NO753005L - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for kondisjonering av

bakterieceller inneholdende glucose-i someraséaktivi tet

Det er-kjent at et glucose-isomeraseenzym kan anvendes for å katalysere omdannelsen av glucose (dextrose) til fructose (levulose) som har en hoyere sotningsstyrke enn utgangsmaterialet. Det er også kjent at glucoseisomerase produseres ved dyrkning av forskjellige bakterier, slik som Streptomyces flavovirens, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenus, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus og lignende i egnet næringsmedium. Glucoseisomerasen dannes primært på innsiden av bakteriecellene som vokser under dets fremstilling. Enkelte stammer produserer en betydelig mengde ekstracellulært enzym. Det foretrekkes generelt at der er neglisjerbar ekstracellulær enzymaktivitet. Cellene kan derefter filtreres fra fermenteringsvæsken og anvendes direkte som en kilde for glucoseisomerase.

Det er Snskelig at bakteriecellene med glucoseisomeraseaktivitet er istand til å kunne.anvendes i en kontinuerlig prosess for isomerisering av glucose til fructose. Forskjellige teknikker er beskrevet innen faget for immobilisering . av enzymet slik at det kan anvendes pånytt i en kontinuerlig prosess. En foretrukken

teknikk er å behandle bakteriecellene med gluta raldehyd. Denne behandling immobiliserer glucoseisomerasen innen cellene og mulig-gjor at cellene kan anvendes i en omrort reaktor eller i en isome-riseringskolonne. Det er imidlertid funnet at hvis ikke bakterie-. cellene med immobilisert glucoseisomeraseaktivitet er. blitt omhyggelig kondisjonert for anvendelse som isomeriseringskatalysatorer, vil de ha utilfredsstillende fysikalsk stabilitet som svekker ko-lonnens hydrauliske karakteristika, den resulterende isomeriserte sirup kan ha uonsket farve, og enzymlevetiden kan bli uonsket ned-satt..

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for kondisjonering av bakterieceller med glucoseisomeraseaktivitet for

I éfterfolgende bruk for å fremstille et fructoseholdig produkt,

hvilken fremgangsmåte omfatter (a) blanding av bakteriecellene ved 10 - 27°C med vann eller en vandig dextroseopplosning ved en pH på

ca. 8 målt ved 25 °C inntil cellene er hydratisert og pH bragt i likevekt, og (b) foring av en vandig dextroseopplosning opp gjennom et skikt av slike bakterieceller ved en temperatur på ca. 60°C og ved en pH på 7,5 - 8,0 målt ved 60°C inntil avlopsopplosningen er klar og pH er stabilisert ved 7,5 - 8,0 målt ved 60°C, eller foring av vann ved en temperatur på IO - 27°C og ved en pH på 8,0 målt ved 25°C opp gjennom et skikt av slike bakterieceller inntil avlopopplosningen er klar og pH derav er stabilisert til 8,0 målt . ved 25°C efterfulgt av foring av en vandig dextroseopplosning opp gjennom skiktet ved en temperatur på ca. 60°C inntil avlopopplosningen har samme dextroseinnhold som den inngående dextroseopplosning.

Bakteriecellene med glucoseisomeraseaktivitet som er anvendbare ifolge foreliggende oppfinnelse, kan produseres efter velkjente metoder. De foretrukne enzymholdige celler produseres ved dyrkning under submerse aerobe betingelser av en kultur av Streptomyces olivaceus NRRL 3583 eller mutanter derav i et medium inneholdende egnede- næringsmidler. De resulterende bakterieceller separeres fra fermenteringsvæsken ved filtrering eller sentrifu-gering.

Forskjellige velkjente metoder kan anvendes for å immo-bilisere glucoseisomerasen. I en foretrukken teknikk suspenderes de gjenvundne bakterieceller i et vandig medium og blandes med glutaraldehyd i en mengde på fra ca. 0,1 til ca. 50 vekt%, basert på cellenes torrvekt.

Da de enzymholdige behandlede bakterieceller vanligvis produseres på et annet sted og ved et tidligere tidspunkt enn når de trenges til å produsere isomerisert sirup,torkes cellene hensiktsmessig for lagring og transport. Slik torking til et fuktighetsinnhold på ca. 3 - 10 vekt% kan utfores i en hvilken som helst egnet torker ved en temperatur på 60 - 70°C. De resulterende agglomererte torrede celler sorteres derefter omhyggelig for efterfolgende bruk i et kolonneskikt. Den agglomererte, torrede celle-masse brytes hensiktsmessig opp i mindre stykker med minimal på-kjenning på de individuelle celler, og stykkene oppsamles på siler under dannelse av en fraksjon som bibeholdes på en 60 mesh sikt,

og som passerer gjennom en 20 mesh sikt.

Når de således fremstillede agglomerater av bakterieceller skal anvendes ved fremstilling av fructoseholdig sirup fra dextrose, har det tidligere vært praksis å plasere cellene i en kolonne og starte foringen av dextroseopplosningen ned gjennom kolonnen under de onskede -temperatur- og pH-betingelser. Generelt tar det betydelig tid for isomerisasjonsreaksjonen stabiliseres til en relativt konstant tilstand. Under dette tidsrom har den resulterende isomeriserte sirup en uonsket farve. Der er også funnet at den anvendbare levetid for cellene er uonsket kort.

Ifolge foreliggende oppfinnelse blandes forst cellene med vann eller en vandig dextroseopplosning. Den sistnevnte opplosning kan bestå av dextrose opplost i vann. Fortrinsvis består den av en forsukret dextroseopplosning fremstillet ved enzymatisk omdannelse av stivelse. Denne dextroseopplosning skal inneholde ca. 30 - 50 vekt% opploste faste bestanddeler, og slike faste bestanddeler skal inneholde ca. 93 96 vekt% dextrose. Denne dextroseopplosning har også en dextrose-ekvivalent på 97 - 98. Denne vann- eller dextroseopplosning anvendes i en mengde på ca. IO vektdeler pr. vektdel av torkede celler. Vann- eller dextroseopplosningen har også en temperatur på 10 - 27°C. Denne vann- eller dextroseopplosning skal også inneholde ca. 0,0005 molar konsentrasjon av cobolt, slik som coboltklorid, ca. 0,005 - 0,007 molar konsentrasjon av magnesium, slik som magnesiumhydroxyd, og ca. 0,01 normal konsentrasjon av et gelatinerende og bufrende middel, slik som sitronsyre. Sitronsyre foretrekkes, da det danner et opploselig chelatkompleks med cobolt og magnesiumionene og medvirker til å bufre vann- eller dextroseopplosningen til den onskede pH. Denne vann- eller dextroseopplosning skal ha en pH på 8, målt ved 25°C, og en slik pH oppnåes hensiktsmessig ved tilsetning av egnet mengde natriumhydroxyd. Cellene og vann- eller dextroseopplosningen holdes i kontakt med minimal omroring ca. 1 time for at cellene skal bli omhyggelig hydratisert, og pH bragt i likevekt.

Oppslemmingen av celler og vann-, eller dextroseopplosning fra det ovenfor angitte trinn overfores defefter til en egnet mantelforsynt reaktorkolonne under dannelse av et skikt med sedimentert dybde på ca. 89 - 100 cm. Minimum omroring av opp slemmingen bor anvendes for å redusere enhver mekanisk odeleggelse av. celleagglomeratene. I en ut f drelsesf orm av oppfinnelsen fores en dextroseopplosning med den samme sammensetning som den ovenfor beskrevne dextroseopplosning, og med en pH på 7,5 - 8,0 målt ved 60°C ved ca. 60°C opp gjennom celleskiktet med en hastighet på 53-61 liter/m av skikttverrsnitt/minutt. Dette er en stromningshastighet som fremkaller ca. 50 - 60 volum% okning åv det sedimenter-te volum celleagglomerater. Den bevirker også den onskede klassi-fisering og omordning av celleagglomeratene.såsnart dextroseopplosningen begynner å trenge inn i skiktet, fores en egnet varmevæske ved 60°C gjennom kolonnemantelen. Avlopopplosningen fra ko-lonnens topp har en betydelig mengde farvelegemer, fordi den inneholder forskjellige rester fra bakteriecellene. Den varme dextroseopplosning skal fores opp gjennom kolonnen inntil overlopet blir klart, og inntil pH på avlopet stabiliseres ved 7,5 - 8,0 målt ved 60°C. Dette krever ca. 2-3 skiktvolumer opplbsning pr. time i

ca. 1-3 timer.

Dextroseopplosningsstrommen stoppes derefter, og celleskiktet tillates å sedimentere. For å redusere mengden av nodven-dig dextroseopplosning for slik kondisjonering kan mesteparten av dextroseopplosningavlopet, unntatt det sterkt farvede startmateri-ale, resirkuleres gjennom kolonnen. Det resirkulerte materiales . pH må justeres til 7,5 - 8,0 målt ved 60°C ved tilsetning av alkali for det anvendes pånytt. I en alternativ utforelsesform av oppfinnelsen behandles cellene i reaktorkolonnen forst ved at en vannopplosning med samme sammensetning som den ovenfor beskrevne vannopplosning fores ved en temperatur på 10 - 27°C og en pH på 8,0 målt ved 25°C opp gjennom celleskiktet inntil avlopopplosningen er klar og pH er stabilisert på 8,0 målt ved 25°C, hvorefter en vandig dextroseopplosning med samme sammensetning som den ovenfor beskrevne dextroseopplosning fores opp gjennom skiktet ved 60°C og ved en pH på 7,5 - 8,0 målt ved 60°C inntil avlopopplosningen har det samme dextroseinnhold som den inngående dextroseopplosning.

Under den ovenfor beskrevne behandling resirkuleres vannopplosningen og den vandige dextroseopplosning gjennom skiktet. Det resirkulerte materiales pH justeres til det onskede nivå ved tilsetning av alkali for det anvendes pånytt.

Alt av dextroseopplosningene som kommer i kontakt med -bakteriecellene med glucoseisomeraseaktivitet vil. inneholde noe fructose dannet ved en isomeriseringsreaksjon. Derfor kan den dextroseopplosning som anvendes i de ovenfor beskrevne kondisjoner-ingstrinn avfarves med carbonbehandling, demineraliseres med ione-byttermaterialer og anvendes senere som komponenter i fructosehol-dige produkter.

Cellene kondisjonert ved den ovenfor angitte prosess kan derefter anvendes på velkjent måte til å fremstille isomerisert sirup. En dextroseopplosning med.den ovenfor beskrevne sammensetning kan stromme gjennom skiktet ved en pH på ca. 8 og en temperatur på ca. 60°C for å produsere et produkt inneholdende ca. 42-48 vekt% fructose, avhengig av stromningshastigheten. Celleagglomerater kondisjonert ifolge foreliggende oppfinnelse utviser en uventet hoy fysikalsk stabilitet og gode hydrauliske karakteristika ideelt egnet for anvendelse i relativt dype skikt (76 - 102 cm). I motsetning til denne må celler som er behandlet ifolge kjente metoder begrenses til anvendelse i grunne skikt (ca. 1,3 - 10,2 cm) med ekstremt store overflatearea1.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere i de efterfolgende eksempler.

Eksempel 1

En fermenteringsopplosning inneholdende Streptomyces olivaceus NRRL 3533 bakterieceller ble erholdt ved dyrkning ,av slike celler i et xyloseholdig medium på kjent måte. Fermenter-ings opplosni ngen ble derefter justert til pH på 8,2 ved tilsetning av natriumhydroxyd. Eri 1 %'s (vekt/volumbasis) vandig opplosning av glutaraldehydet ble tilsatt til fermenteringsopplSsningen i en

mengde på 7 vekt% glutaraldehyd basert på torrvekten av cellene i opplosningen. Den resulterende blanding ble.omrbrt 1 1/2 time

under hvilket tidsrom natriumhydroxyd ble. tilsatt for å holde pH ved 8,2. Cellene ble derefter filtrert, vasket ved pH 8, og derefter torket ved 60 - 70°C til et fuktighetsinnhold på 3 - 10 vekt%. Denne torrede filterkake av agglomererte celler ble derefter brutt opp, og de oppbrutte stykker ble oppsamlet på sikter for å oppnå en fraksjon som ble bibeholdt på en 60 mesh sikt, og som passerte gjennom en 20 mesh sikt. De resulterende, omhyggelig sorterte torrede agglomerater av bakterieceller inneholden-

dé immobilisert glucoseisomerase ble derefter lagret ved romtempe-ratur for videre bruk.

En 300 g's porsjon av de ovenfor lagrede celler ble blandet med en vandig dextrosesirup fremstillet ved enzymatisk behandling av stivelse.. Denne sirup hadde en dextr ose-ekviva lent på 97 og inneholde 30 vekt% opplost fast materiale, hvilket materiale inneholdt 94 vekt% dextrose. Denne sirup forelå ved en temperatur på 10 - 27°C og ble anvendt i en mengde på 10 vektdeler pr. vektdel torrede celler. Denne sirup inneholdt også ca. 0,O005 molar konsentrasjon av coboltklorid, ca. 0,0005 -0,0007 molar konsentrasjon av magnesiumhydroxyd og ca. 0,01 normal konsentrasjon av sitronsyre. Tilstrekkelig natriumhydroxyd ble også tilsatt for å holde pH på dextrosesirupen på 8, målt ved 25°C. Cellene ble holdt i kontakt med dextroseopplosningen ca,.1 time for at cellene skulle bli omhyggelig hydratisert, og pH bragt i likevekt.

Den resulterende oppslemming av celler og dextroseopplosning ble derefter overfort til en reaktor med diameter 3,81 cm og utstyrt med varmemantel under dannelse av et celleskikt med sedimentert dybde på ca. 89 - 100 cm. Minimum omroring av oppslemmingen ble anvendt for å redusere enhver mekanisk, skade på de hydratiserte celler. Dextroseopplosning med den samme sammensetning som ovenfor beskrevet, og med en pH på 7,5 - 8,0 målt ved 60°C ble fort ved 60°C opp gjennom celleskiktet med en hastighet på 53 - 61 liter/ m 2 skikttverrsnittareal/minutt. • såosnar<t>dextroseopplosningen begynte å trenge inn i skiktet, ble en egnet varmevæske ved 60°C fort gjennom mantelen i kolonnen. Den varme dextroseopplosning ble fort opp gjennom kolonnen i ca. 1 time inntil overlopet var klart, og inntil avlbpets pH var stabilisert ved 7,5 - 8,0 målt ved 60°C. Dextroseopplosningsstrommen ble derefter stoppet, og celleskiktet fikk sedimentere 15 - 20 minutter. Under den ovenfor beskrevne kondisjoneringsprosess ble dextroseopplosningen resirkulert gjennom celleskiktet. pH på den dextroseopplosning som ble resirkul-lert ble holdt ved 7,5 - 8,0 målt ved-60°C ved tilsetning av natriumhydroxyd. Hvis pH ville bli tillatt å falle under ca. 7, målt ved 60°C under kondisjoneringen, ville fysikalsk skade av celleagglomeratene være resultatet.

Celleskiktet" var derefter klart for bruk til å isomerisere dextrose til fructose. En dextroseopplosning med den samme sammensetning som ovenfor beskrevet fikk stromme nedover ved hjelp av tyngdekraften under et fremtrykk på 10,2 - 15,2 cm opplbsning gjennom skiktet ved en temperatur på 60°C og en hastighet på 1,5 skiktvolumer pr. time. Dette er en stromningshastighet på ca. 22 liter/m skikttverrsnittareal/time. Dextroseopplosningens pH ble holdt ved 8, målt ved 60°C ved tilsetning av natriumhydroxyd. En isomerisert sirup inneholdende 42 - 43 vekt% fructose (basert på vekten av de opploste faste materialer), uten farve, og ikke inneholdende noe psicose, ble fremstillet. Når dextrosesirupens stromningshastighet ble forandret til 1,1 skiktvolum/time (16,3 liter/ m 2/time) ble der fremstillet et produkt inneholdende 45 - 46 vekt% fructose (basert på vekten av de opploste faste bestanddeler), uten farve og ikke inneholdende noe psicose.

Det ovenfor angitte celleskikt ble anvendt kontinuerlig for isomerisering i over lOOO timer, og celleagglomeratenes aktivi-tet ble bare ubetydelig redusert. Celler innen teknikkens stand som ikke var blitt kondisjonert ifolge foreliggende oppfinnelse ville miste minst halvparten av sin enzymaktivitet efter 500 - 600 timers kontinuerlig bruk. •

Eksempel 2

En 300 g porsjon av omhyggelig sorterte torrede agglomerater av bakterieceller inneholdende immobilisert glucoseisomerase ble fremstillet ifolge den innledende del av eksempel 1. En vannopplosning inneholdende ca. 0,0005 molar konsentrasjon coboltklorid, ca. 0,005 - 0,007 molar konsentrasjon magnesiumhydroxyd og ca. 0,01 normal konsentrasjon sitronsyre og tilstrekkelig natriumhydroxyd til å holde pH ved 8, målt ved 25°C, ble fremstillet. De torrede celler ble derefter blandet med denne vannopplosning ved 10 - 27°C i en mengde på 10 vektdeler vannopplosning pr. vektdel torrede celler. Cellene ble holdt i kontakt med vannopplbsningen ca. 1 time for å tillate at cellene ble omhyggelig hydratisert,

og for at pH skulle bli bragt i likevekt.

Den resulterende oppslemming av celler -og vannopplosning ble derefter overfort til en egnet reaktorkolonne med diameter 3,81 cm og utstyrt med varmemantel under dannelse av et celleskikt med en sedimentert dybde på ca. 100 cm. Minimal omroring av oppslemmingen ble anvendt for å redusere enhver mekanisk skade på de hydratiserte celler. En vannopplosning med samme sammensetning

som ovenfor beskrevet, og med en pH på 8,0, målt ved 25°C, ble

t fort ved 10 - 27°C opp gjennom celleskiktet med en hastighet på 53 - 61 liter/m. skikttverrsnittareal/minutt. Vannopplbsningen ble

fort oppover gjennom kolonnen ca. 1 time inntil utstroraningen var klar, og inntil avlopets pH var stabilisert ved 8,0, målt ved 25°C. Vannopplosningsstromningen ble derefter stoppet. En dextroseopplosning som beskrevet i eksempel 1 ved 60°C og med en pH på 7,5 - 8,0, målt ved 60°C, ble derefter fort opp gjennom celleskiktet med en hastighet på o 53 - 61 liter/m 2 skikttverrsnittareal/minutt inntil avlopopplSsningen fra skiktet hadde det samme dextroseinnhold som den inngående dextroseopplosning. Såsnart dextroseopplosningen begynte å trenge inn i skiktet, ble en egnet varmevæske ved 60°C fort gjennom mantelen i kolonnen. Dextroseopplosningsstromningen ble derefter stoppet, og celleskiktet fikk sedimentere 15 - 20 minutter. Under den ovenfor angitte kondisjoneringsprosess ble

vannopplosningen og den efterfolgende dextroseopplosning resirkulert gjennom celleskiktet. pH på vannoppKsningen og den ef terf ol-gende dextroseopplosning som ble resirku,lert, ble holdt på hen-holdsvis 8, målt ved 25°C, og 7,5 - 8,0, målt ved 60°C ved tilsetning av natriumhydroxyd.

Det resulterende kondisjonerte celleskikt ble derefter anvendt for å isomerisere rextrose til fructose på den måte som er beskrevet under eksempel 1 under dannelse av en isomerisert sirup inneholdende ca. 42 - 43 vekt% fructose, uten farve og ikke inneholdende noe psicose. Det ovenfor kondisjonerte celleskikt hadde en Snskelig lang levetid.

Claims (6)

1- Fremgangsmåte .for kondisjonering av bakterieceller med glucoseisomeraseaktivitet for efterfolgende anvendelse ved fremstilling av et fructoseholdig produkt, karakterisert ved at (a) bakteriecellene ved 10 - 27°C blandes med vann eller en vandig dextroseopplosning ved en pH på 8, målt ved 25°C,inntil cellene er hydratisert og pH bragt i likevekt, og (b) en vandig dextroseopplosning fores opp gjennom et skikt av slike bakterieceller ved en temperatur på 60°C og en pH på 7,5 - 8,0, målt ved 60°C, inntil avlopopplosningen er klar og pH er stabilisert ved 7,5 - 8,0 ved 60°C, eller vann ved en temperatur på. 10 - 27°C og en pH på 3,0, målt ved 25°C, fores opp gjennom et skikt av slike bakterieceller inntil avlopopplosningen -er klar og pH er stabilisert ved 8,0, målt ved' 25°C, hvorefter en vandig dextroseopplosning fores opp gjennom skiktet ved en temperatur på 60°C og en pH på 7,5 - 8,0, målt ved 60°C, inntil avlopopplosningen har det samme dextroseinnhold som den inngående dextroseopplosning.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at den vandige dextroseopplosning anvendt i trinn (a) og (b) har en dextrose-ekvivalent på 97 - 98 og inneholder 30 - 50 vekt% opploste faste bestanddeler, hvilke faste bestanddeler inneholder 93 - 96 vekt% dextrose.

3. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at bakteriecellene med glucoseisomeraseaktivitet på forhånd er blitt behandlet med glutaraldehyd.

4. Fremgangsmåte ifolge krav 3, karakterisert ved at de glutaraldehyd-behandlede celler på forhånd er blitt torket og sortert til å bibeholdes på en 60 mesh sikt og passere gjennom en 20 mesh sikt.

5. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at vann- eller den vandige dextroseopplosning i trinn (b) fores opp gjennom skiktet av bakterieceller med en hastighet på 53-61 liter/m skikttverrsnittsareal/minutt.

6. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at vann- eller den vandige dextroseopplosning inneholder 0,0005 molar konsentrasjon cobolt, 0,005 - 0,007 molar konsentrasjon magnesium og 0,01 normal konsentrasjon sitronsyre.