NO802683L - Fremgangsmaate for fremstilling av polypeptidet psp - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår et hittil ukjent

renset polypeptid eller fysi ologi sk tolerable salter derav, en fremgangsmåte til fremstilling og rensing av polypeptidet og anvendelsen av polypeptidet som spasmolytisk middel. Det har overraskende vist seg at det rensede polypeptid ifølge opp-finnelsen, som kan utvinnes fra svinepankreaskjertler, utviser en relakserende virkning på glatt muskulatur eller spasmolytisk

virkning. Forbindelsen er derfor blitt tildelt trivialbetegnelsen Pankreatisk Spasmolytisk Polypeptid, som her for letthets skyld forkortes til PSP. PSP utviser interessante farmakologiske egenskaper.

Spasmolytiske midler eller antispasmodika såsom atropin, tilsvarende forbindelser og syntetiske legemidler med atropinlig-nénde aktivitet anvendes i stort omfang til behandling av for-skjellige sykdommer, især krampe i de glatte muskler, og til-stander med hypermotilitet. Slike legemidlers ønskede virkning ledsages imidlertid vanligvis av flere bivirkninger som skyldes deres generelle egenskaper som antikolinerge stoffer.

Atropinlignende antikolinerge legemidler har også i stort omfang funnet anvendelse som et diagnostisk hjelpemiddel ved gastrointestinal radiologi, især i sammenheng med et i røntgen-lys billeddannende medium til forbedring av billeddannelsen av det gastrointes tinale område, galleveisområdet og urinveisom-fadet. Et sådant legemiddel administreres vanligvis parenteralt, og de bivirkninger som er klassiske for de angjeldende midler, inntreffer vanligvis på grunn av den dosismengde som er nødvendig for oppnåelse av en relakserende virkning.

Parenteral administrasjon av peptidhormonet glukagon bestående av 29 aminosyrer ble nylig introdusert som et alternativt middel til forminskelse av den gastrointestinale motilitet i sammenheng med radiografiske undersøkelser (jfr. U.S.A. patent nr. 3 862 301) . Glukagon gir imidlertid flere virkninger .i legemet, herunder en sterk innvirkning på metaboliske funksjoner, blant hvilke de tydeligste virkninger er induksjon av hyper-glykemi og lipolyse. Selv om introduksjonen av glukagon til endoskopi således medførte visse fordeler, var de uønskede bivirkninger ikke fullstendig fjernet. Et formål med den forelig- \ gende oppfinnelse er tilveiebringelsen av et spasmolytisk middel, som, mens det utviser antispåsmodiske virkninger oq relakserende virkninger på glatte muskler, hvilke virkninger er sammenlign-bare med de kjente midlers virkninger, utviser vesentlig redu-serte bivirkninger.

Ifølge ett aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveie-bringes det et hittil ukjent, renset polypeptid med følgende aminosyresammensetning:

Trp (2), Lys (4), His (1), Arg (5), Asx (10), Thr (3), Ser (9), Glx (12), Pro (12), Gly (6), Ala (6), Cys 1/2 (14), Val (7), Met (2), Ile (3), Leu (1), Tyr (2), Phe (7), hvor bestemmelsene er beheftet med den vanlige feil på ±10% av de oppgitte verdier. Den partielle aminosyresekvens omfattende i alt 45 aminosyrer fra den N-terminale ende formodes å være følgende:

hvor pyrGlu (aminosyrerest 1) betegner pyroglutamihsyre.

Aminosyresekvensen for PSP antas.å være som følger:

Forkortelsene for aminosyrene fremgår av J.Biol.Chem., 243,

(1968), 3558.

Den foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte til fremstilling av renset PSP, hvilken metode er karakteristisk ved at PSP isoleres fra pankreatisk vev fra svin, fortrinnsvis fra insulinsaltkaken, ved en kombinasjon av kromatografering og utfelling.

Insulinsaltkaken kan fremstilles på følgende måte: Hele, omhyggelig avfettete svinepankréaskjertler findeles i frossen til- stand og ekstraheres deretter på vanlig måte til utvinning av insulin, det vil si ekstraheres med en blanding av vann og et organisk, med vann blandbart oppløsningsmiddel så som en lavere alifatisk alkanol, f.eks. etanol eller isopropanol, i surt medium, for eksempel et medium med pH-verdi i området fra ca. 1,5 til ca. 5, når det måles med et pH-meter i blandingen. Den sure pH-verdi oppnås ved tilsetting av en syre. i blandingen er det organiske oppløsningsmiddel til stede i en konsentrasjon i området fra ca. 40 til ca. 80% (volum/volum) når alle bestanddeler er blandet. Deri resulterende oppslémning omrøres ved en tempe-ratur i området fra ca. 5°C til romtemperatur,• hvoretter resten av kjertler fjernes, for eksempel ved sentrifugering. Ekstrakten nøytraliseres deretter til en pH-verdi i området fra ca. 5 til ca. 9 og klares, f.eks. ved sentrifugering. Ekstrakten syrnes til en pH-verdi i området fira ca. 3 til ca. 4, hvoretter ekstrakten befries for organisk oppløsningsmiddel, f.eks. ved inndamping ved redusert trykk, etterfulgt av fjernelse av fettaktige forbindelser, f.eks. ved sentrifugering. Insulin som er blandet med andre proteiner og polypeptider så som PSP, utsaltes fra den på denne måte vundne konsentrerte ekstrakt, for eksempel ved tilsetting av natriumklorid for oppnåelse av en konsentrasjon i. området fra

ca. 10 til ca. 30% (vekt/volum), og det dannede bunnfall isoleres, f.eks. ved sentrifugering, hvorved saltkaken fås.

Den på denne måte vundne saltkake kan deretter, oppløses i vann, og rått insulin kan isoleres ved isoelektrisk felling ved en pH-verdi i området fra ca. 4,9 til ca. 5,7, f.eks. ved ca. 5,3, eventuelt ved tilstedeværelse av metallioner, for' eksempel sink-ioner, og det rå insulin utvinnes, vanligvis ved sentrifugering. Supernatanten innstilles på en pH-verdi i området fra ca. 5,7 til ca. 7, fortrinnsvis ved ca. 6,5. Det dannede bunnfall inneholdende noe insulin frafiltreres. Til fjernelse av hjelpestoffer så som salter,. tilsettes et overskudd av EDTA til ovennevnte 2. supernatant, etterfulgt av tilsetting av et med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis etanol (vanligvis fra 5 til 20 volum). Man lar blandingen henstå natten over ved ca.

4<Q>C til utfelling og etterfølgende sentrifugering. Bunnfallet tørkes i vakuum, hvorved det fås et tørt pulver som i det føl-gende betegnes "supernatantprotein". På denne nåte utvinnes praktisk talt all proteinet i "supernatentprotein".

PSP kan fås i rå, krystallinsk form fra en oppløsning

av "supernatantprotein" i vann (ca. 10 deler). Oppløsningen omrøres forsiktig, mens det i løpet av ca. 3 timer tilsettes

syre, f.eks. eddiksyre, inntil det oppnås en pH-verdi i området fra ca. 3,8 til ca. 4,8, fortrinnsvis ca. 4>3. Blandingen av-kjøles deretter, og omrøringen fortsettes i 3 døgn, fortrinnsvis ved ca. 4°C. Man utvinner, for eksempel ved sentrifugering,

et produkt beståénde av relativt store, stavformede, dobbeltbrytende krystaller som tørkes i vakuum.

Det således vundne produkt kan renses ytterligere, fortrinnsvis ved anvendelse av anion- og kationkromatografering i logisk rekkefølge.

Til belysning av fremgangsmåten kan anionvekslerkromatografering utføres på en kolonne med "QAE-Sephadex A-25" (forhandles av Pharmacia AB, Sverige) under anvendelse av den på fig. 1

angitte eluent.

Det kromatogram som fås ved avlesning av.absorpsjonen av fraksjoner ved 276 nm gir én hovedtopp. Det som oppsamles og som.svarer til hovedtoppen, innstilles på en pH-verdi på 7,4 og blandes deretter med et med vann blandbart organisk oppløsnings-middel, for eksempel etanol (4 volum). Etter.henstand ved 4°C

i 2 døgn utvinnes ved.sentrifugering et bunnfall som tørkes i vakuum.

Det på denne måte vundne produkt kan renses ytterligere ved kationkromatografering, for eksempel på en kolonne med "SP-Sephadex C-25" (forhandles av Pharmacia). Elueringen kan utføres med den på fig. 2 angitte eluent. Kromatogrammet som fås på analog måte som beskrevet ovenfor, viser.én hovedtopp. Oppsamlede fraksjoner svarende til hovedtoppen inndampes til tørrhet, og remanensen oppløses i vann ved en pH-verdi. i området fra ca. 6 til ca. 8, for eksempel ca. 7, blandes med et overskudd (ca. 12 volum) av et med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel, for eksempel etanol, og får henstå natten over under tilsvarende betingelser som beskrevet ovenfor. Renset PSP som utfeller fra oppløsningen, isoleres ved sentrifugering, vaskes med etanol og tørkes i vakuum.

Alternativt kan det fås PSP-holdig protein ved en ytterligere utsalting av den moderlut som fås, når saltkaken isoleres under anvendelse av natriumklorid i en konsentrasjon på fra 10 til 20%

(vekt/volum). Bunnfallet utvinnes, for eksempel ved sentrifugering. Renset PSP kan fås fra bunnfallet undér anvendelse av anion- og/

eller kationkromatografering i vilkårlig rekkefølge.

Ved en ytterligere fremgangsmåte kan PSP-holdig protein utvinnes ved adsorpsjon på en kation- eller anionveksler, for eksempel alginsyre, sulfonert polystyren eller aminoétylcellu-lose, fra den ovennevnte ekstrakt av pankreaskjertler som fås under anvendelse av en blanding av vann og et organisk med vann blandbart oppløsningsmiddel. Deretter vaskes ionveksleren, og proteinet elueres med et vandig medium. Utvinningen under anvendelse av en ionveksler utføres analogt med kjente metoder.

PSP som utvinnes ved en hvilken som helst av de ovenfor

angitte fremgangsmåter, har følgende karakteristika:

Molekylvekt (beregnet på basis av aminosyresammensetningen) : ca. 11.700.

Molekylvekt (bestemt ved natriumdodecylsulfatgeielektro-forese (Nevillé: J.Biol.Chem. 246, 6328)): ca. 10.700.

Elektroforetiske karakteristika:

Ved basisk DISC elektroforese (basisk DE) i polyakrylamidgel (Horm. Metabol. Research, Suppl. Series 5_, 134) fås i det vesentlige et enkelt bånd med en R^-verdi på 0,65-0,75. Man får et analogt mønster ved analytisk elektrofokusering i polyakrylamidgel, og PI-verdien bestemmes på denne måte til ca. 4,4.

Produkter som fås ved behandling av PSP med .trypsin, a-qhymo-trypsin, CNBr, syre eller pyroglutamataminopeptidase som beskrevet nedenfor, har spasmolytisk aktivitet i samme størrelsesorden som

PSP.

Trypsinbehandling:

20 mg PSP oppløses i 20 ml 0,01 M ammoniumhydrogenkarbonat-oppløsning (pH-vérdi: 7,8), og blandingen inkuberes i 5 minutter ved 37°C. Blandingen inkuberes ved 31°C i 15 minutter etter tilsetting av 100 ul 0,001 M saltsyre inneholdende 0,4 mg TPCK-trypsin (fås fra Worthington Biochem. Corp.) og frysetørkes deretter. g- Chymbtrypsinbehandling: 20 mg PSP oppløses i 200 yl 0,1 M natriumhydroksydoppløsning, og det tilsettes 1800 yl 0,05 M ammoniumhydrogenkarbonatoppløs-ning (pH-verdi: 8,0). Oppløsningen inkuberes i 5 minutter ved 37°C, og det tilsettes 50 yl 0,0ol M saltsyre inneholdende 100 yg a-chymotrypsin (fås fra Sigma Chemical Company). Inkuberingen fortsettes i 1 time ved 37°C, og reaksjonen stanses ved tilsetting av 50 yl konsentrert eddiksyre, hvoretter oppløsningen fryse-tørkes. CNB r— behandling; 20 mg PSP oppløses i 2 ml 70% (volum/volum) maursyre inne holdende 72 mg CNBr. Blandingen oppbevares ved romtemperatur i 40 timer og frysetørkes deretter. Etter tilsetting av 2 ml vann foretas igjen frysetørking.

Syrebehandling:

Prøver inneholdende 1 mg PSP som er oppløst i 100 yl

0,5 N saltsyre, inkuberes ved 37°C i 2, 10 og 21 døgn. Etter inkubering.en utfelles proteinet i hver prøve kvantitativt ved tilsetting av 2 ml acetone. Bunnfallet utvinnes ved.sentrifugering, vaskes med 2 ml acetone og tørkes i vakuum. De på denne måte utvundne prøver og en prøve av ubehandlet PSP analyseres ved basisk DE (jfr. ovenfor) med det forbehold at elektroforése-tiden nedsettes, slik at det for PSP fås en R^-verdi på 0,53.

I den prøve som var inkubert i 2 døgn fås en serie bånd med R^-verdier mellom 0,53 og 0,86. I de prøver som var inkubert

i 10 og 21 døgn, fås kun et enkelt bånd med en Rf-verdi på 0,86. Det fremgår av resultatene at det etter 2 døgns forløp er skjedd en delvis deamidering av PSP og en fullstendig deamidering etter 10 døgns inkubering.

Pyroglutamataminopeptidasebehandling:

6 mg PSP oppløses i 2 ml 50 mM natriummonohydrogenfosfat,

30 mM p-merkaptoetanol, 1 mM EDTA-puffer med en pH-verdi på 7,8. Det tilsettes en oppløsning av 2,5. mg pyroglutamataminopeptidase (fås fra Boehringer, Mannheim) i 0,5 ml av ovennevnte puffer. Blandingen inkuberes i 16 timer ved 37°C og frysetørkes deretter.

(2,5 mg av den anvendte pyroglutamataminopeptidase inneholdt

ca. 10 mU enzymaktivitet).

Renheten av PSP-sluttproduktet kan kontrolleres ved analytisk isoelektrisk fokusering (IEF) og basisk DISC-elektroforese (basisk DE, jfr. ovenfor). Produktet vandrer i det vesentligste som et enkelt bånd i begge systemer. IEF utøfres som angitt i. instruksjonene i LKB-brosjyre I-1804-E02: "LKB Ampholine PAG" plates for analytical electrofpcusing on polyacrylamide gels (LKB-Produkter AB, Bromma, Sverige)..

Ved gelfiltrering av PSP på "Bio-Gel P-30" (forhandles av Bio-rad Laboratories, Richmond, California, U.S.A.) fås likeledes kun en enkelt topp, idet det som elueringsmiddel anvendes IM eddiksyre.

PSP er under anvendelse av kjente metoder analysert for en rekke immunoreaktiviteter. De oppnådde resultater er angitt i tabell 1:

PSPs immonureaktivitet er bestemt ved en ytterst spesifikk "radioimmunobestemmelse" som er utviklet, slik at den er følsom ned til 250 pg/ml.

Antistoffer fremstilles ved immunisering av kaniner med "supernatantprotein" (0,5 ml av en oppløsning inneholdende ca 4 mg protein pr. ml) som er blandet med 0,5 ml Freunds adjuvant,

2 ganger ukentlig i løpet av 26 uker. Begynnende fra den 13. dag

etter den første immunisering oppsamles med jevne mellomrom i løpet av 172 døgn i alt 10 blodprøver a 10 ml fra hvert dyr. De vundne antisera undersøkes for affinitet og kapasitet, og det utvelges et egnet antiserum til anvendelse i radioimmunobestemmeIsen.

125

I-PSP fremstilles ved laktoperoksydasemetoden (Biochim. Biophys.Acta 251, 363). Radioiodert PSP renses på kjent måte ved anionevekslerkromatografering og anvendes til polypeptidradioimmuno-bestemmelse (Diabetologica 7, 10). -

Den foreliggende oppfinnelse angår også salter av PSP, og

som eksempler på sådanne salter kan angis salter med kationer såsom natrium, kalium, magnesium, kalsium og sink og syreaddi-sjonssalter med organiske eller uorganiske syrer såsom maursyre, metansulfonsyre, saltsyre og svovelsyre. For korthets skyld anvendes betegnelsen PSP-forbindelser for PSP og fysiologisk tolerable salter derav.

Det har vist seg at PSP forbindelser og glukagon er om-trent ekvipotente med hensyn til inhibering av amplityden av kontraktlonene.av elektrisk stimulert marsvinileum in vitro, jfr. tabell 2. PSP og glukagon ble oppløst i en 0,9% natrium-kloridoppløsning med 0,1% humant serumalbumin.

Denne effekt av PSP-forbindelser blokkeres av fentolamin, men ikke av rialoxon. Den spontane motilitet av den isolerende ileum.fra reserpinbehandlede marsvin inhiberes med PSP.

Det har på tilsvarende måte vist seg at PSP forbindelser er nesten like så kraftige som glukagon med hensyn til inhibering av peristaltikken hos mus in vivo, jfr. tabell . 3, en ef fekt som kan blokkeres med fentolamin.

PSP forminsker tarmbevegelsen hos kaniner in vivo--e.tter—-intravenøs eller, intraluminal administrasjon i tarmen. Motili-teten bestemmes ved hjelp av et ballongkateter i tarmen som er forbundet med en trykktransducer. I 5 av 5 kaniner (fra 2,5 til 3,0 kg legemsvekt) ga 400 ug PSP som ble administrert intra-venøst eller 5 cm fra ballongen inn i tarmhulrommet, en tydelig forminskelse av tarmmotiliteten, nesten til atoni. 200 ug PSP hadde en klar virkning i 3 av 5 kaniner. Glukagon hadde den samme virkning, men kun når den ble administrert intravenøst.

Det har vist seg at PSP forsinker absorpsjonen av [U-^C]-proteinhydrolysat hos griser og hos pankreatektomerte hunder og av [U-^C]-ovalbumin i pankreatektomerte hunder når forbindelsen administreres peroralt i en kapsel med 3 mg PSP. Grisene og hundene veidde ca. 30 kg. 100 uCi [U-"^C]-proteinhydrolysat eller 5 uCi [U-^C]-ovalbumin blandes med en suspensjon av l g "Idon"/kg.og administreres gjennom en magesonde. Sammenlignet med placebo ble det oppnådd maksimale plasma-dpm-verdier fra 30' til 40 minutter senere etter administrering av PSP. Denne for-sinkelse i absorpsjonen som skyldes ca. 100 ug PSP/kg oralt,

er sannsynligvis uttrykk for en forminsket gastrointestinal motilitet.

Det har vist seg at PSP forbindelser ikke in vitro har hoen virkning på frigjørelse av. glukagon eller insulin eller på lipolyse, og forbindelsene har in vivo ikke noen virkning på blodsukkernivået. Ennvidere ga en intravenøs injisert dosis på inntil 1 mg/kg ikke noen signifikant virkning på blodtrykket hos anestesert rotte.

De ovennevnte farmakologiske data indikerer at PSP forbindelser er verdifulle til forebyggelse og behandling av spastiske til-stander i glatt muskulatur, for eksempel i tarmeru VdT~ qr\ mn~ av deres manglende metaboiiske virkninger kan PSP forbindelser for-delaktig anvendes i stedet for glukagon til endoskopi og til radi ologiske bestemmelser.

PSP forbindelser kan administreres intravenøst som en bolus eller som infusjon. Når man ønsker en effekt med forlenget varig-het - langsommere i begynnelsen - kan PSP forbindelser administreres som et depot fra hvilket de langsomt mobiliseres av blodstrømmen såsom intramuskulært eller subkutant i et område med god perifer sirkulasjon. Den kjennsgjerning at den biologiske aktivitet og immunoreaktiviteten bibeholdes etter at PSP har vært behandlet med magesaft, trypsin og chymotrypsin, og ovennevnte forsøk som viser forsinket absorpsjon etter oral administrasjon av PSP, peker på at det er mulig å administrere PSP oralt. PSP kan således administreres via et endoskop under endoskoperingen, eller PSP kan blandes med kontrastmidlet, for eksempel barium-sulfat, under den radiologiske undersøkelse.

Dosismengden av PSP forbindelser kan tilpasses avhengig av størrelsesordenen av den ønskede virkning og andre faktorer, som vanligvis tas i betraktning ved bestemmelse av doseringen. Som et eksempel på et dosisområde kan angis fra 10 til 200 ug/kg le gemsvekt, selv om det kan administreres lavere eller høyere doser.

Det er mulig å fremstille farmasøytiske preparater inneholdende PSP forbindelser<p>g ett eller flere farmasøytisk tolerable hjelpestoffer. Som eksempler på sådanne hjelpestoffer kan

angis konserveringsmidler og natriumklorid.

Et hensiktsmessig preparat inneholder en effektiv mengde av det rensede polypeptid PSP sammen med et egnet fysiologisk tolerabelt bærestoff.

En passende preparatform er en vandig steril oppløsning av det rensede polypeptid PSP inneholdende 0,9% natriumklorid og eventuelt konserveringsmidler såsom fenol eller en paraben.

Det rensede polypeptid er fortrinnsvis til stede i en

mengde på fra 0,1 til 200 mg/ml, særlig fra 0,5 til 25 mg/ml.

Som et forsøk på å sikre at man etter administrering av en PSP forbindelse får det ønskede resultat, er det tilrådelig . til fremstillingen av PSP preparater å anvende et utgangsmateriale som har en renhet på minst 50%, fortrinnsvis en renhet på minst 90% av en PSP forbindelse.

Ifølge ikke tidligere publiserte data inneholder pankreatinpiller PSP (f.eks. ca. 1/1000). Pankreatinpiller er på grunn av sitt innhold av enzymer blitt anvendt til pankreatektomerte pasienter og pasienter med kronisk pankreatitis. Det har nu vist seg at kommersielt insulin inneholder 30 ppm PSP.

Fremgangsmåten til fremstilling av PSP belyses nærmere i

det følgende. Betegnelsen "høyrenset PSP" angir PSP som beveger seg i det vesentlige som et enkelt bånd i ovennevnte IEF-system og basisk DE^-system.

Eksempel 1.

En saltkake som stammer fra 94 kg svinepankreaskjertler, oppløses i vann til et volum på 3,2 1. Oppløsningens pH-verdi innstilles på 5,3, hvoretter bunnfallet fjernes ved sentrifugering.. Supernatantens pH-verdi reguleres til 6,5, og den dannede suspensjon sentrifugeres. Oppløsningen blandes med 32 ml 0,5 M Na^EDTA og 35 1 etanol. Blandingen får henstå

natten over ved 4°C og sentrifugeres deretter. Bunnfallet tørkes i vakuum, hvorved det oppnås 50 g tørt supernatantproteinpulver.

En oppløsning av pulveret i 500 ml vann omrøres forsiktig, mens det langsomt tilsettes 1 M eddiksyre ved hjelp av en peri-staltisk pumpe, inntil det oppnås en pH-verdi på 4,30 (efter ca. 3 timers pumping). Omrøringen fortsettes i 3 døgn ved 4°C, hvorved det opptrer, krystallisasjon.. Krystallene (stangformet utseende, eventuelt ortorhombisk og dobbeltbrytende) oppsamles ved sentrifugering, suspenderes i 500 1 vann ved 4°C med om-røring natten over, sentrifugeres og tørkes i vakuum.

Utbyttet er 5,2 g.

4 g av dette produkt oppløses i 50 ml 50% (volum/volum) etanol og 50 ml av den i sammenheng med figur 1 anvendte eluent med en pH-verdi på 8,6. Oppløsningen underkastes anionvekslerkromatografering som angitt i figur 1. Det som oppsamles fra hovedtoppen innstilles på en pH-verdi på 7,4, blandes med 4 volum.96% (volum/volum) etanol og får deretter henstå ved 4°C

i 2 døgn. Bunnfallet isoleres ved sentrifugering, vaskes to ganger med 150 ml 96% (volum/volum) étanol og tørkes i vakuum. Utbyttet er 2,6 g.

2,5 g av dette produkt oppløses i 125 ml 50% (volum/volum) etanol og 125 ml av det i figur 2 anvendte elueringsmiddel med. en pH-verdi på 4,7, og det foretas deretter kationvekslerkroma-tografering som angitt i figur 2. Det som oppsamles fra hovedtoppen (den eneste på figuren angitte) inndampes til tørrhet. Remanensen oppløses i vann, og oppløsningens pH-verdi innstilles på 7,1 (det endelige volum er ca. 90 ml). Oppløsningen blandes med 1200 ml 96% (volum/volum) etanol, og blandingen får henstå natten over ved 4°C. Bunnfallet oppsamles ved sentrifugering, vaskes 2 ganger med 150 ml 96% (volum/volum) etanol og tørkes

i vakuum. Utbyttet er 1,8 g høyrenset PSP som oppfyller de i tabell 1 angitte renhetskriterier.

Eksempel 2.

20 g supernatantproteinpulver som er fremstilt som beskrevet i eksempel 1, oppløses i 200 ml vann. Det tilsettes 208 ml 96% (volum/volum) etanol, hvoretter pH-verdien med eddiksyre innstilles på 4,6. Ved sentrifugering fjernes et lite bunnfall. Supernatanten som langsomt blir uklar, underkastes kationveksler-kromatografering på en 2,5 x 80 cm kolonne med "SP-Sephadex C-25" som er ekvilibrert i eluent 1 (bestående av 0,4 M eddiksyre, 0,05 M natriumacetat og 50% (volum/volum) etanol, pH-verdi 4,6).

Eluering med en lineær gradient utføres mellom 3 1 eluent 1

og 3 1 eluént 2 (bestående av 0,3 M natriumacetat og 50% (volum/ volum) etanol, pH-verdi: 8,7). Fraksjoner på 10 ml oppsamles med en elueringshastighet på 40 ml/time. Fraksjonene svarende til den store topp som opptrer fra fraksjon nr. 100 til nr. 130, oppsamles. Det oppsamlede innstilles på en pH-verdi på 8 og blandes deretter med 1,8 1 96% (volum/volum) etanol. Blandingen oppbevares ved 4°C i 24 timer. Det utfelte protein oppsamles ved sentrifugering, vaskes 2 ganger med 150 ml 96% (volum/volum) etanol og tørkes i vakuum. Utbyttet er 2,8 g. 2,5 g av dette produkt oppløses i 250 ml av en TRIS-puffer (bestående av 0,0575 M TRIS, 0,05 N saltsyre, pH-verdi: 7,4). Oppløsningen underkastes anionvekslerkromatografering på en 2,5 x 50 cm kolonne med "QAE-Sephadex A-25" som er ekvilibrert i en TRIS-puffer

(0,115 M TRIS, 0,1 N saltsyre, pH-verdi: 7,4). Kolonnen elueres med ekvilibreringspufferen med en hastighet på 30 ml/time. Fraksjoner på 10 ml oppsamles. De fraksjoner som svarer til

den sentrale overveiende del av den topp som gir maksimum ved fraksjon nr. 225, oppsamles. Det oppsamlede (620 ml) blandes med 60 ml 5 M natriumkloridoppløsning og 12 1 96% (volum/volum) etanol. Blandingen oppbevares ved 4°C i 24 timer. Det utfelte protein oppsamles ved sentrifugering, vaskes 2 ganger med 150 ml 96% (volum/volum) etanol og tørkes i vakuum. Utbyttet er 1,7 g høyrenset PSP.

Eksempel 3.

Til 150 1 av en vandig oppløsning som fåes ved inndampning av en ekstrakt fra 250 kg svinepankreaskjertler og som er be-fridd fra uoppløste bestanddeler, settes 22,5 kg natriumklorid. Blandingen omrøres til oppløsning av det tilsatte salt, og det resulterende bunnfall fjernes ved sentrifugering, hvorved saltkaken fåes. Til moderluten (162 1) settes under omrøring i 2 timer ved romtemperatur 34 kg ammoniumsulfat, hvorved.et bunnfall fåes, som isoleres ved sentrifugering. 223 g vått produkt oppløses ved tilsetting av 500 ml av en puffer (bestående av 0,05 Mmaursyre, 0,01 M natriumhydroksyd, pH-verdi: 3,2). Oppløs-ningens ledningsevne forminskes til 4 mS ved dialyse mot vann. Oppløsningen settes på en 5 x 50 cm kolonne med "SP-Sephadex C-25" som er ekvilibrert med puffer I (bestående av 0,1 M maursyre, 0,02 M natriumhydroksyd, pH-verdi: 3,2). Etter påsetting av oppløsningen elueres kolonnen med en lineær gradient av natrium klorid fra 0 til 0,27 M i puffer I. Det totale volum eluent er 5,5 1. Kolonnen elueres deretter ytterligere med puffer I inneholdende 0,2 7 M natriumklorid. Gjennomstrømningen under påsettingen og elueringen er 100 ml/time, og fraksjoner på 15 ml oppsamles. Det kromatogram som fås ved bestemmelse av fraksjonenes absorpsjon ved 276 nm, viser en hovedtopp fra fraksjon nr. 420 til nr. 530. Det som oppsamles svarende til hovedtoppen, innstilles på en pH-verdi på 7,4 og blandes deretter med 20 volum 96% (volum/volum/ etanol. Etter henstand ved 4°C i 48 timer kan det ved sentrifugering utvinnes et bunnfall som tørkes i vakuum. Utbyttet er 6 g. Det på denne måte vundne produkt renses ytterligere ved anionvekslerkromatografering på

én kolonne med "QAE-Sephadex A-25" som beskrevet i eksempel 2. Utbyttet er 3,4 g høyrenset PSP.

. Eksempel 4.

Et preparat til parenteral administrasjon inneholdende

1 mg PSP pr. ml kan fremstilles på følgende måte:

1 g PSP og 99 g lactose oppløses ill destillert vann, og pH-yerdien innstilles på 7,0. Deretter sterilfUtreres oppløs-ningen. Den sterile oppløsning fylles i 10 ml hetteglass på

en slik måte at hvert hetteglass inneholder 10 ml oppløsning. Deretter frysetørkes oppløsningene, og hetteglassene lukkes under aseptiske betingelser.

Produktet i hetteglassene skal før administeringen oppløses i 10 ml sterilt vann.

Eksempel 5.

Orale preparater kan fremstilles på følgende måte:

100 mg PSP blandes med 9 g maisstivelse, 8 g lactose og

180 mg magnesiumstearat, inntil en homogen blanding fåes. Blandingen fylles i hårde gelatinkapsler (nr. 3) på en slik

måte at hver kapsel inneholder 1 mg PSP.

Fremgangsmåter til fremstilling av PSP og salter derav

kan oppstilles påfølgende måte:

1) Fremgangsmåte til utvinning av et renset polypeptid

PSP som definert ovenfor, ved at polypeptidet utvinnes fra svinepankreaskjertler ved en kombinasjon av kromatografering og utfelling. 2) Fremgangsmåte ifølge punkt 1), hvor kjertlene ekstraheres med en blanding av vann og et med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel i surt medium, bunnfallet fjernes, ekstrakten nøytraliseres, og PSP utvinnes fra den på denne nåte vundne ekstrakt under anvendelse av separasjonsmetoder som er i og for seg kjente, hvoretter PSP om ønskes, omdannes til et salt derav. 3) Fremgangsmåte ifølge punkt 1, hvor produktet utvinnes fra en insulinsaltkake. 4) Fremgangsmåte ifølge punkt 2, hvor utvinningen utføres ved kromatografering under anvendelse av en. kation- og/eller anionveklser. 5) Fremgangsmåte ifølge punkt 4, hvor det foretas en krystallisasjon. 6) Fremgangsmåte ifølge punkt 4, hvor kromatograferingen utføres under oppsamling av hoveddelen av PSP-hovedtoppen. 7) Fremgangsmåte ifølge punkt 2, hvor PSP utvinnes fra den moderlut som dannes når det fremstilles en insulinsaltkake, ved en ytterligere utsalting etterfulgt av kromatografering under anvendelse av en anion og/ellér kationveksler.. 8) Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av punktene 3-6, hvor saltkaken i det vesentlige befries for insulin ved fjernelse av.det bunnfall som dannes i en oppløsning av saltkaken som innstilles på en pH-verdi i området fra ca. 4,9 til ca. 5,7, fortrinnsvis ca. 5,3, og at det bunnfall som dannes i supernatanten ved en pH-verdi i området fra ca. 5,7 til ca. 7,0, fortrinnsvis ca. 6,5, eventuelt fjernes før kromatograferingen utføres. 9) Fremgangsmåte ifølge punkt 5, hvor krystallisasjonen ut-føres ved innstilling av oppløsningens pH-verdi på en verdi i området fra ca. 3,8 til ca. 4,8, fortrinnsvis ca. 4,3.

Claims (9)

1. Renset polypeptid med følgende aminosyresammensetning: Trp (2), Lys (4), His (1), Arg (5), Asx (10), Thr (3), Ser (9), Glx (12), Pro (12), Gly (6), Ala (6), Cys 1/2 (14), Val (7), Met (2) , Ile (3), Leu (1)., Tyr (2), Phe (7), hvor bestemmelsene er beheftet med den vanlige feil på 1 10% av de angitte verdier, og med en delvis aminosyresekvens som fra .den N-terminale ende formodes å være: pyrGlu-Lys-Pro-Ala-Ala-Cys-Arg-Cys-Ser-Arg-Glx-Asx-Pro-5 10 Lys-Asx-Arg-Val-Asx-Cys-Gly-Phe-Pro-Gly-Ile-Thr-Ser-Asx-Glx-Cys-15 20 25 Phe-Thr-Ser-Gly-Cys-Cys-^Phe-Asx-Ser-Glx-Val-Pro-Gly-Val-Pro-Trp-30 35 40 45 hvor pyrGlu (rest 1) betegner pyroglutaminsyre eller et fysiologisk tolerabelt salt derav.

2. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert, ved at det har en renhet på over 50 vektprosent, fortrinnsvis over 90 vektprosent.

3. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert vedat det foreligger i krystallinsk form.

4. Anvendelse av et renset polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3 som spasmolyticum, fortrinnsvis som diagnostisk middel eller som profylaktisk middel.

5. Fremgangsmåte til utvinning av et renset polypeptid ifølge krav 1,karakterisert vedat svinepankreaskjertler ekstraheres med en blanding av vann og et med vann blandbart opp-løsningsmiddel under ekstraksjonsbetingelser som er tilpasset til utvinningen av insulin fra kjertlene, og at polypeptidet (PSP) deretter utvinnes fra den vundne ekstrakt.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat.den vundne ekstrakt ved inndamping befries for det med vann blandbare oppløsningsmiddel, hvoretter fettstoffene fjernes.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat insulinet og ledsagende proteiner utsaltes etter fjernelse av de angjeldende fettstoffer, at saltkaken oppløses i vann, at den resulterende oppløsning innstilles på en pH-verdi mellom 4,9 og 5,7, fortrinnsvis 5,3, og at det dannede bunnfall fjernes.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat insulinet og ledsagende proteiner utsaltes etter fjernelse av fettstoffer,. og at den dannede saltkake fjernes.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat utvinningen utføres ved adskillelse i en fraksjon som er mer beriket med hensyn til det angjeldende polypeptid, etterfulgt av kromatografisk rensing og konsentrering av den med det angjeldende polypeptid berikede fraksjon, inntil det fåes en fraksjon som inneholder minst 50%, beregnet på tørr vekt, av det angjeldende polypeptid.