determinant av interleukin-2 i biokjemisk aktiv form, antistoffer dannet i en dyrevert overfor et syntetisk polypeptid inneholdende 6 til 40 aminosyrerester og med en aminosyresekvens som immunologisk tilsvarer hovedsakelig en aminosyresekvens av en antigen determinant av IL-2. I dette diagnostiske system
immunoreagerer de ovenfor angitte antistoffer med en tilblandet prøve som skal undersøkes, under dannelse av en immunoreaktant hvis nærvær signaliseres ved hjelp av et indikerende middel.
De indikerende midler kan innbefatte enzym-bundne andre antistoffer som er dannet mot antistoffer av den
samme klasse og fra den samme dyreart som de førstnevnte antistoffer. Det indikerende middel signaliserer immuno-reaksjonen ved å bindes til de førstnevnte antistoffer tilstedeværende i immunoreaktanten. I dette system indikeres signalet ved reaksjonen mellom det kjedede enzym og et tilsatt substrat. De indikerende midler kan også innbefatte et radioaktivt element bundet til antistoffene.
Ifølge oppfinnelsen innbefatter enn videre et diagnostisk system (fortrinnsvis i form av sett) for bestemmelse av nærvær av en antigen determinant av et interleukin-2 i en kroppskomponent, i separate beholdere (a) et første reagens som inneholder i biologisk aktiv form et syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen inneholdende en sekvens på fra 6 til 40 aminosyrerester som immunologisk tilsvarer hovedsakelig en aminosyrerestsekvens av den antigene determinant av interleukin-2, idet polypeptidet når dette er kjedet til en bærer som et konjugat og inn-føres i en effektiv mengde som en vaksine i et vertdyr, er i stand til å fremkalle produksjon av antistoffer i verten som immunoreagerer med den antigene determinant av inter-leukin— 2; og (b) et andre reagens som inneholder i biokjemisk aktiv form et anti-polypeptid-antistoff som immunoreagerer med det syntetiske polypeptid, sammen med midler for indikering av nærvær av en immunoreaksjon mellom første og andre reagens.
Når de første og andre reagenser blandes i på forhånd bestemte mengder i nærvær av en på forhånd bestemt mengde av en kroppskomponent eller kultursupernatant som skal under-søkes, gir disse en grad av immunoreaksjon som signaliseres av de indikerende midler. Graden av immunoreaksjon er for skjellig fra en kjent immunoreaksjonsgrad når interleukin-2 innbefattende den antigene determinant, ikke er til stede i kroppskomponenten.
Som angitt, inneholder det første reagens ett av de tidligere beskrevne syntetiske polypeptider, en kombinasjon av slike polypeptider, eller polymerer eller konjugater fremstilt derfra. Det andre reagens innbefatter polyamider inneholdende idiotype regioner av antistoffer dannet mot de syntetiske polypeptider eller deres konjugater (reseptorer av det første reagens). De idiotype-holdige polyamider av det andre reagens kan være hovedsakelig intakte antistoffer eller Fab—, Fab ' eller F (ab') ,,-antistof f reaksjoner hvis fremstilling er beskrevet tidligere. En indikerende gruppe kan også være tilveiebragt til systemet og kan opprinnelig være bundet til eller fri for den ene eller andre av de to reagenser.
Blanding av på forhånd bestemte mengder av det første og andre reagens i nærvær av en på forhånd bestemt mengde av en kroppskomponent som skal undersøkes, resulterer i en immunoreaksjon mellom første og andre reagens (dets reseptor) , og IL-2 og den samme reseptor. Graden eller mengden av den dannede immunoreaksjon mellom første og andre reagens er forskjellig fra en kjent immunoreaksjonsgrad når en for-øket eller nedsatt mengde av IL-2 er til stede i kroppskomponenten.
I en slik konkurrerende bindingsbestemmelse konkurrerer det første reagens [IL-2-polypeptider eller rent intakt IL-2] med IL-2 i en ukjent prøve for binding til et begrenset antall av bindingsseter på antistoff-(reseptor) molekyler dannet mot IL—2-polypeptider. En økning i mengden av ukjent IL-2 i reaksjonen nedsetter bindingen av antistoff til det første (fast fase-reagens). Graden av immunoreaksjon mellom første og andre reagens nedsettes typisk når en øket mengde av IL-2 er til stede i kroppskomponenten, sammenlig-net med den vanlige tilstedeværende mengde.
I vanlig praksis bindes en på forhånd bestemt, kjent mengde av første reagens til en fast bærer slik som en av de ovenfor beskrevne ELISA-plater. Et protein slik som BSA som ikke bindes av det andre reagens, belegges deretter på den faste bærer for å blokkere seter for ikke-spesifikk proteinbinding på den faste bærer. Det blokkerende protein som ikke er bundet, fjernes deretter vanligvis slik som ved skylling.
Det andre reagens og den prøve som skal undersøkes, kan blandes hovedsakelig samtidig med det første, bundne reagens. Fortrinnsvis blandes på forhånd bestemte, kjente mengder av både det andre reagens og den prøve som skal undersøkes under dannelse av et immunkompleks, hvoretter denne blanding blandes med det bundne, første reagens for å binde andre reagens som ikke har dannet et immunkompleks til det første, bærer-bundne reagens. Blandingen opprettholdes i tilstrekkelig tid for at det første og andre reagens får reagere. De bestanddeler som ikke er bundet til den faste bærer, fjernes deretter slik som ved skylling.
Et annet diagnostisk system omfatter de tidligere diskuterte anti-idiotype-antistoffer i biokjemisk aktiv form og et indikerende middel. I dette system reagerer anti-idiotype-antistof f ene eller deres Fab-, Fab'- eller FCab'^-fraksjoner med et antigen i en prøve som skal undersøkes, under dannelse av en immunoreaktant hvis nærvær signaliseres av de indikerende midler.
Det ovenfor angitte system kan også innbefatte andre antistoffer dannet mot antistoffer av den samme klasse og fra samme art som de anti-idiotype-antistoffer som endel av de indikerende midler. Hvor f.eks. anti-idiotype-antistoffene er dannet i kaniner, kan kommersielt tilgjengelige geite-anti-kanin-antistoffer anvendes. Slike andre antistoffer innbefatter hensiktsmessig et merke slik som et kjedet enzym innbefattende pepperrot-peroxydase (HRP), glucoseoxydase eller lignende; et radioaktivt element innbefattende jod 125 eller 131, hydrogen 3, svovel 35 eller carbon 14; et NMR-aktivt element slik som fluor 19 eller nitrogen 15; eller et fluorescent fargestoff slik som fluorescein.
I en annen utførelsesform kan antistoffer være tilveie bragt, f.eks. to forskjellige antigene determinanter av interleukin—2 ifølge de tidligere beskrevne prosedyrer.
En på forhånd bestemt mengde av første antistoff bindes til en fast bærer slik som ovenfor beskrevet, eller til brønner av en mikrotiterplate som beskrevet i det etterfølgende, og en på forhånd bestemt mengde av det andre antistoff merkes med en kjent mengde av et indikerende middel eller gruppe som beskrevet i f.eks. avsnitt III. I særdeleshet kan en ukjent prøve som skal undersøkes med hensyn til nærvær av inter-leukin— 2- aktivitet , blandes med fast fase—bundne antistoffer dannet mot et syntetisk IL-2-polypeptid. Blandingen opprettholdes i et tidsrom tilstrekkelig for at interleukin-2 kan bindes til de fast fase-bundne antistoffer, og vaskes deretter for å fjerne ubundne materialer. Mengden av bundet interleukin—2 kan deretter bestemmes ved å bringe bundet IL-2 i kontakt med antistoffer dannet mot et forskjellig syntetisk IL-2-polypeptid (merket med et indikerende middel) og ved å måle graden av immunoreaksjon som signaliseres av de indikerende midler.
En annen immunokjemisk bestemmelsesteknikk som er egnet for anvendelse ifølge oppfinnelsen, innbefatter minst følgende tre former av enzym-immunobestemmelse (EIA): den immunoenzymometriske test, "sandwich"-metoden for antigen eller antistoff, og den homogene EIA.
ELISA-testen var den første til å bli utviklet og
ble utformet etter den konkurrerende radioimmuno-(RIA) standardprosedyre. Som tidligere diskutert, konkurrerer merket og umerket antigen for binding til en begrenset mengde av fast fase-antistoff. Det enzymmerket som for-trenges, måles, og de etterfølgende beregninger er hovedsakelig de samme som i RIA-prosedyrer.
I den immunoenzymometriske prosedyre omsettes en ukjent mengde av antigen med et overskudd av enzym-merket antistoff, hvoretter et fast fase-antigen for det merkede antistoff tilsettes. Sentrifugering fjerner overskudd av merkede antistoffmolekyler som reagerte med fast fase— antigenet, under dannelse av enzymatisk aktivitet i den løse-lige fase. Enzymaktiviteten forbundet med den løselige fase, måles deretter og tilveiebringer derved et mål for antigen-konsentrasjonen i den ukjente prøve.
"Sandwich"-teknikken bygger på multivalensen av et antigen og dets evne til å bindes samtidig med to forskjellige antistoffmolekyler. Det første antistoffmolekyl er vanligvis en fast fase-reaktant. Det anvendes i overskudd for å sikre binding (kompleksdannelse) av alle antigen-molekylene i den ukjente prøve. Etter blanding av prøven som skal undersøkes og antigen-antistoffet, fullføres den kompleksdannende reaksjon, et overskudd av enzym-merket antistoff tilsettes og inkuberes med komplekset fra den første blanding. Det merkede antistoff kombineres deretter med de tilgjengelige determinanter på antigenet. Ukombinert, merket antistoff fjernes ved vasking, og enzymaktiviteten av det bundne merke bestemmes. Som tidligere, er mengden av enzym bundet til komplekset, et direkte mål for mengden av antigen i den undersøkte prøve.
Hvor den prinsipale indikerende gruppe eller merke er
et enzym slik som HRP eller glucoseoxydase, er ytterligere reagenser nødvendige for å synliggjøre det faktum at en immunreaksjon har funnet sted og at antistoff-antigen-komplekset er blitt dannet. Slike ytterligere reagenser for HRP innbefatter hydrogenperoxyd og en oxydasjons-farve-forløper slik som diaminobenzidin. Ytterligere reagenser som er anvendbare sammen med glucoseoxydase, innbefatter ABTS-fargestoff og glucose.
Uttrykkene "indikerende gruppe" eller "merke" anvendes her for å innbefatte enkle atomer og molekyler som er kjedet til reseptoren eller som anvendes separat, og hvorvidt disse atomer eller molekyler anvendes alene eller i forbindelse med ytterligere reagenser. Slike indikerende grupper eller merker er i seg selv velkjente innen immunokjemien.
En indikerende gruppe eller merke tilføres fortrinnsvis sammen med reseptoren og kan pakkes sammen med denne eller pakkes separat. Ytterligere reagenser slik som hydrogenperoxyd og diaminobenzidin, kan også innbefattes i systemet når en. indikerende gruppe slik som HRP anvendes. Slike mat erialer er lett tilgjengelige kommersielt, slik som mange indikerende grupper, og behøver ikke å tilføres sammen med det diagnostiske system. I tillegg vil enkelte reagenser slik som hydrogenperoxyd, spaltes ved henstand, eller er på annen måte kortlivede slik som enkelte radioaktive ele-menter, og kan på bedre måte tilføres av den endelige bruker.
Ytterligere diagnostiske bestemmelser kan anvendes for å bestemme nærvær av en antigen determinant av IL-2. Eksempelvis kan IL—2-holdige celler påvises ved cytoplasmisk farging av fikserte vevsnitt (immunohistologi eller immunofluorescens - se avsnitt XIII) eller ved anvendelse av en fluorescens-aktivert cellesorterer (strømningscytofluor-metri).
Strømnings-cytofluormetri som anvender en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS), er en metode for separering av T- og B-lymfocytter. I en FACS utvikles små dråper ved ultralydvibrering i en liten dyse på en slik måte at hver lille dråpe inneholder en enkel celle merket med et fluorescent merke slik som FITC (fluorescein-isothiocyanat)
eller TRITC (tetramethylrhodamin-isothiocyanat). Ettersom de små dråper passerer en etter en gjennom en laserstråle, analyseres hver celle med hensyn til intensitet, farge og polarisering av dets fluorescens.
De karakteristiske signaler fra individuelle celler analyseres deretter for å bestemme hvorvidt cellen oppfyller visse på forhånd utvalgte kriterier. Hvis den gjør dette, lades elektrisk den lille dråpe inneholdende cellen og av-bøyes og separeres fra hovedstrømmen ettersom den passerer gjennom et elektrisk felt. Ved å binde egnede fluorescente antistoffer til enten T- eller B-celler kan man separere den ene eller andre cellepopulasjon fra en cellesuspensjon.
Således kan affinitetsrenset IL-2 eller syntetiske polypeptider som hovedsakelig tilsvarer determinantdeler av anvendes for å tilveiebringe antistoffer som er anvendbare ved påvisning av IL-2 i biologiske væsker (kultursupernatanter, sera og lignende) erholdt fra normale donatorer eller fra individer med forskjellige sykdomstilstander. Disse antistoffer kan anvendes ved direkte bindings- eller konkurrerende bindingsundersøkelser. Slike bindings-undersøkelser innbefatter: (a) konkurrerende inhibering med umerket IL-2 i en prøve av bindingen av et merket spesifikt antistoff overfor IL-2 eller et av foreliggende syntetiske polypeptider bundet til en fast bærer; (b) konkurrerende inhibering med umerket IL-2 i en prøve av bindingen av en kjent mengde av merket IL-2 eller et av foreliggende syntetiske polypeptider til et antistoff ifølge oppfinnelsen bundet til en fast bærer; (c) binding av IL-2 i en prøve til et første antistoff bundet til en fast bærer bestemt ved tilsetning av et andre merket antistoff. [De første og andre antistoffer er fortrinnsvis monoklonale antistoffer dannet mot IL-2-avledede polypeptider eller mot naturlig IL-2, og slike antistoffer kryssreagerer ikke (konkurrerer ikke for IL-2-binding)]> (d) konkurrerende inhibering med umerket IL-2 i en prøve av bindingen av et merket anti-idiotype-antistoff rettet mot et IL-2-beslektet monoklonalt antistoff.
Mengden av IL-2 bundet til celleoverflatereseptorer eller bindingsseter (og således mengden av tilstedeværende celleoverflatereseptorer i en prøve) kan også bestemmes som følger.
Celler med IL-2 overflatereseptorer inkuberes med umerket humant IL-2 (eller deler derav). Den resulterende suspensjon opprettholdes i et tidsrom tilstrekkelig for at interleukin—2 kan bindes til IL-2 celleoverflatereseptorene, og cellene vaskes deretter for å fjerne ubundet materiale. Mengden av interleukin-2 bundet til cellene kan deretter bestemmes ved å bringe bundet IL-2 i kontakt med antistoffer dannet mot et syntetisk IL-2 polypeptid (et anti-polypeptid-antistof f) merket med et indikerende middel, og separering av ethvert ubundet materiale. Mengden av merket anti-polypeptid-antistof f som bindes til IL-2 som signaleres med de indikerende midler, er et mål for mengden av IL-2 bundet til celleoverflatereseptorene. Mengden av IL-2 bundet til celleoverflatereseptorene, er enn videre proporsjonal med mengden av celleoverflatereseptorer i prøven.
I tillegg kan mengden av merket, affinitets-renset humant IL-2 (eller deler derav) bundet til celleoverflatereseptorer eller bindingsseter, bestemmes. I en slik
35
prosedyre merkes IL-2 internt f .eks. med S-methionin- og affinitets-renses på en immunosorbantkolonne som beskrevet
i det etterfølgende i avsnitt V. Alternativt kan IL-2 affinitets-renses og deretter eksternt merkes med<1>25I.
Cellene (f.eks. fra en pasient med en autoimmun sykdom) immobiliseres på filterskiver i 96—brønns immunofil-treringsplater hvor hver brønn er blokkert med en egnet serum- eller BSA-holdig buffer. Cellene omsettes deretter med økende konsentrasjoner av merket, affinitets—renset IL-2.
Ubundet IL-2 vaskes fra brønnene ved immunofiltrering, og mengden av merke gjenværende i hver brønn bestemmes. Standardkurver angående mengden av bundet IL-2 til konsentrasjonen av IL-2 tilsatt til hver brønn, kan deretter kon-strueres. Basert på den kjente molekylvekt av IL-2 og den spesifikke aktivitet av merket IL-2, vil dataene muliggjøre bestemmelse av antall IL—2-molekyler (og således antall av celleoverflatebindende seter) bundet ved metning.
Den ikke-spesifikke (umettbare) binding kan bestemmes ved å utfelle bindingsstudier i nærvær av et overskudd av umerket IL-2. Disse resultater trekkes deretter fra resul-tatene ved metning for å bestemme spesifikk binding.
V. Affinitetssorbanter for IL- 2- rensing
Affinitetssorbanter hvori de oligoklonale eller monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen utgjør de aktive, .bindende deler, utgjør en annen utførelsesform av oppfinnelsen.
I denne utførelsesform kjedes reseptorene slik som antistoffer fremstilt ifølge oppfinnelsen, til en fast bærer som er kjemisk inert overfor lymfokinet som skal renses med disse sorbanter. Angivelsen "kjemisk inert" anvendes her for å angi at en kjemisk reaksjon mellom den faste bærer og lymfokinet ikke finner sted. Fysiologiske interaksjoner mellom den faste bærer og lymfokinet slik som ikke-spesifikk binding, kan og vil imidlertid oppstå mellom disse, selv om slike interaksjoner fortrinnsvis nedsettes til et minimum.
Den faste bærer kan omfatte et utall av materialer slik som tverrbundet dextran, f .eks. Sephadejl® G-25, -50, -100, -200 og lignende tilgjengelig fra Pharmacia Fine Chemicals of Piscataway, NJ, agarose og tverrbundet agarose, f.eks. Sepharose® 6B, C16B, 4B, CL4B og lignende, også tilgjengelig fra Pharmacia Fine Chemicals; "Bio-Gel" A-0, 5M, A-1,5M,
A-50M, og lignende, tilgjengelig fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA; eller polyacrylamidperler, f. eks. "Bio-Gel" P-2, P-30, P-100, P-300 og lignende, også tilgjengelig fra Bio-Rad Laboratories. Polyacrylamidperler har den laveste ten-dens for ikke-spesifikk binding blant de ovenfor angitte bærere, men har også typisk en lav porøsitet som begrenser deres bindingskapasitet. Agarosen og tverrbundne agarose-materialer er her foretrukne og vil bli anvendt illustrativt som en fast bærer.
Agarosebæreren er typisk aktivert for binding under anvendelse av cyanogenbromid. Den aktiverte bærer vaskes deretter og kjedes til reseptormolekylene uten tørking av den aktiverte bærer. Den bærer-kjedede reseptor vaskes deretter og er klar for bruk. Uomsatte grupper på bæreren kan omsettes med et amin slik som ethanolamin eller Tris, om ønsket, selv om reaktiviteten av disse reaktive grupper avtar raskt.
Affinitetssorbanten kan anvendes i sin løse tilstand slik som i et begerglass eller en kolbe, eller kan pakkes i en kolonne. Før bruk er det fordelaktig at affinitetssorbanten vaskes i bufferen eller annet vandig medium som anvendes for lymfokinrensingen for å eliminere ikke-spesifikt bundne proteiner eller de reseptorer som ustabilt ble kjedet til bæreren.
En vandig sammensetning av IL-2 med en aminosyrerestsekvens svarende til aminosyrerestsekvensen av polypeptidet til hvilket antistoffene av affinitetssorbanten bindes slik som serum eller et celleekstrakt, tilveiebringes og blandes deretter med affinitetssorbanten. Denne blanding danner et reversibelt, kjedet antistoff-antigenkompleks mellom antistoffet og lymfokinet.
Komplekset separeres deretter fra resten av den ikke-kompleksdannede, vandige sammensetning under dannelse av lymfokinet i renset formreversibelt kjedet til affinitetssorbanten. Når blandingen finner sted i et begerglass eller kolbe, kan denne separasjon utføres ved filtrering og vasking. Når sorbanten er i en kolonne, kan separasjonen finne sted ved eluering av det ikke-kompleksdannede, van-dige medium, igjen fortrinnsvis etterfulgt av et vasketrinn.
Når det rensede protein ønskes fritt for affinitetssorbant, kan det typisk erholdes etter et flertall prosedyrer. I hvilke som helst av disse prosedyrer dissosieres det reversibelt kjedede kompleks i dets komponentdeler av bærer-kjedet antistoff og IL-2, etterfulgt av separering av IL-2 fra det kjedede antistoff under dannelse av det rensede lymfokin fritt for - affinitetssorbant.
Dissosiasjonen av det reversible kompleks kan utføres på et utall måter. En 0,2 molar glycin—hydrokloridløsning ved en pH-verdi på 2,5 anvendes typisk. Alternativt kan det bundne IL-2 konkurreres bort fra den kjedede reseptor ved blanding av det reversible kompleks med et overskudd av det immunogene polypeptid anvendt for å danne antistoffet. En slik konkurrering forhindrer mulig denaturering av IL-2. Separering av det dissosierte IL-2 fra affinitetssorbanten kan utføres som ovenfor beskrevet.
Fremstilling av affinitetssorbanter og deres anvendelse er vel kjent. Slike materialer og anvendelser som inkorporerer de oligoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, har imidlertid tidligere ikke vært tilgjengelige.
En detaljert beskrivelse av affinitetssorbanter, deres fremstillingsmetoder og bruk hvori antigenet er kjedet til bæreren, kan finnes i Antibody as a Tool, Marchalonis and Warr, forf., John Wiley&Sons, New York, side 64-67 og 76-96 (1982).
VI. Resultater
A. ELISA- reaktivitet av kanin- anti- polypeptidsera Kaniner ble immunisert med tetanus toxoid eller albuskjell hemocyaninkonjugater av kjemisk syntetiserte polypeptider bestående av 13 til 15 aminosyrerester hvis sekvenser hovedsakelig tilsvarer aminosyrerestsekvensen av en del av interleukin 2 (IL-2). De resulterende sera ble undersøkt i en ELISA for reaktivitet mot (gjenkjennelse av og binding til) det immuniserende polypeptid og delvis renset IL-2.
Spesifisitetskontroller innbefattet: (a) ubeslektede polypeptider; (b) falske preparater av humant IL-2 (dvs. supernatanten av tonsil-avledede celler dyrket uten mitogen og oppsamlet med supernatant av dyrkede, bestrålte lymfo-blastoidceller i PHA og PMA); og (c) okseserumalbumin. Ytterligere spesifisitetskontroller innbefattet (d) pre-immunsera for de immuniserte kaniner, og (e) hyperimmune kaninsera spesifikke for syntetiske peptider avledet fra aminosyrerestsekvensen av overflateantigenene av munn- og klovsykeviruset eller hepatitis B virus (i særdeleshet syntetiske polypeptider nr. 65 og 7 2 av munn- og klowirus og hepatitis som beskrevet i Kurz et al., Nucleic Acid Res., 9_, 1919 (1981) og Valenzuela et al., Nature, 280, 815
(1979)].
Fig. 3 viser representative resultater som demonstrerer spesifisiteten av kanin-anti-P82-serum (RCCP82). Anti-P8 2-sera hadde den høyeste anti-IL-2-titer av de fire anti-sera som var reaktive overfor IL-2. Anti-P82-sera (R ocP8 2) viste en meget sterkere reaksjon mot plater belagt med det immuniserende peptid P8 2 (panel A) og et tonsil IL-2-preparat (panel B) enn det preimmune, normale kaninserum (NRS) eller kanin-anti-P72-(hepatitis B) serum (RocP72). Anti-P82-serum produserte bare reaktivitet av bakgrunnsnivå mot et ubeslektet polypeptid P81 (panel C).
Som vist i etterfølgende tabell I, fremkalte alle polypeptider, bortsett fra polypeptid P8 3, høytitrede anti-polypeptid-antistof fer . Enn videre fremkalte fire av de åtte polypeptider antistoffer som reagerte med et tonsil-avledet IL-2-preparat i en fast fase ELISA.
Anti-IL-2-antistoffer ble først påvist en uke etter den tredje immunisering. Konsentrasjonen av antistoff var deretter tilbøyelig til å avta, men antistoffene var tilbøye-lige til å øke i titer etter en ytterligere behandling med polypeptid-bærerkonjugatet gitt 6-8 uker etter den tredje injeksjon. Antistoffer forble påvisbare i lengre perioder. Anti-IL-2-titere var lavere enn de respektive anti-polypep-tidtitere (tabell I). Ingen kryssreaktivitet blant de forskjellige IL-2-avledede polypeptider ble observert. De samme fire polypeptider som fremkalte IL-2-reaktive antistoffer i kaniner, fremkalte også dannelse av anti-IL-2-antistoffer i mus.
B. Inhibering av fast fase ELISA av løselige polypeptider
For å fastslå hvorvidt den samme antistoffpopulasjon reagerer med det immuniserende polypeptid og med IL-2, ble en ELISA utført i nærvær av økende konsentrasjoner av løse-lige polypeptider.
Som vist i fig. 4, ble reaktiviteten av anti-P84-serum mot fast fase P84 eller IL-2 spesifikt inhibert av P84 polypeptidet i løsning (50% inhibering ved 10-100 nanogram pr.
ml av polypeptid), men ikke av et ubeslektet polypeptid,
P81. Den samme begrensede populasjon av anti-polypeptid-antistoffer reagerte med IL-2, da et gitt løselig polypeptid spesifikt inhiberte bindingen av det bestemte anti-polypeptid-antistof f til IL-2.
C. Reaktivitet mot renset Jurkat IL- 2
Antiseraene som viste reaktivitet mot delvis renset tonsil-avledet IL-2, ble affinitetsrenset på kolonner av Affi-gel 10 koblet med det respektive polypeptid. Anti-polypeptid-antistof f er og anti-IL-2-antistoffer ble coeluert fra kolonnen etter tilsetning av en pH 2,5 glycin-HCl-buffer.
Binding av de affinitets-rensede antistoffer ble studert i en ELISA mot Jurkat-avledet IL-2 renset ved AcA-44 kromatografi og (isoelektrisk fokusering) IEF. Denne preparering ga et IL-2 enkeltbånd på en 10% SDS gel og ble betraktet å være 90% rent. Dette representerer en human IL-2-preparering som er mer ren enn det tonsil-avledede IL-2 som ble anvendt tidligere.
Som vist i fig. 5, reagerte affinitetsrensede anti-P82-antistoffer (Roe P82) spesifikt med det rensede IL-2 (TCGF) .
I andre lignende bestemmelser reagerte også affinitets-renset anti-P12-og anti-P84-antistof f er med renset Jurkat IL-2 eller rekombinant IL-2, mens anti-P81 manglet signifikant
aktivitet.
D. Korrelasjon av IL-2 biologisk aktivitet med EL I SA -
immunoreaktivitet
4 liter IL-2-holdig uren tonsil-supernatant ble fraksjonert på en AcA-44 kolonne, og individuelle fraksjoner ble testet med hensyn til biologisk aktivitet i en IL-2 biobestemmelse og for immunoreaktivitet med anti-polypeptid-antistoffer i en fast fase ELISA. I det sistnevnte tilfelle ble rene (ufortynnede) fraksjoner anvendt for å belegge ELISA-platene.
Fig. 6 viser resultater av en representativ bestemmelse med et affinitetsrenset kanin-anti—P84-antistoff. En glimrende korrelasjon mellom biologisk aktivitet og immunoreaktivitet ble funnet, og toppene av de to aktivitetsprofiler var var like.
Derimot reagerte ikke AcA-44-avledede fraksjoner av et falskt IL-2-preparat i noen signifikant grad med anti-polypeptid-antistof fet . En glimrende korrelasjon mellom biologisk aktivitet og immunoreaktivitetsprofiler ble enn videre funnet etter to ytterligere rensetrinn; spesifikt, kromatografi på Affi-gel-blått etterfulgt av DEAE-Sephacel<®>kromatografi.
En lignende korrelasjon ble observert med anti-P8 2-antistoffer, og i en mindre grad, med anti-Pl2-antistoffer. Disse resultater antyder sterkt at antigenet gjenkjent av anti-polypeptid-antistof f ene i de delvis rensede IL-2-preparater, faktisk er IL-2.
E. Western flekkanalyse
Western flekkteknikken [Towbin et al., Proe. Nati.
Acad. Sei. (USA), 76'4350 (1979)] ble anvendt for ytterligere å bestemme identiteten av antigenet i IL-2-holdige dyrkningssupernatanter som reagerer med anti-P84-antistoffer. Urene, konsentrerte tonsil-avledede supernatanter underkastet Western flekkanalyse, åpenbarte to nært anordnede proteinbånd, i molekylvektområdet på 15.000-18.000 dalton,
som reagerte med anti-P84-antistoff (fig. 7). Preimmunt
serum eller et ubeslektet antistoff reagerte ikke på lignende måte.
Enn videre ble biologisk aktivt IL-2 eluert i en
skarp topp fra en praktisk talt identisk posisjon i gelen (fig. 7). Disse resultater viser at: a) anti-P84-antistoff reagerer med et protein eller proteiner som vandrer i en stilling svarende til størrelsen av humant IL-2, og b) dette protein og den biologiske aktivitet av IL-2 samvandrer på gelen.
F. Immunofluorescens av PHA- stimulerte celler
En studie ble utført for å bestemme hvorvidt anti-polypeptid-antistof f ene reagerer in situ med IL-2-produserende celler. PHA-stimulert (eller kontroll) humant PBL ble fiksert og behandlet med et affinitetsrenset kanin-anti-P84-antistoff og et FITC-konjugert geite-anti-kanin IgG.
Cytoplasmisk farging av PHA-stimulert PBL ble observert (se fig. 8a). Spesifisitet av denne reaksjon ble demonstrert fordi: a) fargingen ble eliminert ved preinkubering av anti-P84-antistoffene med 2Cyug pr. ml av løselig P84 (fig. 8b), men ikke ved preinkubering med P81; b) ustimulert og lipopolysaccharid-stimulert PBL ble ikke farget; og c) PHA-stimulert PBL, behandlet med et anti-P7 2-(hepatitis B) antistoff, ble ikke farget under de samme betingelser .
VII. Materialer og metoder
A. Produksjon av humant IL- 2
IL-2 ble avledet fra humane tonsilceller og fra Jurkat human leukemisk T-cellelinje. Tonsiler fjernet under rutinemessig tonsilektomi, ble erholdt fra Children's Hospital i San Diego. Enkle cellesuspensjoner (2-5x10 9 celler pr. donor) ble fremstilt ved maling av tonsilene under aseptiske betingelser. Jurkat-celler (klon 10E4) ble erholdt fra dr. G. Dennert, Salk Institute for Biological Studies,
La Jolla, CA.
For IL-2-produksjon ble celler (både de humane tonsil- avledede og Jurkat-cellene) dyrket til 2x10 celler pr. ml i et dyrkningsmedium omfattende 2 deler RPMI-1640 medium (M.A. Bioproducts, Inc.), 1 del Dulbeccos . modifiserte Eagles medium (DMEM) (M.A. Bioproducts, Inc.) og 1 del
Hams F-12 medium (M.A. Bioproducts, Inc.).Dyrkningsmediet ble supplert med 4,5 g pr. 1 av glucose, 10 mikromolar ethanolamin, 5 yug pr. ml hver av en blanding av insulin, transférrin og natriumselenitt (ITS, Collaborative Research, Inc., Waltham, MA), 50^ug pr. ml gentamycin, 5x10 ^ molar 2-mercaptoethanol og 10 mikromolar HEPES buffer [4-(2-hydroxy-ethyl)-1—piperazinethan—sulfonsyre].
Produksjon av IL-2 ble stimulert i cellene ved tilsetning av et fytomitogen. Fytomitogener er en heterogen gruppe av proteiner som har få felles strukturelle trekk, men som erkarakterisert vedfølgende tre egenskaper hvor bare den første er vesentlig for at et protein skal betraktes som et fytomitogen: (1) spesifikk binding til sukkere, (2) agglutin-er ing av celler og (3) stimulering av lymfocytter. Ved å betrakte disse egenskaper ligner fytomitogener (også angitt som "lectiner") antistoffer, men avviker fra antistoffer ved at lectiner ikke produseres i respons på en spesifikk stimulus, lectiner er begrenset i sin spesifisitet til carbo-hydrater og lectiner er ikke immunoglobuliner, men omfatter en relativt uensartet gruppe av proteiner.
De tre lectiner som mest hyppig anvendes innen immuno-logien, er Concanavalin A (Con A) ekstrahert fra jack-bønner (Canavalia ensiformis), fytohemagglutinin (PHA) ekstrahert fra nyrebønner (Phaseolus vulgaris) og kermsbær mitogen
(PWM) som finnes i røttene og bladene av kermsbær (Phyto-lacca americana).
Etter tilsetning av et lectin vil ikke-delende lymfocytter vokse, differensiere og formere seg; med andre ord virker lectinet som en mitosis-stimulerende substans (et mitogen). Den mitogene effekt kan måles ved å telle for-størrede lymfocytter (blåster) eller ved bestemmelse av økningen i inkorporeringshastigheten av merket thymidin, uridin eller leucin i DNA, RNA eller protein.
Lectin-stimulerte lymfocytter utviser samme spekter
av funksjonelle karakteristika som lymfocytter stimulert med antigener. Eksempelvis utskiller stimulerte B-lymfocytter immunoglobuliner, mens stimulerte T-lymfocytter produserer lymfokiner som påvirker adferden av andre celler og som kan virke som cytotoksiske celler.
I foreliggende bestemmelse ble IL-2-produksjonen stimulert i Jurkat-cellene med 1% fytohemagglutinin-M
(PHA-M, Grand Island Biological Co., Grand Island, NY) og 50 nanogram pr. ml av forbolmyristatacetat (PMA, P-L Bio-chemicals, Inc., Milwaukee, WI). De tonsil-avledede celler ble stimulert under lignende betingelser, men med tilsetning av bestrålte (5.000 rad)Daudi [ATCC CCL 213] eller Raji [ATCC CL 86] lymfoblastoid-cellelinjeceller til en konsentrasjon på 0,5x10^ celler pr, ml.
Falske eller analoge IL-2-preparater ble dannet ved dyrkning av tonsilceller i fravær av PHA-M og PMA, og ved separat dyrkning av bestrålte Daudi eller Raji lymfoblastoid-celler i nærvær av PHA-M og PMA. Supernatantene av de to separate kulturer som manglet påvisbar IL—2-aktivitet, ble oppsamlet. Alle supernatanter ble høstet etter 4 2 timer ved sentrifugering ved 3.000 omdreininger pr. minutt (rpm)
i 15 minutter, ble filtrert og lagret fryste. Dette preparat vil i det etterfølgende bli angitt som "falskt IL-2-preparat".
B. Rensing av IL- 2
De tonsil-avledede supernatanter ble konsentrert 50 til 100 ganger ved ultrafiltrering gjennom en YM-10 membran (Amicon Corp., Lexington, MA). Hver konsentrert supernatant ble renset ved sekvensvis kromatografi innbefattende passasje gjennom en 5 cm x 90 cm eksklusjonskolonne av AcA-44-gel
(LKB Produkter AB, Bromma, Sverige), etterfulgt av passasje gjennom en 2,5 cm x 10 cm affinitetskolonne av Affi-gel-blått (Bio-Rad, Richmond, CA). Fraksjoner som utviste aktivitet ved IL—2 biobestemmelsen som er beskrevet i underavsnitt C i det etterfølgende, ble oppsamlet. Det oppsamlede aktive materiale ble ytterligere renset ved passasje gjennom en
AcA-44 kromatografikolonne.
Alternativt ble det oppsamlede, aktive materiale underkastet isoelektrisk fokusering (IEF) på en 100 ml IEF— kolonne (LKB Produkter AB, Sverige) i en amfolinblanding (LKB Produkter AB, Sverige) ved pH 3 til 10. Denne prosedyre resulterte i en 1.000 til 3.000 gangers rensing med en gjenvinning på 30-50% av den IL-2-biologiske aktivitet. IL-2 avledet fra Jurkatceller, ble renset ved en lignende prosedyre som beskrevet av Robb et al., J. Exp. Med., 154, 1455 (1981), men med følgende modifikasjoner. Etter konsentrering på en YM-10-membran ble cellekultur-supernatanten fraksjonert på en AcA-44 kolonne og elektrofokusert som ovenfor beskrevet.
C. IL- 2- biobestemmelse
Urene kultursupernatanter eller materialer erholdt under de forskjellige rensetrinn, ble testet med hensyn til IL-2-aktivitet ved metoden beskrevet av Gillis et al., J. Immunol., 120, 2027 (1978). En IL-2-avhengig linje, CTLL-2, erholdt fra dr. J. Watson i University of California, Irvine, ble anvendt som kilde for indikatorceller.
Kort angitt, ble testsupernatantene fortynnet to eller fire ganger i 20,ul RPMI-1640 medium supplert med kalvefosterserum (FCS) og 5x10 molar 2-mercaptoethanol. CTLL-2-cellene (lxlO<4>) ble tilsatt til de fortynnede test-supernatanter og ble inkubert ved 37°C i 24 timer i en fuktig atmosfære med 5% carbondioxyd. Kulturer ble høstet etter en 4-timers avslutningspuls med 1 mikrocurie tritiert thymidin ( 3HTdR, 6,7 curie pr. millimol, New England Nuclear, Boston, MA) på en Skatron cellehøster (Flow Laboratories, Rockville, MD) og ble tellet i en væske-scintilla-sjonsteller.
En tonsil-avledet supernatant som rutinemessig ga 50% av det maksimale<3>HTdR-opptak til en sluttfortynning på ca, 1:40, ble skjønnsmessig tilskrevet en aktivitet på 10 enheter pr. ml for sammenligningsformål. Aktiviteten i testsupernatantene ble beregnet ved å sammenligne fortynningene som ga 50% av den maksimale respons under anvendelse av regresjonsanalyse.
VIII. Peptidsynteser og utvelgelse
A. Syntese av polypeptider
Polypeptider innbefattende ca. 15 aminosyrer som skulle syntetiseres, ble utvalgt fra den publiserte sekvens av humant IL-2 som beskrevet i Taniguchi et al., Nature,
302, 309 (1983). Denne utvelgelse var basert delvis på en serie av regnemaskinanalyser for å bestemme de aminosyrerestsekvenser av humant IL-2 som mest sannsynlig ville bli avdekket på overflaten av det naturlige protein. Se f.eks. Richmond et al., J. Mol. Biol. 119, 537 (1978).
Polypeptidene ble kjemisk syntetisert ved fast fasemetoder som beskrevet i Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc, 8_5, 2149 (1963) og Houghten et al., Int. J. Peptide Protein Research, Ij6, 311 (1980) . De relativt korte polypeptider anvendt her, svarer hovedsakelig til antigene determinanter av humant IL-2.
Fig. 1 viser den 153 aminosyrerestsekvens av IL-2. Aminosyrerestsekvensene av de 8 syntetiske polypeptider beskrevet her, er vist i fig. 1 og 2. I visse tilfeller ble en cysteinrest tilsatt til aminoenden eller carboxyenden av enkelte av polypeptidene for å medhjelpe til kobling til en proteinbærer som beskrevet i det etterfølgende. Sammenset-ningen av alle polypeptider ble bekreftet ved aminosyre-analyse.
Generelt fremstilles et immunogen eller syntetisk polypeptid ved trinn for å tilveiebringe et flertall av aminosyrer som tilsvarer aminosyrerestene av et antigent determinantområde av interleukin-2 og syntetisering av disse aminosyrer til et polypeptid som har en peptidsekvens svarende til peptidsekvensen av denne antigene determinant. Det fremstilte syntetiske polypeptid kan anvendes for å produsere en vaksine, vanligvis ved kjeding av dette til en bærer under dannelse av et konjugat, hvoretter konjugatet dispergeres i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.
Polypeptidene syntetiseres fortrinnsvis i henhold til de ovenfor omtalte fast fasemetoder under anvendelse av en cysteinharpiks. Se Merrifield et al., supra. Sidekjedene av
individuelle aminosyrer beskyttes som følger: Arg-tosyl,
Ser, Thr, Glu og Asp<->O-benzyl; Tyr-O-brombenzyloxycarbamyl; Trp-N-formyl. N-formylgruppen på Trp-restene fjernes etter splitting av peptidet fra harpiksbæreren ved behandling med 1,0 molar ammoniumbicarbonat til en peptidkonsentrasjon på 1,0 mg/ml i 16 timer ved romtemperatur. Yamashiro et al.,
J. Org. Chem., 38_, 2594-2597 (1973). Effektiviteten av koblingen ved hvert trinn kan overvåkes med ninhydrin eller picrinsyre og er fortrinnsvis mere enn 99% i alle tilfeller. Se Gisin, Anal. Chem. Acta, 58, 248-249 (1972) og Kaiser, Anal. Biochem., 3£, 595-598 (1980).
B. Fremstilling av polymerer
Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan kobles sammen under dannelse av en antigen polymer omfattende et flertall av polypeptidene.
En slik polymer har den fordel at den utviser forøket immunologisk reaksjon og hvor forskjellige polypeptider anvendes for å danne polymeren, har den ytterligere evne til å fremkalle antistoffer som immunoreagerer med flere antigeniske determinanter av interleukin-2.
En polymer kan fremstilles ved syntetisering av polypeptidene som ovenfor diskutert, og ved tilsetning av cysteinrester ved både amino- og carboxy-endene under dannelse av et diCys-polypeptid. Deretter oppløses 10 mg av diCys-polypeptidet (inneholdende cysteinrester i uoxydert form) i 2 50 ml 0,1 molar ammoniumbicarbonatbuffer. Det oppløste diCys-polypeptid luftoxyderes deretter ved forsiktig omrør-ing av den resulterende løsning i et tidsrom på ca. 18 timer, eller inntil det ikke er noe påvisbart, fritt mercaptan ved Ellman-testen. [Se Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 8_2:70-77 (1959)]. Den således fremstilte polymer inneholder et flertall av polypeptidene ifølge oppfinnelsen som repeterende enheter. Disse polypeptidrepeterende enheter er bundet sammen ved oxyderte cysteinrester.
C. Kobling av polypeptider til proteinbærere
De syntetiske polypeptider ble koblet til albuskjell hemocyanin (KLH) eller tetanus toxoid (TT) ved den ene eller andre av følgende to metoder. I den første metode ble bæreren aktivert med m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester og ble deretter koblet til polypeptidet gjennom en cysteinrest tilsatt til amino- eller carboxy-enden av polypeptidet, som beskrevet i Liu et al., Biochem., 8_0, 690
(1979). Ved den andre metode ble polypeptidet koblet til bæreren gjennom frie aminogrupper under anvendelse av en 0,04% glutaraldehydløsning, hvilket er vel kjent. Se f.eks. Klipstein et al., J. Infect. Dise, 147, 318 (1983).
Som tidligere diskutert, er cysteinrester tilsatt til amino- og/eller carboxy-endene av det syntetiske polypeptid, blitt funnet å være særlig anvendbare for dannelse av konjugater via disulfidbindinger og Michael addisjonsreak-sjonsprodukter, men andre metoder velkjente innen faget for fremstilling av konjugater kan også anvendes. Eksempler på ytterligere bindingsprosedyrer innbefatter anvendelse av dialdehyder slik som glutaraldehyd (diskutert ovenfor) og lignende, eller anvendelse av carbodiimidteknologi slik som ved anvendelse av et vannløselig carbodiimid, f.eks. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.
Anvendbare bærere er velkjente innen faget og er generelt proteiner i seg selv. Eksempler på slike bærere er albuskjell hemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albuminer slik som okseserumalbumin eller humant serumalbumin (BSA eller HSA), røde blodceller slik som saueerythrocytter (SRBC), tetanus toxoid, såvel som polyaminosyrer slik som poly-(D-lysin:D-glutaminsyre) og lignende.
Som velkjent innen faget, er det ofte gunstig å binde det syntetiske polypeptid til dets bærer ved hjelp av en intermediær, kjedende gruppe. Som ovenfor angitt, er glutaraldehyd en slik kjedende gruppe. Når imidlertid cystein anvendes, er den intermediære kjedende gruppe fortrinnsvis en m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS). MBS tilsettes typisk først til bæreren ved en ester-amid-utvekslingsreaksjon. Deretter kan den ovenfor angitte Michael-reaksjon følges, eller addisjonen kan følges av addisjon av en blokkert mercaptogruppe slik som thioeddiksyre (CH^COSH) over maleimido-dobbeltbindingen. Etter splitting av den acylblokkerende gruppe dannes en disulfidbinding mellom den deblokkerte, kjedende mercaptangruppe og mer-captanet av den tilsatte cysteinrest av det syntetiske polypeptid .
Valg av bærer er mer avhengig av den endelige beregnede anvendelse av antigenet enn av determinantdelen av antigenet, og er basert på kriterier som ikke er noe særlig involvert i følgende oppfinnelse. Hvis f.eks. en vaksine skal anvendes i dyr, må det velges en bærer som ikke utvikler en uønsket reaksjon i det bestemte dyr. Hvis en vaksine skal anvendes på mennesker, vil de alt overveiende forholdsregler innbefatte mangel på immunokjemisk eller annen bivirkning av bæreren og/eller det resulterende antigen, sikkerhet og effektivitet, dvs. de samme forholdsregler som gjelder for enhver vaksine som er beregnet for human bruk.
IX. Immuniseringsprosedyrer
Inokulaene eller vaksinene anvendt her, inneholder den angitte mengde av polypeptid alene som en polymer av individuelle polypeptider kjedet sammen gjennom reaksjon med glutaraldehyd, eller som et konjugat kjedet til en bærer. Disse inokula kan inneholde polypeptid-ender etterfulgt av oxydasjon med f.eks. atmosfærisk oxygen ved moderate pH-verdier mellom pH 7 og pH 10, og til polypeptidkonsentra-sjoner på 20^ug til 500 mg pr. inokulering. De angitte mengder av polypeptid refererer til vekten av polypeptid uten vekten av en bærer når en bærer anvendes.
Inokulaen inneholdt også et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel slik som vann eller saltvann, og innbefattet enn videre typisk en adjuvans. Adjuvanser slik som Freunds fullstendige adjuvans (CFA), Freunds ufullstendige adjuvans (IFA) og alun, er materialer som er velkjente innen faget og som er kommersielt tilgjengelige fra flere kilder.
Inokula-lagerløsninger ble fremstilt med CFA, IFA eller alun som følger: En mengde av det syntetiske poly peptid, polymere polypeptid eller konjugat tilstrekkelig til å tilveiebringe den ønskede mengde av polypeptid pr. inokulering, ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) til en pH-verdi på 7,2 eller en hvilken som helst annen egnet pH-verdi. Like volumer av CFA, IFA eller alun ble deretter blandet med polypeptidløsningen under dannelse av et inokulum inneholdende polypeptid, vann og adjuvans hvori vann-til-olje-forholdet var ca. 1:1. Blandingen ble deretter homogenisert under dannelse av inokula—lagerløsningen.
Kaniner ble injisert intramuskulært med et inokulum omfattende 300 til 400^um av polypeptidkonjugat emulgert i Freunds fullstendige adjuvans (CFA), Freunds ufullstendige adjuvans (IFA) eller ble blandet med alun (5 mg pr. ml i hvert tilfelle) på dag 0, 14 og 21. Hver immunisering besto av 4 intramuskulære injeksjoner av inokulumet i siden på dyrene. Mus ble immunisert på en lignende måte under anvendelse av 1/10 av den ovenfor angitte dose pr. injeksjon.
Dyrene ble tappet for blod 7 og 14 dager etter den siste injeksjon. I enkelte tilfeller mottok dyrene for-sterkningsinjeksjoner i alun og ble deretter tappet for blod om nødvendig. Kontroll-preimmunt serum ble erholdt fra hvert dyr ved blodtagning like før den første immunisering.
Inokula-lagerløsninger kan også fremstilles med albuskjell hemocyanin (KLH), KLH i IFA (Freunds fullstendige adjuvans), KLH-alun-absorbert, KLH-alun-absorbert-pertussis, edestin, tyroglobulin, tetanus toxoid og tetanus toxoid i IFA.
Etter injeksjon eller annen innføring av antigenet ellet inokulumet i verten svarer vertens immunsystem med å produsere store mengder av antistoff mot antigenet. Da den spesifikke antigeniske determinant av det fremstilte antigen, dvs. antigenet dannet fra det syntetiske polypeptid og bæreren immunologisk tilsvarer hovedsakelig determinanten av det naturlige antigen av interesse, blir verten immun mot det naturlige antigen. I det tilfellet hvor oppfinnelsen anvendes som en vaksine, er dette det ønskede resultat.
Den effektive mengde av polypeptid pr. inokulering av- henger bl.a. av den inokulerte dyreart, kroppsvekten av dyret og det valgte inokuleringssystem, hvilket er velkjent. Inokulaer fremstilles typisk fra det tørkede, faste polypeptid eller polypeptidpolymer ved suspendering av polypeptidet eller polypeptidpolymeren i vann, saltvann eller adjuvans, eller ved binding av polypeptidet til en bærer og suspendering av det bærer-bundne polypeptid (konjugat) i et lignende, fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel slik som en adjuvans (som tidligere beskrevet). En effektiv mengde av polypeptid tilstedeværende i en vaksine, kan være fra 20yug til 500 mg pr. inokulering, ikke innbefattende vekten av bæreren.
X. Diagnostikk
Sera eller affinitetsrensede antistoffer (som blod-prøver) ble undersøkt i en enzymkjedet immunosorbentbestemmelse (ELISA) . Rundbunnede "immulon" 2 mikrotiterplater (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) med 96 brønner pr. plate ble belagt med løsninger av polypeptidene (500 ng pr. ml), delvis renset IL-2 (50 til 100 enheter pr. ml) eller 1% okseserumalbumin (BSA). Serumfortynninger av sera i 1% BSA-buffer ble tilsatt til platene for å blokkere ikke-spesifikke proteinbindingsseter i brønnene på platene. Platene ble deretter opprettholdt (inkubert) i 1 time ved 37°C og ble vasket 8 ganger med en fosfatbufret saltvanns-løsning (PBS) (pH 7,2) inneholdende 0,05% polyoxyethylen (20)
(R1)
sorbitanmonolaurat (Tweerr-^ 20) .
Platene ble deretter opprettholdt i 1 time ved 3 7°C med en 1:2000 fortynning av affinitetsrenset, pepperrot-peroxydase(HRP)-konjugert geite-anti-mus IgG + IgM for å måle museantistoffer eller geite-anti-kanin IgG for å måle kaninantistoffer (Tago Inc,, Burlingame, CA).
Deretter ble platene vasket med vann, og peroxydase-merkede antistoffer bundet til den faste bærer, ble omsatt med en løsning av 0,4 mg pr. ml av ortho-fenylendiamin og 0,006% hydrogenperoxyd (begge erholdt fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i en citrat-fosfatbuffer ved pH 5,0 for å utvikle fargemerket. Reaksjonen ble stoppet etter 15-30 minutter i mørket ved tilsetning av 50^ul av 2 molar svovelsyre. Absorbansen ble bestemt ved 4 90 nm i en MR600 Microplate Reader (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA).
Mengden av antistoff i serumet som var nødvendig for
å mette halvparten av polypeptidet og halvparten av IL-2
som var belagt på hver plate, ble deretter beregnet under anvendelse av standardteknikker. Disse resultater er vist i tabell 1 i avsnitt VI(A).
XI. Affinitetsrensing av kanin- anti- polypeptid- antistoffer
2 mg polypeptid ble oppløst i 1 ml 100 millimolar 3-N-morfolinopropan-sulfonsyre-(MOPS) buffer (pH 7,5) tilsatt til 2 ml vasket Affi-gel 10 (Bio-Rad, Richmond, VA) og opprettholdt ved 4°C over natten. Uomsatte grupper på gelen ble blokkert med 1/10 volum 1 molar ammoniumklorid i 1 time ved romtemperatur (23°C). Det gelkoblede polypeptid ble deretter vasket med PBS etterfulgt av vasking med 100 millimolar glycin—HCl-buffer (pH 2,5) og ble pakket i en 1x2 cm kolonne av en plastsprøyte.
Immunt kaninserum (5-20 ml) ble tilsatt til kolonnen i en strømningshastighet på 20-40 ml pr. time. Kolonnen ble vasket med PBS, og bundet antistoff ble eluert med 100 millimolar glycin-HCl-buffer ved pH 2,5. Syreeluatene (2 ml pr. fraksjon) ble nøytralisert med 1/20 volum 1 molar Tris-HCl-buffer (2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol).
Fraksjoner ble undersøkt ved en ELISA som ovenfor beskrevet, på polypeptid-belagte eller IL—2-belagte plater,
og deres proteininnhold ble bestemt ved Lowry-metoden som beskrevet i Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951). Aktive eluatfraksjoner ble oppsamlet, konsentrert til
1-5 mg protein pr. ml, dialysert mot PBS, etterfulgt av dialyse mot 100 MOPS buffer, pH 7,5, og ble lagret ved -20°C.
XII. Western- blått analyse
Proteinbestanddeler i urene 100-gangers konsentrerte IL—2-holdige supernatanter ble separert ved natriumdodecyl sulfat (SDS)-polyacrylamidgel-elektroforese som beskrevet i Laemmli, Nature, 227, 580 (1970), og ble deretter elektroforetisk blottet på nitrocellulosepapir som beskrevet i Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Science, USA, 7_ 6, 4350
(1979) .
Flekkene ble blokkert for å minimere ikke-spesifikk binding av antistoffene og ble merket med affinitetsrenset anti-P84 antistoff (5^ug pr. ml) under anvendelse av en modifikasjon av standardprosedyrer som beskrevet i [Johnson et al., Gene Anal. Tech., 1, 3 (1984)].
De blokkerte og merkede flekker ble deretter vasket
3 ganger med blokkerende buffer [Johnson et al., Gene Anal. Tech., 1, 3 (1984)] og opprettholdt i 1 time ved romtemperatur
125
med I-Staphylococcus aureus protein A til en konsentrasjon på 1x10 tellinger pr. minutt pr. gelspor. Det radiomerkede protein A tilveiebringer et merke for nærvær av IgG-antistoffer via en kompleksdannelsesreaksjon.
De protein A-merkede flekker ble vasket grundig som ovenfor angitt, skyllet med vann, tørket og underkastet autoradiografi. En parallellgel ble kuttet i et flertall av 2 ml tykke skiver, og skivene ble eluert ved maling og inkubering av disse i 300^ul 5% FCS-supplert dyrkningsmedium i 16 timer ved 37°C. Mediet ble deretter inkubert ved 4°C i 4 timer for å utfelle SDS fra gelene. Bunnfallet ble fjernet ved sentrifugering, og supernatantene ble testet med hensyn til IL— 2—aktivitet som ovenfor beskrevet.
XIII. Immunofluorescens
Humane perifere blodlymfocytter (PBL) ble separert
fra heparinisert blod ved Ficoll-Hypaque sentrifugering (<t>ølstopaque"-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Cellene ble dyrket til 2xl0<6>celler pr. ml i RPMI-1640 medium pluss 5% kalvefosterserum (FCS) i fravær eller nærvær av 0,5% fytohemagglutinin-M. Cellene ble høstet to dager senere, ble vasket to ganger og pelletisert på glassplater under anvendelse av en cytosentrifuge.
Platene ble fiksert i 5 minutter med methanol, vasket med vann og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med 10-50yug pr. ml anti-IL-2-polypeptid-antistoff eller kontroll-antistoff i PBS og 10% FCS. Etter vasking av glassplatene med vann ble hver plate behandlet med en 1:50 fortynning av fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugert geite-anti-kanin IgG (CappelLaboratories, Cochranville, PA) i 30 minutter ved 4°C, ble vasket med vann og observert i et Zeiss mikroskop under fase- og fluorescensmikroskopi.
Det foregående er beregnet som en illustrasjon av oppfinnelsen, men begrenser ikke denne. Utallige variasjoner og modifikasjoner kan foretas uten å avvike fra oppfinnelsens ramme. Det skal forstås at ingen begrensning med hensyn til de spesifikke antistoffer, sammensetninger og bruk som er her beskrevet, er beregnet.

Claims (21)

1. Syntetisk polypeptid inneholdende 6 til 40 aminosyrerester med en aminosyrerestsekvens som hovedsakelig tilsvarer en aminosyrerestsekvens av en antigenisk determinant av interleukin-2, hvilket syntetiske polypeptid i seg selv, som en polymer eller som et konjugat av angitte polypeptid bundet til en bærer og injisert i en vert i en effektiv mengde og 1 et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel, har evne til å fremkalle produksjon av antistoffer overfor angitte antigeniske determinant av interleukin-2.
2. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, innbefattende sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, representert av formelen:
3. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, innbefattende sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, representert av formelen:
4. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, innbefattende sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, representert av formelen:
5. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, innbefattende sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, representert av formelen:
6. Inokulum omfattende en effektiv mengde av et syntetisk polypeptid inneholdende 6 til 40 aminosyrerester med en amino syrerestsekvens som immunologisk tilsvarer hovedsakelig en aminosyresekvens av en antigenisk determinant av interleukin-2, og et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel, hvilket inokulum, når dette innføres i en vert, er i stand til å fremkalle produksjon av antistoffer i verten som immunoreagerer med angitte antigeniske determinant av interleukin-2.
7. Inokulum ifølge krav 6, karakterisert ved at det syntetiske polypeptid innbefatter sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxy-enden, representert av formelen:
8. Inokulum ifølge krav 6, karakterisert ved at det syntetiske polypeptid innbefatter sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxy-enden, representert av formelen:
9. Inokulum ifølge krav 6, karakterisert ved at det syntetiske polypeptid innbefatter sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxy-enden, representert av formelen:
10. Inokulum ifølge krav 6, karakterisert ved at det angitte syntetiske polypeptid innbefatter sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, representert av formelen:
11. Inokulum ifølge krav 6, karakterisert ved at det angitte, syntetiske polypeptid er bundet til en bærer valgt fra gruppen bestående av albuskjell hemocyanin, albuskjell hemocyanin i Freunds ufullstendige adjuvans, alun, albuskjell hemocyanin-alun-absorbert, albuskjell hemocyanin—alun-absorbert-pertussis, edestin, thyroglobulin, tetanus toxoid og tetanus toxoid i Freunds ufullstendige adjuvans.
12. Antistoffer dannet i et dyr mot et syntetisk polypeptid inneholdende 6 til 10 aminosyrerester med en aminosyresekvens som immunologisk tilsvarer hovedsakelig en aminosyresekvens av en antigenisk determinant av interleukin-2, hvilke antistoffer har evnen til å immunoreagere med angitte antigeniske determinant av interleukin-2.
13. Antistoffer ifølge krav 12, karakterisert ved at angitte syntetiske polypeptid innbefatter en sekvens av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, representert av formelen og valgt fra gruppen bestående av:
14. Diagnostisk system for bestemmelse av nærvær av en antigenisk determinant av interleukin-2, omfattende i biokjemisk aktiv form antistoffer dannet i en dyrevert mot et syntetisk polypeptid inneholdende 6 til 40 aminosyrerester, med en aminosyresekvens som immunologisk tilsvarer hovedsakelig en aminosyresekvens av en antigenisk determinant av interleukin-2, hvilke antistoffer immunoreagerer med en tilblandet prøve som skal undersøkes, under dannelse av en immunoreaktant hvis nærvær signaliseres av et indikerende middel.
15. Diagnostisk system ifølge krav 14, karakterisert ved at de angitte syntetiske polypeptider innbefatter sekvensen av aminosyrerester, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, representert av formelen og valgt fra gruppen bestående av:
16. Diagnostisk system ifølge krav 14, ytterligere innbefattende et indikerende middel omfattende enzymkjedede andre antistoffer, hvilke andre antistoffer er dannet mot antistoffer av den samme klasse og fra samme art som først-nevnte antistoffer, og som signaliserer angitte immunoreaksjon ved binding til angitte førstnevnte antistoffer tilstedeværende i angitte immunoreaktant, hvilket signal indikeres ved omsetning av angitte, kjedede enzym med et tilsatt substrat.
17. Diagnostisk system ifølge krav 14, karakterisert ved at angitte, indikerende midler omfatter et radioaktivt element bundet til angitte antistoffer, og at angitte immunoreaksjon fremkaller ut-felling av angitte immunoreaktant inneholdende angitte radioaktive element.
18. Diagnostisk system for bestemmelse av nærvær av en antigenisk determinant av interleukin-2 i en kroppskomponent, omfattende i separate beholdere (a) et første reagens som inneholder i biologisk aktiv form et syntetisk polypeptid inneholdende en sekvens på 6 til 40 aminosyrerester som immunologisk tilsvarer hovedsakelig en aminosyrerestsekvens av angitte antigeniske determinant av interleukin-2, hvilket polypeptid, når dette er kjedet til en bærer som et konjugat og innført i en effektiv mengde som en vaksine i et vertdyr, er i stand til å fremkalle produksjon av antistoffer i verten som immunoreagerer med angitte antigeniske determinant av interleukin- 2 j og (b) et andre reagens som inneholder i biokjemisk aktiv form et anti-polypeptid-antistoff som immunoreagerer med angitte, syntetiske polypeptid} sammen med midler for indikering av nærvær av en immunoreaksjon mellom angitte første og andre reagenser; hvilke første og andre reagenser, når disse blandes i på forhånd bestemte mengder i nærvær av en på forhånd bestemt mengde kroppskomponent som skal undersøkes, gir en grad av immunoreaksjon som signaliseres av angitte, indikerende midler hvor graden av angitte immunoreaksjon er forskjellig fra en kjent immunoreaksjonsgrad når interleukin-2 innbefattende angitte antigeniske determinant, ikke er til stede i angitte kroppskomponent.
19. Fremgangsmåte for dannelse av et anti-polypeptid-antistof f, omfattende trinnene: (a) administrering til en vert av et syntetisk polypeptid i en mengde tilstrekkelig til å fremkalle produksjon av antistoffer overfor en antigenisk determinant av interleukin-2, hvilket syntetiske polypeptid har en aminosyrerestsekvens som hovedsakelig tilsvarer aminosyrerestsekvensen av en antigenisk determinant av interleukin-2; og (b) de således dannede anti-polypeptid-antistoffer gjenvinnes.
20. Fremgangsmåte for undersøkelse av nærvær av en antigenisk determinant av interleukin-2 i en prøve, omfattende: (a) tilveiebringelse av et anti-polypeptid-antistoff overfor et syntetisk polypeptid ifølge krav 1; (b) blanding av en på forhånd bestemt mengde av angitte anti-polypeptid-antistoff med en på forhånd bestemt mengde av prøve som skal undersøkes for nærvær av den antigeniske determinant til hvilken anti-polypeptid-antistoffet bindes; (c) opprettholdelse av blandingen i et tidsrom tilstrekkelig for at angitte anti-polypeptid-antistoff kan bindes til den antigeniske determinant tilstedeværende i den blandede prøve; og (d) bestemmelse av graden av binding mellom angitte anti-polypeptid-antistoff og angitte antigeniske determinant av interleukin-2.
21. Affinitetssorbant omfattende en inert, fast bærer som har kjedet dertil i biokjemisk aktiv form antistoffer dannet i en dyrevert mot et syntetisk polypeptid inneholdende 6 til 40 aminosyrerester, med en aminosyresekvens som immunologisk tilsvarer hovedsakelig en aminosyresekvens av en antigenisk determinant av interleukin-2, hvilken affinitetssorbant danner et reversibelt kompleks når den blandes med en vandig sammensetning inneholdende et interleukin-2.
NO854887A 1984-04-05 1985-12-04 Antistoffer mot humant interleukin-2 fremkalt av syntetiske polypeptider. NO854887L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/597,179 US4636463A (en) 1984-04-05 1984-04-05 Antibodies to human interleukin-2 induced by synthetic polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO854887L true NO854887L (no) 1986-01-29

Family

ID=24390429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO854887A NO854887L (no) 1984-04-05 1985-12-04 Antistoffer mot humant interleukin-2 fremkalt av syntetiske polypeptider.

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4636463A (no)
EP (1) EP0157643A3 (no)
JP (1) JPS61501912A (no)
AU (1) AU4119085A (no)
ES (1) ES8607564A1 (no)
IL (1) IL74784A0 (no)
NO (1) NO854887L (no)
WO (1) WO1985004653A1 (no)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5939832A (ja) * 1982-08-28 1984-03-05 Ajinomoto Co Inc モノクロ−ナル抗体ならびにその製法、使用法
US4636463A (en) * 1984-04-05 1987-01-13 Scripps Clinic And Research Foundation Antibodies to human interleukin-2 induced by synthetic polypeptides
JPS61225199A (ja) * 1985-03-29 1986-10-06 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ヒトインタ−ロイキン2ポリペチド誘導体
KR940004077B1 (ko) * 1985-04-18 1994-05-11 바이오테크놀로지 오스트레일리아 프로프라이어터리 리밋티드 재조합 인히빈
CN86104525A (zh) * 1985-07-31 1987-02-25 武田药品工业株式会社 人类白细胞介素-2的分析方法和试剂
US5866363A (en) 1985-08-28 1999-02-02 Pieczenik; George Method and means for sorting and identifying biological information
ATE165363T1 (de) * 1985-08-28 1998-05-15 George Pieczenik Verfahren und mittel zur sortierung und bestimmung biologischer informationen
US4816401A (en) * 1985-09-09 1989-03-28 University Of Rochester Serum free cell culture medium
US5496924A (en) * 1985-11-27 1996-03-05 Hoechst Aktiengesellschaft Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion
WO1988000970A2 (en) * 1986-08-08 1988-02-11 Regents Of The University Of Minnesota Method of culturing leukocytes
US4882424A (en) * 1987-05-11 1989-11-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Activation antigen
US5149788A (en) * 1987-05-19 1992-09-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Purification of chimeric proteins containing an IL-2 moiety by receptor-affinity chromatography
US5089603A (en) * 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
DE68928704T2 (de) * 1988-03-24 1998-12-10 Terrapin Technologies, Inc., San Francisco, Calif. Gruppe von getrennten peptiden
JPH03500415A (ja) * 1988-07-05 1991-01-31 アムジエン・インコーポレーテツド インターロイキン2類似体
US5208218A (en) * 1988-09-19 1993-05-04 Ludwig Institute For Cancer Research T cell growth factor glycoproteins
EP0440742B1 (en) * 1988-10-27 1997-01-15 The Regents Of The University Of Minnesota Liposome immunoadjuvants containing il-2
US5310875A (en) * 1989-06-21 1994-05-10 Tanox Biosystems, Inc. Peptides corresponding to membrane-bound IgA
CA2019714A1 (en) * 1989-06-27 1990-12-27 Richard A. Chizzonite Process for the determination of interleukins
US5484735A (en) * 1989-08-23 1996-01-16 Northwestern University Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids
DE4024919A1 (de) * 1990-08-06 1992-02-13 Boehringer Mannheim Gmbh Peptide mit fuer (alpha)1-mikroglobulin charakteristischer antigener determinante
ATE171071T1 (de) * 1991-12-31 1998-10-15 Zymogenetics Inc Verfahren und zusammensetzungen zur verminderung von blutverlust
AU669889B2 (en) * 1992-03-09 1996-06-27 Ludwig Institute For Cancer Research Nucleic acid sequences coding for or complementary to nucleic acid sequences coding for interleukin 9 receptor
GB9312874D0 (en) * 1993-06-22 1993-08-04 Biokine Tech Ltd Peptides for use in medicine
US6297361B1 (en) * 1997-01-06 2001-10-02 Promega Corporation Use of histidine decarboxylase immunoreactivity to detect human cancer
US7153943B2 (en) * 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
US7495087B2 (en) 1997-07-14 2009-02-24 Bolder Biotechnology, Inc. Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
BR9812267B1 (pt) * 1997-07-14 2013-11-26 Hormônio de crescimento recombinante.
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
CA2219961C (en) * 1998-01-09 2010-06-01 The University Of Southern California Vasopermeability enhancing peptide of human interleukin-2 and immunoconjugates thereof
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US7727560B2 (en) * 2004-05-18 2010-06-01 Sou Yi Lu Treating cancer, liver, kidney, platelet and hemopoietic disorder or complication

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4218436A (en) * 1977-09-21 1980-08-19 The Upjohn Company Compounds and methods
FI83662C (fi) * 1980-07-17 1991-08-12 Scripps Clinic Res Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning.
US4438030A (en) * 1980-07-25 1984-03-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Antibodies to immunogenic peptides and their use to purify human fibroblast interferon
US4473493A (en) * 1981-04-29 1984-09-25 Immunex Corporation Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4478744A (en) * 1982-01-25 1984-10-23 Sherwood Medical Company Method of obtaining antibodies
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4493795A (en) * 1983-10-17 1985-01-15 Syntex (U.S.A.) Inc. Synthetic peptide sequences useful in biological and pharmaceutical applications and methods of manufacture
US4636463A (en) * 1984-04-05 1987-01-13 Scripps Clinic And Research Foundation Antibodies to human interleukin-2 induced by synthetic polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
US4636463A (en) 1987-01-13
JPS61501912A (ja) 1986-09-04
ES8607564A1 (es) 1986-06-16
ES541867A0 (es) 1986-06-16
EP0157643A2 (en) 1985-10-09
WO1985004653A1 (en) 1985-10-24
EP0157643A3 (en) 1987-07-15
AU4119085A (en) 1985-11-01
IL74784A0 (en) 1985-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO854887L (no) Antistoffer mot humant interleukin-2 fremkalt av syntetiske polypeptider.
Urbanski et al. Topographic Determinants on Cytochrome c: I. The Complete Antigenic Structures of Rabbit, Mouse, and Guanaco Cytochromes C in Rabbits and Mice
CA1219232A (en) Polypeptide-induced monoclonal receptors to protein ligands
WO1996013593A2 (en) Soluble single chain t cell receptors
CA1253069A (en) Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell and b cell determinants
CA1257540A (en) Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products
AU6523590A (en) Novel peptides associated with the cd4 binding region of gp120 and their methods of use
CA2158047C (en) Allergenic protein and peptides from house dust mite and uses therefor
EP0812332A1 (en) AN IMMUNOINTERACTIVE MOLECULE WHICH BINDS THE $i(TIE)2/TEK RECEPTOR EXTRACELLULAR DOMAIN
WO1988000346A1 (en) Monoclonal antibodies to unreduced, nonenzymatically-glycated proteins
Altman et al. Antibodies of predetermined specificity against chemically synthesized peptides of human interleukin 2.
Moore et al. Rodent IgE-binding factor genes are members of an endogenous, retrovirus-like gene family.
Quaranta et al. Distribution of antigenic determinants recognized by three monoclonal antibodies (Q2/70, Q5/6 and Q5/13) on human Ia-like alloantigens and on their subunits
US5310729A (en) Interferon-related polypeptides as CR2 ligands and their use for modulating immune cell functions
US7122193B1 (en) Retro peptides, antibodies thereto and their uses for vaccination and in vitro diagnosis
JPS6327498A (ja) Htlv−iii/lavウイルス関連ペプチド
Rathjen et al. Identification of antigenic determinants on insulin recognized by monoclonal antibodies
JP4318458B2 (ja) pan特異的モノクローナル抗体
Shih et al. Characterization and quantitation of the circulating forms of serum transferrin receptor using domain-specific antibodies
Ulrich et al. Immune recognition of human major histocompatibility antigens: localization by a comprehensive synthetic strategy of the continuous antigenic sites in the first domain of HLA‐DR2 β chain
AU2323092A (en) Proteins s polypeptides and uses thereof
CA2050941C (en) Antibody to smooth muscle myosin heavy chains
Atassi et al. Immune recognition of serum albumin—XIV. Cross-reactivity by T-lymphocyte proliferation of subdomains 3, 6 and 9 of bovine serum albumin
Cordero et al. Binding of 125I-prothymosin α to lymphoblasts through the non-thymosin α1 sequence
EP0265847B1 (en) Monoclonal antibody reacting with TRF (interleukin-5)