NO784096L

NO784096L - PROCEDURES FOR DIAGNOSIS OF MALIGNOMES

Info

Publication number: NO784096L
Application number: NO784096A
Authority: NO
Inventors: Friedrich Douwes
Original assignee: R & Z Vermoegensverw Gmbh
Priority date: 1977-12-12
Filing date: 1978-12-06
Publication date: 1979-06-13
Also published as: IT7830722A0; PT68891A; CH646793A5; FR2411412B3; SE432157B; ATA872478A; DE2755363A1; GB2009927A; IT1160323B; GB2009927B; FI783782A; PL211672A1; RO75333A; CA1129319A; ES243564Y; BE872651A; ES475905A1; AR220356A1; DE2755363C3; IL56152A0

Description

. Framgangsmåte for diagnose av jna li gnome r* . Procedure for diagnosis of jna li gnome r*

Oppfinnelsen gjelder en testmetode in vitro for diagnose av ondartede svulster (tumor), fortrinnsvis hos mennesker, hvor man bestemmer bevegelighetsforandringen til celleformede blodbestanddeler, som kommer i berøring med en bevegelsehemningsfaktor (MIF), og hvor nevnte faktor separeres fra lymfosytter som sensibiliseres mot svulstvev. En slik bevegelsehemningsfaktor blir ikke separert når lymfosyttene stammer fra pasienter som ikke har noen ondartet svulst, fordi disse iymfosyttene ikke er sensibilisert og følgelig ikke frigjør noen bevegelsehemningsfaktor ved berøring med tumor-antigenet. The invention relates to an in vitro test method for the diagnosis of malignant tumors (tumor), preferably in humans, where the change in mobility of cellular blood components that come into contact with a motility inhibitory factor (MIF) is determined, and where said factor is separated from lymphocytes that are sensitized against tumor tissue. Such an inhibitory factor is not separated when the lymphocytes originate from patients who do not have a malignant tumor, because these lymphocytes are not sensitized and consequently do not release an inhibitory factor on contact with the tumor antigen.

Det er kjent fra litteraturen (Douwes, F.R. m.fl., Verh. Deutsche Ges. inn;., Med., 82. bind, J.F. Bergmann-Verlag, Miinchen 1976; jfr. litteraturlisten) at det er mulig å identi-fisere ondartede svulster på et tidlig stadium ved hjelp av den såkalte elektroforese-bevegelighetstesten (EMT). Prinsippet for denne testen (EMT) baserer seg på det faktum at bevegelseshastigheten (bevegeligheten) til bestemte legemer (makrofager, granulocytter, andre blodlegemer), som er synlige i det elektriske feltet til et spesialmikroskop (cytoferimeter), bare forandrer seg når legemene kommer i berøring med lymfokiner fra sensibiliserte lymfosytter. Det forutsettes herved at lymfosyttene, som er sensibilisert mot et bestemt antigen (såkalte T-lymfosytter), frigjør en rekke oppløselige faktorer, de såkalte lymfokiner. Til disse faktorer regnes bevegelseshemnings-faktoren (MIF). Den påvirker bevegelsesevnen til blodlegemene, spesielt makrofager og granulocytter og sørger for at disse stanser opp og akkumulerer seg på det sted, der det antigenet befinner seg, som utløser sensibiliseringen. In VIVO betyr dette tumorens ødeleggelsesmulighet. It is known from the literature (Douwes, F.R. et al., Verh. Deutsche Ges. inn;., Med., 82. vol., J.F. Bergmann-Verlag, Miinchen 1976; cf. the literature list) that it is possible to identify malignant tumors at an early stage using the so-called electrophoresis motility test (EMT). The principle of this test (EMT) is based on the fact that the speed of movement (motility) of certain bodies (macrophages, granulocytes, other blood cells), which are visible in the electric field of a special microscope (cytoferrimeter), only changes when the bodies enter contact with lymphokines from sensitized lymphocytes. It is hereby assumed that the lymphocytes, which are sensitized against a specific antigen (so-called T-lymphocytes), release a number of soluble factors, the so-called lymphokines. Among these factors is the mobility impairment factor (MIF). It affects the movement ability of the blood cells, especially macrophages and granulocytes and ensures that these stop and accumulate at the place where the antigen is located, which triggers the sensitization. In vivo, this means the tumor's destruction potential.

Lymfosytter hos pasienter, som lider av ondartede svulster, reagerer spesifikt med frigjøringen av de såkalte oppløselige faktorer når de kommer i berøring med et basisk protein, som på den ene side kan tas fra hjernemassen eller på den annen side fra kreftvevet. Basisk protein, som framhever de spesifikke reaksjonene med lymfosyttene, betegnes innen litteratoren som den eneefalittogene faktor (EF) og basisk protein fra kreftvev (CaBP). Utvinningen skjer i samsvar med en i og for seg kjent framgangsmåte (Caspary, E.A. m.fl., Brit. Med. 1971, side 613-617, og andre publikasjoner, se Douwes,F.R. foran). Lymphocytes in patients suffering from malignant tumors react specifically with the release of so-called soluble factors when they come into contact with a basic protein, which on the one hand can be taken from the brain mass or on the other hand from the cancerous tissue. Basic protein, which highlights the specific reactions with the lymphocytes, is referred to in the literature as the enephalitogenic factor (EF) and basic protein from cancer tissue (CaBP). The extraction takes place in accordance with a procedure known per se (Caspary, E.A. et al., Brit. Med. 1971, pages 613-617, and other publications, see Douwes, F.R. above).

De resultater fra blodundersøkelser med elektro-foresebevégelighetstesten som er beskrevet i litteraturen, viser at man ved hjelp av denne test kan oppnå praktisk talt 100% differensiering av prøvene og på dette grunnlag bestemme om de ihneholdér h.h.v. en organisme med ondartede sykdommer (tumor), en frisk organisme eller en organisme med såkalt god-artede sykdommer. Samtlige undersøkte pasienter med (ondartede) svulster viste en positiv lymfosyttreaksjon, dvs. lymfosyttene avga én faktor, som forårsaket en målbar og karakteristisk for-andring i indikatorcellenes bevegelighet (jfr. Douwes, F.R., foran). Kontrollundersøkelser av pasienter med ikke-ondartede sykdommer viste ikke noen slik lymfosyttreaksjon. Falske resultater skulle kunne stamme fra bestemte årsaker. Elektro-foresebevegelighetstesten kan således betraktes som den mest følsomme krefttesten fram til i dag. The results from blood tests with the electrophoresis motility test described in the literature show that with the help of this test you can practically achieve 100% differentiation of the samples and on this basis decide whether they contain or an organism with malignant diseases (tumor), a healthy organism or an organism with so-called benign diseases. All examined patients with (malignant) tumors showed a positive lymphocyte reaction, i.e. the lymphocytes released one factor, which caused a measurable and characteristic change in the motility of the indicator cells (cf. Douwes, F.R., front). Control examinations of patients with non-malignant diseases did not show any such lymphocyte reaction. False results could stem from specific causes. The electrophoretic motility test can thus be considered the most sensitive cancer test to date.

Den praktiske utnyttelse av den foran beskrevne testen forutsetter imidlertid at man behersker bruken av et relativt komplisert instrument, nemlig cytoferometeret, og dette er avgjort en ulempe. Det personale, som overvåker og måler den nevnte bevegelseshastighet, må gis nitid utdannelse og opp-læring og må dessuten selv overvåkes. På grunn av minskende oppmerksomhet (som funksjon av tiden), er bare en begrenset arbeidsinnsats mulig. Bruken av elektroforesetesten innskrenk-er seg derfor til spesialiserte institutter. Vurderingen av prøvningen skjer mens blodlegemene er i bevegelse, dvs. dyna-misk.<M>Avbrytelse" av testen er således ikke mulig, og følgelig kan det heller ikke gjennomføres noen etterbestemmelse. However, the practical use of the test described above requires mastery of the use of a relatively complicated instrument, namely the cytopherometer, and this is definitely a disadvantage. The personnel who monitor and measure the aforementioned speed of movement must be given regular education and training and must also be monitored themselves. Due to diminishing attention (as a function of time), only a limited amount of work is possible. The use of the electrophoresis test is therefore restricted to specialized institutes. The assessment of the test takes place while the blood cells are in motion, i.e. dynamically.<M>Interruption" of the test is thus not possible, and consequently no subsequent determination can be carried out either.

Formålet med oppfinnelsen er å anvise en testmetode for diagnose av ondartede svulster, hvilken metode i størst mulig utstrekning på en generell og uspesifikk måte m.h.t. arten av den ondartede svulsten med større nøyaktighet angir nærværet av ondartede svulster, men som i prinsippet kan gjen-nomføres i ethvert legelaboratorium, samt som er spesielt velegnet for masseundersøkelser på kreftklinikker. Resultatet av testen skal uten videre kunne måles på ny. Testen skal kunne utnyttes statistisk og arkiveres uten me11omkommende protokoll-skriving. The purpose of the invention is to prescribe a test method for the diagnosis of malignant tumours, which method to the greatest extent possible in a general and non-specific way with regard to the nature of the malignant tumor with greater accuracy indicates the presence of malignant tumors, but which can in principle be carried out in any medical laboratory, and which is particularly suitable for mass examinations in cancer clinics. The result of the test must be able to be measured again without further ado. The test must be able to be used statistically and archived without the necessary protocol writing.

Disse formål oppnås ved en testmetode av den inn-ledningsvis angitte art, hvor de lymfosytter, som skal under-søkes som celleformede blodbestanddeler, og som en del av en leukocyttsuspensjon, underkastes en i og for seg kjent bevegel-sehemningstest, idet leukocyttene etter dennes forløp bringes i berøring med et antigen, som stimulerer dannelsen av bevegelsehemningsfaktor, og tilslutt inkuberes, og at leukocyttbevegelsen etter et bestemt tidsintervall hemmes og fikseres. These objectives are achieved by a test method of the kind indicated at the outset, where the lymphocytes, which are to be examined as cellular blood components, and as part of a leukocyte suspension, are subjected to a movement inhibition test known per se, as the leukocytes according to this process is brought into contact with an antigen, which stimulates the formation of movement inhibition factor, and finally incubated, and that leukocyte movement is inhibited and fixed after a certain time interval.

Det er kjent forskjellige bevegelsehemningstester, som egner seg for undersøkelser m.h.t. det forannevnte formål, bl.a. den såkalte kapillarteknikk etter Søborg og Bendixen. For å realisere oppfinnelsen er det nødvendig å måle bevegeligheten til indikatorcellene ved "frysing" aV en bevegelsestil-stand oppnådd etter en bestemt tid. Different movement inhibition tests are known, which are suitable for investigations with respect to the aforementioned purpose, i.a. the so-called capillary technique after Søborg and Bendixen. In order to realize the invention, it is necessary to measure the mobility of the indicator cells by "freezing" a state of movement achieved after a certain time.

I samsvar med oppfinnelsen måles fortrinnsvis ut-bredelsen og bevegelighetsforandringen av leukocyttene inne i et meget fint, omtrent 10 ym tykt, "åpent" kapillarsjikt. En testanordning, som har vist seg særlig hensiktsmessig, består av et tosjiktselement, nærmere bestemt en bærer av et inert medium, eksempelvis glass, og en agar, som er anriket med næringsstoffer for blodcellene. En spesielt velegnet agar, som finnes på markedet, går under benevnelsen "agarose" og produ-seres av Behring-Werke. In accordance with the invention, the distribution and change in mobility of the leukocytes is preferably measured inside a very fine, approximately 10 µm thick, "open" capillary layer. A test device, which has proven to be particularly suitable, consists of a two-layer element, more specifically a carrier of an inert medium, for example glass, and an agar, which is enriched with nutrients for the blood cells. A particularly suitable agar, available on the market, goes by the name "agarose" and is produced by Behring-Werke.

Mellomsjiktet mellom agaren og bæreren er fortrinnsvis delvis fylt med en væske. Dette sjikt har en tykkelse av ca. 1-20 ym. Ved bevegelseshemningstesten velges fortrinnsvis en inkubasjonstid av mellom 10 og 30 timer. Testen gjennomfør-es med en prøve av leukocyttirik "moderlut" ("buffycoat"), utvunnet fra menneskeblod, og med et konstant antall leukocytter som utgjør mellom 10 4 og 10 7 per prøve. Ved disse standard- vérdier dreier det seg om prøvede verdier, som ikke krever ho-en overdreven blodtapping av pasientene. The intermediate layer between the agar and the carrier is preferably partially filled with a liquid. This layer has a thickness of approx. 1-20 etc. An incubation time of between 10 and 30 hours is preferably chosen for the immobility test. The test is carried out with a sample of leukocyte-rich "mother liquor" ("buffy coat"), extracted from human blood, and with a constant number of leukocytes which is between 10 4 and 10 7 per sample. These standard values are tested values, which do not require excessive bloodletting of the patients.

Prøven tilsettes en antigenoppløsning i forholdet 1:50 - 1:10. I denne forbindelse kan man benytte antigenoppløs-ningén utvunnet i samsvar med en framgangsmåte beskrevet av Caspary og' Field, eller utvunnet ved hjelp av en 3 m KC1-ekstråksjon i henhold til Meltzer. Som utgangsmateriale benyt- , tes vev fra ondartede svulster som stammer fra mennesker som har blitt operert, eller hjernemasse fra mennesker. Det er imidlertid også mulig å utvinne ahtigenoppløsninger fra tumor-celler som er odlet in vitro. An antigen solution is added to the sample in a ratio of 1:50 - 1:10. In this connection, one can use the antigen solution extracted in accordance with a procedure described by Caspary and Field, or extracted by means of a 3 m KC1 extraction according to Meltzer. The starting material used is tissue from malignant tumors originating from people who have undergone surgery, or brain mass from people. However, it is also possible to extract antigen solutions from tumor cells that have been grown in vitro.

Testmetoden ifølge oppfinnelsen kan ikke bare benyttes ved en uspesifikk undersøkelse av ondartede svulster, idet den også kan "utvides" til å gjelde en organ-spesifikk undersøkelse. Hvis det benyttes antigener, som er utvunnet fra carcinomvev eller kreftsvulstveV fra spesielle organer, vil lymfosytter til pasienter* som er angrepet av samme organ-eårcinom, reagere på den beskrevne måten,I litteraturen er beskrevet åt eksempelvis antigenoppløsninger, som er utvunnet fra brystkreftsvulster som angitt hos Caspary og Field eller Meltzer gir en spesifikk reaksjon utelukkende for pasienter med brystkreftsvulster. The test method according to the invention cannot only be used for a non-specific examination of malignant tumours, as it can also be "extended" to apply to an organ-specific examination. If antigens are used, which have been extracted from carcinoma tissue or cancer tumor tissue from special organs, lymphocytes from patients* who have been attacked by carcinoma of the same organ will react in the manner described. indicated by Caspary and Field or Meltzer gives a specific reaction exclusively for patients with breast cancer tumors.

Når mån får en positiv immunreaksjon, dvs. ved mis-tanke om kreftsvulst, er det også mulig å gjennomføre en sétlé. tester med organspesifikke antigener og dermed innenfor en relativt kort tidsperiode få rede på hvilke organer, som skulle kunne være angrepet åv en kreftsvulst. When the moon has a positive immune reaction, i.e. in case of suspected cancer, it is also possible to carry out a sétlé. tests with organ-specific antigens and thus within a relatively short period of time find out which organs could be attacked by a cancerous tumour.

Det er også av stor viktighet at den såkalte immunreaksjon, dvs. frambringelsen av retardasjonséffekten ved indikatorcellenes bevegelse i denne test, på en overraskende måte kan forsterkes ved at prøveoppløsningen tilføres en opp* løsning med såkalt overføringsfaktor. Denne faktor er kjent innén immuhitetsiæren (jfr. eksempelvis M. Roserithal: "Der Transferfaktor und seine therapeutische Anwendung"; Sveits, md. Wschr. Bd. 104, 1974, side 1501-1506). Overføringsfaktoren kan framstilles med utgangspunkt i normale blodleukocytter. Faktoren utgjør en subcellular, dialyserbar, ikke-immunogen leukocyttfaktor, som er ansvarlig for den reaksjon som skyldes T-lymfosyttene. Det finnes på markedet overføringsfaktorprepa-rater, (Schura, Krefeld), som er framstilt ved fraksjonering i flytende oksygengass med etterfølgende trinnvis ultrafraksjo-nering. En enhet, som forekommer i handelen, inneholder over-føringsfaktor fra ca. 5«IO<10>leukocytter. Preparatet er stabi-lisert med 1% human-albubinoppløsning. It is also of great importance that the so-called immune reaction, i.e. the production of the retardation effect by the movement of the indicator cells in this test, can be enhanced in a surprising way by adding a solution with a so-called transfer factor to the sample solution. This factor is known within the immunity field (cf. for example M. Roserithal: "Der Transferfaktor und seine therapeutische Anwendung"; Switzerland, md. Wschr. Bd. 104, 1974, pages 1501-1506). The transfer factor can be produced from normal blood leukocytes. The factor constitutes a subcellular, dialyzable, non-immunogenic leukocyte factor, which is responsible for the reaction due to the T-lymphocytes. There are transfer factor preparations on the market (Schura, Krefeld), which are produced by fractionation in liquid oxygen gas with subsequent stepwise ultrafractionation. A unit, which occurs in the trade, contains a transfer factor from approx. 5«IO<10>leukocytes. The preparation is stabilized with 1% human albumin solution.

Det har vist seg at det ved tilsetning av overfør-ings faktor oppnås en forsterkning av immunreaksjonen. Ved over-føringsfaktor-tilsetningen blir derved diskrimineringen eller undertrykkelsen av den enkelte test vesentlig forbedret. It has been shown that by adding a transfer factor, a strengthening of the immune reaction is achieved. When the transfer factor is added, the discrimination or suppression of the individual test is thereby significantly improved.

Oppfinnelsen gjelder også en testplate for gjennom-føring av framgangsmåten. Denne består av en plan bæreplate av inert materiale, eksempelvis glass, der det er påført et 0,5-5 mm tykt, stivnet agarsjikt, som har to stort sett sirkelform-ede, utstansede hull med en diameter av mellom 0,5 og 5 mm (fortrinnsvis 2,2-3,0 mm). Hvert hull har et slikt volum at det kan opptas ca. 5-20 p£, fortrinnsvis 8 testmasse. Det er viktig at de utstansede hullene er slik utformet at det kapillare bevegelsessjiktet blir ensartet også innenfor over-gangsområdet mellom hull og sjikt. The invention also applies to a test plate for carrying out the method. This consists of a flat carrier plate of inert material, for example glass, on which a 0.5-5 mm thick, solidified agar layer has been applied, which has two largely circular, punched holes with a diameter of between 0.5 and 5 mm (preferably 2.2-3.0 mm). Each hole has such a volume that approx. 5-20 p£, preferably 8 test mass. It is important that the punched holes are designed in such a way that the capillary movement layer is uniform also within the transition area between the hole and the layer.

Oppfinnelsen vil bli nærmere belyst i tilknytning til etterfølgende eksempler. The invention will be explained in more detail in connection with subsequent examples.

Dessuten henvises det til tegningsfigurene, der fig. 1 viser et grunnriss av en testplate ifølge oppfinnelsen, mens fig. 2 viser platen i tverrsnitt. In addition, reference is made to the drawings, where fig. 1 shows a plan view of a test plate according to the invention, while fig. 2 shows the plate in cross-section.

Eksempel 1Example 1

A. Utvinning av leukocyttsuspensjonA. Recovery of leukocyte suspension

30 ml humanblod (blod fra pasient) hepariniseres med 300 USP-enheter natriumheparinat. Det hepariniserte blodet undersjiktes i et lite plastrør med 8 ml 6 vektprosents deks-. tranoppløsning i fysiologisk koksaltoppløsning (dekstranets molekylvekt 75.000). Deretter lar man erytrocyttene sedimente-re ved 37°C i et varmeskap i ca. 45 min. Den leukocytt-rike del ("buffycoat") tas opp med en hevert pg blandes med like volumdeler av en 0,9 vektprosents NaCl-oppløsning, og sentrifugeres deretter i 15 min. med en akselerasjon av 750 g. Det kuleformede materiale som separeres fra ved sentriguferingen, vaskes på ny to ganger i en 10 ml Hank's oppløsning (pH 7,2) og suspenderes i et Te 199-medium (produsent: Serva, Heidelberg). Ved vaskingen og.suspenderingen hvirVles cellene opp med en pipette, inntil man makroskopisk ikke kan oppdage noen celle-klumper. Leukocyttene telles etter farging med tyrkisk oppløs-ning i et kammer i overensstemmelse med Neubauer, med antallet innstilt på. 2xl05 celler/viS. i Te 199-medium. I gjennomsnitt forelå i prøvene,25% énkjernede celler (lymfosytter og mono-cytter) samt 7.5% granulocytter. Erytrocyttkontaminasjoneh var mindre enn 1:1. 30 ml of human blood (blood from a patient) is heparinized with 300 USP units of sodium heparinate. The heparinized blood is sublayered in a small plastic tube with 8 ml of 6% by weight dex-. tran solution in physiological saline solution (dextran molecular weight 75,000). The erythrocytes are then allowed to sediment at 37°C in a warming cabinet for approx. 45 min. The leukocyte-rich part ("buffycoat") is taken up with a sieve and mixed with equal parts by volume of a 0.9% by weight NaCl solution, and then centrifuged for 15 min. with an acceleration of 750 g. The spherical material separated from by centrifugation is washed again twice in a 10 ml Hank's solution (pH 7.2) and suspended in a Te 199 medium (manufacturer: Serva, Heidelberg). During the washing and suspension, the cells are vortexed with a pipette, until no clumps of cells can be detected macroscopically. The leukocytes are counted after staining with Turkish solution in a chamber according to Neubauer, with the number set to . 2xl05 cells/viS. in Te 199 medium. On average, the samples contained 25% mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) and 7.5% granulocytes. Erythrocyte contamination was less than 1:1.

B. Framstilling av antigenoppløsningB. Preparation of antigen solution

For framstilling av antigenoppløsningen skal den éncefalittogene faktoren (EF) eller det basiske proteinet fra carcinomvey (CaBP) isoleres. Tumoren resp. hjernen bearbeides under sterile betingelser så hurtig som mulig etter at de er fjernet operativt. Bindevev og frisk vev fjernes fra svulsten. Deretter findeles svulsten resp. hjernevevet med en steril skalpell (operasjonskniv) og findeles ytterligere i en homogenisator i isbad. Svulstvevet opphetes ikke ved denne behand-ling. Homogenisatet suspenderes i et fire ganger så stort volum destillert vann og sentrifugeres deretter ved 23ooo g. To prepare the antigen solution, the encephalitogenic factor (EF) or the basic protein from carcinomave (CaBP) must be isolated. The tumor or the brains are processed under sterile conditions as soon as possible after they have been surgically removed. Connective tissue and healthy tissue are removed from the tumor. The tumor is then crushed or the brain tissue with a sterile scalpel (surgical knife) and further minced in a homogenizer in an ice bath. The tumor tissue is not heated by this treatment. The homogenate is suspended in four times the volume of distilled water and then centrifuged at 23ooo g.

Det dannede, faste materialet suspenderes på ny i et fire ganger så stort volum 0,9 prosents NaCl-oppløsning, homogeniseres og sentrifugeres ved 23 000 gi 30 min. Det igjen med en fire ganger så stor volummengde destillert vann resuspenderte materialet (kulen) frysetørkes. Det frysetørkede pulveret tilsettes en blanding av kloroform/metanol (2:1) i forholdet 1:10 og omrøres i 30 min. Blandingen sentrifugeres i 10 min. ved 600 g. Den ovenfor beliggende væsken kastes. The solid material formed is resuspended in four times the volume of 0.9 percent NaCl solution, homogenized and centrifuged at 23,000 g for 30 min. The resuspended material (the ball) is freeze-dried with four times the volume of distilled water. The freeze-dried powder is added to a mixture of chloroform/methanol (2:1) in a ratio of 1:10 and stirred for 30 min. The mixture is centrifuged for 10 min. at 600 g. The above liquid is discarded.

Denne prosess gjentas to ganger. Kulen lufttørkes. This process is repeated twice. The bullet is air-dried.

Den tørkede kulen resuspenderes i en fem ganger så stor volummengde av en 5 prosents NaCl-oppløsning i vann og sentrifugeres i 30 min. ved 23 000 g. Den ovenfor beliggende væsken kastes. Under tilsetning av n/100 NaCl innstilles den igjen i en fem ganger større volummengde destillert vann resuspenderte kulen på en pH av 3,5. Suspensjonen rystes lett i 30 min. og sentrifugeres deretter på ny i 30 min. ved 23 000 g. Den ovenfor beliggende væsken kastes. Enda en gang resuspenderes kulen i den fem ganger større mengden destillert vann*som med n/100 HC1 innstilles på en pH-verdi av 2,6 og får stå i 3-18 timer. pH-verdien forandres ikke i denne tidsperiode. Suspensjonen sentrifugeres i 30 min. ved 23 000 g. Den ovenfor beliggende væsken tas vare på, kulen vaskes på ny i n/100 NåCl ved pH 2,6 og sentrifugeres. Den her dannede, ovenfor beliggende væsken tas vare på. De to sistnevnte væskene blandes og dialyseres deretter mot destillert vann. Derettér skjer en frysetørking. The dried sphere is resuspended in five times the volume of a 5 per cent NaCl solution in water and centrifuged for 30 min. at 23,000 g. The above liquid is discarded. During the addition of n/100 NaCl, the sphere is resuspended in a five times greater volume of distilled water to a pH of 3.5. The suspension is shaken lightly for 30 min. and then centrifuged again for 30 min. at 23,000 g. The above liquid is discarded. Once again, the ball is resuspended in the five times larger amount of distilled water*, which is adjusted to a pH value of 2.6 with n/100 HC1 and allowed to stand for 3-18 hours. The pH value does not change during this time period. The suspension is centrifuged for 30 min. at 23,000 g. The above liquid is taken care of, the pellet is washed again in n/100 NaCl at pH 2.6 and centrifuged. The liquid formed here, located above, is taken care of. The two latter liquids are mixed and then dialyzed against distilled water. Freeze-drying then takes place.

Det oppnås en antigen-testoppløsning ved oppløsning av 0,1 mg/ml av den frysetørkede substansen i destillert vann. For en oppløsning av det basiske proteinet fra svulstvev (CaBP) gjelder en i prinsippet lik framstillingsprosess. An antigen test solution is obtained by dissolving 0.1 mg/ml of the freeze-dried substance in distilled water. For a solution of the basic protein from tumor tissue (CaBP), a basically similar production process applies.

C. Framstilling av testplaten ( jfr, også fig.' 1 og 2)C. Preparation of the test plate (cf. also fig. 1 and 2)

0,5 g av en spesiell kulturagar ("Agarose"; produsent: Behring-Wérke, Marburg) veies i en 50 ml Erlenmeyerkolbe. Dertil settes 22,5 ml sterilt destillert vann. 0.5 g of a special culture agar ("Agarose"; manufacturer: Behring-Wérke, Marburg) is weighed into a 50 ml Erlenmeyer flask. Add 22.5 ml of sterile distilled water to this.

Til en annen Erlenmeyerkolbe settes'22,5 ml av det dobbelkonsentrerte Tc 199-mediet og 5 ml plasma utvunnet fra humanblod. Med Erlenmeyerkolben fastspent i et stativ oppløses agarosen under lett rysting i et kokende vannbad. Kolben lukkes med en folie eller en propp, da vannet ellers kan fordampe. 22.5 ml of the doubly concentrated Tc 199 medium and 5 ml of plasma extracted from human blood are added to another Erlenmeyer flask. With the Erlenmeyer flask clamped in a stand, the agarose is dissolved under gentle shaking in a boiling water bath. The flask is closed with foil or a stopper, otherwise the water can evaporate.

Etter fullstendig oppløsning av agarosen lar man denne avkjøles i et vannbad ved 47°C. I samme bad forvarmes deretter blandingen av medium og plasma samt tilsettes agarosen After complete dissolution of the agarose, it is allowed to cool in a water bath at 47°C. In the same bath, the mixture of medium and plasma is then preheated and the agarose is added

under rysting, slik at det nå foreligger 50 ml av en 1 prosents agaroseoppløsning i enkelt Tc 199-medium med 10% plasma. while shaking, so that there is now 50 ml of a 1 percent agarose solution in single Tc 199 medium with 10% plasma.

Ved hjelp av en utporsjoneringspipette, som er opp-varmet på forhånd, påfylles 5 ml av agaren i runde vevkultur-' skåler (Petriskåler) 10 med en diameter av 50 mm, slik det framgår av fig. 1. Etter at agaren er stivnet, utstanses det i agaren ved hjelp av en teleskopstansekanyle (Behring-Werke, Marburg) og en sjablon hull 11 med en diameter av 2,5 mm. Ved utstansingen skal det tas hensyn til at agarsjiktet ved stan-seområdet ikke oppløses av glassjiktet, for ikke å utvide kapillarsjiktet og følgelig ikke garantere leukocyttenes bevegelse. Using a portioning pipette, which has been heated in advance, 5 ml of the agar is filled in round tissue culture dishes (Petri dishes) 10 with a diameter of 50 mm, as can be seen from fig. 1. After the agar has solidified, it is punched in the agar using a telescopic punch needle (Behring-Werke, Marburg) and a template hole 11 with a diameter of 2.5 mm. When punching out, care must be taken that the agar layer at the punching area is not dissolved by the glass layer, so as not to expand the capillary layer and consequently not guarantee the movement of the leukocytes.

Anordningen av hullene 11 framgår av fig. 1. Selv-sagt er også andre utførelsesformer mulige. Fig. 2 viser et forstørret tverrsnittsriss gjennom den nedre delen av skålen 10. Det er antydet i fig. 2 at agarsjiktet 1 er atskilt fra skål-ens 10 glassjikt, Ved et tynt kapillarsjikt 3. De ulike hull-rekkene er eksempelvis beregnet for: The arrangement of the holes 11 appears in fig. 1. Of course, other embodiments are also possible. Fig. 2 shows an enlarged cross-sectional view through the lower part of the bowl 10. It is indicated in fig. 2 that the agar layer 1 is separated from the glass layer 10 of the dish, In the case of a thin capillary layer 3. The various rows of holes are designed, for example, for:

A. Kontrollprøve (standard)A. Control sample (standard)

B. Testsuspensjon med allmenngyldig antigen.B. Test suspension with universal antigen.

C. Testsuspensjon med organ-spesifikt antigen.C. Test suspension with organ-specific antigen.

D. Testsuspensjon med organisk antigen og over-føringsfaktor. D. Test suspension with organic antigen and transfer factor.

D. Reaksjon, inkubasjon og fikseringD. Reaction, incubation and fixation

For en test ble følgende tilsetninger framstilt:For a test, the following additives were produced:

1. Med 100 ] xl leukocyttsuspensjon i samsvar med A og 8 u& antigensuspensjon i samsvar med B, 2. med 100 u& leukocyttsuspensjon og 8 uJl n/100 NaCl-oppløsning (for referanseverdien). 1. With 100 ] xl leukocyte suspension in accordance with A and 8 u& antigen suspension in accordance with B, 2. with 100 u& leukocyte suspension and 8 uJl n/100 NaCl solution (for the reference value).

De blandede tilsetningene 1 og 2 inkuberes i 60 min. ved 37°C i varmeskap ved en luftfuktighet av 100%. Deretter påfylles det fra den inkuberte oppløsningen i hvert hull 8 uA leukocytt- og antigenholdig substans resp. standardsubstans. For bestemmelsen av leukocyttbevegelsen og innvirkningen av de av lymfocyttene produserte, bevegelsehemmedde faktorene står det til rådighet 2-5 måleresultater likesom 2-5 referanseverd-ier, dette i overensstemmelse med antall hull i testplaten. De celler som inngår i suspensjonen og som ble innført i hullene i begynnelsen av forsøket, beveger seg inn i mellomsjiktet 3 mellom agaren og skålflaten. Ved en inkubasjon av platene ved 37°C i varmeskap i 18 timer opprettholdes denne bevegelse i et visst tidsrom. Leukocyttene beveger seg ikke inn i agaren, men trekker bare næringsstoffene ut av denne. Inkubasjonen gjennom-føres ved en relativ fuktighet av 100% i et fuktkammer. The mixed additions 1 and 2 are incubated for 60 min. at 37°C in a warming cabinet at a humidity of 100%. Then, from the incubated solution, 8 uA of leukocyte- and antigen-containing substance or standard substance. For the determination of the leukocyte movement and the impact of the immobilizing factors produced by the lymphocytes, 2-5 measurement results as well as 2-5 reference values are available, this in accordance with the number of holes in the test plate. The cells that form part of the suspension and that were introduced into the holes at the beginning of the experiment, move into the intermediate layer 3 between the agar and the dish surface. By incubating the plates at 37°C in a warming cabinet for 18 hours, this movement is maintained for a certain period of time. The leukocytes do not move into the agar, but only extract the nutrients from it. The incubation is carried out at a relative humidity of 100% in a humidity chamber.

Etter inkubasjonen oversjiktes platene i 15 min. med metanol og tilslutt i 10 min. med formalinoppløsning (37 vektprosent metanol). Til sist trekkes agaren forsiktig av som et sjikt fra bunnen av skålen. De cellene som er forflyttet i mellomsjiktet, fikseres nå ved skålflaten. Etter tørkingen inn-farges cellene ifølge Pappenheim, hvorved mørkfiolette ringer 4 (vandringsringer) viser seg på platens flate (jfr. fig. 1). E. Bestemmelse og beregning av resultatene. Med et måleforstørrelsesglass (Bausch & Lomb) be stemmes diameteren for vandringsringen. Derved må også medtas de i periferien sporadisk forekommende cellene med polymorfe kjerner. Fra flere bestemmelser oppnås den aritmetiske middelverdi. After the incubation, the plates are overlaid for 15 min. with methanol and finally for 10 min. with formalin solution (37% methanol by weight). Finally, the agar is carefully pulled off as a layer from the bottom of the dish. The cells that have moved into the intermediate layer are now fixed at the bowl surface. After drying, the cells are stained according to Pappenheim, whereby dark violet rings 4 (migration rings) appear on the surface of the plate (cf. Fig. 1). E. Determination and calculation of the results. Use a measuring magnifying glass (Bausch & Lomb) to measure the diameter of the travel ring. In doing so, the cells with polymorphic nuclei occurring sporadically in the periphery must also be included. From several determinations, the arithmetic mean value is obtained.

Kvotienten mellom (migreringsflaten) vandringsflaten F^med antigen og vandringsflaten F2uten antigen gir en "migreringsindeks<M>; MI: The quotient between the (migration surface) migration surface F^ with antigen and the migration surface F2 without antigen gives a "migration index<M>; MI:

MI = F^/F2MI = F^/F2

En migreringsindeks (vandringsindeks, bevegelsesindeks) somA migration index (migration index, movement index) which

er 0,85 betyr hemning av leukocyttene i betydelig omfang og dermed en positiv cellereaksjon. I etterfølgende tabell angis et måleeksempel: is 0.85 means inhibition of the leukocytes to a significant extent and thus a positive cell reaction. The following table shows a measurement example:

Rekke Ø(mm) Flate (mm<2>) MIRow Ø(mm) Flat (mm<2>) MI

B 6,75 Fx» 35,8 0,80 W 6.75 Fx» 35.8 0.80

A 7,55 F2»44,75 (1) A 7.55 F2»44.75 (1)

Førstegangs undersøkelsen med totalt 97 pasienter skulle kunne gi effekten av migrerings- eller bevegelseshemningstesten ved brystkreft. 27 av 47 undersøkte pasienter med brystkreft viser en hemning, som er større enn 15% (»58-7%), dvs. en migreringsindeks MI som underskrider 0,85. Når det gjelder de 23 undersøkte pasientene med sykelige forandringer i brystet viser bare fire (av 23) en slik hemning (= 17%); The initial investigation with a total of 97 patients should be able to provide the effect of the migration or mobility impairment test in breast cancer. 27 out of 47 examined patients with breast cancer show an inhibition, which is greater than 15% (»58-7%), i.e. a migration index MI that is below 0.85. Regarding the 23 examined patients with morbid changes in the chest, only four (out of 23) show such inhibition (= 17%);

m.h.t. pasienter med fibroadenom viste én pasient av fem (= 20%) hemning. Følgende tabell gir en totaloversikt: regarding patients with fibroadenoma showed one patient in five (= 20%) inhibition. The following table provides an overall overview:

Eksempel 2 Example 2

Utnyttelse av overføringsfaktoren for forsterkning av immunreaksjonen. Utilization of the transfer factor for enhancing the immune response.

Det skal påpekes at det kan oppnås en forsterkning av immunreaksjonen ved tilsetning av en oppløsning med over- føringsfaktor (produsent: Schura, Krefeld). Det viser seg at migreringsfaktoren,, ved tilsetning av denne faktor, blir ster-kere utpreget enn i forhold til testeksempel i. It should be pointed out that a strengthening of the immune reaction can be achieved by adding a solution with transfer factor (manufacturer: Schura, Krefeld). It turns out that the migration factor, when this factor is added, becomes more pronounced than in relation to test example i.

Følgende testtilsetninger ble framstilt:The following test additives were produced:

1. 100 ufi. leukocyttsuspensjon + 8 uAantigenoppløs-ning. 2. 100 u£ leukocyttsuspensjon ♦ 8u£ antigenoppløs-ning 20 u& oppløsning av overføringsfaktor (preparat Schura, 1 u£ tilsvarer omtrent overføringsfaktoren fra 5xl05 leukocytter) . 1. 100 ufi. leukocyte suspension + 8 uAntigen solution. 2. 100 u£ leukocyte suspension ♦ 8u£ antigen solution 20 u& solution of transfer factor (preparation Schura, 1 u£ corresponds approximately to the transfer factor from 5xl05 leukocytes) .

3. 100 u£ leukocyttsuspensjon3. 100 u£ leukocyte suspension

4. 100 u£ leukocyttsuspensjon 20 uA overførings-faktoroppløsning som ved tilsetning 2. 4. 100 u£ leukocyte suspension 20 uA transfer factor solution as in addition 2.

Inkubasjon og preparering av skålene skjer som angitt i eksempel, 1, Man framstiller en skål med 4x5 hull (diameter 2,5 mm). En rekke med 5 hull ble fylt med 10 uÅ av test-tilsetningene 1-4. Incubation and preparation of the dishes takes place as indicated in example, 1. A dish with 4x5 holes (diameter 2.5 mm) is prepared. An array of 5 holes was filled with 10 µA of test additives 1-4.

Følgende resultater ble oppnådd (middelverdi fra fem forsøk): The following results were obtained (mean value from five trials):

Den lave MI-verdien for rekkene B/C tyder på et til-felle av ondartet svulst. The low MI value for rows B/C indicates a case of malignant tumor.

Resultater fra bevegelsehemningstesten (migrerings'-inhiberingstesten) ved bruk av overføringsfaktor ved bestemmelse av gastro-intestinale svulster: Det ble gjennomført målinger ved hjelp av metodik-ken ifølge eksempel 2. I en (frisk) kontrollgruppe av pasienter fikk man ingen nevneverdig hemning: migreringsindeksen lå ved 1,02 - 0,1. Overføringsfaktoren påvirket ikke disse resultater. I en gruppe av pasienter, som led av svulster på tykk-tarmen, lå migreringsindeksen på 0,65 0,2. Av de 15 undersøk-te tilfellene viste 11 en migreringsindeks som var lavere enn 0.85. Etter tilsetning av overføringsfaktor lå migreringsindeksen ved 0,61 - 0,09. Dessuten lå migreringsindeksen under 0,85 etter tilsetning av overføringsfaktor hos 14 av 16 pasienter, slik at det også her ble oppnådd en markant forbedring av for-søksresultatene. I andre undersøkte grupper kunne det ikke på-vises noen nevneverdig hemning. Results from the movement inhibition test (migration inhibition test) using transfer factor in the determination of gastro-intestinal tumours: Measurements were carried out using the methodology according to example 2. In a (healthy) control group of patients, no significant inhibition was obtained: the migration index was at 1.02 - 0.1. The transfer factor did not affect these results. In a group of patients who suffered from tumors on the large intestine, the migration index was 0.65 0.2. Of the 15 investigated cases, 11 showed a migration index that was lower than 0.85. After adding the transfer factor, the migration index was 0.61 - 0.09. Furthermore, the migration index was below 0.85 after the addition of transfer factor in 14 out of 16 patients, so that a marked improvement in the trial results was also achieved here. In other examined groups, no significant inhibition could be demonstrated.

Eksempel 3Example 3

Det kan også ekstraheres en antigenoppløsning fra svulstceller, som er vasket i en fermentasjonskultur in vitro, med en nøytral buffer under gjentatt oppdeling av vevet. Hjernetumorcellene odles på følgende måte in vitro: Mån må i denne forbindelse se nøye til at det opprettholdes sterile ar-beidsforhold. Cellene vaskes fortrinnsvis i en homogeniserings-oppløsning av typen Hank<1>senen i 30 sekunder. Omrøring bør forhindres. Samtlige vegger og flater av kolben, fortrinnsvis en glasskolbe med et volum av 250 ml, vaskes omsorgsfullt i Oppløs-ningen renses fra cellene ved sentrifugering i kulde i en tid av 10 min. Mediet helles i et glassbeger. Man tilsetter en liten mengde bufret proteinas-enzymoppløsning, og det foretas en hurtig spyling for å forhindre en nedbrytning av cellene. An antigen solution can also be extracted from tumor cells, which have been washed in a fermentation culture in vitro, with a neutral buffer during repeated division of the tissue. The brain tumor cells are cultivated in the following manner in vitro: In this connection, care must be taken to ensure that sterile working conditions are maintained. The cells are preferably washed in a homogenizing solution of the Hank<1>senen type for 30 seconds. Agitation should be prevented. All walls and surfaces of the flask, preferably a glass flask with a volume of 250 ml, are carefully washed in The solution is cleaned from the cells by centrifugation in the cold for a period of 10 min. The medium is poured into a glass beaker. A small amount of buffered proteinase enzyme solution is added, and a quick rinse is carried out to prevent a breakdown of the cells.

I samsvar med den foretrukne metoden tilsettes opp til 2 ml trypsinoppløsning (EDTA) i en kolbe. Trypsinoppløsningen av-helles etter spyling i 10 sek. In accordance with the preferred method, up to 2 ml of trypsin solution (EDTA) is added to a flask. The trypsin solution is poured off after rinsing for 10 sec.

Deretter tilsettes en tilsvarende volummengde av en fersk trypsinoppløsning. Denne inkuberes inntil man ved ob-servasjon i mikroskop konstaterer at cellene separeres fra kammerets vegger. Dette tar vanligvis 5-10 min. Man tilsetter et hensiktsmessig tilvekstmedium, eksempelvis 50 ml av en opp-løsning av en 7-10 prosents oppløsning av serumet fra kalver i 100 ml næringsmedium av typen "F-10". 25 ml av det ferske mediet med cellene overføres til et nytt tilvekstkammer (kolbe) for forplantningen. Begge kammere anbringes i omtrent 7 døgn i en inkubator ved 35°C. I samsvar med dette eksempel, fram til dette punkt, deles en kultur av de kunstige svulstcellene i tp friske kulturer i omtrent samtlige 7 døgn. Framgangsmåten kan gjentas i intervaller på 7 døgn. Antallet in feitro voksende celler fordobles i samtlige 7 døgn. A corresponding volume of a fresh trypsin solution is then added. This is incubated until observation under a microscope shows that the cells are separated from the walls of the chamber. This usually takes 5-10 minutes. A suitable growth medium is added, for example 50 ml of a solution of a 7-10 per cent solution of the serum from calves in 100 ml of nutrient medium of the "F-10" type. 25 ml of the fresh medium with the cells is transferred to a new growth chamber (flask) for propagation. Both chambers are placed for approximately 7 days in an incubator at 35°C. In accordance with this example, up to this point, a culture of the artificial tumor cells is divided into tp healthy cultures for approximately the entire 7 days. The procedure can be repeated at intervals of 7 days. The number of fat-growing cells doubles every 7 days.

Mediet med cellene overføres til et sentrifugerings-rør og sentrifugeres i kulde i 10 min. med en hastighet av 3000 r/min (omtrent 2200 g). Mediet kastes. De celler, som er igjen i tilvekstkammeret, avskrapes frå kammerveggene og ned-vaskes i sentrifugeringsrøret med en nøytral bufferoppløsning* Cellene vaskes te ganger med én nøytral bufferoppløsning og sentrifugeres på ny i kulde med en hastighet av 3000 r/min (omtrent 2200 g). Mediet kastes. De tilvokste cellene suspenderes i 10 ml nøytral fosfatbuffer, inntil de er klare for ekstraksjon. Deretter behandles de utvokste cellene i kulde i 20 sek. med en lydanordning for å bryte cellene i stykker. I hvilket som helst av tilfellene må denatureringen av proteinet forhindres i størst mulig grad. Etter den forannevnte be-handlingen sentrifugeres cellene i 30 min. ved 30.000 r/min (omtrent 220 000 g). Det produkt som befinner seg øverst i sentrifugeringsrøret dekanteres. 10 ml av bufferoppløsningen nyttes for å vaske de gjenværende cellerestene. Oppløsningen behandles igjen med lyd og sentrifugeres * og det produkt som befinner seg øverst i sentrifugeringsrøret slås sammen med det dekanterte produktet. Denne prosess gjentas enda en gang. De sammenførte produktene fordampes for å redusere volumet fra ca. 30 ml til ca. 6-7 ml. En tilsvarende del uttas for bestemmelse av totalt protein. The medium with the cells is transferred to a centrifugation tube and centrifuged in the cold for 10 min. at a speed of 3000 r/min (about 2200 g). The medium is discarded. The cells that remain in the growth chamber are scraped off the chamber walls and washed down in the centrifuge tube with a neutral buffer solution* The cells are washed three times with one neutral buffer solution and centrifuged again in the cold at a speed of 3000 r/min (approximately 2200 g) . The medium is discarded. The grown cells are suspended in 10 ml of neutral phosphate buffer until they are ready for extraction. The grown cells are then treated in the cold for 20 seconds. with a sonic device to break the cells apart. In either case, the denaturation of the protein must be prevented to the greatest extent possible. After the aforementioned treatment, the cells are centrifuged for 30 min. at 30,000 r/min (about 220,000 g). The product at the top of the centrifuge tube is decanted. 10 ml of the buffer solution is used to wash the remaining cell debris. The solution is again sonicated and centrifuged * and the product at the top of the centrifuge tube is combined with the decanted product. This process is repeated once more. The combined products are evaporated to reduce the volume from approx. 30 ml to approx. 6-7 ml. A corresponding portion is taken for determination of total protein.

Ved hjelp av en væskekromatografikolonne og féltre-ring gjennom et filter med meget fine porer befris preparatet deretter for forurensninger. De ulike detaljer ved denne framgangsmåte er beskrevet i tysk offentlighetsskrift nr. 2.606.257, Eksempel 2. Man utvinner et polypetid med en molfekylvekt av ca. 10.000. Man framstiller en antigenoppløsning, som har en konsentrasjon av omtrent 100 mg antigen per liter. With the help of a liquid chromatography column and filtration through a filter with very fine pores, the preparation is then freed from impurities. The various details of this procedure are described in German publication no. 2,606,257, Example 2. One extracts a polypetid with a molecular weight of approx. 10,000. An antigen solution is prepared, which has a concentration of approximately 100 mg of antigen per litre.

Forsøkene ifølge eksemplene 1 og 2 gjennomføres med det antigenet som er utvunnet på kunstig måte. Det viser seg at det kunstig frambragte antigenet medfører samme virkning som det antigenet, som ble utvunnet fra kroppsvev. The experiments according to examples 1 and 2 are carried out with the antigen which has been extracted artificially. It turns out that the artificially produced antigen has the same effect as the antigen that was extracted from body tissue.

Eksempel 4Example 4

Anvendelse av et organispesifikt antigen.Application of an organ-specific antigen.

A. Utvinningen av leukocyttsuspensjonen skjedde som beskrevet i Eksempel 1-A. A. The recovery of the leukocyte suspension took place as described in Example 1-A.

B. Framstilling av en organspesifikk antigenoppløs-ning. B. Preparation of an organ-specific antigen solution.

Så ferskt som mulig utvunnet svulstvev fra en bryst- tumor befris for blod, fett- og bindevev samt oppskjæres i små terninger eller strimler. Samtlige etterfølgende trinn gjennom-føres ved 4°C. Dé små vevstykkene findeles i en kaliumklorid-oppløsning (konsentrasjon 3 mol/liter) til omtrent ert-store stykker. pH-verdi for denne råsuspensjon innstilles på 7,4. Deretter findeles vevet ved hjelp av en homogenisator av typen Ultraturrax (20 000 r/min). Homogenisatet oppbevares i 24 timer, hvoretter det sentrifugeres. Det materialet, som utvinnes etter 60 min. sentrifugering ved 4000 g (hvilket materiale befinner seg øverst i sentrifugeringsrøret), dialyséres i 2 timer mot en 10 ganger større vblummengdé destillert vann bg deretter i ytterligere 24 timer mot en 50 ganger større volummengde av en 0,9 prosents NaCl-oppløsning. Fra dialysatet utfelles proteinene ved tilsetning av 2-molar ammuniumsulfat i en tid av 1 time og separeres ved 20 minutters sentrifugering ved 4000 g. Etter suspensjon av proteinene i en 0,9 prosents HaCl-oppløsning gjennomføres en 1 times dialyse mot den 5 ganger større volummengde destillert vann og en ytterligere dialyse mot den 50 ganger større volumraengden 0,9 prosents NaCl-oppløs-ningen. Etter steril-filtrering gjennom et 0,45 millipor-mikropor-filter påfylles antigenekstrakten små ampuller og oppbevares ved -20°C. Før anvendelse bestemmes proteininnholdet i en slik tilsetning ved Biuretmetoden etter den foran beskrevne TCA-felling. As freshly as possible, tumor tissue extracted from a breast tumor is freed of blood, fat and connective tissue and cut into small cubes or strips. All subsequent steps are carried out at 4°C. The small pieces of tissue are crushed in a potassium chloride solution (concentration 3 mol/litre) into roughly pea-sized pieces. The pH value for this crude suspension is set to 7.4. The tissue is then finely divided using an Ultraturrax type homogenizer (20,000 r/min). The homogenate is stored for 24 hours, after which it is centrifuged. The material, which is extracted after 60 min. centrifugation at 4000 g (which material is located at the top of the centrifuge tube), is dialyzed for 2 hours against a 10 times larger volume of distilled water bg then for a further 24 hours against a 50 times larger volume of a 0.9 percent NaCl solution. From the dialysate, the proteins are precipitated by adding 2-molar ammonium sulfate for 1 hour and separated by centrifuging for 20 minutes at 4,000 g. After suspension of the proteins in a 0.9 percent HaCl solution, a 1-hour dialysis is carried out against the 5 times larger volume of distilled water and a further dialysis against the 50 times greater volume of the 0.9 per cent NaCl solution. After sterile filtration through a 0.45 millipore micropore filter, the antigen extract is filled into small ampoules and stored at -20°C. Before use, the protein content of such an addition is determined by the Biuret method following the TCA precipitation described above.

C. Samme testpiate som i eksempel 1 benyttes.C. The same test piate as in example 1 is used.

For testen framstilles tre tilsetninger:For the test, three additives are produced:

1. med 100 uA leukocyttsuspensjon fra pasientblod ifølge eksempel 1-A ♦ 8 yt n/100 NaCl-oppløsning (for rekken A^standardvérdi), 2. med lOOOuA leukocyttsuspensjon + 8 yi antigensuspensjon ifølge Eksempel 4-B. 3. med 100 uA leukocyttsuspensjon + 8 uA antigensuspensjon ifølge Eksempel 4-B ♦ 15 uA overføringsfåktoropp-løsning. 1. with 100 uA leukocyte suspension from patient blood according to example 1-A ♦ 8 yt n/100 NaCl solution (for the series A^standard value), 2. with lOOOuA leukocyte suspension + 8 yi antigen suspension according to Example 4-B. 3. with 100 uA leukocyte suspension + 8 uA antigen suspension according to Example 4-B ♦ 15 uA transfer factor solution.

Testplaten som har en hulldiameter av 2,5 mm sjiktes med 8 uA av den ifølge Eksempel 1 inkuberte testsubstansen 1-3. Resultatene gjenfinnes nedenfor, idet verdiene representerer middelverdier fra fem beregninger. The test plate, which has a hole diameter of 2.5 mm, is layered with 8 µA of the test substance 1-3 incubated according to Example 1. The results are found below, as the values represent mean values from five calculations.

Resultatene peker i retning av en brysttumorsvulst, fordi migreringsindeksen ligger klart under 0,8, og resultatene ved bruk av overføringsfaktor er ytterligere forsterket. The results point in the direction of a mammary tumor, because the migration index is clearly below 0.8, and the results when using the transfer factor are further enhanced.

Ytterligere undersøkelser viser at resultatene fra pasienter, som angitt i Eksempel 1, forandres på en enda mer betegnende måte.. Blant pasientene med brystsvulster viser ved anvendelse av metoden og ved hjelp av overføringsfaktoren mer enn 90% en migreringsindeks, som er mindre enn 0.80. Bare hos 10% av pasientene med brystsvulster er migreringsindeksen større enn 0.85. Further investigations show that the results from patients, as indicated in Example 1, change in an even more significant way. Among the patients with breast tumors, using the method and using the transfer factor, more than 90% show a migration index, which is less than 0.80. Only in 10% of patients with breast tumors is the migration index greater than 0.85.

Eksempel 5 Example 5

Bevegelighetsforandringen hos lymfocytter, fremmede makrofager og andre indikatorceller ble bestemt ved hjelp av The motility change in lymphocytes, foreign macrophages and other indicator cells was determined by means of

en kapillartest ifølge SØborg og Bendixen, Man benyttet seg av en 10 m tykk, åpen kapillar. Resultatene tilsvarte de som ble oppnådd i Eksempel 1 og 2, idet prinsippet m.h.t. like tilsetninger anvendes, a capillary test according to SØborg and Bendixen, A 10 m thick, open capillary was used. The results corresponded to those obtained in Examples 1 and 2, as the principle regarding similar additions are used,

SluttbemerkningerConcluding remarks

Testmetoden skal ikke benyttes for spesielle syk-domsbildet. Falske, negative resultater fås ved samtlige såkalte leukoser. En forklaring på dette kan for nærværende ikke gis, da nettopp leukemi-angrepne celler har meget høyt innhold av basiske proteiner. Dessuten forstyrres ikke den cellulære immuniteten hos disse pasienter på en så påfallende måte at dette resultat skulle kunne forklares med en forstyrrelse av immunsystemet. Dessuten er det i denne sammenheng iøynefallende at den kroniske, lymfatiske leukemi, likesom den akutte, lymfatiske leukemi, ikke viser noen reaksjon, mens lymfosarkomet og lymfogranulematosene oppfører seg som andre ondartede svulster. Før kemoterapien viser pasientene en tydelig hemming. Allerede etter den første kemoterapisyklus oppheves imidlertid denne hemning og i den andre syklus forvandles den til en falsk, positiv verdi. Dessuten fås det falske resultater Eos pasienter i tumorkakeksi. Pasienter med hurtig-voksende svulster eller pasienter i tumorkakeksi gir delvis falske resultater når det her foreligger en forstyrrelse av den cellulære immuniteten. The test method must not be used for special medical conditions. False, negative results are obtained with all so-called leukoses. An explanation for this cannot currently be given, as precisely leukemia-affected cells have a very high content of basic proteins. Moreover, the cellular immunity in these patients is not disturbed in such a striking way that this result could be explained by a disturbance of the immune system. Moreover, in this connection it is striking that the chronic lymphatic leukaemia, like the acute lymphatic leukaemia, shows no reaction, while the lymphosarcoma and the lymphogranulomatosis behave like other malignant tumours. Before the chemotherapy, the patients show a clear inhibition. Already after the first cycle of chemotherapy, however, this inhibition is lifted and in the second cycle it is transformed into a false positive value. In addition, false results are obtained in patients with tumor cachexia. Patients with fast-growing tumors or patients with tumor cachexia partially give false results when there is a disturbance of the cellular immunity.

Det pågår forsøk for å få svar på disse spørsmål,Attempts are underway to get answers to these questions,

Falske, positive resultater støter man først ogFalse, positive results are encountered first and

fremst på ved inflammatoriske og degenerative neurologiske syk-primarily on inflammatory and degenerative neurological diseases

dommer, eksempelvis multiple sklerose. Ifølge Vaspary og Field ligger forklaringen i en kryssreaksjon mellom faktoren EF og sensibiliseringen av lymfosyttene med hjernevev. conditions, for example multiple sclerosis. According to Vaspary and Field, the explanation lies in a cross-reaction between the factor EF and the sensitization of the lymphocytes with brain tissue.

De falske resultater kan imidlertid lett skillesHowever, the false results can be easily distinguished

fra ved en forundersøkelse, og de angitte sykdommer byr derfor ikke på noen hindringer for bruken av testen. from a preliminary examination, and the indicated diseases therefore do not present any obstacles to the use of the test.

Claims

1. Test method in vitro for diagnosis of malignancies

tumors, preferably in humans, where the change in mobility of cellular blood components that come into contact with a motility-inhibiting factor (MIF) is determined, and where said factor is separated from lymphocytes that are sensitized against tumor tissue, characterized in that as cellular blood components those lymphocytes, which examined as part of a leukocyte suspension is subjected to a per se known migration or movement inhibition test, during which the lymphocytes are brought into contact with an antigen, which stimulates the formation of MIF, and then incubated, and that the leukocyte movement after a certain fixed period of time is inhibited and fixed.

2. Test method as stated in claim 1, characterized in that the movement speed of the leukocytes is determined in a capillary intermediate layer, which is 1-20 um thick and which is at least partially filled with liquid.

3. Test method as stated in claim 2, characterized in that the intermediate layer is limited on the one hand by an inert medium (for example glass) and on the other hand limited by an agar layer which is enriched with nutrients.

4. Test method as stated in one of the claims 1-3, characterized in that the test is carried out with a sample of leukocyte-rich material ("buffyeoate"), which is extracted from human blood and with a constant number of leukocytes that is between 10 5 and 10 7 per try.

5. Test method as stated in claim 4, characterized in that the sample is added to an antigen solution according to Caspary and Field or a 3 m KCl extract from tumor tissue according to Meltzer in the ratio (volume of sample to antigen solution) of 1:60 - 1:10.

6. Test method as stated in claim 5, characterized in that an organ-specific antigen solution is added to the sample.

7. Test method as stated in claim 4, characterized in that the sample is supplied with an antigen solution, which is obtained by growing tumor cells in vitro, which solution contains between 50 and 200 mg of tumor antigen per 1000 ml of a suitable, aqueous solvent.

8. Test method as stated in one of claims 4-7, characterized in that, in addition to the antigen solution, a transfer factor solution is added to the sample.

9. Test method as stated in claim 8, characterized in that the number of leukocytes, from which the added amount of transfer factor is extracted, relates to the number of leukocytes present in the sample, such as 1:1 - 1:100.

10. Test method as stated in one of the preceding claims, characterized in that the incubation time in the migration inhibition test is between 10 and 30 hours at a temperature of 35-37.5°C at a relative humidity of 90-100%.

11. Test plate for carrying out the method as stated in one of claims 1-10, characterized by a flat support plate or dish (10) of inert material (for example glass), on which a 2-5 mm thick, solidified agar layer is placed , as between the support plate or dish (10) and the agar layer there is a capillary migration layer with a thick thickness of 1-10 ym, and that the agar layer has at least two large f. set circular holes (11) with a diameter of between 0.5 mm and 5 mm, preferably 2.5 mm.

12. Test plate as specified in claim 11, characterized in that the grooves are designed in such a way that uniformity is achieved for the capillary migration layer also in the vicinity of the transition from the holes to the capillary layer.