NO770373L - Fremgangsm}te ved bestemmelse av paracetamol. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en bestemmelsesmetode for • paracetamol i legemsvæsker, og særlig i blod. Den angår en fremgangsmåte for å skille prøver av legemsvæsker på basis av paracetamolinnholdet.

Paracetamol, som er et vanlig navn på 4 *-hydroxy-acetanilid, har utstrakt anvendelse for dets virkning som et anaTgetisk og antipyretisk middel. Ved normal anvendelse er paracetamol en sikker droge. Tatt i overdoser kan imidlertid paracetamol, som mange andre medisiner, være skadelige. Når det f.eks. taes i store mengder (som mere enn 50 tabletter tatt på ett tidspunkt) , kan det bevirke akutt hepatisk nekrose.

Akutt hepatisk nekrose kan behandles med forskjellige velkjente midler, men slike behandlinger kan i seg selv ha meget bestemte og ubehagelige følger. Det er derfor viktig at behandling av paracetamol-overdosepasiénter er berettiget på grunn av alvorligheten av deres tilstand, og en eller annen måte for å bestemme graden av paracetamol-overdose trenges for å bedømme deres tilstand. Det er derfor ønskelig å ha ét spesifikt og en-tydig middel til å bestemme paracetamol, og fortrinnsvis bør denne metode også være hurtig og temmelig enkel. Det er ønskelig at bestemmelsesmetoden er hurtig slik at hvis behandling er nød-vendig, bør denne gies så hurtig som mulig efter paracetamol-inntagelsen, for å få de beste resultater.

Det har vist seg at i pa racetamol-overdosetilfeller fordeles paracetamolet i det vesentlige likt mellom de røde blodceller og blodplasmaet. Nivået av paracetamol i blodplasmaet er således en pålitelig indikasjon på graden av paracetamol-overdose, og aksepteres i alminnelighet som en god indikasjon på sannsynlig påfølgende leverskade.

Flere metoder er kjent for å bestemme plasma-paracetamol, som metoder som involverer gass-væskekromatografi, men disse er komplekse, tidskrevende og unødig følsomme for å bestemme om behandling for en paracetamol-overdose er nødvendig. Slike metoder krever også en høy dyktighetsgrad av den som utfører dem.

Differensielle absorpsjonsmetoder kan også anvendes, men det nødvendige utstyr er ikke vanligvis generelt tilgjengelig på sykehus. Kolorimetriske best emm.elsesmetoder anvendt tidligere, har vært tilbøyelige til påvirkning fra andre droger, og spesielt fra barbiturater som temmelig sannsynlig er tilstede i overdose-pasienter.

Foreliggende oppfinnelse, i et henseende, fremskaffer en bestemmelsesmetode for paracetamol i blod, ved hvilken en prøve av blodet som skal undersøkes, deproteiniseres og det dannede deproteiniserte flytende skikt fraskilles, omsettes med et overskudd av salpetersyrling og gjøres alkalisk ved tilsetning av et passende alkali, slik at paracetamol tilstede i den opprinnelige blodprøve bevirker.dannelsen av en gul farvning av den behandlede prøve, og intensiteten av den gule farve av den behandlede prøve bestemmes ved sammenligning med en standard for å bestemme konsentrasjonen av paracetamol i den opprinnelige blodprøve.

Fremgangsmåter for. deproteinisering av blod er velkjente, og omfatter i.alminnelighet tilsetning av et f elningsmiddel til blodet som reagerer med proteinet og bevirker at det faller ut som et bunnfall og efterlater et deproteinisert væskeskikt. Trikloreddiksyre er vidt anvendt som et felningsmiddel og foretrekkes for anvendelse ved bestemmelsesmetoden ifølge oppfinnelsen. Et annet vidt anvendt felningsmiddel er perklorsyre, og denne kan anvendes. Mengden av felningsmiddel som kreves, er selvsagt avhengig av størrelsen av blodprøven og det spesielle stoff som anvendes, men det antaés å være innen en fagmanns kompetanse å velge passende mengder av felningsmiddel for å deproteinisere blodprøver ved foreliggende fremgangsmåte. Som illustrasjon kan nevnes at 3 ml 200 g/l trikloreddiksyre er effektiv til å felle proteinet i en 2 ml prøve av menneskeblod.

Efter deproteiniseringen skilles det deproteiniserte væskeskikt fra det utfelte protein. Denne adskillelse kan utføres på en hvilken som helst konvensjonell måte som ved sent rifugering, dekanter ing eller filtrering. Det har vist seg at filtrering gir fullstendig godtagbar adskillelse av den deproteiniserte væske fra proteinet for formålene ifølge oppfinnelsen, og da dette bare krever enkel apparatur, er det den foretrukne metode.

Den deproteiniserte væske (plasma) behandles med et overskudd av salpetersyrling, for å nitrosylere eventuelt tilstedeværende paracetamol. Ved uttrykket "et overskudd av salpetersyrling"

menes at mere salpetersyrling anvendes enn det som støkiometrisk kreves for å nitrosylere den maksimale mengde paracetamol som sannsynligvis er tilstede i prøven. Det har vist seg at et overskudd av salpetersyrling ikke griper forstyrrende inn i bestemmelsen, og det er således mulig å anvende ganske store mengder av salpetersyrling for å sikre fullstendig nitrosylering av paracetamol et .

Salpetersyrling i seg selv er meget ustabil og fremstilles derfor fortrinnsvis in situ ved tilsetning av en syre til et nit rit. Skjønt det er mulig å anvende en rekke syrer og nit riter (selvsagt forutsatt at de ikke griper forstyrrende inn i bestemmelsesmetoden) og allikevel få tilfredsstillende resultater, anvendes fortrinnsvis et alkalimetallnitrit som nat riumnit rit og en syre som fortynnet saltsyre i passende mengder for å gi den ønskede mengde salpetersyrling. Når imidlertid en syre anvendes i deproteiniseringstrinnet, vil det deproteiniserte væskeskikt vanligvis være tilstrekkelig surt til å frigjøre salpetersyrling fra et nitrit og således trenges ikke tilsetning av ytterligere syre. Ved en særlig foretrukken fremgangsmåte hvori trikloreddiksyre anvendes i deproteiniseringstrinnet, er det bare nød-vendig å tilsette en passende mengde nat riumnit rit til det deproteiniserte væskeskikt for å danne det ønskede overskudd av salpetersyrling.

Skjønt overskudd av salpetersyrling på ingen måte griper forstyrrende inn i bestemmelsesmetoden ifølge oppfinnelsen, kan det i noen tilfelle være ønskelig å fjerne eventuelt overskudd efter den fullstendige nitrosylering av paracetamolet. Hvis fjernelse av eventuelt salpetersyrlingoverskudd er nødvendig, kan sulfaminsyre tilsettes til prøven for å reagere med og således fjerne overskuddet av salpetersyrling.

Efter nitrosyleringen og eventuelt ytterligere trinn for å fjerne overskudd av salpetersyrling, gjøres den deproteiniserte væske alkalisk, fortrinnsvis til en pH over 10, ved tilsetning av et passende alkali. Uttrykket "passende alkali" er anvendt for å utelukke muligheten av at alkaliet kan gripe forstyrrende inn i

bestemmelsesmetoden og gjøre det vanskelig eller umulig å oppnå en pålitelig bedømmelse av mengden av paracetamol som er tilstedé i den opprinnelige blodprøve, eksempelvis bør alkaliet ikke selv bevirke vesentlig farvning av den behandlede oppløsning, ellers kan farvningen av oppløsningen som skyldes nærværet av paracetamol, utydeliggjøres. Det er vanligvis mest bekvemt å anvende en alkalimetallbase, som natriumhydroxyd, for å innstille prøvens pH.

Den behandlede prøve vil, hvis paracetamol var tilstede i den opprinnelige blodprøve, være gul av farve, og intensiteten av den gule farve er et mål på paracetamolkonsentrasjonen i den opprinnelige prøve slik at jo mørkere den gule farve er, desto høyere er paracetamolkonsentrasjonen. Bestemmelsesmetoden ifølge oppfinnelsen fremskaffer således en hurtig visuell indikasjon på paracetamolmengden i blod. Intensiteten av gulfarven bestemmes ved sammenligning med en standard for å bestemme paracetamolkonsent ras jonen i den opprinnelige blodprøve. Intensiteten kunne bestemmes nøyaktig., f. eks . ved hjelp av et spekt rofotomet er , og paracetamolkonsent ras jonen bestemmes fra den målte lysintensitet ved referanse til en standardtabell eller kurve som viser variasjonen av farveintensitet med paracetamolkonsentrasjoner for de spesielle mengder av reaktanter som anvendes. Det har imidlertid vist seg at en tilstrekkelig nøyaktig indikasjon på paracetamolkonsent ra s jonen av den opprinnelige blodprøve kan fåes ved visuell sammenligning av farven (eller graden av intensitet av farven)

av den behandlede prøve med en standard som angir farvene eller farveintensiteten erholdt for en rekke forskjellige paracetamolkonsent ras joner under anvendelse av de spesielle mengder av reaktanter som anvendes. Eksempelvis kan således standarden være i form av et kromatografisk objektglass (eller endog en serie foto-grafier) som viser farvene erholdt fra prøver med kjente paracetamolinnhold. En slik bestemmelsesmetode kan bare muliggjøre bestemmelsen av det område av paracetamolkonsent ras.jon innen hvilket paracetamolinnholdet av en prøve .faller, men det har vist seg at tilstrekkelig nøyaktighet kan oppnåes til å gi en pålitelig indikasjon på om behandling av en overdosepasient er nødvendig.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer således en meget hurtig, og allikevel enkel bestemmelsesmetode som muliggjør sortering av blodprøver for å bestemme deres paracetamolinnhold uten å kreve kompleks apparatur eller fine analytiske metoder. Foreliggende fremgangsmåte muliggjør at en bestemmelse av paracetamol kan ut-føres meget hurtig, typisk i løpet av ca. 5 minutter, og dessuten er de erholdte farvede oppløsninger stabile i betraktelig tid, typisk opptil 2 timer. Oppfinnelsen fremskaffer også en hurtig fremgangsmåte for å klassifisere en rekke blodprøver i grupper på basis av deres paracetamolinnhold.

Ved et annet aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse således en fremgangsmåte til å skille en rekke blodprøver i to eller flere grupper, hvor hver gruppe har et assosiert, forutbestemt område av paracetamolinnhold, i hvilke alle blodprøver er behandlet på lignende måte, idet behandlingen omfatter å deproteinisere blodprøven og skille fra det deproteiniserte væskelag, som

så omsettes med et overskudd av salpetersyrling og gjøres alkalisk ved tilsetning av et passende alkali slik at eventuelt tilstedeværende paracetamol i den opprinnelige blodprøve bevirker en gul farve i den behandlede prøve. Intensiteten av den gule farve av hver behandlet prøve bedømmes, ved sammenligning med en standard, for å bestemme konsentrasjonen av paracetamol i den tilsvarende opprinnelige blodprøve, og de behandlede prøver henføres så til de tilsvarende grupper på basis av den bedømte farveintensitet.

Selvsagt utføres behandlingen av prøvene og bestemmelsen av

de behandlede prøver på den ovenfor beskrevne måte.

Det er vesentlig for at foreliggende fremgangsmåte skal være pålitelig, at reaksjonen for å danne den gule farve er spesifikk for paracetamol, da nærværet av droger eller metaboliter som reagerer på lignende måte, ville føre til feilaktige konklusjoner

og mulig unødig behandling. Forbindelsene vist i tabell 1 nedenfor, er blitt prøvet i konsentrasjoner på 50 - 500[ig/ml (avhengig av deres oppløseligheter i vann) og har vist seg ikke å gripe forstyrrende inn i foreliggende fremgangsmåte. Disse droger ble valgt som de mest sannsynlige som kan være tilstede i blodet hos over-dosepasienter, og de ble prøvet i nivåer som svarer til inntagelse ' av store mengder.

De to hovedmetaboliter av paracetamol ble også prøvet og viste ingen forstyrrelse. Foreliggende fremgangsmåte oppviser derfor den nødvendige spesifisitet.

For å bestemme om behandling av en paracetamoloverdose eir nødvendig eller ikke, må der også taes hensyn til tiden mellom inntagelse av overdosen og bestemmelsen av nivået av paracetamol

i blodet. Paracetamolinnholdet i blodet avtar med tid, som nevnt ovenfor, og paracetamolnivået. over hvilket behandling er nødvendig eller ønskelig, avtar således med tiden fra det tidspunkt paracetamolet ble inntatt.. Dette fremgår av tabell 2 nedenfor som viser den kritiske paracetamolkonsentrasjon i blodet, over hvilken

behandling anbefales som en funksjon av tiden efter inntagelse. Andre faktorer som alder og den fysiske tilstand av pasienten kan selvsagt også påvirke avgjørelsen om behandling er ønskelig.

Videre detaljer med hensyn til variasjonen av det kritiske paracetamolnivå med tid finnes i litteraturen, f .eks . i en artikkel av L. F. Prescott et al, The Lancet, 6. april 1974,

s. 588-592.

Det følgende eksempel og forsøksresultater er gitt for å illustrere oppfinnelsen og viser foretrukne trekk ved oppfinnelsen.

Eksempel

En bestemmelse ble utført i henhold til foreliggende'fremgangsmåte under anvendelse av et forsøksutstyr omfattende:

20 ml sprøyte,

fleksible.sprøytenåler,

trikloreddiksyre (200 g/l),

filterpatroner,

filtrerpapir,

natriumnitrit ,

'natriumhydroxydpellets (50 mg NaOH/pellet ) ,

farvesammenligningsstandard, og

beholdere.0

Sprøyten ble forsynt med en fleksibel nål, og en 2 ml blod-prøve ble dratt inn i sprøyten. Derpå ble med nålen pekende vertikalt oppad en like stor mengde luft (2 ml) trukket inn i sprøyten. Eventuelt overskudd av blod ble tørret av nålen, og derpå ble 3 ml 200 g/l trikloreddiksyre trukket inn i sprøyten. Med nålen pekende vertikalt oppad igjen ble sprøyt estemplet trukket helt tilbake, derpå ble nålen bøyet dobbelt for å forhindre lekkasje, og sprøyten ble forsiktig rystet.

Filterpatronen ble satt sammen med et nytt filtrerpapir og anvendt til å filtrere innholdet fra sprøyten. Ca. 2 - 4 roi av filtratet (deproteinisert blod eller plasma) ble oppsamlet i en beholder inneholdende ca. 150 mg natriumnitrit. Beholderen ble rystet for å oppløse eventuelt dannet faststoff og hensatt i 2 minutter. Den dannede oppløsning ble så gjort alkalisk ved å tilsette en natriumhydroxydpellet, og beholderen ble igjen rystet inntil denne var oppløst.

Den behandlede prøve ble så sammenlignet visuelt med farvesammenligningsstandarden for å bestemme paracetamolinnholdet av den opprinnelige blodprøve.

Forsøksresultat er

Forsøksutstyret anvendt i eksemplet ble anvendt på nøyaktig samme måte av uavhengige operatører for å bestemme paracetamol-innholdene av en rekke blodprøver. En rutinemessig spektrofoto-metrisk analyse for paracetamol ble også utført, og resultatene av de forskjellige analyser er angitt i tabell 3 nedenfor (en strek indikerer at operatøren ikke analyserte angjeldende prøve).

Det påpekes at på farvesammenligningsstandarden i det an-vendte prøveutstyr var de ventede farver for paracetamolnivåer på 0, 50, 100, 200 og 300 [ i g/ ml vist.

Dette viser at bestemmelsesmetoden ifølge oppfinnelsen gir resultater sammenlignbare med standard spektrofotometriske metoder, med en tilstrekkelig nøyaktighet til å bestemme enten behandling trenges, og man oppnår disse resultater hurtigere og under anvendelse av relativt enkelt utstyr.

Det påpekes at skjønt foreliggende fremgangsmåte er beskrevet med referanse til bestemmelse av paracetamolinnholdet i menneskeblod, er fremgangsmåten like anvendbar for å bestemme paracetamolinnholdet i andre væsker. Eksempelvis kan de anvendes i forbind-else med andre menneskelige legemsvæsker som spytt, eller med andre legemsvæsker av andre dyr.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av paracetamol i blod,karakterisert ved, at en prøve av blodet som skal undersøkes, deproteihiseres, og det dannede deproteiniserte væskeskikt fraskilles, omsettes med et overskudd av salpetersyrling og gjøres alkalisk ved tilsetning av et passende alkali, slik at paracetamol som er tilstede i den opprinnelige blodprøve, bevirker en gul farve i den behandlede prøve, og intensiteten av den gule farve av den behandlede prøve bedømmes ved sammenligning med en standard for å bestemme konsentrasjonen av paracetamol i den opprinnelige blodprøve.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat blodprøven deproteiniseres ved å tilsette en passende mengde trikloreddiksyre.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved. at en 2 ml prøve av menneskeblod deproteiniseres ved tilsetning av 3 ml 200 g/l trikloreddiksyre .

4- Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert vedat det deproteiniserte væskeskikt fraskilles ved filtrering.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 - /+, karakterisert vedat overskuddet av salpetersyrling fremstilles in situ ved innvirkning av en syre på et nit r it .

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert vedat salpetersyrlingen fremstilles in situ fra et alkalimetallnitrit og en syre.

7- Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved, at der som alkalimetallnitrit anvendes natriumnitrit.

8-Fremgangsmåte ifølge krav 5 - 7,karakterisert vedat der som syre for fri-gjøring av salpetersyrling fra nitratet anvendes fortynnet saltsyre.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 7>karakterisert vedat trikloreddiksyren anvendes i deproteiniseringstrinnet i en slik mengde at salpetersyrlingen dannes in situ ved tilsetning av en passende mengde natriumnitrit til det deproteiniserte væskeskikt.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1 - 9>karakterisert vedat efter fullstendig nitrosylering av paracetamolet som er tilstede i prøven, eventuelt overskudd av salpetersyrling fjernes ved tilsetning åv sulfaminsyre.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1-10,karakterisert vedat den deproteiniserte væske efter nitrosylering og eventuell påfølgende fjernelse av overskudd av salpetersyrling, bringes til en pH over 10 ved tilsetning av et passende alkali.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1-11,karakterisert vedat der som alkali anvendes en alkalimetallbase.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert vedat der som alkalimetallbase anvendes nat riumhydroxyd .

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1 - 13,karakterisert vedat standarden er i form av et kromatografisk referanseobjektglass som viser farvene erholdt fra prøver med kjent paracetamolinnhold.

15- Fremgangsmåte for å skille en rekke blodprøver i to eller flere grupper hvor hver gruppe har et tilsvarende, forutbestemt område av paracetamolinnhold,karakterisert vedat blodprøvene behandles på lignende måte, idet behandlingen omfatter deproteinisering av blodprøven og fraskillelse av det dannede deproteiniserte væskeskikt, den deproteiniserte væske så omsettes med et overskudd av salpetersyrling og gjøres alkalisk ved tilsetning av et passende alkali, slik at eventuelt tilstedeværende paracetamol i den opprinnelige blodprøve bevirker dann-elsen av en gul farve i den behandlede prøve, og at intensiteten av den gule farve av hver behandlet prøve bedømmes, ved sammenligning med en standard, for å bestemme konsentrasjonen av paracetamol i den tilsvarende opprinnelige blodprøve, og at de behandlede prøver henføres til de passende grupper på basis av den b'edømte f arveintensit et . l6. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat behandlingen av prøvene og bedømmelsen av de behandlede prøver utføres som angitt i krav 2 - 14.