NO812397L - Bestemmelse av en antigenkonsentrasjon i legemsvaesker og reagens til bruk ved bestemmelsen - Google Patents

Description

Ved kompetitiv ra*dioimmunoassey underkastes en radioaktiv markert antigen en umarkert antigen og et for antigenet spesifikt antilegeme for en kompetitiv antigen-antilegeme-reaks jon i en vandig pufferoppløsning. Derved konkurrerer en definert mengde av radioaktivt markert antigen og umarkert.antigen om

en definert mengde antilegeme, idet antilegemene foreligger i overskudd sammenlignet til antigenet. Den til antilegemet bundne del av det aradioaktivt markerte antigen er avhengig

av mengden av umarkert antigen og avtar med økende mengde av umarkert antigen.

Prinsippet av den radioimmunometriske målemetode beror på

at den til antilgemet bundne del av det radioaktivt markerte antigen som iakttas en prøve som skal måles sammenlignes med resultatet av justeringsprøver med kjent antigeninnhold og derved bestemmes antigeninnholdet i prøven som skal måles.

For målingen av den til antilgemet bundne del av det radioaktivt markerte antigen er det nødvendig å adskille antigen-antilegeme-komplekset fra ikke bundet antigen. Metoden til det kompetetive radioimmunoassay er i detalj omtalt i litte-raturen (sammenlign R.P. Ekins, Br.Med.Bull. 30.'3-11 (1974) samt CM. Boyd, D.L. Herzberg; i: Practical radioimmuno-

assay side 1-13 (A.J. Moss, G.V. Dalrymple, CM. Boyd, eds.) The CV. Mosby Company, Saint Louis 1976) .

Nøyaktigheten av den kompetetive radioimmunoassay avhenger vesentlig av skilling av det til antilegemet bundede radioaktivt markerte antigen fra fritt radioaktivt markert anti-

gen etter avslutning av antigen-antilegeme-reaksjonen.

Metoder og skillereagenser til adskillelse av antilegeme-bundet og fritt antigen er kjent, f.eks. 1. Felling av antigen-antilegeme-komplekset med protein-fellingsreagenser sammenlign B. Desbuquois, G.D. Aurbach J.Clin.Endocr. J33 732-738 (1971) .

2. Adsorbsjon av det frie antigen på adsorbsjonsmiddel

3. Binding av antilegeme (før antigen-antilegeme-reaksjonen) til overflaten av vannuoppløselige fastlegemer, sammenlign DOS 2 322 533 4. Adsorbsjon av antigen-antilegeme-komplekset på stafylokokkus-aureus-celler, sammenlign S. Jonsson, G. Kronvall Eur.J.Immunol. 4, 29-33 (1974) 5. Felling av antigen-antilegeme-komplekset ved hjelp av et annet antilegeme (skilleantilegeme), sammenlign M.J. Martin, J. Landon Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry side 269-281 (Pasternak, editor) Heyden, London (1975). 6. Adsorbsjon av antigen-antilegeme-komplekset på små vann-uoppløselige partikler (fastlegemer) som er belagt med et annet antilegeme (skilleantilegeme), sammenlign F.C. Den Hollander, A.H.W.M Schuurs Radioimmunoassay Methods, side 419-422 (Kirkham andHunter, eds.) Churchill Livingstone, London (1971); S. Jonsson, G. Kronvall IAEA Report SM 177/48, 287-298 (1974).

Skillingen av antilegeme-bundet og fritt antigen' foretas ved hjelp av en faseadskillelse som for det meste går foran et sentrifugasjonstrinn.

De overnevnte metoder kan omtales som følger:

1. Felling av antigen-antilegeme-komplekset ved proteinut-fellingreagenser som etanol, ammoniumsulfat eller polyetylenglykol er enkel å gjennomføre da det med en gang etter sammenblanding med fe-lingsreagens er mulig en adskillelse ved sentrifugering. Denne metode forutsetter imidlertid at i prøven som skal måles er det inneholdt en tilstrekkelig mengde av immunoglobuliner. Dette er riktignok tilfelle i serum og plasma, imidlertid ikke i urin, liquor eller magesaft.

Effektive skillinger er dessuten bare mulig ved antigener

med en molvekt som ligger vesentlig under antilegemenes molvekt. Følgelig er denne fremgangsmåte bare anvendbar for spesieltilfeller. Videre har den den ulempe at en ofte ikke uvesentlig del av det frie antigen medutfelles. Denne medut-felling svinger med proteininnhold og proteinsammensetning av prøven og kan forstyrre måleresultatet. 2. Adsorbsjon av det frie antigen på adsorbsjonsmidler som aktivkull, ioneutvekslere og silikater er bare egnet for små antigener (f.eks. steriode, peptider) og ikke generelt anvend-bare. Dessuten kan reaksjonslikevekten forstyrres ved lengre reaksjonstid med adsorbsjonsmiddelet. 3. Ved anvendelse av et antilegeme som er bundet til overflaten og vannuoppløselig fastlegemer (f.eks. en indre vegg av små prøverør, papirstrimler, polymerkuler av forskjellig størrelse, glassperler, bakterieceller) foreligger det under inkubasjonen dannede antigen-antilegeme-kompleks likeledes

på fastlegemer og adskilles ved fastlegemet fra det frie antigen som er inneholdt i reaksjonsoppløsningen.

Den hver gang like mengde antilegemer, hvormed slike fastlegemer er belagt, er forutsetning for nøyaktigheten av den kompetitive radioimmunoassay og er bare oppnåelig i et stort arbeide og omhyggelighet. I tillegg opptrer under tiden uønskede forstyrrelser ved adsorbsjon av proteiner fra

prøven på fastlegemet og den dermed forbundne blokkering

av antilegemet som må være vikrsom i definert mengde.

4. På grunn av de spesifike adsorbsjonsegenskaper av stafylokokkus-aureus-celler for noen klasser av immunoglobuliner av forskjellige dyrearter - de ved radioimmunoassay anvendte antilegemer hører til immunglobuliner - kan stafylokokkus-aureus-celler tjene som adsorbens for antigen-antilegeme- komplekser. Metoden er bare anvendbar når antilegemene til-hører en immunglobulinklasse av en dyreart hvis tilsvarende immunglobulin bindes spesifikt av stafylokokkus-aureus. Følgelig er fremgangsmåten ikke anvendbar for antilegemer

av en hver ønskelig dyretype.

Inneholder ved siden av det som reagens anvendte antilegeme

i tillegg også prøven som skal måles (f.eks. serum eller plasma) større mengder av stafylokokkus-aureusbindende immunglobulin så må det anvendes en tilsvarende større

mengde av stafylokokkus-aureus-celler. Dette har den

ulempe at ved uspesifik adsorbsjon av fritt antigen er skillingen ikke fullstendig. 5. Utfelling av antigen-antilegeme-komplekset ved hjelp av et annet antilegeme (skilleantilegeme), som er rettet mot det antigen-spesifike første antilegeme, er tidskrevende, fordi det må gjennomføres to antigen-antilegeme-reaksjoner. Den annen antigen-antilegeme-reaksjon kan forkortes ved hjelp av reaksjonsakselerator. Denne metode har den ulempe at det opptrer uønskede medutfellinger av fritt antigen som bestemmes av prøvens svingende proteininnhold. Dessuten er utfellingen dårlig synlig og kan ubemerket gå tapt ved adskillelse av det overstående. 6. Adsorbsjonen av antigen-antilegeme-komplekset ved hjelp av et annet antilegeme (skilleantilegeme) som er rettet mot det antigen-spesifike første antilegeme og er bundet kovalent til et vannuoppløselig fastlegeme (f.eks. cellulose, stafylokokkus-aureus) har den ulempe at til fullstendig adsorbsjon av antigen-antilegeme-komplekser kreves noen timer under hvilke det i tillegg stadig bevegelse, av reaksjonskaret må frembringes en homogen sispensjon av fastlegemet.

Oppfinnelsen oppgave er å tilveiebringe en skillefremgangs-måte og et skillereagens til adskillelse av fritt antigen fra et til et første antilegeme bundet antigen ved den kompetitive radioimmunoassay, idet skillefremgangsmåten og skillereagenset unngår ulempene ved de overfor under pkt. 1-6

nevnte skillefremgangsmåter og skillereagenser.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til binding av et

til et første antilegeme spesifikt bundet antigen i en vandig oppløsning og til adskillelse av dette bundne antigen fra ikke-bundet antigen til kvalitativ eller kvanitativ bestemmelse av antigenkonsentrasjonen i en kroppsvæske ved hjelp av den kompetetive radioimmunoassay, idet det første antilegeme med det spesifikt bundne antigen ved hjelp av et annet antilegeme som på den ene side er bundet til en stafylokokkus-aureus-celler og på den andre side binder det første antilegeme spesifikt, adskilles fra det frie i den vandlige oppløsning oppløste antigen, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat det til den vandige oppløsning settes en reaksjonsakselerator som akselererer den spesifike binding av første antilgeme ved hjelp av annet antilegeme således at bindings-reaksjonen er avsluttet i løpet av få minutter.

De i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendte antigener

er peptider, proteiner eller glykoproteiner som tilsvarer deres funksjon kan være hormoner, enzymer, transportproteiner eller strukturproteiner og som ved immunisering av forskjellige virveldyrarter, fortrinnsvis pattedyr, frembringer en dannelse av antigen-spesifike første antilegemer.

Bestemmelse av antigener i kroppsvæsker som blodplasma, blodserum, urin, liquor, magesaft, duodenalsaft, fostervann eller synovialvæske foretas ved hjelp av den kompetetive radioimmunoassay, idet de nevnte kroppsvæsker kan stamme fra mennesker eller fra et dyr.

Som annet antilegeme finnes slike forskjellige dyreklasser anvendelse i første rekke fra hvirveldyr, fortrinnsvis fra pattedyr., idet dette annet antilegeme utvunnet ved immunisering av dyrene med immunglobuliner av en fremmed dyreart hvorfra første antilegeme stammer. Stafylokokkus-aureus-celler binder gamma-globuliner fra mennesker eller fra forskjellige dyrearter som esel, gjeter, svin, hund, katt, mar-svin eller kaniner spesifikt over deres Fc-fragment, idet det antigen-spesifike Fab-fragment av gamma-globuliner forblir uberørt av bindingen til stafylokokkus-aureus-cellene (sammenlign J.W. Goding, J. Immunol .Me th. 20_, 241-253 (1978) .

Fordelaktig er anvendelsen av et annet antilegeme av større dyr som gjeit eller esel. Det annet antilegeme lar seg ved inkubasjon av stafylokokkus-aureus-celler binde med serumet av det immuniserte dyr, idet spesielt gamma-globulinet bindes spesifikt og de ikke-bindende serumproteiner og andre serum-bestanddeler lett kan adskilles ved vasking av cellene uten at det igjen desorberes en vesentlig mengde annet antilgeme.

For bestemmelse av et antigen i kroppsvæsker som inneholder større mengder av immunoglobuliner, spesielt gamme-globuliner som blodserum eller blodplasma er det fordelaktig å binde det annet antilegeme i tillegg til den nevnte spesifike (adsorbtive) binding kovalent til stafylokokkus-aureus-cellene. Derved bindes det annet antilegeme kovalent etter den spesifike adsorbsjon til stafylokokkus-aureus-cellene under milde be-tingelser ved hjelp av et bifunksjonelt reagens, idet reak-sjonsevnen av annet antilegeme ikke vesentlig går tilbake.

På grunn av den kovalente binding kan annet antilegeme ikke løse seg fra cellen og ikke fortrenges ved gammaglobuliner av prøven.

Ved kovalent-binding med et bifunksjonelt reagens forbindes

på den ene side aminogrupper av annet antilegeme og på den annen side aminogrupper av celleveggproteinene av stafylokokkus-aureus med hverandre. Som bifunksjonelle reagenser anvendes dialdehyder, diimidater, diestere eller diiso-

cyanater, f.eks. glutardialdehyd, dimetyladipindiimidat, suberinsyredimetylester eller heksametylendiisocyanat.

Stafylokokkus-aureus-cellene blir før anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hensiktsmessig avlivet ved hjelp av varme- eller formaldehydbehandling. Fortrinnsvis oppvarmes cellene 30 minutter ved 80°C og inkuberes i en l,5%ig formal^-dehydoppløsning hvorved cellenes bindingsevne for gamma-globuliner ikke vesentlig avtar.

Reaksjonsakseleratorer ifølge oppfinnelsen er stoffer som akselererer den spesifike bindingsreaksjon av et første antilegeme ved hjelp av et annet antilegeme, idet de ikke vesentlig endrer den rommelige polypeptidstruktur av immunoglobuliner, spesielt gamma-globuliner, og dermed ikke ødelegger antilegemenes spesifike reaksjonsevne, f.eks. hydrofile polymerer som dekstran eller polyvinylpyrrolidon. Fortrinnsvis anvendes stoffer som i høyere konsentrasjoner fortrinnsvis uoppløseliggjør immunglobuliner, spesielt gamme-globuliner eller utfeller, f.eks. hydrofile polymerer som polyetylenglykol eller salter, som ammoniumsulfat eller natriumsulfat. Herved er det anvendt en lavere konsentrasjon av disse stoffer enn den ville føre til felling av førte antilegeme og av antigenet.

Konsentrasjonen av reaksjonsakseleratoren i reaksjonsbland-ing bestående av det første antilegeme og antigenet samt det til stafylokokkus-aureus-celler bundede annet antilegeme velges således at

polyetylenglykolkonsentrasjonen generelt utgjør 3 til

10 vekt%, fortrinnsvis 4 til 8 vekt%, spesielt 5 til 6 vekt% respektiv, - dekstrankonsentrasjonen utgjør generelt 3 til 20 vekt%, fortrinnsvis 5 til 10 vekt%, spesielt 7 vekt% respektiv,

polyvinylpyrrolidonkonsentrasjonen utgjør generelt 3 til

15 vekt%, fortrinnsvis 5 til 10 vekt%, spesielt 7 vekt% respektiv, ammoniumsulfatkonsentrasjonen er generelt 0,3 til 1,2 molar, fortrinnsvis 0,5 til 0,9 molar, spesielt 0,7 til 0,8 molar, respektiv, - natriumsulfitkonsentrasjonen er generelt 0,5 til 1,5 molar, fortrinnsvis 0,8 til 1,2 molar, spesielt 1,0 molar.

Molekylvekten av den polymere reaksjonsakselerator ligger i tilfelle polyetylenglykol generelt mellom 1000 og 20.000, fortrinnsvis mellom 2000 og 10.000, spesielt ved 6000.

I tilfellet dekstran gene.reit mellom 2000 og 50.000, fortrinnsvis mellom 4000 og 20.0000, spesielt mellom 8000 og 12.000.

I tilfellet polyvinylpyrrolidon generelt mellom 2000 og 25.000, fortrinnsvis mellom 5000 og 15.0000, spesielt ved 10.000.

Reaksjonsakseleratoren kan allerede før reaksjonen av det første antilgeme med antigenet has til reaksjonsblandingen før det til stafylokokkus-aureusbundne annet antilegeme tilsettes til skilling. Fortrinnsvis tilsettes imidlertid til reaksjonsblandingen bestående antigen og første antilegeme et bruksferdig skillereagens.

Det bruksferdige skillereagens inneholder i en vandig puffer-oppløsningen det til stafylokokkus-aureus bundne annet antilegeme samt reaksjonsakseleratoren, hvis konsentrasjon er valgt således at etter tilsetning av det bruksferdige skillereagens til reaksjonsblandingen bestående antigen og første antilegeme, foreligger reaksjonsakseleratoren i over-

nevnte konsentrasjon.

Mengden av det til stafylokokkus-aureus bundne andre antilegeme (ved anvendelse av 0,1 ml kroppsvæske som skal bestemmes) tilsvarer den mengde som vanligvis kreves ved en utfelling,av antigen-antilgeme-komplekset ved hjelp av et ikke bundet annet antilegeme.

Mengden av stafylokokkus utgjør (ved anvendelse av 0,1 ml kroppsvæske som skal bestemmes) vanligvis 0,1 til 10 ml, fortrinnsvis 1 til 5 mg, spesielt 2,5 mg.

For gjennomføring av den radioimmunometriske bestemmelse inkuberes i første rekke radioaktivt markert antigen, ikke-markert antigen og antigen spesifikt antilegeme samme. Der-

ved anvendes som ikke-markert antigen enten en oppløsning av kjent antigeninnhold til anvendelse som justeringsprøve eller en kroppsvæske ukjent antigen innhold som prøven som skal bestemmes.

Inkubasjonen foretas vanligvis ved temperaturer mellom

0 og 45°C, fortrinnsvis mellom 17° og 27°C, og vanligvis ved værelsetemperatur.

Skillereagenset rystes før tilsetning av reaksjonsblandingen således at det fåes en jevn cellesuspensjon. Skillereagensets temperatur ligger vanligvis mellom 0° og +45°C, fortrinnsvis tilpasses den temperaturen av den forangående inkubasjon.

Etter blanding av skillereagenset med reaksjonsblandingen

er bindingen av første antilegeme ved hjelp av annet antilegeme avsluttet i løpet av få minutter. I løpet av denne tid forblir cellene pga. deres lille størrelse jevjt fordelt 1 oppløsningen således at de ikke går tapt for en binding ved sedimentasjon. Ved etterfølgende sentrifugering adskilles det til første antilegeme bundne antigen med de ved annet

antilegeme oppladede stafylokokkus-aureus-celler som utfell--ing fra det frie antigen fra den overstående oppløsning.

For bestemmelsen av mengden av det til første antilegeme bundne markerte antigen dekanteres eller frasuges den overstående oppløsning, idet utfellingen hensiktsmessig deretter vaskes med en pufferoppløsning. Ved et større volum av den overstående væske kan det ses bort fra vasking.

Bestemmelsen av radioaktiviteten foretas etter kjente frem-gangsmåter ved strålingsdetektorer.

A. Skillefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er egnet ved bestemmelsen av antigener med lav eller. hqby molekylvekt spesielt for peptider og proteiner som follikel-stimulerende hormon, luteiniserende hormon, brystkjertelstimuler-ende hormon,horiongondotropin, prolaktin, placentalaktogen, veksthormon, adrenokortikotropt hormon, gukagon, g-kjeden av ;koriogonadotropin, paratormon, alfafetoprotein, karcino-embryonalt,antigen, prostata-spesifike sure fosfater,

svangerskapsspesifikt g^-glykoprotein som fravær av anti-gent-spesifikt antilegem ikke bindes til stafylokokkus-aureus-celler .

B. Skillefremgangsmåten er generelt anvendbar til skilling av fritt antigen fra til et ønskelig første antilegeme bundet antigen, idet det første antilegeme stammer fra en ønskelig første dyreart og annet antilegeme hver gang ved immunisering av en annen dyreart med immunglobin fra første dyreart, idet annen dyreart velges således at dens gammaglobuliner for en stor del spesifikt bindes av

stafylokokkus-aureus-cellene.

C. Ved den spesifike binding av antigen-oppladet første antilegeme til det spesifikt til stafylokokkus-aureus-celler bundne annet antilegeme gir skillefremgangsmåten en sterk kvantitativ skilling av det fire antigen~av til første antilgeme bundet antigen som heller ikke vesentlig forstyrres ved sterkt svingende protein-innhold av prøven som skal bestemmes. D. Reaksjonsakseleratoren for binding av det antigen-oppladede første antilegeme ved hjelp av det stafylokokkus-aureus-bundede annet antilegeme krever bare en meget kort annen inkubasjonstid, under hvilken en stadig bevegelse av reaksjonsblandingen for homogen fordeling av cellene er overflødig således at etter sammenblanding med skillereagenset kan det sentrifugeres uten et ytterligere arb-eidstrinn og uten større forsinkelse.

E. Celleutfellingen etter sentrifugeringen er tydelig synlig

og henger godt til bunnen av sentrifugerøret således at adskillelsen av den overstående væske ved hjelp av av-sugning eller dekantering er problemtløst og kan enkelt kontrolleres visuelt.

Oppfinnelsen skal forklares ved hjelp av noen eksempler hvor samtlige prosentangivelser refererer seg..til vekt%.

Eksempel 1

Bestemmelse av det humane luteiniserende hormon ( hLH) i blodplasma eller blodserum.

a) Fremstilling av skillereagens

Til 50 ml av en 10%ig suspensjon av stafylokokkus-aureus-celler i en 0,9%ig natriumkloridholdig 0,05 m vandig natrium-fosfatpufferoppløsning av pH 7,4 ble det satt 16 ml av et antiserum fra gjeit som inneholder antilegemer mot gamma-globulin fra kaniner. Suspensjonen ble omrørt en time. Deretter adskiller de med antilegemer oppladede celler ved sentrifugering og dekantering fra det ovenstående. Cellene ble resuspendert i 45 ml av det overnevnte puffer og for kovalent binding av antilegemet til cellene under stadig omrøring blandet med

■50 ml av en 0,2%igglutardialdehydoppløsning i den overnevnte puffer og etter en times omrøring med 50 ml av en 5% natrium-sulfitoppløsning i overnevnte puffer for å innaktivere over-flødig ikke-omsatte glutardialdehyd. Etter ytterligere en times omrøring ble cellene adskilt ved sentrifugering og dekantering fra det overstående. Cellene ble vasket, idet de ble resuspendert i 200 ml 0,05 m vandig natriumfosfatpuffer av pH 7,4 og adskilt ved sentrifugering og dekantering fra vaskepufferen.

Det bruksferdige skillereagens ble fremstilt, idet de således behandlede celler ble resuspendert med det annet antilegeme deretter i 500 ml av en 10%ig oppløsning av polyetylenglykol med en molekylvekt på 6000 i 0,05 m vandig natriumfosfat-puf f ere av pH 7,4.

b) Gjennomføring av bestemmelsen.

Analysene ble gjennomført i små sentrifugerør av 3 til 5 ml

av polystyren eller polypropylen.

0,1 ml av det humane serum- eller plasmaprøven som skulle undersøkes ble fylt i et lite rør. 0,1 ml av en justerings-prøve med forskjellige hLH-kosentrasjoner, f.eks. 0, 4, 7, 14, 27, 54 og 100 m enheter hLH/ml ble hver gang hatt i et

12 5

lite rør. 0,2 ml av en J-hLH-holdig oppløsning (ca. 0,5 ng hLH/ml av en spesifik radioaktivitet på 100 nCi jod-125/ng hLH) ble hatt i alle små rør. 0,2 ml av en antilegemeopp-løsning mot hLH som i fravær av umarkert hLH kunne binde 30

125

til .50 % av J-hLH ble hatt i alle rør. Inkubasjonen fant sted i løpet av 20 timer ved værelsetemperatur.

0,5 ml av det bruksferdige skillereagens tilsvarende eksempel la) som før brukt ble rystet for å få en homogen cellesus-

pensjon ble hatt i alle rør.

Alle rør ble rystet for å blande innholdet og etter minst

ti minutter ble sentrifugert ca. 2000 g ti minutter. Utfellingen ble adskilt ved dekantering eller frasugning fra den overstående væske og vasket med 0,05 m vandig natriumfosfat-pufferoppløsning av pH 7,4.

Etter adskillelse av den overstående væske ble gamma-stråling av det i utfellingen innholdte markerte hLH målt i alle rør.

I et diagram ble impulsen av gamma-strålingen av justeringsprøv-en pr. tidsenhet oppført lineært mot hLH-konsentrasjonen av justeringsprøven Av dette diagram ble det deretter bestemt hLH-konsentrasjonen av den ukjente prøve.

Eksempel 2

Bestemmelse av humant alfafetoprotein ( AFP) i fostervann,

a) Fremstilling av skillereagenset

Til 50 ml av en 10%ig suspensjon av stafylokokkus-aureus-celler i en 0,9%ig vandig natriumklorid ble det satt 50 ml av et antiserum fra esel som inneholdt antilegemer mot gamma-globulin fra kaniner. Suspensjonen ble omrørt i en time. Deretter ble cellene adskilt ved sentrifugering og dekantering fra overstående væske. Cellene ble vasket, idet de ble resuspendert med 200 ml 0,9%ig vandig natriumkloridoppløsning og adskilt ved sentrifugering og dekantering av vaskeopp-løsningen. Det bruksferdige skillereagens ble fremstilt,

idet de således behandlede celler ble resuspendert med annet antilegeme deretter i 50 0 ml av en vandig pufferoppløsning av pH 7,4 som inneholdt 1,6 m natriumsulfit og 0,05 m natriumfosfat.

b) Gjennomføring av bestemmelsen.

Analysene ble gjennomført i små sentrifugerør fra 3 til 5 ml

av polystyren eller polypropylen.

0,1 ml av fostervannprøven som skulle undersøkes på forhånd fortynnet 1:11 ble hatt i et rør. 0,1 ml av en justerings-prøve med forskjellige AFP-konsentrasjoner, f.eks. 0, 25, 50, 100, 200 og 400 enheter AFP/ml ble hatt hver gang i et rør. 0,2 ml av en 12 5J-AFP-holdig oppløsning (ca. 1 enhet AFP/ml av en spesifik radioaktivitet på 40 nCi jod-125/enheter AFP) ble hatt i alle rør.

0,2 ml av en antilegemeoppløsning mot AFP som i fravær av

125

umarkert AFP kunne binde 40 til 60 % av J-AFP ble hatt i alle rør. Inkubasjonen fant sted i løpet av 20 timer ved værelsetemperatur.

0,5 ml av det bruksferdige skillereagens tilsvarende eksempel 2a) som før brukt kort ble rystet, for å danne en homogen cellesuspensjon ble hatt_.i alle rør.

Alle rør ble rystet kort for å blande innholdet og 5 til 10 minutter senere sentrifugert ved ca. 2000 g i 10 minutter.

Utfellingen ble adskilt ved dekantering eller frasugning

fra overstående væske. Etter adskillelse av overstående væske ble gamma-strålingen av det i utfellingen innholdte markerte AFP målt i alle rør.

I et diagram ble impulsen av gamma-strålingen av justerings-prøven pr. tidsenhet oppført lineært mot AFP-konsentrasjonen i justeringsprøven. Fra dette diagram kunne det deretter bestemmes AFP-konsentrasjonen i den ukjente prøve.

Eksempel 3

Bestemmelse av humant alfafetoprotein ( AFP) i fostervann

a) Fremstilling av skillereagenset.

Fremstillingen av skillereagenset ble innbefattende vasketrinnet gjennomført tilsvarende eksempel la).

Det bruksferdige skillereagens ble fremstilt idet de således beahdnlede celler ble resuspendert med annet antilegeme deretter i 500 ml av en 10%ig oppløsning av polyvinylpyrrolidon med en midlere molekylvekt på 10.000 i 0,05 m vandig natriumfosfatpuffer på pH 7,4.

b) Gjennomføring av bestemmelsen.

Analysene ble gjennomført i små sentrifugerør av 3 til 5 ml

av polystyren eller polypropylen.

0,1 ml av fostervannprøven som skulle undersøkes og på forhånd fortynnet til 1:100 ble hatt.i et rør. 0,1 ml av en juster-ingsprøve med forskjellige AFP-konsentrasjoner, f.eks. 0,

25, 50, 100, 200 og 400 enheter AFP/ml ble hatt hver gang i et rør. 0,2 ml av en<125>J-AFP-holdig oppløsning (ca.

1 enhet AFP/ml av en spesifik radioaktivitet på 40 nCi jod-125/enhet AFP/ ble hatt i alle rør. 0,2 ml av en antilegeme-oppløsning mot AFP som i fravær av umarkert AFP kunne binde

125 40 til 60% av -J-AFP ble hatt i alle rør. Inkubasjonen fant sted i løpet av 20 timer ved værelsetemperatur.

l,o ml av den bruksferdige skillereagens tilsvarende eksempel 3a) som før brukt ble^rystet for å få en homogen cellesuspensjon, ble hatt i alle rør.

Alle rør ble for å blande innholdet, rystet kort og sentri fugert 10 til 30 minutter senere ved ca. 200 g i 10 minutter.

Utfellingen ble adskilt ved dekantering eller frasugning av den overstående væske.

Etter adskillelse av den overstående væske ble gamma-strålingen av det i utfelllingen innholdte markerte AFP målt i alle rør.

I et diagram ble oppført impulsen av -gammas tr ål ingen av juster-ingsprøven pr. tidsenhet lineært mot AFP-konsentrasjonen i justeringsprøven. Av dette diagram kunne det deretter bestemmes AFP-konsentrasjonen i den ukjente prøve.

Eksempel 4

Bestemmelse av humane skjoldbrukskjertel- stimulerende hormon ( hTSH) i blodserum eller blodplasma.

a) Fremstilling av skillereagenset.

Fremstillingen av skillereagenset ble gjennomført innbefattende vasketrinnet tilsvarende eksempel la). Det bruksferdige skillereagens ble fremstilt idet de således behandlede celler ble resuspendert med annet antilegeme deretter i 500 ml av en vandig pufferoppløsning av pH 7,4 som inneholdt 1,3 m ammoniumsulfat og 0,05 m natriumfosfat.

b) Gjennomføring av bestemmelsen.

0,1 ml av det humane serum- eller plasmaprøve som skulle

undersøkes ble hatt i et rør. 0,1 ml av en justeringsprøve med forskjellige hTSH-konsentrasjoner, f.eks. 0, 6, 12, 25,

50 og 100 y-enheter hTSH/ml ble hver gang hatt i et rør.

12 5

0,1 ml av en J-hTSH-holdig oppløsning (ca. 0,4 ng hTSH/

ml av en spesifik radioaktivitet av 80 nCi jod-125/ng hTSH) ble hatt i alle rør. 0, 1 ml av en antilegemeoppløsning mot hTSH som ved fravær av umarkert hTSH kunne binde 30

125

til 50% av J-hTSH ble hatt i alle rør...Inkubasjonen fant sted i løpet av 20 timer ved værelsetemperatur.

0,5 ml av det bruksferdige skillereagens tilsvarende eksempel 4a) som før bruk kort ble rystet for å få en homogen cellesuspensjon ble hatt i alle rør.

Alle rør ble for sammenblandingen av innholdet rystet kort

og 15 til 30 minutter senere sentrifugert ved ca. 2000 g i 10 minutter.

Utfellingen ble adskilt ved dekantering eller frasugning av den overstående væske og vasket med en 0,05 molar vandig natriumfosfatpufferoppløsning av pH 7,4.

Etter adskillelse av overstående væske ble det målt gamma-strålingen av det i utfellingen;.inneholdte markerte hTSH

i alle rør.

I et diagram ble oppført impulsen av gamma-strålingen og justeringsprøven pr. tidsenhet lineært mot hTSH-konsentrasjonen i justeringsprøven. Av dette diagram kunne det da bestemmes hTSH-konsentrasjonen i den ukjente prøve.30.

Eksempel 5

Bestemmelse av det humane follikel- stimulerende hormon

( hFSH) i blodserum eller blodplasma

a) Fremstilling av skillereagenset.

Fremstillingen av skillereagenset innbefattende vasketrinn

ble gjennomført tilsvarende eksempel la).

Det bruksferdige skillereagens ble fremstilt idet de således behandlede celler ble resuspendert med annet antilegeme der etter i 500 ml av en 15%ig oppløsning av polyvinylpyrrolidon med en midlere molekylvekt på 10.000 i 0,05 molar vandig natriumfosfatpuffer på pH 7,4.

b) Gjennomføring av bestemmelsen.

Analysene ble gjennomført i små sentrifugerør av 3 til 5 ml

polystyren eller polypropylen.

0,1 ml av den humane serum- eller plasmaprøve som., skul le undersøkes ble hatt i et rør. 0,1 ml av en justeringsprøve med forskjellige hFSH-konsentrasjoner, f.eks. 0, 5, 10, 20, 40 og 80 m enheter hFSH/ml ble hver gang hatt i et rør.

12 5

0,2 ml av en J-hFSH-holdig oppløsning (ca. 0,5 ng hFSH/ml av en spesifik radioaktivitet på 100 nCi jod-125/ng hFSH) ble hatt i alle rør. 0,2 ml av en antilegemeoppløsning mot hFSH

125 som i fravær av umarkert hFSH kunne binde 30 til 50% av J-hFSH ble hatt i alle rør.

Inkubasjonen fant sted i løpet av 20 timer ved værelsetemperatur.

0,5 ml av den bruksferdige skillereagens tilsvarende eksempel 5a) som før bruk ble kort rystet for å få en homogen cellesuspensjon ble hatt i alle rør.

Alle rør ble for blanding iav innholdet rystet kort og 15 til 30 minutter senere sentrifugert ved ca. 2000 g i 10 minutter.

Utfellingen ble avskilt ved dekantering eller frasugning av overstående væske og vasket med 0,0 5 m vandig natriumfosfat-puf f eroppløsning av pH 7,4.

Etter adskillelsen av overstående væske ble gamma-strålingen av det i utfellingen inneholdte markerte hFSH målt i alle rør. I et diagram ble det oppført impulsene av gamma-strålingen og justeringsprøven pr. tidsenhet lineært mot hFSH-konsentrasjonen av justeringsprøvene. Av dette diagram kunne deretter hFSH-konsentrasjonen i den ukjente prøve bestemmes.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte til binding av et til et første antilegeme spesifikt bundet antigen i en vandig opplø sning og til adskillelse av dette bundne antigen fra ikke-bundet antigen for bestemmelse av antigenkonsentrasjonen i et kroppsvæske ved hjelp av kompetitiv radioimmunoassay, idet første antilegeme er bundet med det spesifikt bundede antigen gjennom et annet antilegeme som på den ene side er bundet til en stafylokokkus aureus-celle og på den annen side binder spesifikt første antilegeme, adskiller fra det fri i den vandige oppløsning oppløste antigen, karakterisert ved at det til den vandige oppløsning settes en reaksj ons>akselerator som akselererer den spesifike binding av første antilegeme ved hjelp av annet antilegeme.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at som reaksjonsakselerator anvendes polyetylenglykol, dekstran, polyvinylpyrrolidon, ammoniumsulfat eller natriumsulfit.

3. Reagens for adskillelse av fritt antigen fra et til et første antilegeme bundet antigen ved bestemmelse av et antigen ved hjelp av kompetitiv radioimmunoassay bestående av en vandig pufferoppløsning, en reaksjonsakselerator og stafylokokkus aureus-celler, hvortil annet antilegeme er spesifikt bundet.