LU83206A1 - Gereinigtes polypeptid,verfahren zum isolieren und verwendung desselben sowie pharmazeutische zusammensetzung und waessrige sterile loesung - Google Patents
Gereinigtes polypeptid,verfahren zum isolieren und verwendung desselben sowie pharmazeutische zusammensetzung und waessrige sterile loesung Download PDFInfo
- Publication number
- LU83206A1 LU83206A1 LU83206A LU83206A LU83206A1 LU 83206 A1 LU83206 A1 LU 83206A1 LU 83206 A LU83206 A LU 83206A LU 83206 A LU83206 A LU 83206A LU 83206 A1 LU83206 A1 LU 83206A1
- Authority
- LU
- Luxembourg
- Prior art keywords
- cys
- psp
- pro
- ser
- val
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 6
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 title claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 8
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000000812 cholinergic antagonist Substances 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002921 anti-spasmodic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 claims 1
- OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OWOFCNWTMWOOJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- LUJVWKKYHSLULQ-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN LUJVWKKYHSLULQ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 1
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 claims 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 claims 1
- 208000032207 progressive 1 supranuclear palsy Diseases 0.000 description 64
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 20
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 12
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 12
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 12
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000008991 intestinal motility Effects 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- -1 lipid compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 3
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002048 spasmolytic effect Effects 0.000 description 3
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N Magnesium oxide Chemical compound [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 108010079943 Pentagastrin Proteins 0.000 description 2
- 108090000919 Pyroglutamyl-Peptidase I Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940065524 anticholinergics inhalants for obstructive airway diseases Drugs 0.000 description 2
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- CCGSUNCLSOWKJO-UHFFFAOYSA-N cimetidine Chemical compound N#CNC(=N/C)\NCCSCC1=NC=N[C]1C CCGSUNCLSOWKJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001380 cimetidine Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 230000030135 gastric motility Effects 0.000 description 2
- 230000005176 gastrointestinal motility Effects 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 229960000444 pentagastrin Drugs 0.000 description 2
- ANRIQLNBZQLTFV-DZUOILHNSA-N pentagastrin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1[C]2C=CC=CC2=NC=1)NC(=O)CCNC(=O)OC(C)(C)C)CCSC)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 ANRIQLNBZQLTFV-DZUOILHNSA-N 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DNXIKVLOVZVMQF-UHFFFAOYSA-N (3beta,16beta,17alpha,18beta,20alpha)-17-hydroxy-11-methoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]-yohimban-16-carboxylic acid, methyl ester Natural products C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(C(=O)OC)C(O)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 DNXIKVLOVZVMQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 1
- OSASDIVHOSJVII-WDSKDSINSA-N Arg-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OSASDIVHOSJVII-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229930003347 Atropine Natural products 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 208000000668 Chronic Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- LVNMAAGSAUGNIC-BQBZGAKWSA-N Cys-His Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 LVNMAAGSAUGNIC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 206010065713 Gastric Fistula Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N Hyosciamin-hydrochlorid Natural products CN1C(C2)CCC1CC2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 206010033649 Pancreatitis chronic Diseases 0.000 description 1
- FKFCKDROTNIVSO-JYJNAYRXSA-N Phe-Pro-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FKFCKDROTNIVSO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZZCICYRSZASNF-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DZZCICYRSZASNF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- LCQMZZCPPSWADO-UHFFFAOYSA-N Reserpilin Natural products COC(=O)C1COCC2CN3CCc4c([nH]c5cc(OC)c(OC)cc45)C3CC12 LCQMZZCPPSWADO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-SFWBKIHZSA-N Reserpine Natural products O=C(OC)[C@@H]1[C@H](OC)[C@H](OC(=O)c2cc(OC)c(OC)c(OC)c2)C[C@H]2[C@@H]1C[C@H]1N(C2)CCc2c3c([nH]c12)cc(OC)cc3 QEVHRUUCFGRFIF-SFWBKIHZSA-N 0.000 description 1
- QWZIOCFPXMAXET-CIUDSAMLSA-N Ser-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QWZIOCFPXMAXET-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N Ser-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 1
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOBWAPHTEJGALG-JKCMADFCSA-N [(1r,5s)-8-methyl-8-azoniabicyclo[3.2.1]octan-3-yl] 3-hydroxy-2-phenylpropanoate;sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O.C([C@H]1CC[C@@H](C2)[NH+]1C)C2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1.C([C@H]1CC[C@@H](C2)[NH+]1C)C2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 HOBWAPHTEJGALG-JKCMADFCSA-N 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N atropine Chemical compound O([C@H]1C[C@H]2CC[C@@H](C1)N2C)C(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N 0.000 description 1
- 229960000396 atropine Drugs 0.000 description 1
- 229960002028 atropine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical class [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 201000000079 gynecomastia Diseases 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000035873 hypermotility Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000395 magnesium oxide Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229960004127 naloxone Drugs 0.000 description 1
- UZHSEJADLWPNLE-GRGSLBFTSA-N naloxone Chemical compound O=C([C@@H]1O2)CC[C@@]3(O)[C@H]4CC5=CC=C(O)C2=C5[C@@]13CCN4CC=C UZHSEJADLWPNLE-GRGSLBFTSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 108010056579 pancreatic spasmolytic polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 230000008855 peristalsis Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001999 phentolamine Drugs 0.000 description 1
- MRBDMNSDAVCSSF-UHFFFAOYSA-N phentolamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1N(C=1C=C(O)C=CC=1)CC1=NCCN1 MRBDMNSDAVCSSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- BJOIZNZVOZKDIG-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C([C]5C=CC(OC)=CC5=N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 BJOIZNZVOZKDIG-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 229960003147 reserpine Drugs 0.000 description 1
- MDMGHDFNKNZPAU-UHFFFAOYSA-N roserpine Natural products C1C2CN3CCC(C4=CC=C(OC)C=C4N4)=C4C3CC2C(OC(C)=O)C(OC)C1OC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 MDMGHDFNKNZPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
*" * ί 2170.3 00-LU ^ . ÎO 3 y ►: *ç \ i i » j i * NOVO INDUSTKÏ Λ/S., Novo Allé, 2880 Bagsvaerd,
Danemark
Gereinigtes Polypeptid, Verfahren zum Isolieren und Verwendung desselben sowie pharmazeutische Zusammensetzung und wäßrige sterile Lösung
Die Erfindung betx-ifft ein gereinigtes Poly-; peptid, ein Verfahren zum Isolieren eines gereinigten | Polypeptids, eine pharmazeutische Zusammensetzung, ; eine wäßrige sterile Lösung eines gereinigten Poly- ; peptids sowie die Verwendung des gereinigten Poly peptids.
^ Die Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges gereinigtes Polypeptid oder ein physiologisch akzeptables Salz desselben sowie auf ein Verfahren zum Gewinnen und zur Reinigung desr II selben und auf die Verwendung desselben als spas- : / · ‘ i « «* molytisches Ayons, überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß das erf indungsger.iäße gereinj g!;.c Polypeptid, welches aus Schweinepankreas gewinn-^ bar ist, entspannende oder spasmolytische Effekte auf glatte Muskulatur bewirkt. Aus diesem Grunde t wurde es mit dem Triv.ialna.men pankreatisches spas- molytisches Polypeptid, welcher im weiteren aus Gründen der Bequemlichkeit su PSi’ abgekürzt wird, bezeichnet. PSP zeigt interessante pharmakologische Eigenschaften.
Spasmolytische Agenzien oder Antispasmolytika, wie Atropin, mit diesem verwandte Verbindungen und synthetische Medikamente mit atropinartigem Effekt, werden weitverbreitet für die Behandlung einer Vielzahl von Beschwerden, insbesondere von Krämpfen glatter Muskulatur und Hypermotilitäts-zuständen,verwandt. Nichtsdestoweniger wird die beabsichtigte Wirkung derartiger Stoffe üblicherweise von einer Anzahl Nebeneffekte be-: gleitet, welche ihrem allgemeinen Charakter als
Anticholinergika zuzuschreiben sind.
Als diagnostisches Hilfsmittel beim Röntgen des Gastrointestinal-Traktes, insbesondere zusammen » mit einem Röntgenkontrastmittel zur Verbesserung der Darstellung des Gastrointestinal-, Gallen- und Ausscheidungstraktes sind bisher allgemein atropinähnliche Anticholinergika verwandt worden. Derartige Medikamente werden üblicherweise parenteral | gegeben und aufgrund der Dosis, die notwendig ist, — \J um vollständige Entspannung zu erreichen, werden « Λ üblicherweise auch die klassischen Nebenwirkungen dieser Substanzen angetroffen.
Kürzlich wurde die parenterale Gabe des Peptidhormons Glukagon, welches aus 29 Aminosäuren besteht, als alternatives Mittel zur Reduktion der gastro-intestinalen· Motilität in Zusammenhang mit radiologischen Untersuchungen eingeführt (s. US~Pa-tent Nr. 38 62 301). Glukagon zeigt aber außerdem eine Vielzahl weiterer Wirkungen im menschlichen Körper, eingeschlossen einen starken Einfluß auf die metabolischen Regelfunktionen, wobei die deutlichste Wirkung das Hervorrufen von Hyperglykämie und Lipolyse ist. Daher konnten, obwohl der Einsatz von Glukagon in der Endoskopie bestimmte Vorteile brachte, die unerwünschten Nebenwirkungen nicht vollständig ausgeschaltet werden.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Spasmolytikum zu liefern, welches, während es antispasmische und entspannende Wirkungen auf glatte Muskulatur - ähnlich denen bekannter Agenzien - besitzt, wesentlich geringere Nebenwirkungen zeigt.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein ge-. reinigtes Polypeptid folgender Aminosäurezusammen-
Setzung gelöst:
Trp (2), Lys (4), His (1), Arg (5), Asx (10), Thr (3), Ser (9), Glx (12), Pro (12), Gly (6), Ala (6),
Cys1/2 (14) , Val (7), Met (2), Ile (3), Leu (1), f) Tyr (2), Phe (7), wobei die Bestimmungen den üblichen ~ '1 Fehler von ± 10 % der angegebenen Zahlen aufweisen, h ( 1 s wobei der Antinosäuresequenz folgendermascen Dein soll:
PyrGlu-Lys~Pro-Ala-Ala~Cys~Arg-Cys~Ser-Arg-Gln~Asp~Pro-~Lys-Asn- 15 10 15
Arg-Val-Asn-Cys-Gly-Phe-Pro-Gly-Ile-Thr-Ser-Asp-Gln-Cys-Phe-Thr- 20 25 30
Ser-Gly~Cys-Cys-Phe-Asp~Ser-Gln~Val-Pro~Gly-Val-Pro-Trp*-Cys-Phe-35 40 45
Ser-Pro-Leu-Pro-Ala-Gln-Glu-Ser-Glu-Glu-Cys-Val-Met-Gln-Val-Lys-50 55 60
Ala-Arg-Lys-Asn-Ser-Gly-Tyr-Pro-Gly-Ile-Cys-Pro-Glu-Asp-Cys-Ala-65 70 75
Ada-Aarg-Asn-Cvs-Cys-Phe-Ser-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Val-Pro-Tip-Cys- 80 " 85 '90 95
PhO“Phe-Pro-Met“Ser-Val-Glu-Asp*“Cys-HiS“*Tyri wobei pyrGlu (Amino- 100 105 säurerest 1) Pyroglutaminsäure sein soll, oder ein physiologisch akzeptables Salz davon. Die Abkürzungen für die Aminosäuren sind aus J. Biol. Chenu 243,(1968), 3558, ersichtlich. Weiterhin liefert die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren eines gereinigten Polypeptids, gekennzeichnet durch Isolieren des Polypeptids aus Schweinepankreasdrüsen durch eine Kombination von Chromatographie und Ausfällen und ein weiteres Verfahren, gekennzeichnet durch Isolieren des Polypeptids aus einem Insulinsalzkuchen. Ein weiteres Verfahren zum Isolieren eines derartigen Polypeptids ist gekennzeichnet durch Isolieren von PSP aus der Mutterlauge, die entsteht, wenn ein Insulinsalz-^ kuchen hergestellt wird, durch weiteres Aussalzen, ' gefolgt durch Chromatographie, unter Verwendung eines
Anionen- und/oder Kationen-Austauschers. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Menge eines gereinigten Polypeptids enthält, gemeinsam mit einem geeigneten physiologisch akzeptierbaren Träger tL oder Exzipienten. Eine erfindungsgemäße wäßrige
A
t *· * sterile Lösung eines gereinigten Polypeptids ist dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 0,9 -L Natrri um-· Chlorid und gegebenenfalls Konservierungsmittel wie Hydroxibenzoesäure oder Phenol enthält. Weiter-hin wird die Aufgabe durch die Verwendung des gereinigten Polypeptids als Medikament gelöst.
Die Erfindung liefert also außerdem ein Verfahren % zur Herstellung gereinigten PSP’s, wobei dieses Verfahren das Isolieren von PSP aus Schweinepeinkreas-gewebe, bevorzugt aus dom Insulinsalzkuchen durch eine Kombination von Chromatographie- und Ausfällverfahrensschritten, beinhaltet.
Der Insulinsalzkuchen kann, wie folgt, hergestellt werden: Ganze, sauber entfettete Schweinepankreasdrüsen werden gefroren : fein zerteilt und sodann dem konventionellen Extraktionsprozeß für das Gewinnen von Insulin unterworfen, nämlich mittels einer Mischung aus Wasser und einem organischen wassermischbaren Lösungsmittel , wie einem niedrigen aliphatischen Älkanol~ beispielsweise Ethanol oder Isopropanol - in einem sauren Medium, beispielsweise einem Medium mit einem pH im Bereich von etwa 1,5 bis 5, gemessen mit einem pH-Meter in ' der Mischung, extrahiert. Der saure pH wird durch Zu- 1 * gäbe einer Säure erreicht—In.-.der fertigen
Mischung aller Komponenten ist das organische Lösungsmittel in einer Konzentration im Bereich von i etwa 40 bis 80 Vol.% vorhanden. Die resultierende Auf-*1 Schlämmung wird bei einer Temperatur -im Bereich von etwa 5°C bis -r ...· « v
«I
» zu Umgebungstemperatur,gei'ührt, gefolgt durch Abtrennen der Drüsen-Reste, beispielsweise durch Zentrifugieren.
Der Extrakt vjj.rd sodann auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 9 neutralisiert und geklärt, beispielsweise durch Zentrifugation. Der Extrakt wird auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis 4 angesäuert, woraufhin der Extrakt von jeglichem organischen Lösungsmittel befreit wird, beispielsweise durch Verdampfen bei reduziertem Druck, gefolgt durch Abtrennen der Lipid-Verbindungen,beiopieisweise durch Zentrifugation. Insulin, gemischt mit anderen Proteinen und Polypeptiden, wie PSP, wird aus den deraart erhaltenen, konzentrierten Extrakten ausgesalzen, beispielsweise durch Zugabe von Natriumchlorid bis zu einer Konzentration im Bereich von etwa 10 bis. 30 % (Gew./Vol.), und das derart gebildete Präzipitat - beispielsweise durch Zentrifugation, -r isoliert, wodurch der Salzkuchen gebildet wird.
Der derart erhaltene Salzkuchen kann daraufhin in ’Wasser gelöst und das Rohinsulin durch Ausfällung am ? isoelektrischen Punkt bei.einem pH im Bereich von etwa 4,9 bis 5,7, beispielsweise bei etwa 5,3, wahlweise in Gegenwart von Metallionen, beispielsweise Zinkionen,,isoliert und gewonnen werden, üblicherweise durch Zentri- ' fugation. Der pH-Wert des Überstandes wird in den Bereich von zwischen etwa 5,7 bis 7, bevorzugt etwa 6,5, eingestellt. Das gebildete Präzipitat, welches etwas Insulin enthält, wird abzentrifugiert. Um Hilfs-, Substanzen, wie Salze, zu entfernen, wird ein EDTA-Überschuß zum obigen Überstand dazugegeben, gefolgt | durch Zugabe eines wassermischbaren organischen _ ' vJf Lösungsmittels, bevorzugt von Ethanol (üblicherweise
V
i , ï zwischen 5 bis 20 Vol.-Teile). Die Mischung wird übei* Nacht bei etwa 4° C stehengelassen, um Präzipitat zu bilden und anschließend zentrifugiert. Das Präzipitat wird vakuum-getrocknet und liefert ein trockenes Pulver, welches im weiteren hier als , "Überstands-Protein" bezeichnet wird. Durch dieses
Verfahren kann praktisch das gesamte Proteinma-‘ terial des "überstands-Proteins" gewonnen, werden.
PSP kann in einer rohen, kristallinen Form aus einer Lösung von "Überstands-Protein " in Wasser (etwa 10 Teile) gewonnen werden. Die Lösung wird leicht gerührt, während Säure, beispielsweise Essigsäure, über etwa 3 Stunden zugegeben wird, bis ein pH-Wert im Bereich von etwa 3,8 bis 4,8, bevorzugt etwa 4,3, erreicht wird. Die Mischung wird daraufhin gekühlt und weitere drei Tage, bevorzugt bei etwa 4° C, weitergerührt. Eine Ausbeute relativ großer, stäbchenförmiger, doppelbrechender Kristalle wird isoliert, beispielweise durch Zentrifugation, und vakuum-getrocknet.
Das derart erhaltene Material kann weiter gereinigt , werden, bevorzugt durch Anwendung aufeinanderfol gender Schritte von Anionen- und Kationenaustauschchromatographie.
Zur Erläuterung des Verfahrens kann beispielsweise Anionenaustauschchromatographie auf einer Säule von jj "QAE-Sephadex A-25" (geliefert durch Pharmacia AB, — sj Schweden) unter Verwendung des in Figur 1 der be- i gleitenden Zeichnungen gegebenen Elutionsmittels (TRIS ist dabei tris-Hy droxirae thyl-Zuninomethan) durchgeführt werden. Das bei Überwachung der optischen Dichte von Fraktionen bei 276 nm erhaltene Chromatogramm zeigt einen Hauptpeak. Die gesammelten Fraktionen, die dem Hauptpeak entsprechen, werden auf pH 7,4 eingestellt und anschließend mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, beispielsweise Ethanol (4 Vol.-Teile) gemischt. Nach zweitägigem Stehen bei 4° C wird das Abgeschiedene durch Zentrifugation gewonnen und vakuum-getrocknet.
Das so erhaltene Material kann weiter durch Kationen-austauschchromatograiJhie, beispielsweise auf einer Säule von "SP-Sephadex C-25" (geliefert durch Pharmacia) gereinigt werden. Elution kann mit dem Elutionsmittel, das auf Figur 2 der begleitenden Zeichnung angegeben ist, durchgeführt werden. Das in der gleichen Weise wie oben beschrieben erhaltene Chromatogramm zeigt einen Hauptpeak.Die gesammelten, diesem entsprechenden Fraktionen werden zur Trockenheit abgedampft, der. Rückstand in Wasser bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis etwa 8 gelöst, beispielsweise bei etwa 7, mit einem Überschuß (etwa 12 Vol.-Teile) eines wasserlöslichen organischen Lösungs- « * mittels, beispielsweise Ethanol, gemischt, und über Nacht unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben gehalten. Gereinigtes PSP, welches sich aus der Lösung abscheidet, wird durch Zentrifugation isoliert, mit Ethanol gewaschen und vakuum-getrocknet.
Alternativ dazu kann PSP-haltiges Protein aus der %
Mutterlauge erhalten werden, die entsteht, wenn der Salzkuchon unter Verwendung von Natriumchlorid in einer Konzentration von 10 bis 20 % (Gew./Vol.) durch einen zusätzlichen Aussalz-Verfahrensschritt isoliert wird. Das Präzipitat wird beispielsweise durch Zentrifugation gewonnen. Gereinigtes PSP kann aus diesem Präzipitat durch Verwendung von Anionen- lind/oder Kationenaustauschchromatographie in beliebiger Reihenfolge gewonnen werden.
Ein weiteres Verfahren zur Isolation von PSP-haltigem Protein aus dem obigen Extrakt der Pankreasdrüsen verwendet eine Mischung von Wasser und einem organischen, wassermischbaren Lösungsmittel durch Adsorption an einem Kationen- oder Anionenaustauscher, beispielsweise Algininsäure, sulfoniertes Polystyron oder Aminoethyleellulose. Anschließend wird der Ionenaustauscher gewaschen und das Protein mit einem wäßrigen Medium eluiert. Die Isolation mit Hilfe eines Ionenaustauschers wird nach Verfahren durch-i geführt, die bekannten Verfahren analog sind.
PSP, das nach einem der oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, besitzt folgende charakteristischen Eigenschaften : *
Molekulargewicht, berechnet aus der Aminosäurezu-sammensetzung: etwa 11.700.
Molekulargewicht, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-? DISC-Gelelektrophorest (Neville: J. Biological Chemistry 246 (1971) 6328): et-.: ^0.700.
4 .f~~ -9 -
Elektrophorese-Charakteristika : Basische DISC-^leK-trophorese (basische DE) in Polyacrylamid-t:·.. . v,>ie durch J. Schlichtkrull et al. (Horm. Metabo Research,
Suppl. Sériés j5 (1974) 134) beschrieben, zeigt im wesentlichen eine einzige Bande mit einem von 0,65 bis 0,75. Ein ähnliches Muster wird bei analytischer Elektrofokussierung in Polyacrylam.id-Gel erhalten, wodurch der (isoelektrischer Punkt) auf etwa 4,4 bestimmt wird.
Die Produkte, die bei Behandlung von PSP mit Trypsin, ^ -Chymotrypsin, CNBr, Säure oder Pyroglutamat-'Aminopeptidase wie weiter unten beschrieben, enthalten werden, haben eine spasmolytische Aktivität gleicher Größenordnung wie PSP.
Trypsinbehandlung 20 mg PSP wurden in 20 ml 0,01 M NH^HCO^-Lösung (pH : 7,8) gelöst und 5 Minuten bei 37° C präinkubiert. Nach Zugabe von 100 μΐ 0,001 M HCL, welche 0,4 mg TPCK-Trypsin enthielt (erhältlich von Worthington Biochem.
Corp.), wurde die Mischung bei 37° C weitere 15 Minuten inkubiert und anschließend lyophilisiert.
cC~ Chyirto t ry p s i n b eh an d 1 un g 20 mg PSP wurde in 20C μΐ 0,1 M NaOH gelöst und 1800 μΐ 0,05 M NH^HCO^ (pH : 8,0) zugegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten bei 37° C präinkubiert und anschließend 50 ul 0,001 M Salzsäure, welche 100 jug cC-Chymotrypsin enthielt (erhältlich von Chemical Company) zugegeben. Die Inkubation 1 Stunde bei 37° C fort- | gesetzt und die Reaktro d ar eh Zugabe von 50 ul kon- zentrierter Essigsäure abgebrochen, vroraufhind die Lösung lyo- 7__ » 10 - philisiert wurde.
CHBr-Bc-handlung 20 mg PSP wurden in 2 ml 70 Vol.-prozentiger Ameisensäure, welche 72 mg CNBr enthielt, gelöst. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 40 Stunden gehalten und anschließend lyophilisiert. Das Lyophilisieren wurde anschließend nach Zugabe von 2 ml Wasser wiederholt.
Säurebehandlung 1 mg PSP-Proben, in 100 pl 0,5 N Salzsäure gelöst, wurden'bei 37° C 2, 10 und 21 Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Protein jeder Probe quantitativ durch Zugabe von 2 ml Aceton ausgefällt.
Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation isoliert, mit 2 ml Aceton gewaschen und vakuum-getrocknet. Die derart erhaltenen Proben und eine Probe unbehandeltes. PSP wurden durch basische DISC-Elektrophorese (s. oben) analysiert, wobei die Zeit der Elektrophorese reduziert wurde, so daß ein R^ = 0,53 für PSP resul tierte. Bei der 2 Tage inkubierten Probe zeigte sich eine Serie von Banden, deren R^ zwischen 0,53 bis 0,86 lag. Bei den Proben, die 10 und 21 Tage inkubiert wurden, trat lediglich eine einzige Bande mit Rf = '0,86 auf. Diese Resultate zeigen, daß eine teilweise Deamidierung von PSP nach 2 Tagen auftrat und daß eine vollständige Deamidierung nach 10 Tagen der Inkubation stattgefunden hatte.
Pyroglutamat-Aminopeptidase-Behandlung
i Eine 6 mg Probe PSP wurde in 2 ml eines Puffers mit ! 50 m M Natriummonohydrogenphosphat (Na2H PO^), 30 m M
t s » p~Mercaptoethanol, 1 m M EDTA und einem pH-ï?crt von t .
7,8 gelöst. Eine Lösung von 2,5 mg Pyroglutaraat-
Aminopeptidase (Boehringer Mannheim) in 0,5 ml des-«« selben l3u£fers wurde zugegeben. Die Mischung wurde » ·' o 16 Stunden bei 37 C inkubiert und lyophilisiert (2,5 mg der eingesetzten Pyroglutamat-Aminopeptidase zeigten eine enzymatische Aktivität von 10 mu).
Die Reinheit des endgültigen PSP-Produktes kann durch analytische isoelektrische Fokussierung (analytical isoelectric focusing, IEF) und basische DISC-Elektrophorese (basic DE, s. oben) überprüft werden. Das Produkt wandert im wesentlichen als einzelne Bande in beiden Systemen. IEF wird entsprechend dem in der LKB-Broschüre I-1804-E02: "LKB Ampholin PAG", beschriebenen Vex~fahren, mit Platten Tür analytisches Elektrofokussieren auf Polyacrylamid-Gelen (LKB-Produkter AB, Bromma, Schweden) durchgeführt. Bei Gelfiltration des Polypeptids auf "Bio-Gel P-30" (Biorad Laboratories, Richmond, California, U.S.A.) wird lediglich ein einziger Peak bei Verwendung von 1 M Essigsäure als Elutionsmittel gefunden.
PS'P ist mit einer Anzahl allgemein bekannter Immun-Reak- ' ' tivitäts-Reaktionen untersucht worden. Die Resultate I sind in Tabelle 1 aufgeführt: ~ - 12 - y • Tabelle 1
Immunoreaktant Gehalt (ppm)
Insulin (IRI) 3 - 6
Gesamkglukagon(totales GLI) /10,02
Pankreatisches Glukagon (pankrea-tisches GLI) ^0,02
Gefäßaktives intestinales Peptid (VIP) <0,02
Pankreatisches Polypeptid * (Schwein) /^0,08 C-Peptid (Schwein) ^0,1
Somatostatin ^jD,0Q2
Die Immunreaktion von PSP wird durch ein hochspezifisches Radioimmunassay-Verfahren gemessen, welches derart entwickelt ist, daß es bis zu 250 pico g pro ml' aufspürt.
Antikörper wurden durch Immunisieren von Kaninchen mit "Überstandsprotein", gemischt mit Freund1schem Zusatz (0,5 ml) 26 Wochen lang jeweils 2 mal pro Woche (0,5 ml einer Lösung, die etwa 4 mg Protein ·. pro ml enthielt) hergestellt.
Vom 13. Tag nach der ersten Immunisierung wurde eine Gesamtmenge von 10 Blutproben.(10 ml) von jedem Tier genommen,und diese in regelmäßigen Intervallen über einen Zeitraum von 172 Tagen fortgesetzt und gesammelt. Die erhaltenen Antisera wurden auf Affinität und Kapazität geprüft und ein geeignetes Antiserum wurde für die Verwendung in den Radioimmunassay-Ver-fahren ausgewählt.
À ’ 125 I-PSP wurde nach der Lactoperoxidascmethode,. hergestellt, entwickelt von Thorell und Johansson (Biochim.
Biophys. Acta 251 (1971) 363). Das mit radioaktivem Jod markierte PDP wurde durch an sich bekannte Anionen-austauschchromatographie gereinigt und für die Poly-peptid-Radioimmunoessay-Methode, entsprechend dem von L.G. Beding entwickelten Verfahren verwandt (Diabetologica 2 (1971), 10).
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf Salze von PSP und, als Beispiele für derartige Salze, Salze mit Kationen wie Natrium, Kalium, Magnes iura, Kalzium und Zink sowie Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren wie Ameisensäure, Methansulfonsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, um nur einige zu nennen.
7ms Gründen der Kürze wird die Bezeichnung "PSP- · Verbindungen" verwandt, um sowohl PSP als auch physiologisch akzeptable Salze desselben zu benennen.
Es wurde gefunden, daß PSP-Verbindungen und Glukagon etwa gleich wirksam bei der Verringerung der Amplitude von Kontraktionen elektrisch angeregten Guinea-Schwein-Ileums in vitro sind, s.a. Tabelle 2. PSP und Glukagon wurden in 0,9 %igem Natriumchlorid mit 0,1 % menschlichem Serum Albumin gelöst.
Tabelle 2
Inhibitions-Effekte in Prozent
Konzentration im __
Bad des Organs, Molar PSP Glukagon ~~ 1θ“5 89 89 ! 10~6 49 51
Jh 10~7 21 24
N
Diese Auswirkungen von PSP-Verbindungen konnten durch Phentolaroin/aber nicht durch Naloxon/blockiert werden. Die Spontan-Motilität isolierten Ileums aus Reserpin-' behandelten Guinea-Schweinen wurde durch PSP inhibiert.
PSP-Verbindungen wurden ebenfalls als etwa genauso wirksam wie Glukagon in bezug auf die Inhibition der '....... Peristaltik von Mäusen in vivo befunden, s. Tabelle 3, ein Effekt, der wiederum durch Phentolamin unterbunden werden konnte.
Tabelle 3
Substanz Prozent Darm, der von Holzkohle ( 50 mg/kg Sub- zurückgelegt wird, verglichen mit kutan) einer Kontrolle PSP 78
Glukagon 66
Atropinsulfat 64 PSP reduziert die intestinale Motilität in Kaninchen nach intravenöser oder intraluminaler Gabe in den Darm. Die Motilität wurde mit Hilfe eines Ballonkatheters im Darm, angeschlossen an einen Druckum- -wandler, aufgezeichnet. Bei fünf von fünf Kaninchen (Körpergewicht 2,5 bis 3,0 kg) verursachten 400 pg . PSP, intravenös oder 5 cm vom Ballon in das Lumen • ; des Darmes gegeben, eine deutliche Reduktion der
Darmmotilität, fast eine Atonie.
200 pg übten einen deutlichen Effekt bei drei von fünf Kaninchen aus. Glukagon hatte die gleiche Wir-• kung, jedoch nur, wenn es intravenös gegeben wurde.
J - 15 -
Es wurde gefunden, daß PSP die Absorption von • 14 -, CU- Cj -Proteinhydrolysat in Schweinen und Hunden, 1 denen das Pankreas entfernt worden war, und von L U- C “Ovalbumin in Hunden mit entfernter Pankreas verärgerte, wenn die Verbindung per os in einer • Kapsel mit 3 mg PSP gegeben worden war. Die Schweine 1 4 und die Hunde wogen etwa 30 kg. JlOOjuCi U- C -Pro-tein-Hydrolysat oder 5 pCi L ü- C J -Ovalbumin wurden mit einer Suspension von 1 g/kg Idon (WarenZeichen) vermischt und durch Magensonden gegeben. Maximale Plasma dpm-Werte wurden 30 bis 40 Minuten nach Gabe von PSP,verglichen mit einem Placebo, erreicht. Dieser Absorptions-Aufschub, der durch etwa 100 }ig/kg PSP oral bewirkt wird, bedeutet wahrscheinlich eine reduzierte gastro-intestinale Motilität.
Es ist gefunden worden, daß PSP-Verbindüngen keinerlei in vitro-Effekt auf die Freisetzung von Glukagon oder Insulin oder auf die Lipolyse haben, und auch in vivo keine Wirkung auf den Blutglukosegehalt ausüben. Genauso wenig übte eine intravenös injizierte Dosis bis zu 1 mg/kg irgendeinen bemerkenswerten Effekt auf den Blutdruck einer anästhetisierten Ratte aus.'
Diese oben angegebenen pharmakologischen Daten zeigen den potentiellen Wert von PSP-Verbindungen für das Verhindern · * und die Behandlung von Krampfzuständen glatter Muskulatur, * beispielsweise im Intestirialtrakt.Aufgrund des Fehlens metabolischer Auswirkungen können PSP-Verbindungen vorteilhaft als Ersatz für Glukagon in der Endoskopie ! und bei Röntgenuntersuchungen eingesetzt werden.
: - 16 -
Ausser der spasmolytischen Wirkung besitzt PSP ebenfalls einen hemmenden Effekt auf die gastrische Säureausscheidung. Patienten mit Zwölffingerdarmgeschwüren profitieren besonders von einer Behandlung mit einer Substanz welche die gastrische Säureausscheidung hemmt. Derselbe Patient leidet jedoch unter erhöhter Magen-und Darmmotilität. PSP verbindet zwei äusserst wünschenswerte Wirkungen für die Behandlung von an Zwölffingerdarmgeschwüren leidenden Patienten , nämlich eine hemmende Wirkung auf die Darmund Magenmotilität und eine hemmende Wirkung auf gastrische Säureausscheidungen.
Als Beispiel eines Medikamentes, welches verwendet wird um gastrische Säureausscheidung zu hemmen, kann Cimetidin genannt werden. Cimetidin besitzt jedoch oft unerwünschte Nebenwirkungen wie Durchfall, Ausschlag, Steigerung der Leberenzyme und Gynäkomastie. Da PSP ein Polypeptid ist, das oral eingenommen wird und nicht in grösseren Mengen im Intestinaltrakt absorbiert wird, ist ein systematisches Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen höchst unwahrscheinlich .
Es wurde festgestellt, dass PSP Pentagastrin-stimulierte , gastrische Säureausscheidungen bei Ratten und Katzen mit chronischen, gastrischen Fisteln hemmt. 10 ßg PSP welche während einer Stunde bei Ratten angewendet wurden, schienen ebenso wirksam wie 1 /tg Somatostatin bezüglich der Hemmung von Säureausscheidung nach 5 f-q Pentagastrin s.c., das heisst, die Peptiden sind auf molarer Basis ungefähr gleichwertig. 10 ytg/kg PSP s.c. und 250 J^q PSP oral in Kapseln wirken bei Katzen.
Die Daten zeigen den Wert von PSP bei der Behandlung von Zwölffingerdarmgeschwüren. PSP kann also von Patienten n mit Zwölffingerdarmgeschwüren in Kapseln oral eingenommen werden.
_ - 16a - PSP- Verbindungen können intravenös als Bolus oder als Infusion gegeben werden. Wenn ein verlängerter Effekt, der langsamer eintritt, erwünscht wird, können PSP-Verbindungen als Depot gegeben werden, von welchem sie langsam durch den Blutstrom mobilisiert werden, beispielsweise Subkutan oder intramuskulär in einem Bereich guten peripheren Kreislaufes. Die Tatsache,-daß die biologische Aktivität und die Immunreaktionsfähigkeit aufrechterhalten werden, nachdem PSP Magensaft, Trypsin, Chymotrypsin und den oben beschriebenen Experimenten unterworfen wurde, wobei verlangsamte Absorption nach oraler Gabe von PSP beobachtet wurde, weist auf den - oralen Weg als mögliche Art der Gabe hin. Dement sprechend kann PSP durch ein Endoskop während der Endpskopie gegeben werden oder mit dem Kontrastmittel, beispielsweise Bariumsulfat, während dem Röntgen-Verfahren gemischt werden.
Die Dosierungsgeschwindigkeiten von· PSP-Verbindungen können entsprechend der Größe des erwünschten Antwortverhaltens und anderer Faktoren eingestellt werden, die routinemäßig -berücksichtigt werden, wenn die Dosierung bestimmt wird.
Als Beispiel eines Dosierungsbereichs kann 10 bis 200 ^ig pro kg Körpergewicht angegeben werden, obwohl auch eine höhere oder niedrigere Dosis gegeben Vierden kann.
• i ’ Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche PSP-Verbindungen und eine oder mehrere andere pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz(en) aufweist. Als Beispiel derartiger Träger können Konservierungsmittel und Natriumchlorid genannt werden.
λ Wenn versucht wird,sicherzustellen, daß das erwünschte _ .// Resultat nach Gabe einer PSP-Verbindung erreicht wird, Λ- empfiehlt es sich, ein Startmaterial für die Herstellung von PSP-Präparationen zu verwenden, Vielehen eine Reinheit von mindestens 50 %, bevorzugt eine Reinheit von mindestens 90 % einer PSP-Verbindung besitzt.
Nach bisher nicht veröffentlichten Daten enthalten * Pankreatin-Tabletten PSP (beispielsweise 1 pro tausend).
Aufgrund ihres Enzym-Gehaltes sind Pankreatin-Tabletten fü^r Patienten verwandt worden, denen die Pankreas entfernt wurde und für Patienten mit chronischer Pankreasentzündung. Außerdem ist nun gefunden worden, daß kommerziell erhältliches Insulin etwa 30 ppm PSP enthält.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung, in der Ausführungsbeispiele an Hand der Zeichnung erläutert sind. Dabei zeigt:
Fig. 1 ein Beispiel eines Chromatogrammes einer Anionen-Austauschchromatographie von "Überstands-Protein"; und
Fig. 2 ein Beispiel eines Chromatogrammes einer Kationen-Austauschchromatographie t der gesammelten Fraktionen des Haupt-
Peaks der Figur 1.
k
In .den nun folgenden Ausführungsbeispielen, welche keineswegs den Erfindungsgedanken eingrenzen sollen, wird mit "hochgereinigtem PSP" PSP bezeichnet, welches im wesentlichen als einzige Bande in den oben beschriebt ^ benen Isoelektrofokussing und basischen DISC-Elektro- - 18 - « phorese-Verfahren wandert.
Beispiel 1
Ein aus 94 kg Schweinepankreasdrüsen gebildeter Salz-» kuchen wurde in Wasser auf ein Volumen von 3,2 1 ge löst. Der pH-Wex*t der Lösung wurde auf 5,3 eingestellt, woraufhin das Präzipitat durch Zentrifugation abgetrennt wurde. Der pH-Wert des Überstandes wurde auf 6,5 eingestellt und die dabei gebildete Suspension zentrifugiert. Die Lösung wurde mit 32 ml 0,5 M Na^EDTA upd 35 1 Ethanol gemischt. Die Mischung wurde über Nacht bei 4° C stehengelassen und anschließend zentrifugiert. Das Präzipitat wurde vakuum-getrocknet und lieferte 50 g trockenen "überstands-Protein"-Pulvers.
Eine Lösung des Pulvers in 500 ml Wasser wurde leicht gerührt, während langsam mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe 1 M Essigsäure zugegeben wurde, bis ein pH-Wert von 4,3 erreicht war (nach etwa drei Stunden pumpen).
Das Rühren wurde daraufhin drei Tage bei 4° C fortgesetzt, wodurch Kristallisation eintrat. Die Kristallernte (bei erstem Hinsehen stäbchenförmig, möglicherweise orthorombisch und Doppelbrechung zeigend) wurde durch Zentrifugation geerntet, in 500 ml Wasser bei — 4υ C durch Rühren über Nacht suspendiert, zentrifugiert und vakuum-getrocknet. Die Ausbeute war 5,2 g.
4g dieses Materials wurde in 50 ml von 50 %igem (V/V) Ethanol und 50 ml Elutionsmittel (s. Figur 1) bei pH-Wert' 8,6 gelöst. Die Lösung wurde Anionen-austauschchromatographie, wie in Figur 1 gezeigt, * unterworfen. Die .vereinigten Fraktionen des Haupt-“ sj Peaks wurden auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, / - 19 -
(J
s mit 4 Volumen 96 %igem (V/V) Ethanol vermischt und sodann bei 4° C zwei Tage gelagert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 150 ml 96 %igem (V/V) Ethanol gewaschen und vakuumgetrocknet. Die Ausbeute betrug 2,6 g.
•2,5 g dieses Materials wurde in 125 ml 50 %igem , (V/V) Ethanol und 125 ml Elutionsmittel (s. Figur 2) bei pH 4/7 gelöst und anschließend Kationenaustauschchromatographie, wie in Figur 2 dargestellt, unterworfen. Die vereinigten Fraktionen des Haupt-Peaks(lediglich "sichtbare") wurden zur Trockenheit abgedampft. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und der pH der Lösung auf 7,1 eingestellt (das Endvolumen war etwa 90 ml). Die Lösung wurde mit 1200 ml 96 Sigen (V/V) Ethanols gemischt und bei 4° C über Nacht stehengelassen. Das gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 150 ml 96 %igen (V/V) Ethanols gewaschen und vakuum-getrocknet. Die Ausbeute war 1,8 g hoch gereinigtes PSP, welches die in Tabelle 1 zusammengefaßten Reinheitsanforderungen erfüllte.
Beispiel 2 20 g des "Uberstands-Protein"-Pulvers,welches, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt worden war, wurde in 200 ml Wasser gelöst. 208 ml 96 %igen (V/V) Ethanols wurden zugegeben, gefolgt durch Einstellung des pH-Wertes auf 4,6 mit Essigsäure.Eine geringfügige Menge Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Der Uberstand, welcher langsam trüb __ | wurde, wurde Kationenaustauschchromatographie auf t ' v einer ‘2,5 cm Durchmesser x 80 cm Länge-Säule "SP-Sephadex 025" unterworfen, im Elutionsmittel 1 ' (0,4 M Essigsäure, 0,05 M Natriumacetat, 50 % (V/V)
Ethanol, pH; 4,6) äquilibriert. Elution mit einem linearen Gradienten wurde zwischen 3 1 des Elutionsmittels 1 und 3 1 des Elutionsmittels 2 (0,3 M Natriumacetat, 50 % (V/V) Ethanol, pH: 8,7) durchgeführt. 10 ml-Fraktionen wurden bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 50 ml x>ro Stunde gesammelt. Die Fraktionen, die dem großen Peak, der zwischen den Fraktionen 100 bis 130 auftritt, entsprechen, wurden vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen wurden auf einen pH-Wert von 8 gebracht und anschließend mit 1,8 1 96 %igen (V/V) Ethcrnols gemischt. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 4° C stehengelassen. Das abgeschiedene Protein wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 150 ml 96 %igen (V/V) Ethanols gewaschen und vakuum-getrocknet. Ausbeute:' 2,8 g.
2,5 g dieses Materials wurde in 250 ml eines TRIS-Puffers (0,0575 M TRIS, 0,05 N HCL, pH:' 7,4),gelöst. Die Lösung wurde Anionenaustauschchromatographie auf einer Säule von 2,5 cm Durchmesser,50 cm Länge mit "QAE-Sephadex A-25", äquilibriert in einem TRIS-Puffer (0,115 M TRIS, 0,1 N HCL, pH: 7,4); unterworfen. Die Säule wurde mit dem Aquilibrierungspuffer mit einer Geschwindigkeit von 30 ml pro Stunde eluiert.
Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt. Die Fraktionen, die dem zentralen Hauptanteil des Pealcs entsprechen, der ein Maximum bei Fraktion 225 besitzt, wurden ver-« einigt. Diese vereinigten Fraktionen (620 ml) wurden \l mit 60 ml einer 5 M Natriumchloridlösung und 121 / “ 21 - 96 %igen (V/V) Ethanols gemischt.
Die Mischung wurde 24 Stunden bei 4° C stchonge-lassen. Das abgeschiedene Protein wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 150 ml 96 %igen .(V/V) Ethanols gewaschen und vakuum-getrocknet. Ausbeute; 1,7 g hochgereinigtes PSP.
Beisplei 3
Zu 150 1 einer wäßrigen Lösung, die durch Abdampfen eines Extraktes aus 250 kg Schweinepankreasdrüsen erhalten wurde, und die von unlöslichem Material befreit worden war, wurden 22,5 kg Natriumchlorid zugegeben. Die Mischung wurde gerührt, um das zugegebene Salz zu lösen, das entstehende Präzi-pitcit wurde durch Zentrifugation entfernt und lieferte derart den Salzkuchen. Zur Mutterlauge (162 1) wurden 34 kg Ammoniumsulfat unter fortgesetztem zweistündigen Rühren bei Raumtemperatur gegeben, wodurch ein Präzipitat gebildet wurde, das durch Zentrifugation isoliert wurde. 223 g des feuchten Produktes wurden durch Zugabe von 500 ml eines Puffers (0,05 M Ameisensäure, 0,01 M Natriumhydroxidpuffer, pH: 3,2) gelöst. Die Leitfähigkeit der Lösung wurde auf 4 mS durch Dialyse gegen Wasser reduziert. Die Lösung wurde auf eine 5 cm Durchmesser x 50 cm Länge Säule von "SP-Sephadex C-25", äquilibriert mit Puffer I (0,1 M Ameisensäure, 0,02 M Natriumhydroxid, pH; 3,2) gegeben. Nach Aufträgen der Lösung wurde die Säule mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0 bis 0,27 M in Puffer I eluiert.Das gesamte Volumen 4 des eluierten Materials betrug 5,5 1. Anschließend
wurde die Säule weiter mit Puffer I eluiert, der 0,27 M
Natriumchlqrid enthielt. Der Durchfluß während dem Aufbringen und Elution betrug 100.mil pro Stunde und es wurden .Fraktionell von 15 ml gesammelt. Das durch überwachen der optischen Dichte der Fraktionen bei 276 nm erhaltene Chromatogramm zeigte einen Haupt-Peak von der Fraktion 420 bis 530. Die dem Ilaupt-Peak entsprechenden vereinigten Fraktionen wurden auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und anschließend mit 20 Volumenteilen 96 %igen (V/V) Ethanols gemischt. Wach 48-stündigem Stehenlassen bei 4° C wurde Abgeschiedenes durch Zentrifugation gewonnen und vakuum-getrocknet. Ausbeute: 6 g. Das derart erhaltene Material wurde weiterhin durch Anionenaustauschchromatographie auf einer "QAE-Sephadex A-25"-Säule gereinigt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Ausbeute: 3,4 g hochgereinigtes PSP.·
Beispiel 4 . ·
Eins Präparation zur parenteralen Gabe, welche 1 mg PSP pro ml enthält, kann wie folgt hergestellt werden: 1 g PSP und 99 g Laktose werden in 1 1 destilliertem
Wasser gelöst und der pH auf 7,0 eingestellt. Die - Lösung wird anschließend steril gefiltert. Die sterile 3 Lösung wird in 10 cm Ampullen derart abgefüllt, daß jede Ampulle 10 ml der Lösung enthält. Anschließend werden die Lösungen lyophilisiert und die Ampullen unter aseptischen Bedingungen verschlossen.
Λ Die Präparation in jeder der Ampullen soll vor der ; ’ 23 “ ♦
Beispiel 5 *
Präparationen für orale Gaben können wie fo3 cjt hergestellt werden: 100 mg PSP werden mit 9 g Mais-Stärke, 8 g Laktose und 18o mg Magnesiumstearat gemischt, . bis eine homogene Mischung erhalten wird. Die Mischung wird in > Hart-Gelatinekapseln Nr. 3 derart eingefüllt, daß jede Kapsel 1 mg PSP enthält.
Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren ver-schiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.
“ - 24 - .
Claims (19)
1. Gereinigtes Polypeptid PSP bezeichnet, dessen ( Aminosäure-sequenz anscheinend wie folgt ist: pyrGlu-Lys-Pro-AJ a-Ala-Cys*Arg-Cys-Ser-Arg-Gln-Asr.i-Pro-Lv«'- a«. 1 5 10 15 Arg-Val-Asn-Cys-Gly-Phe-Pro-Gly-Ile-Thr-Ser-Asp-Gln-Cys-Phe-Thr- 20 25 30 Ser-Gly-Cys-Cys-Phe-Asp-Ser-Gln-Val-Pro-Gly-Val-Pro-Trp-Cys-Phc- 35 40 45 ßer-Pro-Leu--Pro-Ala~Gln-Glu~Ser-Glu-Glu-Cys-Val-Met-Gln-Vul-Lys-50 55 G0 Ala-Arg-“Lys"Asn-Ser“Gly~Tyr-Pro“Gly-Ile-CyS“PrO"Glu-Asp--Cys-7vla-65 70 75 Ala-Arg-Asn-Cys-Cys-Phe-Ser-Asp-Thr-Ile~Pro-Glu-Val-Pro-Trp-Cys-80 85 90 95 Phe-Phe-Pro-Met-Ser-Val-Glu-Asp-Cys-His-Tyr: wobei pyrGlu (Amino 100 105 säurerest 1 )' Pyroglutarninsäure sein soll, oder ein physiologisch akzeptables Salz davon. ί ' j j i 1 : - 2lC - i j hi A
2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine höhere Reinheit als 50 Gev/.-S besitzt, bevorzugt höher als 90 Gew. - %.
3. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß' es in kristalliner Form ist.
4. Verfahren zum. Isolieren eines gereinigten Polypeptids nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch Isolieren des Polypeptids aus Schweinepankreasdrüsen durch eine Kombination von Chromatographie und Ausfällen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Extraktion der Drüsen mit einer Mischung von Wasser und einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel in saurem Medium, Abtrennen des Ausgefällten, Neutralisieren des Extraktes und Isolieren des PSP aus dem derart erhaltenen Extrakt unter Einsatz an sich bekannter Abtrenn-Verfahren.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das isolierte PSP in ein Salz desselben umge- rr.: wandelt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet· idurch * „ Isolieren des Polypeptids aus einem Insulinsalz kuchen.
8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolation durch Chromatographie | mit Hilfe eines Kationen- und/oder Anionen- Λ- J x ' l austauschers durchgeführt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gehennzeichnet, daß es eineil Kristallisationsprozeß einschließt.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromatographie mit der AufSammlung des Hauptteiles des Haupt-PSP-Peaks durchgefürht wird. 1T. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, gekennzeichnet durch Isolierern von PSP aus der Mutterlauge, die entsteht, wenn ein Insulinsalzkuchen hergestellt wird, durch weiteres Aussalzen, gefolgt durch Chromatographie unter Verwendung eines Anionen- und/oder Kationen- t austauschers.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Salzkuchen im wesentlichen von Insulin befreit wird, durch Abtrennen des in einer Lösung des Salzkuchens,die auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 4,9 bis 5,7 eingestellt wurde, v gebildeten Ausgefällten, bevorzugt bei etwa 5,3, bevor die Chromatographie durchgeführt wird. " ’ ' 13.Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeich net, daß ein im Überstand nach dem Ausfällen bei v einem pH von etwa 4,9 bis 5,7 bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,7 bis 7,0, bevorzugt bei etwa 6,5, gebildetes Präzipitat vor der Chromatographie entfernt wird. 4~ 14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Kristallisieren durch Einstellen des %> , i pH-V7ertes der Lösung auf einen Wert ira Bereich von etwa 3/8 bis 4,8, bevorzugL etwa 4/3, durchgeführt wird.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Menge eines gereinigten Polypeptids, entsprechend einem der An- . Sprüche 1 bis' 3, aufweist, gemeinsam mit einem ge eigneten physiologisch akzeptierbaren Träger oder Exzipienten.
16. Wäßrige sterile Lösung eines geDreinigten Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 0,9 % Natriumchlorid und gegebenenfalls Konservierungsmittel wie ein Hydro:ti-benzoesäure-ester oder Phenol aufweist.
17. Verwendung des gereinigten Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Medikament eingesetzt wird.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es als Spasmolytikum eingesetzt wird.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekenn- f- 4 " zeichnet, daß es als Diagnose-Hilfsmittel einge setzt wird. v
20. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es als therapeutisches Agens eingesetzt wird.
21. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekenn- >, zeichnet, daß es als prophylaktisches Agens einge- 4 4 < 6 setzt wird. x
22. Losung nach Anspruch IC,· dadurch gekennzeichnet, daß das gereinigte Polypeptid in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 bis etwa 200 mg/ml, bevorzugt zwischen etwa 0,5 bis 25 mg/ml, vorgesehen ist. NOVO INDUSTRI A/S ^ t ~ - 29 -
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LU83206A LU83206A1 (de) | 1981-03-10 | 1981-03-10 | Gereinigtes polypeptid,verfahren zum isolieren und verwendung desselben sowie pharmazeutische zusammensetzung und waessrige sterile loesung |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LU83206 | 1981-03-10 | ||
| LU83206A LU83206A1 (de) | 1981-03-10 | 1981-03-10 | Gereinigtes polypeptid,verfahren zum isolieren und verwendung desselben sowie pharmazeutische zusammensetzung und waessrige sterile loesung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LU83206A1 true LU83206A1 (de) | 1981-06-24 |
Family
ID=19729606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LU83206A LU83206A1 (de) | 1981-03-10 | 1981-03-10 | Gereinigtes polypeptid,verfahren zum isolieren und verwendung desselben sowie pharmazeutische zusammensetzung und waessrige sterile loesung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| LU (1) | LU83206A1 (de) |
-
1981
- 1981-03-10 LU LU83206A patent/LU83206A1/de unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69632224T2 (de) | Reduzierung von Gelation von Fettsäureacylierten Proteinen unter Nutzung von Zitratpuffer | |
| US4370317A (en) | Pancreatic spasmolytic polypeptide | |
| DE3881801T2 (de) | Menschliche somatomedin-träger-protein-untereinheiten und verfahren zu ihrer herstellung. | |
| EP0209061A2 (de) | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel | |
| DE19908041A1 (de) | Kovalent verbrückte Insulindimere | |
| EP0207956A1 (de) | Hirudin-pa und dessen derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung. | |
| DE69625354T2 (de) | Relaxinartiger faktor und damit zusammenhängende verfahren und verwendungen | |
| DD296933A5 (de) | Peptide | |
| CH661869A5 (de) | Arzneimittel zur behandlung der ulkuskrankheit. | |
| DE69420872T2 (de) | Hgh enthaltende pharmazeutische zubereitungen | |
| DE69830842T2 (de) | Peptide als kalium kanalaktivatoren | |
| DE3586793T2 (de) | Verwendung von vollsynthetischem alpha-hanap. | |
| LU83206A1 (de) | Gereinigtes polypeptid,verfahren zum isolieren und verwendung desselben sowie pharmazeutische zusammensetzung und waessrige sterile loesung | |
| Ismail et al. | Effect of Buthus minax (L. Koch) scorpion venom on plasma and urinary electrolyte levels | |
| DE68928646T2 (de) | Natriuretisches hormon | |
| DE69531608T2 (de) | Therapeutische Mittel für Störung des Fettstoffwechsels | |
| DE2748213C2 (de) | ||
| DE3034198A1 (de) | Gereinigtes polypeptid, verfahren zum isolieren und verwendung desselben sowie pharmazeutische zusammensetzung und waessrige sterile loesung | |
| DE69015081T2 (de) | Nicht-digoxinähnlicher Na+,K+-ATPaseinhibitorischer Faktor. | |
| US4342748A (en) | Sleep-promoting factor | |
| DE69032591T2 (de) | Physiologisch aktive peptide und den calcium-metabolismus regulierende arzneimittel, die genannte peptide als wirkungsvollen bestandteil enthalten | |
| US3629391A (en) | Method for diagnosing diabetes | |
| Taton et al. | Studies on the pathogenesis of lipoatrophic diabetes: A case of congenital systemic absence of adipose tissue associated with insulin-resistant diabetes mellitus and hepatosplenomegaly | |
| GB2059970A (en) | Spasmolytic polypeptide | |
| EP0107782A1 (de) | Verfahren zur Isolierung von Relaxin |