NO341310B1

NO341310B1 - En mortierella alpina C16/18 fettsyreelongase

Info

Publication number: NO341310B1
Application number: NO20082224A
Authority: NO
Inventors: Quinn Qun Zhu; Zhixiong Xue; Daniel Joseph Maccol
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2005-10-19
Filing date: 2008-05-14
Publication date: 2017-10-02
Also published as: WO2007046817A1; KR20080068074A; AU2005337476A1; EP1937704B1; EP1937704A1; CN101563356A; JP4786715B2; CA2622398A1; CN101563356B; JP2009512437A; US20070087420A1; US7470532B2; CA2622398C; DK1937704T3; NO20082224L; AU2005337476B2; EP1937704A4

Description

FELT FOR OPPFINNELSEN

Denne oppfinnelse er innenfor feltet bioteknologi. Mer spesifikt så vedrører denne oppfinnelse isoleringen og karakteriseringen av et nukleinsyrefragment som koder for et Ci6/i8fettsyre elongaseenzym som er nyttig for å øke produksjonen av stearinsyre i oljeaktige mikroorganismer.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Olje biosyntese i en celle refererer generisk til syntesen av triacylglyceroler (TAGer) hvor TAGer er definert som nøytrale lipider som består av tre fettacylresiduer som er esterifisert til et glyserolmolekyl. Like oljer kan inneholde et hvitt spekter med fettsyrer, inkludert mettede og umettede fettsyrer og kortkjedede og langkjede fettsyrer. Og ikke overraskende så påvirker flere faktorer mengden av olje som produseres og dets slutt-fettsyrersammensetning innen en spesifikk mikrobe.

Selv om tradisjonelle tilnærmingsmåter (for eksempel kryssing) og genetiske konstruksjonstilnærmingsmåter har hvert vellykket brukt til å produsere oljefrøplanter som har forbedret oljeinnhold [vist ved den kommersielle tilgjengeligheten av for eksempel høy laurat kanola, høy stearat kanola, høy olein soyabønner og høy olein mais], så er ikke lignende manipulering av oljeinnhold i oljeaktige mikrober blitt signifikant etterfulgt i fortiden. Nylige anstrengelser for å konstruere mikrober som har evnene til kommersielt å produsere langkjede co-3 og/eller co-6 polyumettede fettsyrer ("PUFAr"; for eksempel 18:3, 18:4, 20:3, 20:4, 20:5, 22:6 fettsyrer) innen deres olje-fraksjon har imidlertid skapt et behov for fremgangsmåter for å øke karbonstrømning inn i lipidmetabolismen.

Lipidmetabolisme i de fleste organismer katalyseres av et multi-enzym fettsyresyntase-kompleks ("FAS") og finner initielt sted ved kondenseringen av åtte to-karbon-fragmenter (acetylgrupper fra acetyl-CoA) som danner palmitat, en 16-karbonmettet fettsyre (Smith, S. FASEB J, 8(15) 1248-59 (1994)). Med en gang fritt palmitat (16:0) er frigjort fra FAS så gjennomgår molekylet enten elongering (dvs. via en C16/18fettsyreelongase til å produsere stearinsyre (18:0)) eller av metning (dvs. via en A9 desaturase til å produsere palmitoleinsyre (16:1)). Alle andre fettsyremolekyler syntetiseres fra disse to metabolske forløperne. Fordi den primære skjebnen til palmitat er elongering så er det imidlertid konkludert (mens avmetting kun er en mindre reaksjon i de fleste organismer), at C16/18fettsyreelongaser spiller en viktig rolle i å bestemme total karbonstrømning inn i den fettsyrebiosyntetiske reaksjonsveien og spiller dermed en bestemmende rolle i både mengden og sammensetningen av olje som produseres.

WO 00/12720 vedrører identifiseringen av forskjellige gener involvert i forlengelsen av langkjedede polyumettede fettsyrer, dvs. elongaser og anvendelser derav. Den isolerte nukleotidsekvensen som angis koder for en funksjonelt aktiv elongase som benytter en polyumettet fettsyre eller en monoumettet fettsyre som substrat. Sekvensen kan avledes fra en sopp av slekten Mortierella og kan spesifikt isoleres fra Mortierella alpina.

En rekke fettsyreelongaser er blitt isolert ogkarakteriserti de siste årene. For eksempel så er en nyttig oversikt som diskuterer elongeringen av langkjede fettsyrer i gjær, pattedyr, planter og lavere eukaryoter den til Leonard, A E, et al (Prog Lipid Res 43 36-54

(2004)). Tabell 1 til Leonard et al tilveiebringer en oppsummering av fettsyreelongase-gener, GenBank tilgangsnummerne og reaksjonen som hvert enzym katalyserer (dvs. fra S. cervisiae [ELOl, EL02, EL03], human, mus [Elovi, Elov2, Elov3, Elov4, Lee], rotte [rELOl, rEL02], Caenorhabditis elegans [CEELOl], Mortierella alpina [GEELO, MAELO], Isochrysis galbana [IgASEl] og Physcomitrellapatens [PSE1]). Tilleggsfettsyre elongaser som er blitt beskrevet og funksjoneltkarakterisertinkluderer de fra Ostreococcus tauri [OtELOl , OtEL02], Thalassiosira pseudomana [TpELOl , TpEL02], Xenopus laevis [XIELO] og Oncorhynchus mykiss [OmELO] (Meyer, A , et al, J. Lipid Res 45(10) 1899-1909 (2004)), Thraustochytrium aureum (U S 6.677.145), Ppatens [pavELO] (Pereira, S et al, Biochem J 384 357-366 (2004)), og Caenorhabditis elegans CeEL02 (Kniazeva, M et al, Genetics 163 159-169 (2003)). Imidlertid så er det kun rotte rEL02 og C. elegans CeEL02 elongasene som er klassifisert som Ci6/i8fettsyreelongaser som har den passende substratspesifisiteten til å muliggjør omdannelse av palmitat til stearinsyre. Dermed så var det ønskelig her å identifisere og å karakterisere en ny C16/18 fettsyreelongase for å ha en måte til å tillate oppreguleringen av karbonstrøm inn i lipidmetabolismen i en oljeaktig mikrobe ved å anvende teknikkene innenfor genetisk konstruksjon.

Søkerne har løst det fastsatte problemet ved å isolere genet som koder for en C16/18 fettsyreelongase fra Mortierella alpina og å vise økt omdannelse av 16:0 til 18:0 ved å overuttrykke genet i den oljeaktige gjæren Yarrowia lipolytica. Dette muliggjorde øket PUFA innhold i den mikrobielle oljen og øket oljebiosyntese.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen vedrører et gen som koder for et Ci6/i8fettsyreelongaseenzym som er isolert fra. Mortierella som er nyttig for manipuleringen av den biokjemiske reaksjonsveien som fører til konstruksjonen av mikrobielle oljer og spesielt i oljeaktig gjær.

Følgelig så tilveiebringer oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som koder for et C16/18fettsyre elongaseenzym, kjennetegnet ved at enzymet har minst 90 % identitet med en aminosyresekvens som satt frem i SEK ID NR: 2, eller et isolert nukleinsyremolekyl som er fullstendig komplementært dertil.

I tillegg så tilveiebringer oppfinnelsen polypeptider som kodes for av de isolerte nukleinsyremolekylene i oppfinnelsen, genetiske kimære og vertsceller som uttrykker det samme.

I en lignende utførelsesform så tilveiebringer oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som omfatter a) en nukleotidsekvens som koder for et C16/18fettsyreelongaseenzym på minst 275 aminosyrer som har minst 90 % identitet basert på BLAST fremgangsmåten på oppstilling når den sammenlignes med polypeptid som har sekvensen satt frem i SEK ID NR: 2, eller b) en nukleotidsekvens som omfatter komplementet til nukleotidsekvensen i a).

I tillegg så blir det tilveiebrakt fremgangsmåter for produksjonen av stearinsyre som omfatter

a) å tilveiebringe en oljeaktig gjær som omfatter en isolert nukleinsyre som koder for et polypeptid som har C16/18fettsyreelongaseaktivitet som definert heri under

kontrollen av passende regulatoriske sekvenser,

b) å tilveiebringe en kilde for elongasesubstrat som omfatter palmitat,

c) å dyrke den oljeaktige gjæren fra trinn (a) med elongasesubstratet i (b) under betingelser hvor stearinsyre blir produsert og

d) valgfritt å gjenvinne stearinsyren i trinn (c).

På samme måte så tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for produksjonen av

polyumettede fettsyrer som omfatter

a) å tilveiebringe en oljeaktig gjær som omfatter

(I) et isolert nukleinsyrefragment som koder for et polypeptid som har Ci6/i8fettsyreelongaseaktivitet som definert heri, og (II) gener som koder for en funksjonell polyumettet fettsyre biosyntetisk

reaksjonsvei,

b) å tilveiebringe en kilde for elongasesubstrat som omfatter palmitat,

c) å dyrke den oljeaktige gjæren i trinn (a) med elongasesubstratet i (b) under betingelser hvor polyumettede fettsyrer produseres og

d) valgfritt gjenvinne de polyumettede fettsyrene i trinn (c).

Det er også beskrevet en mikrobiell olje produsert ved hjelp av fremgangsmåten i

oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE OG SEKVENSBESKRTVELSEN

Fig. 1 representerer grafisk forholdet mellom SEK ID NR: 1, 2, 7, 14, 17, 18, 19 og 29 som hver relaterer til C16/18fettsyreelongaseenzymet (EL03) { Mortierella alpina. Fig. 2 tilveiebringer plasmider for følgende (A) pZF5T-PPC, (B) pZUF6S, og (C) pZUF6S-E3WT

Fig. 3 illustrerer den PUFA biosyntetiske reaksjonsveien og forløperne.

Oppfinnelsen kan mer fullstendig forstås fra den følgende detaljerte beskrivelsen og de medfølgende sekvensbeskrivelsene som danner en del av denne søknad.

De følgende sekvensene overholder 37 C F R §1,821-1 825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") og er i overensstemmelse med World Intellectual Property Organization (WIPO) Standard ST 25 (1998) og sekvensopplistingskravene til EPO og PCT (Regler 5 2 og 49 5(a-bis), og Seksjon 208 og Annex C i de administrative instruksjonene. Symbolene og formatet anvendt for nukleotid og aminosyresekvensdata overholder reglene som er satt frem i 37 C F.R §1 822.

SEK ID NR: 1, 2, 7, 14, 17-22 og 25-28 er ORF kodende gener eller proteiner (eller deler av dem) eller plasmider som identifisert i tabell 1.

SEK ID NR: 3, 4 og 5 korresponderer til BD-Clontech Creator Smart<®>cDNA bibliotek kitt primerne SMART IV oligonukleotid, CDSIII/3' PCR primer og 5'-PCR primer

SEK ID NR: 6 korresponderer til Ml 3 fremover primeren anvendt for cDNA biblioteksekvensering.

SEK ID NR: 8 og 9 korresponderer til Genome Walker adapteren fra ClonTech's Universal Genome Walker™ Kitt, anvendt for genomspasering for å isolere den 3' enderegionen tilM. alpina EL03.

SEK ID NR: 10-13 korresponderer til henholdsvis primerne MA Elong 3'1, API, MA elong 3'2 og AP2 anvendt for genomspasering for å isolere den 3'-enderegionen avM alpina ELO 3.

SEK ID NR: 15 og 16 korresponderer til henholdsvis primerne MA Elong 5'1 og MA Elong 5'2 anvendt for genomspasering for å isolere den 5' enderegionen tilM alpina EL03.

SEK ID NR: 23 og 24 korresponderer til henholdsvis primere MA ELONG 5' Ncol 3 og MA ELONG 3' Noti 1, anvendt for å omformere det fullstendige EL03 fraM alpina cDNA.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Søkerne har isolert et Mortierella alpina gen som koder for en Ci6/i8fettsyreelongase som er ansvarlig for omdannelsen av palmitat til stearinsyren. Dette gen (identifisert her som "EL03") kan være nyttig for å forandre mengden av langkjede polyumettede fettsyrer (PUFA) som blir produsert i oljeaktig gjær, slik som Yarrowia lipolytica.

Viktigheten av PUFA er udiskutabel. For eksempel så er visse PUFAer viktige biologiske komponenter i friske celler og er anerkjente som "essensielle" fettsyrer som ikke kan syntetiseres de novo i pattedyr og i stedet må skaffes til veie enten i maten eller som utledes av videre avmetting og elongering i linoleinsyre (LA) eller a-linolensyre (ALA). I tillegg så produserer et høyt inntak av langkjedede co-3 PUFAer kardio-vaskulære beskyttende effekter (Dyerberg, J et al., Amer. J. Clin Nutr 28 958-966

(1975), Dyerberg, J et al, Lancet 2(8081) 117-119 (Juli 15, 1978), Shimokawa; H, World Rev Nutr Diet, 88 100-108 (2001), von Schacky, C, og Dyerberg, J., World Rev Nutr Diet, 88 90- 99 (2001)) Flere andre studier dokumenterer vidtrekkende helse-gevinster ved administrering av co-3 og/eller co-6 fettsyrer mot en rekke symptomer og sykdommer (for eksempel astma, psoriasis, eksem, diabetes, cancer). Som sådan så finner den foreliggende oppfinnelsen mange anvendelsesmuligheter. PUFAer eller derivater av dem, akkumulert ved hjelp av metodologien som er utgreiet her kan anvendes som diettsubstitutter, eller supplementer, spesielt i formuleringer for små barn, for pasienter som gjennomgår intravenøs næringstilførsel eller for å forhindre eller å behandle feilernæring. Alternativt så kan de rensede PUFAENE (eller derivater av dem) inkorporeres inn i matoljer, fett eller margariner som er formulert slik at i normal anvendelse så ville mottakeren motta den ønskede mengden for diett-supplementering. PUFAene kan også være inkorporert i småbarnformuleringer, næringssupplementer eller andre matprodukter og kan finne anvendelser som anti-inflammatoriske eller kolesterolsenkende midler. Valgfritt så kan sammensetningene anvendes for farmasøytisk anvendelse (human eller veterinær). I dette tilfellet så blir PUFAene generelt administrert oralt men de kan administreres ved hjelp av enhver rute hvor de kan absorberes på en vellykket måte, for eksempel parenteralt (for eksempel subkutant, intramuskulært eller intravenøst), rektalt, vaginalt eller tropikalt (for eksempel som en hudsalve eller lotion).

Supplementering av mennesker eller dyr med PUFAer produsert ved hjelp av rekombinante måter kan resultere i økte nivåer av de tilsatt PUFAene så vel som deres metabolske avkom. For eksempel så kan behandling med ARA resultere i ikke bare økte nivåer av ARA men også nedstrømsprodukter av ARA slik som prostaglandiner. Komplekse regulatoriske mekanismer kan gjøre det ønskelig å kombinere forskjellige PUFAer eller tilsett forskjellige konjugater av PUFAer for å forhindre, kontrollere eller overvinne slike mekanismer for å oppnå de ønskede nivåene av spesifikke PUFAer i et individ.

Definisjoner

I denne utgj øring så blir en rekke uttrykk og forkortelser anvendt. De følgende definisjonene blir tilveiebrakt:

"Åpen leseramme" forkortes ORF

"Polymerasekjedereaksjon" forkortes PCR

"American Type Culture Collection" forkortes ATCC

"Polyumettet fettsyre(r)" forkortes PUFA(er)

"Mikrobielle oljer" eller "enkel celleoljer" er de oljer som naturlig produseres av mikroorganismer (for eksempel alger, oljeaktig gjær og filamentøs sopp) i løpet av deres livstid. Disse oljer oppbevares generelt i cellen som "nøytrale lipider". Uttrykkene

"triasylglyserol", "olje" og "TAGer" refererer til nøytrale lipider som er sammensatt av tre fettasylresiduer som er esterefisert til et glyserolmolekyl (og slike uttrykk vil anvendes om hverandre gjennom den foreliggende utgreiingen her). Slike oljer kan inneholde korte eller langkjede mettede og umettede fettsyrer. "Olje biosyntese" refererer dermed generisk til syntesen av TAGer i cellen.

Uttrykket "fettsyrer" refererer til langkjede alifatiske syrer (alkanoinsyrer) av forskjellige kjedelengder, fra ca Ci 2 til C22(selv om både lengre og kortere kjedelengde-syrer er kjent). De predominante kjedelengdene er mellom Ci6og C22. Strukturen av en fettsyre er representert ved et enkelt benevningssystem av "XY", hvor X er det totale antallet karbon (C) atomer i den bestemte fettsyren og Y er antallet dobbeltbindinger. Tilleggsdetaljer som vedrører differensieringen mellom "mettede fettsyrer" mot "umettede fettsyrer", "mono umettede fettsyrer" mot "polyumettede fettsyrer" eller "PUFAer") og "omega-6 fettsyrer" (co-6 eller n- 6) mot "omeaga-3 fettsyrer" (co-3 eller M-3) blir tilveiebrakt i WO2004/101757.

Nomenklatur anvendt for å beskrive PUFAer i den foreliggende utgreiingen er vist under i tabell 2.1 kolonnen med tittel "stenografibetegnelse", så blir omegareferansesystemet anvendt for å indikere antallet karboner, antallet dobbeltbindinger og posisjonen av dobbelbindingen nærmest omegakarbonet, når de telles fra omegakarbonet (som nummereres 1 for dette formål). Det gjenværende av tabellen oppsummerer de vanlige navnene til co-3 og co-6 fettsyrer og deres forløpere, forkortelser som vil anvendes gjennom spesifikasjonen og hver forbindelses kjemiske navn.

Et "elongasesystem" refererer til et sett med fire enzymer som er ansvarlig for elongering av en fettsyrekarbonkjede for å produsere en syre som er to karboner lenger enn fettsyresubstratet som elongasesystemet virker på. Mer spesifikt så skjer prosessen med elongering i assosiasjon med fettsyresyntase, hvor CoA er acylbæreren (Lassner et al, The Plant Cell 8 281-292 (1996)). I det første trinnet som er funnet å være både substratspesifikt og også hastighetsbegrensende, så blir malonyl-CoA kondensert med et langkjedet acyl-CoA til å gi CO2og et P-ketoacyl-CoA (hvor acyIdelen er blitt elongert med to karbonatomer). For formålene her så vil et enzym som katalyserer den første kondenseringsreaksjonen refereres til heretter som en "elongase" eller en "fettsyreelongase". Påfølgende reaksjoner inkluderer reduksjon til P-hydroksyasyl-CoA, dehydrering til et enoyl-CoA og en andre reduksjon for å gi det elongerte asyl-CoA.

Som er velkjent i fagfeltet så kan fettsyreelongaser ha forskjellige substratspesifisiteter og selektiviteter, hvor "substratspesifisiteter" refererer til enzymets aktivitet når den møter et enkelt substrat og "substratselektivitet" beskriver seleksjonen av et bestemt substrat fra en substratblanding. For eksempel så vil en C16/18fettsyreelongase foretrekke et Ci6substrat, en C18/20fettsyreelongase vil foretrekke et Cissubstrat og en C20/22fettsyreelongase vil foretrekke et C20substrat. På samme måte så er en A9 fettsyreelongase i stand til å katalysere omdannelsen av LA og ALA til henholdsvis EDA og ETrA. Det er viktig å legge merke til at noen fettsyreelongaser har bred spesifisitet og dermed kan et enkelt enzym være i stand til å katalysere flere fettsyre-elongasereaksjoner (for eksempel å dermed virke som både en C16/18fettsyreelongase og en C18/20fettsyreelongase). I foretrukne utførelsesformer så er det mest ønskelig å empirisk bestemme spesifisiteten til en fettsyreelongase ved å transformere en passende vert med genet for fettsyreelongasen og å bestemme dets effekt på fettsyreprofilen til verten.

Innenfor sammenhengen med den foreliggende utgreiingen så refererer uttrykket "EL03" til et Mortierella alpina C16/18 fettsyreelongaseenzym (tilveiebrakt her som SEK ID NR 2), som kodet for av elo3 genet (SEK ID NR 1). Basert på data rapportert her så katalyserer EL03 helst omdannelsen av palmitat (16:0) til stearinsyre (18:0).

Uttrykket "desaturase" refererer til et polypeptid som kan avmette, det vil si introdusere en dobbelbinding i en eller flere fettsyrer for å produsere en mono eller polyumettet fettsyre. Til tross for anvendelsen av omegareferansesystemet gjennom spesifikasjonen i referanse til spesifikke fettsyrer så er det lettere å indikere aktiviteten av en desaturase ved å telle fra karboksylenden av substratet ved å anvende deltasystemet. Av spesiell interesse her er A9 desaturaser som katalyserer omdannelsen av palmitat til palmitoleinsyre (16:1) og/eller stearattil oleinsyre (18:1). Andre desaturaser som er relevante for den foreliggende utgreiingen inkluderer Al2 desaturaser som avmetter en fettsyre mellom det 12 og det 13 karbonatomet nummerert fra den karboksylterminale enden av molekylet og som katalyserer omdannelsen av oleinsyre til LA, Al 5 desaturaser som katalyserer omdannelsen av LA til ALA; Al 7 desaturaser som katalyserer omdannelsen av DGLA til ETA og/eller ARA til EP A, A6 desaturaser som katalyserer omdannelsen av LA til GLA og/eller ALA til STA, A5 desaturaser som omkatalyserer omdannelsen av DGLA til ARA og/eller ETA til EP A, A4 desaturaser som katalyserer omdannelsen av DPA til DHA og A8 desaturaser som katalyserer omdannelsen av EDA til DGLA og/eller ETrA til ETA.

Uttrykkene "omdannelseseffektivitet" og "prosent substratomdannelse" refererer til effektiviteten som et spesielt enzym (for eksempel en desaturase eller en elongase) kan omdanne substratet til produktet med. Omdannelseseffektiviteten måles i henhold til den følgende formelen ([produkt]/[substrat+produkt])<*>100, hvor "produkt" inkluderer det øyeblikkelige produktet og alle produkter i reaksjonsveien utledet fra det.

Uttrykket "PUFA biosyntetisk reaksjonsveienzym" refererer til et hvert av de følgende enzymene (og gener som koder for nevnte enzymer) som er assosiert med biosyntesen til en PUFA, inkludert en A4 desaturase, en A5 desaturase, en A6 desaturase, en Al 2 desaturase, en Al 5 desaturase, en Al 7 desaturase, en A9 desaturase, en A8 desaturase, en A9 fettsyreelongase, en C14/16fettsyreelongase, en C16/18fettsyreelongase, en C18/20fettsyreelongase og/eller en C20/22fettsyreelongase. På samme måte så refererer uttrykket "co-3/co-6 fettsyrebiosyntetisk reaksjonsvei" til et sett med gener som når de uttrykket under de passende betingelsene koder for enzymer som katalyserer den direkte eller indirekte produksjonen av enten den ene eller begge co-3 og co-6 fettsyrene. En representativ reaksjonsvei er illustrert i fig. 3 og tilveiebringer omdannelsen av myristinsyre gjennom diverse intermediater til DHA som viser hvordan både co-3 og co-6 fettsyrer kan produseres fra en felles kilde. Reaksjonsveien er naturlig oppdelt i to deler hvor en del vil generere co-3 fettsyrer og den andre delen vil kun generere co-6 fettsyrer. Den delen som kun genererer co-3 fettsyrer vil refereres til her som den co-3 fettsyrebiosyntetiske reaksjonsveien mens den delen som genererer kun co-6 fettsyrer vil refereres til her som den co-6 fettsyre biosyntetiske reaksjonsveien.

Uttrykket "funksjonell" som anvendt her i sammenheng med den PUFA biosyntetiske reaksjonsveien betyr at noen (eller alle) av genene i reaksjonsveien uttrykker aktive enzymer. Det bør forstås at "PUFA biosyntetiske reaksjonsvei" eller "funksjonell PUFA biosyntetisk reaksjonsvei" ikke medfører at alle genene som er opplistet i avsnittet over er nødvendig, ettersom en rekke fettsyreprodukter kun vil kreve uttrykket av et under-sett med genene i denne reaksjonsvei.

Uttrykket "oljeaktig" refererer til de organismer som tenderer til å lagre deres energi-kilde i formen av lipid (Weete, In Fungal Lipid Biochemistry, 2. utgave, Plenum, 1980). Uttrykket "oljeaktig gjær" refererer til de mikroorganismer som er klassifisert som gjær som kan lage olje. Generelt så følger det cellulære olje eller TAG innholdet hos oljeaktige mikroorganismer en sigmoid kurve hvor konsentrasjonen av lipid øker inntil den når et maksimum i den sene logaritmiske eller den tidlige stasjonære vekstfasen og deretter gradvis reduseres under de sene stasjonære og dødsfasene (Yongmanitchai and Ward, Appl. Environ. Microbiol 57 419-25 (1991)). Det er ikke uvanlig for oljeaktige mikroorganismer og akkumulere i overskudd av ca 25 % av deres tørre cellevekt som olje. Eksempler på oljeaktig gjær inkluderer men er ikke på noen måte begrenset til de følgende slektene Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon og Lipomyces.

Som anvendt her så vil uttrykkene "isolert nukleinsyrefragment" eller "isolert nukleinsyremolekyl" anvendes om hverandre og vil bety en polymer av RNA eller DNA som er enkel eller dobbel trådet, som valgfritt inneholder syntetiske ikke-naturlige eller forandrede nukleotidbaser. Et isolert nukleoinsyrefragment i formen av en polymer av

DNA kan omfatte et eller flere segmenter av cDNA, genomisk DNA eller syntetisk

DNA.

Et nukleoinsyremolekyl er "i stand til å hybridisere" til et annet nukleinsyremolekyl slik som et cDNA, genomisk DNA eller RNA molekyl, når en enkelt trådet form av nukleinsyremolekylet kan anneale til det andre nukleinsyremolekylet under de passende betingelser med hensyn på temperatur og ionestyrke i løsning. Hybridisering og vaske-betingelser er velkjent og eksemplifisert i Sambrook, J, Fritsch, E F og Maniatis, T Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor NY (1989), spesielt kapittel 11 og tabell 11 1 i dette. Betingelsene for temperatur og ionestyrke bestemmer "stringensen" av hybridiseringen. Stringensbetingelser kan justeres for å screene for moderat lignende fragmenter (slik som homologe sekvenser fra fjernt relaterte organismer), til veldig like fragmenter (slik som gener som duplikerer funksjonelle enzymer fra nært relaterte organismer). Posthybridiseringsvasker bestemmer stringensberingelsene. Et sett med foretrukne betingelser anvender en rekke vasker som starter med 6X SSC, 0,5 % SDS ved romtemperatur i 15 minutter, deretter repetert med 2X SSC, 0,5 % SDS ved 45°C i 30 minutter og deretter repetert to ganger med 0,2X SSC, 0,5 % SDS ved 50°C i 30 minutter. Et mer foretrukket sett med stringenter betinges av anvender høyere temperaturer hvor vaskingene er identiske til de som er nevnte over unntatt at temperaturen for de siste to 30 minutters vaskene i 0,2X SSC, 0,5 % SDS ble øket til 60°C. Et annet foretrukket sett med veldig stringente betingelser anvender to sluttvasker i 0,1X SSC, 0,1 % SDS ved 65°C. Et tilleggssett med stringente betingelser inkluderer hybridisering ved 0,1X SSC, 0,1 % SDS, 65°C og vasking med 2X SSC, 0,1 % SDS etterfulgt av 0,1X SSC, 0,1 % SDS for eksempel.

Hybridisering krever at de to nukleinsyrene inneholder komplementære sekvenser selv om avhengig av stringensen til hybridiseringen, så kan det være mulig med feiltreff mellom baser. Den passende stringensen for å hybridisere nukleinsyrer er avhengig av lengden av nukleinsyrene og graden av komplimentering, variabler som er velkjente i fagfeltet. Jo større graden av likhet eller homologi mellom de to nukleotidsekvensene jo høyere er verdien for Tm for hybrider av nukleinsyrer som har de sekvenser. Den relative stabiliteten (som korresponderer til høyere Tm) til nukleinsyrehybridiseringer avtar i følgende rekkefølge RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. For hybrider som er større enn 100 nukleotider i lengde så er ligninger for å beregne Tm blitt utledet (se Sambrook et al, supra, 9.50-9.51). For hybridiseringer med kortere nukleinsyrer, dvs. oligonukleotider, så blir posisjonen av feiltreffene viktigere og lengden av oligo- nukleotidet bestemmer dets spesifisitet (se Sambrook et al, supra, 11.7-11.8). I en utførelsesform så er lengden av en hybridiserbar nukleinsyre minst ca 10 nukleotider. Helst så er en minimumslengde for en hybridiserbar nukleinsyre minst ca 15 nukleotider, mer ønskelig minst ca 20 nukleotider; og mest ønskelig så er lengden minst ca 30 nukleotider. Videre så vil en fagperson forstå at temperaturen og vaskeløsningens salt-konsentrasjon kan justeres ettersom det er nødvendig i henhold til faktorer slik som lengden av proben.

En "vesentlig del" av en aminosyre eller nukleotidsekvens er den del som omfatter nok av aminosyresekvensen til et polypeptid eller nukleotidsekvensen av et gen til putativt å identifisere det polypeptid eller gen, enten ved manuell evaluering av sekvensen av en fagperson, eller ved computerautomatisert sekvens sammenligning og identifisering ved å anvende algoritmer slik som BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S F, et al JMol Biol 215 403-410 (1993)). Generelt så er en sekvens på 10 eller flere etterfølgende aminosyrer eller 30 eller flere nukleotider nødvendig for putativt å identifisere en polypeptid eller nukleinsyresekvens som homolog til et kjent protein eller gen. Videre, med hensyn til nukleotidsekvenser, så kan genspesifikke oligonukleotidprober som omfatter 20 til 30 etterfølgende nukleotider anvendes i sekvens avhengig fremgangsmåter for genidentifisering (for eksempel Southern hybridisering) og isolering (for eksempel in situ hybridisering av bakterielle kolonier eller bakteriofag plakk). I tillegg så kan korte oligonukleotider på 12 til 15 baser anvendes som omformeringsprimere i PCR for å skaffe tilveie et bestemt nukleinsyrefragment som omfatter primerne. Følgelig så omfatter en "vesentlig del" av en nukleotidsekvens nok av sekvensen til spesifikt å identifisere og/eller isolere et nukleinsyrefragment som omfatter sekvensen. Den foreliggende spesifikasjonen gir delvis eller fullstendig aminosyre og nukleotidsekvenser som koder for et eller flere bestemte sopproteiner. Fagpersonen som har fordelen av sekvensene som rapporteres her, kan nå anvende hele eller en vesentlig del av de utgreiede sekvensene for formål kjent for fagfolk. Følgelig så omfatter den foreliggende oppfinnelsen de fullstendige sekvensene som rapport i de vedlagte sekvenslistene, så vel som vesentlige deler av de sekvenser som er definert over.

Uttrykket "komplementær" blir anvendt for å beskrive forholdet mellom nukleotidbaser som er i stand til å hybridisere til hverandre. For eksempel med hensyn til DNA som er adenosin komplementær med tymin og sytosin komplementær med guanin. Følgelig så inkluderer den foreliggende oppfinnelsen også isolerte nukleinsyrefragmenter som er komplementære til de fullstendige sekvensene som er rapportert i de medfølgende sekvenslistene så vel som de vesentlige like nukleinsyresekvensene.

Uttrykket "prosent identitet" som kjent i fagfeltet, er et forhold mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser bestemt ved å sammen-ligne sekvensene. I fagfeltet så betyr "identitet" også graden av sekvensslektsskap mellom polypeptid og polynukleotidsekvenser, som tilfellet kan være som bestemt ved treffet mellom tråder i slike sekvenser. "Identitet" og "likhet" kan lett beregnes ved hjelp av kjente fremgangsmåter inkludert men ikke begrenset til de som er beskrevet i 1) Computational Molecular Biology (Lesk, A M , Ed ) Oxford University NY (1988), 2) Biocomputing Informatics and Genome Projects (Smith, D W , Ed ) Academic NY

(1993), 3) Computer Analvsis of Sequence Data. Part I (Griffin, A M, and Griffin, H G, Eds ) Humania NJ (1994). 4 ) Sequence Analvsis in Molecular Biology (von Heinje, G, Ed) Academic (1987), og 5 ) Sequence Analvsis Primer (Gribskov, M and Devereux, J, Eds ) Stockton NY (1991). Foretrukne fremgangsmåter for å bestemme identitet er designet for å gi det beste treffet mellom sekvensene som testes. Fremgangsmåter for å bestemme identitet og likhet er kodifisert i offentlige tilgjengelige computer-programmer. Sekvensoppstillinger og prosentidentitetsberegninger kan utføres ved å anvende Megalign programmet i LASEREGNE bioinformatisk computingpakken (DNASTAR Inc, Madison, WI) Flere oppstillinger av sekvenser utføres ved å anvende Clustal fremgangsmåten for oppstilling (Higgins and Sharp, CABIOS. 5 151-153

(1989)) med standard parametere (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Standard parametere for parvise oppstillinger ved å anvende Clustal fremgangsmåten er KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 og DIAGONALS SAVED=5.

Passende nukleinsyremolekyler (isolerte polynukleotider i den foreliggende oppfinnelsen) koder for polypeptider som er minst 90 % identiske til aminosyresekvensene som er rapportert her. Mest foretrukket er nukleinsyremolekyler som koder for aminosyresekvenser som er minst ca 95 % identiske til aminosyresekvensene som er rapportert her. Passende nukleinsyremolekyler har ikke bare de ovenfor nevnte homologiene, men koder vanligvis for et polypeptid som har minst 50 aminosyrer, helt minst 100 aminosyrer, mer ønskelig minst 150 aminosyrer, enda mer ønskelig minst 200 aminosyrer og mest ønskelig minst 250 aminosyrer.

Uttrykket "sekvensanalysesoftware" refererer til enhver computeralgoritme eller softwareprogram som er nyttig for analysen av nukleotid eller aminosyresekvenser. "Sekvensanalysesoftware" kan være kommersielt tilgjengelig eller uavhengig utviklet. Vanlig sekvensanalysesoftware vil inkludere men er ikke begrenset til 1) GCG settet med programmer Wisconsin Package Version 9 0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), 2) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., JMol Biol 215.403-410 (1990)), 3 ) DNASTAR (DNASTAR, Inc Madison, WI), 4) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI), og 5 ) FASTA programmet som inkorporerer Smith-Waterman algoritmen (W R Pearson, ComputMethods Genome Res., [Proe Int Symp] (1994), Meeting Date 1992,111-20 Suhai, Sandor, Ed Plenum New York, NY). Innenfor sammenhengen med denne søknad så vil det forstås at der hvor sekvensanalysesoftware anvendes for analyse, så vil resultatene av analysen være basert på "standardverdiene" til det refererte programmet med mindre annet er spesifisert. Som anvendt her så vil "standardverdier" bety ethvert sett med verdier eller parametere som opprinnelig fulgte med softwaren når den først ble initialisert.

"Kodondegenerering" refererer til naturen til den genetiske koden som tillater variasjon av nukleotidsekvensen uten å påvirke aminosyresekvensen til det kodede polypeptidet. En fagperson er klar over "kodonbiasen" som utvises av spesifikk vertscelle i anvendelse av nukleotidkodoner for å spesifisere en gitt aminosyre. Når man syntetiserer et gen for forbedret uttrykk i en vertscelle så er det derfor ønskelig å designe genet slik at dets frekvens av kodonanvendelse nærmer seg frekvensen til den foretrukne kodonbruken til vertscellen.

Uttrykket "kodonoptimalisert" som det refererer til gener eller kodende regioner av nukleinsyrefragmenter, refererer til forandringen av kodoner i genet eller de kodende regionene i nukleinsyremolekylene for å reflektere den vanlige kodonbruken til vertsorganisme uten å forandre polypeptidet som DNA koder for.

"Gen" refererer til et nukleinsyrefragment som uttrykker et spesifikt protein og som kan refererer til den kodende regionen alene eller så kan det inkludere regulatoriske sekvenser som kommer før (5' ikke-kodende sekvenser) eller etter (3' ikke-kodende sekvenser) den kodende sekvensen. "Nativt gen" refererer til et gen som finnes i naturen med dets egne regulatoriske sekvenser. "Kimært gen" refererer til et hvert gen som ikke er et nativt gen og som omfatter regulatoriske og kodende sekvenser som ikke finnes sammen i naturen. Følgelig så kan et kimært gen omfatte regulatoriske sekvenser og kodende sekvenser som er utledet fra forskjellige kilder og regulatoriske sekvenser og kodende sekvenser som er utledet fra den samme kilden men som er arrangert på en måte som er forskjellig fra den som finnes i naturen. "Endogent gen" refererer til et nativt gen i sin naturlige lokalisering i genomet til en organisme. Et "fremmed" gen refererer til et gen som er introdusert inn i vertsorganismen ved hjelp av genoverføring. Fremmede gener kan omfatte native gener som er satt inn i en ikke-nativ organisme,

native gener introdusert inn i en ny lokalisering innen den native verten eller kimære gener. Et "kodonoptimalisert gen" er et gen som har dets frekvens av kodonbruk designet for å etterligne frekvensen av foretrukket kodonbruk til vertscellen.

"Kodende sekvens" refererer til en DNA sekvens som koder for en spesifikk aminosyresekvens. "Passende regulatoriske sekvenser" refererer til nukleotidsekvenser som er lokalisert oppstrøms (5' ikke-kodende sekvenser), innen eller nedstrøms (3' ikke-kodende sekvenser) av en kodende sekvens og som influerer transkripsjonen, RNA prosesseringen eller stabiliteten eller translasjonen av den assosierte kodende sekvensen. Regulatoriske sekvenser kan inkludere promotorer, translasjonsledersekvenser, introner, polyadenylering gjenkjenning sekvenser, RNA prosesseringssteder, effektor bindings-steder og stamme-sløyfe strukturer.

"Promotor" refererer til en DNA sekvens som er i stand til å kontrollere uttrykket av en kodende sekvens eller funksjonelt RNA. Generelt så er en kodende sekvens lokalisert 3' for en promotorsekvens. Promotorerer kan være utledet i sin helhet fra et nativt gen eller så kan de være sammensatt av forskjellige elementer utledet fra forskjellige promotorer som finnes i naturen eller til og med omfatte syntetiske DNA segmenter. Det forstås av fagfolk at forskjellig promotorer kan styre uttrykk av et gen i forskjellige vev eller celle-typer eller på forskjellige trinn av utvikling eller som respons på forskjellige miljø eller fysiologiske betingelser. Promotorer som forårsaker at et gen uttrykkes i de fleste celle-typer hele tiden refereres vanligvis til som "konstitutive promotorer". Det er videre god-tatt at fordi i de fleste tilfeller de nøyaktige grensene til regulatoriske sekvenser ikke er blitt fullstendig definert så kan DNA fragmentet av forskjellig lengde ha identisk promotoraktivitet.

Uttrykket "3' ikke-kodende sekvenser" eller "transkripsjonsterminator" refererer til DNA sekvenser som er lokalisert nedstrøms fra en kodende sekvens. Dette inkluderer polyadenyleringsgjenkjenningssekvenser og andre sekvenser som koder for regulatoriske signaler som er i stand til å påvirke mRNA prosessering eller genuttrykk. Polyadenyleringssignalet er vanligviskarakterisert vedå påvirke tilsettingen av poly-adenylsyrehaler til den 3'enden av mRNA forløperen. Den 3' regionen kan influere transkripsjonen, RNA prosesseringen eller stabiliteten eller translasjon av den assosierte kodende sekvensen.

"RNA transkript" refererer til produktet som et resultat fra RNA polymerasekatalysert transkripsjon av en DNA sekvens. Når RNA transkriptet er en perfekt komplementær

kopi av DNA sekvensen så refereres det til som det primære transkriptet eller så kan det være en terminal sekvens som er utledet fra posttranskripsjonell prosessering av det primære transkriptet og refereres til som det modne RNA. "Budbringer RNA" eller "mRNA" refererer til RNA som er uten introner og som kan translateres til protein av cellen. "cDNA" refererer til et dobbelttrådet cDNA som er komplementær til å utledet fra mRNA. "Sens" RNA refererer til RNA transkript som inkluderer mRNA og som kan translateres til protein av cellen. "Antisens RNA" refererer til et RNA transkript som er komplementært til hele eller del av et mål som primært transkript eller mRNA og som blokkerer uttrykket av målgenet (US 5.107.065, WO 99/28508) Komplementariteten til et antisens RNA kan være med enhver del av det spesifikke gentranskriptet, det vil si ved den 5' ikke-kodende sekvensen, den 3' ikke kodende sekvensen eller den kodende sekvensen. "Funksjonelt RNA" refererer til antisens RNA, ribosym RNA eller annet RNA som ikke translateres og likevel har en effekt på cellulære prosesser.

Uttrykket "operativt koblet" refererer til assosiasjonen mellom nukleinsyresekvenser på et enkelt nukleinsyrefragment slik at funksjonen av et er påvirket av det andre. For eksempel så er en promotor operativt koblet med en kodende sekvens når den er i stand til å påvirke uttrykket av den kodende sekvens (dvs. den kodende sekvensen er under den transkripsjonelle kontrollen til promotoren). Kodende sekvenser kan være operativt koblet til regulatoriske sekvenser i sens eller antisens orientering.

Uttrykket "uttrykk", som anvendt her refererer til transkripsjonen og den stabile akkumuleringen av sens (mRNA) eller antisens RNA utledet fra nukleinsyrefragmentet eller fragmentene i oppfinnelsen. Uttrykk kan også referere til translasjon av mRNA til et polypeptid.

"Transformasjon" refererer til overføringen av et nukleinsyremolekyl inn i en vertorganisme som resulterer i genetisk stabil arv. Nukleinsyremolekylet kan være et plasmid som replikerer autonomt, for eksempel; eller så kan det integreres inn i genomet til vertsorganismen. Vertsorganismer som inneholder de transformerte nukleinsyrefragmentene refereres til som "transgene" eller "rekombinante" eller "transformerte" organismer.

Uttrykket "plasmid", "vektor" og "kassett" refererer til et ekstra kromosomalt element som ofte bærerer gener som ikke er del av den sentrale metabolismen i cellen og som vanligvis er i formen av sirkulære dobbelttrådede DNA fragmenter. Slike fragmenter kan være autonomt replikerende sekvenser, genomt integrerende sekvenser, fag eller nukleotidsekvenser, lineære eller sirkulære, av et enkelt eller dobbelttrådet DNA eller RNA, utledet fra enhver kilde hvor et antall nukleotidsekvenser er blitt koblet eller rekombinert til en unik konstruksjon som er i stand til å introdusere et promotor-fragment og en DNA sekvens for et selektert genprodukt sammen med passende 3' utranslatert sekvens inn i en celle. "Uttrykkskassett" refererer til en spesifikk vektor som inneholder et fremmed gen eller gener og som har elementer i tillegg til det fremmede genet eller genene som tillater forsterket uttrykk av det gen i en fremmed vert.

Uttrykket "homolog rekombinasjon" refererer til utbyttingen av DNA fragmenter mellom to DNA molekyler (i løpet av overkryssing). Fragmentene som utbyttes flankeres av områder med identiske nukleotidsekvenser mellom de to DNA molekylene (dvs. "regioner med homologi").

Uttrykket "regioner av homologi" refererer til strekk av nukleotidsekvens på nukleinsyrefragmenter som deltar i homolog rekombinasjon som har homologi til hverandre. Effektiv homolog rekombinasjon vil vanligvis finne sted når disse regioner med homologi er minst ca 10 bp i lengde mens minst ca 50 bp i lengde er foretrukket. Vanlige fragmenter som er ment for rekombinasjon inneholder minst to regioner med homologi der hvor målrettet genødeleggelse eller erstatning er ønsket.

Standard rekombinante DNA og molekylære kloningsteknikker anvendt her er velkjent i fagfeltet og er beskrevet av Sambrook, J, Fritsch, E F and Maniatis, T, Molecular Cloning A Laboratory Manual 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY (1989) (i det følgende "Maniatis"), ved Silhavy, T J, Bennan, M L og Enquist, L W, Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY (1984), og ved Ausubel, F M et al, Current Protocols in Molecular Biology. utgitt ved Greene Publishing Assoc and Wiley-Interscience (1987)

Sekvensidentifikasjon av Mortierella alpina Ci6/ is Fettsvreelongasen

I den foreliggende oppfinnelsen så er et gen som koder for en C16/18 fettsyreelongase (betegnet her som "EL03") blitt isolert fra et cDNA bibliotek fra Mortierella alpina

som tilhører DuPont. M. alpina er en organisme som naturlig akkumulerer fettsyrer som har kjedelengder som er lik eller større enn C20 i sin TAG fraksjon, og indikerer dermed at C16/18 fettsyreelongasen sannsynligvis fungerer med høy effektivitet for å sikre en stor strøm av stearinsyre inn i den PUFA biosyntetiske reaksjonsveien.

Sammenligning av Ci6/i8fettsyreelongasenukleotidbase og utledede aminosyresekvenser med publiserte databaser, ved å anvende en BLAST algoritme (Altschul, S F , et al, Nucleic Acids Res 25 3389-3402 (1997)), avslører at de mest like kjente sekvenser er ca 37 % identiske til aminosyresekvensen til Ci6/18fettsyreelongasen som er rapportert her over en lengde på 275 aminosyrer. Foretrukne aminosyrefragmenter er minst 90 % identiske med sekvensene heri og de sekvenser som er ca 95 % identiske er mest foretrukne. På samme måte så er foretrukne C16/18fettsyreelongase kodende nukleinsyresekvenser som korresponderer til den foreliggende ORF de som koder for aktive proteiner og som er minst 00 % identiske til nukleinsyresekvensene som koder for C16/18fettsyreelongasen som er rapportert her hvor de sekvenser som er ca 95 % identiske er mest foretrukne.

Identifisering or isolering av homologer

C16/18fettsyreelongasenukleinsyremolekylet i den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes for å identifisere og å isolere gener som koder for homologe proteiner fra den samme eller andre bakterielle, alge, sopp eller plantearter.

Identifikasionsteknikker

For eksempel så kan en vesentlig del av Mortierella alpina C16/18fettsyreelongase-aminosyre eller nukleotidsekvensen som er beskrevet her anvendes for putativt å identifisere relaterte polypeptider eller gener enten ved manuell evaluering av sekvensen av en fagperson eller ved computerautomatisert sekvens sammenligning og identifikasjon ved å anvende algoritmer slik som BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul, S F, et al, J. Mol Biol 215403-410 (1993)) og ClustalW (Megalign program i DNASTAR software).

Alternativt så kan den foreliggende fettsyreelongasesekvensen brukes som et hybridi-seringsmiddel for identifiseringen av homologer. De basale komponentene i en nuklein-syrehybridiseringstest inkluderer en probe, en prøve som er mistenkt for å inneholde genet eller genfragmentet av interesse og en spesifikk hybridiseringsfremgangsmåte. Prober er vanligvis enkelttrådede nukleinsyresekvenser som er komplementære med nukleinsyresekvensene som skal detekteres. Prober er "i stand til å hybridisere" med nukleinsyresekvensene som skal detekteres. Probelengden kan variere fra fem baser til ti til tusenvis av baser og vil være avhengig av den spesifikke testen som skal gjøres. Vanligvis så er en probelengde på ca 15 baser til ca 30 baser passende. Kun del av probemolekylet trenger å være komplementær til nukleinsyresekvensen som skal detekteres. I tilegg så trenger ikke komplementariteten mellom proben og målsekvensen være perfekt. Hybridisering skjer mellom ikke perfekte komplementære molekyler med det resultat at en viss fraksjon av basene i den hybridiserte regionen ikke er paret med den passende komplementære basen.

Hybridiseringsfremgangsmåter er godt definerte. Vanligvis så må proben og prøven blandes under betingelser som vil tillate nukleinsyrehybridisering. Dette involverer å la proben komme i kontakt med prøven i nærværet av et uorganiske eller organiske salt under de passende konsentrasjons og temperaturbetingelsene. Proben og prøvenuklein-syrene må være i kontakt lenge nok slik at enhver mulig hybridisering mellom proben og prøvenukleinsyren kan finne sted. Konsentrasjonen av probe eller mål i blandingen vil bestemme tiden som nødvendig for at hybridisering skal finne sted. Jo høyere probe og mål konsentrasjonen er jo kortere er hybridiseringsinkubasjonstiden som er nød-vendig. Valgfritt så kan et chaotropisk middel tilsettes. Det chaotropiske middelet stabiliserer nukleinsyrer ved å hemme nukleaseaktivitet. Videre så tillater det chaotrope middelet sensitiv og stringent hybridisering av korte oligonukleotidprober ved romtemperatur (Van Ness and Chen, Nucl. Acids Res 19 5143-5151 (1991)). Passende chaotrope midler inkluderer guanidinklorid, guanidintiocyanat, natriumtiocyanat, litiumtetrakloracetat, natriumperklorat, rubidiumtetrakloracetat, kaliumjodid og cesium-trifluoracetat blant andre. Vanligvis så vil det chaotrope middelet være til stede i en sluttkonsentrasjon på ca 3 M. Hvis det er ønskelig så kan man tilsette formamid til hybridiseringsblandingen, vanligvis 30 til 50 % (v/v).

Forskjellige hybridiseringsløsninger kan benyttes. Vanligvis så omfatter disse fra ca 20 til 60 volum%, helst 30 volum%, av et polart organisk løsemiddel. En vanlig hybridi-serings løsning bruker ca 30 til 50 % v/v formamid, ca 0,15 til 1 M natriumklorid, 0,05 til 0,1 M buffere (for eksempel natriumsitrat, Tris-HCl, PIPES eller HEPES (pH område ca 6 til 9)), ca 0,05 til 0,2 % detergen (for eksempel natriumdodecylsulfat) eller mellom 0,5 til 20 mM EDTA, FICOLL (Pharmacia Inc) (ca 300 til 500 kdal), polyvinyl-pyrrolidon (ca 250 til 500 kdal) og serumalbumin. Også inkludert i den vanlige hybridi-seringsløsningen vil være umerkede bærenukleotider på ca 0,1 til 5 mg/ml, fragmentert kjerne DNA (for eksempel kalvetymus eller laksesperm DNA, eller gjær RNA), og valgfritt fra ca 0,5 til 2 % wt/vol glysin. Andre tilleggsstoffer kan også inkluderes slik som volumeksklusjonsmidler som inkluderer en rekke polare vannløselige eller svell-bare midler (for eksempel polyetylenglykol), anioniske polymerer (for eksempel poly- akrylat eller polymetylakrylat) og anioniske sakkaridpolymerer (for eksempel dekstran-sulfat).

Nukleinsyrehybridisering er adapterbar til en rekke analyseformater. En av de mest passende er smørbrødanalyseformatet. Smørbrødanalysen er spesielt adapterbar for hybridisering under ikke-denaturerende betingelser. En primær komponent i en smør-brødtype analyse er en fast støtte. Den faste støtten har adsorbert til seg eller kovalent koblet til seg immobilisert nukleinsyreprobe som er umerket og komplementær til en del av sekvensen.

Is oleringsfremgangsmåter

Mortierella alpina Ci6/i8fettsyreelongasen som er identifisert her kan anvendes for å isolere gener som koder for homologe proteiner fra den samme eller andre bakterie, alge, sopp eller plantearter, basert på sekvensavhengige protokoller. For eksempel så inkluderer disse protokoller men de er ikke begrenset til 1) fremgangsmåter for nukleinsyrehybridisering, 2) fremgangsmåter for DNA og RNA omformering eksemplifisert ved diverse anvendelser av nukleinsyreoppformeringsteknologier [for eksempel polymerasekjedereaksjon (PCR), Mullis et al, US patent4.683.202, ligasekjedereaksjon (LCR), Tabor, S. et al, Proe Acad Sei USA 82 1074 (1985), eller på forskyvnings-oppformering (SD A), Walker, et al, Proe. Nati Acad Sei

U SA., 89 392 (1992)], og 3) fremgangsmåter for bibliotekskonstruksjon og screening ved komplementering.

For eksempel så kunne gener som koder for lignende proteiner eller polypeptider til fettsyreelongasen som er beskrevet her isoleres direkte ved å anvende hele eller en del av de foreliggende nukleinsyrefragmentene som DNA hybridiseringsprober for å screene biblioteker fra enhver ønsket gjær eller stoff ved å anvende metodologi som er velkjent for fagfolk (hvor de gjær eller sopp som produserer PUFA ville være å foretrekke). Spesifikke oligonukleotider basert på de foreliggende nukleinsyresekvensene kan designes og syntetiseres ved hjelp av fremgangsmåter kjent i fagfeltet (Maniatis, supra). Videre så kan hele sekvensene anvendes direkte for å syntetisere DNA prober ved hjelp av fremgangsmåter kjent for fagfolk (for eksempel tilfeldige primer DNA merking, nick translatering eller endemerkingsteknikker) eller RNA prober ved å anvende tilgjengelige in vitro transkripsjonssystemer. I tilegg så kan spesifikke primere bli konstruert og anvendt for å amplifisere en del av (eller fullengde av) umiddelbar sekvens. De resulterende oppformeringsproduktene kan merkes direkte i løpet av opp formeringsreaksjonene eller merkes etter oppformeringsreaksjonene og anvendes som prober for å isolere fullengde DNA fragmenter under betingelser med passende stringenter.

I PCR-type oppformeringsteknikker har vanligvis primerne forskjellige sekvenser og er ikke komplementære med hverandre. Avhengig av ønskede testbetingelsene, så bør sekvensene til primerne være designet for å tilveiebringe både effektiv og pålitelig replikering av målnukleinsyren. Fremgangsmåter for PCR primerdesign er vanlig og velkjent i fagfeltet (Thein and Wallace, "The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", in Human Genetic Diseases. A PracticalApproach, K E Davis Ed , (1986) s. 33-50, IRL Herndon, VA, and Rychhk, W, In Methods in Molecular Biology. White, B A Ed, (1993) Vol 15, s. 31-39, PCR Protocols Current Methods and Applications Humania Totowa, NJ)

Generelt så kan to korte segmenter av de foreliggende EL03 sekvensene anvendes i PCR protokoller for å oppformere lengre nukleinsyrefragmenter som koder for homologe gener fra DNA eller RNA. PCR kan også utføres på et bibliotek med klonede nukleinsyrefragmenter hvor sekvensen til en primer er utledet fra de foreliggende nukleinsyrefragmentene og sekvensen til den andre primeren tar fordelen av tilstedeværelsen av polyadenylsyrehalene i den 3'enden av mRNA forløperen som koder for mikrobielle gener. Eller så kan den andre primersekvensen være basert på sekvenser utledet fra kloningsvektoren, for eksempel ved å anvende RACE protokollen (Frohman et al., PNAS USA 85 8998 (1988)) for å generere cDNA ved å anvende PCR for å oppformere kopier av området mellom et enkelt punkt i transkriptet og den 3' eller den 5' enden. Primere som er orientert i den 3' og den 5' retningen kan designes fra de foreliggende sekvensene. Ved å anvende kommersielt tilgjengelige 3' RACE eller 5' RACE systemer (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), så kan spesifikke 3' eller 5' cDNA fragmenter isoleres (Ohara et al, PNAS USA 86 5673 (1989), Loh et al., Science 243 217

(1989))

Tilgjengeligheten av de foreliggende nukleotid og utledede aminosyre Ci6/i8fettsyre-elongasesekvenser fasiliterer immunologisk screening av DNA uttryktsbiblioteker. Syntetiske peptider som representerer deler av den foreliggende aminosyresekvensen kan syntetiseres. Disse peptider kan anvendes for å immunisere dyr til å produsere polyklonale eller monoklonale antistoffer med spesifisitet for peptider eller proteiner som omfatter aminosyresekvensene. Disse antistoffer kan så anvendes for å screene DNA uttryksbibliotek for å isolere fullengde DNA kloner av interesse (Lerner, R A Adv Immunol. 36 1 (1984); Maniatis, supra).

Gen optimalisering for forbedret heterologt uttrykk

Etter identifiseringen og isoleringen av en bestemt Ci6/i8fettsyreelongase (for eksempel SEK ID NR 1 og 2) så kan en rekke teknikker benyttes for å forbedre uttrykk av C16/18fettsyreelongasen av interesse i en alternativ vert. To slike teknikker inkluderer kodon optimalisering og mutagenese av genet.

Som vil forstås av en fagperson så er det ofte nyttig å modifisere en del av kodonene som koder for et bestemt polypeptid som skal uttrykkes i en fremmed vert (slik at det modifiserte polypeptidet anvender kodoner som er foretrukket av den alternative verten) fordi dette vesentlig kan forsterke uttrykket av det fremmede genet som koder for polypeptidet. En fagperson vil være familiær med teknikkene for å bestemme de foretrukne verstkodonene innen en bestemt verstart av interesse og å beregne og å syntetisere den alternative kodende sekvensen (se for eksempel WO2004/101753). I en utførelsesform i oppfinnelsen så kan det for eksempel være ønskelig å modifisere en del av kodonene som koder for EL03 polypeptidet for å forsterke uttrykket av genet i Yarrawia Hpolytica.

I alternative utførelsesformer så kan mutageneseteknikker slik som in vitro mutagenese og seleksjon, setedirigert mutagenese, feil "prone" PCR (Melnikov et al., NucleicAcids Research, 27(4) 1056-1062 (15. februar, 1999)), "genshuffling" (US 5.605.793, US 5.811.238, US 5.830.721, og US 5.837.458) eller andre måter brukes for å skaffe til veie mutasjoner i naturlig forekommende elongasegener slik som C16/18fettsyreelongasen som er beskrevet her (hvor slike mutasjoner kan inkludere slettinger, innsettinger og puntkmutasjoner eller kombinasjoner av dem). Dette ville tillate produksjon av et polypeptid som har fettsyreelongaseaktivitet in vivo med mer ønskelige fysikalske og kinetiske parametere for funksjon i en bestemt vertscelle (for eksempel en lengre halveringstid eller en høyere produksjonshastighet av en ønsket fettsyre). Eller hvis det er ønskelig så kan regionene til et polypeptid av interesse som er viktig for enzymatisk aktivitet bestemmes gjennom rutinemutagenese, uttrykk av de resulterende mutante polypeptidene og bestemmelse av deres aktiviteter. Et overblikk over disse teknikker er beskrevet i WO 2004/101757.

Fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen omfatter anvendelse av den fullstendige sekvensen til Ci6/i8fettsyreelongasegenet som rapportert i de vedlagte sekvenslistene, komplementet til denne fullstendige sekvens, vesentlige deler av denne sekvens som definert heri og kodonoptimaliserte elongaser utledet fra dem som definert i de medfølgende krav. Sekvenser som vesentlig er homologe til sekvensene beskrevet heri er også vist.

Mikrobiell biosyntese av fettsyrer

Lipidmetabolisme er en basisk metabolsk prosess som nesten alle dyr, planter og mikroorganismer innehar og dermed innehar nesten alle disse mikroorganismer evnen til å syntetisere palmitat (16:0), stearinsyre (18:0) og oleinsyre (18:1) (fordi disse fettsyrer er essensielle for fosforlipidbiosyntese). Som illustrert i fig. 3 så er hver av disse fettsyrer utledet fra myristinsyre (14:0). Spesifikt så blir fritt palmitat produsert fra myristinsyre via en elongeringsreaksjon (dvs. katalysert av en Cu/i6fettsyreelongase), deretter kan palmitat elongeres av en C16/18fettsyreelongase til å produsere stearinsyre eller umettet til å produsere palmitoleinsyre (16:1)). Fordi den primære skjebnen til palmitat er elongering så blir det imidlertid konkludert at C16/18fettsyreelongaser spiller en viktig rolle i å bestemme total karbonstrømming inn i den fettsyrebiosyntetiske reaksjonsveien fordi disse enzymer kontrollerer mengden av stearinsyre produsert i den mikrobielle cellen.

Fremgangsmåter som er nyttig for å manipulere biokjemiske reaksjonsveier er velkjent for fagfolk. Det er forventet at introduksjon av kimære gener som koder for C16/18fettsyreelongasen som er beskrevet her, under kontrollen av de passende promotorene vil resultere i øket produksjon av stearinsyre i en transformert vertsorganisme. Som sådan så er det et formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for produksjonen av stearinsyre i en oljeaktig gjær hvor den oljeaktige gjæren blir tilveiebrakt med (a) et isolert nukleinsyremolekyl som koder for en C16/18fettsyreelongase som definert heri og (b) en kilde for elongasesubstrat som omfatter palmitat hvor gjæren styrkes under betingelser slik at nukleinsyremolekylet uttrykkes og palmitatet omdannes til stearinsyre og hvor stearinsyren valgfritt gjenvinnes.

Videre så kan C16/18fettsyreelongasegenet og dets korresponderende enzymprodukt som er beskrevet her anvendes indirekte for produksjonen av co-3 og/eller co-6 PUFA. Spesifikt så blir det overveid av C16/18fettsyreelongasen som er beskrevet her kan uttrykkes sammen med et eller flere gener som koder for andre enzymer slik at en serie med reaksjoner finner sted for å produsere en ønsket PUFA produkt.

Selv om mange mikroorganismer (inkludert alger, bakterier, mugg, sopp og gjær) kan syntetisere PUFAer og omegafettsyrer i det ordinære forløpet av cellulær metabolisme så er det også mulig å introdusere denne evnen inn i en organisme som ikke nativt produserer PUFA (eller produserer de ønskede PUFAene og/eller lipidprofil). En fagperson vil være familiær med betraktningene og teknikkene som er nødvendig for å introdusere en uttrykkskassett eller kassetter som koder for passende enzymer for PUFA biosyntese inn i den valgte vertsorganismen. For disse formål så er en rekke desaturase og elongasegener som er involvert i PUFA produksjonen blitt identifisert gjennom genetiske måter og DNA sekvensene til noen av disse genene er offentlig tilgjengelige (for eksempel se WO 2004/101757 for en oversikt over tilgjengelige gener i GenBank og/eller patentlitteraturen og betraktninger for å velge et spesifikt polypeptid som har desaturase eller elongaseaktivitet). Og selv om det ikke er utdypet i detalj her så blir flere læringer tilveiebrakt i litteraturen hvor diverse organismer konstrueres for å produsere spesifikke PUFAer, noen illustrative referanser blir tilveiebrakt som følger selv om disse ikke bør betraktes som begrensende: WO 98/46763, WO 98/46764, WO 98/46765, WO 99/64616, WO 2002/077213, WO 2003/093482, WO 2004/057001, WO 2004/090123, WO 2004/087902, U S 6.140.486, U S 6.459.018, U S 6.136.574. U S. 2003/0172399, U S 2004/0172682, U S. 2004/098762; U S 2004/0111763, U S 2004/0053379, U S 2004/0049805, U S 2004/0237139; U S 04/0172682, Beaudoin F et al., PNAS USA, 97(12).6421-6426 (2000), Dyer, J M et al., Appl. ErtviMicrobiol, 59 224-230 (2002), Domergue, F. etalEur. J. Biochem. 269 4105-4113 (2002), Qi, B et al., Nature Biotech. 22 739-745 (2004), og Abbadi et al., The Plant Cell, 16 2734-2748

(2004)).

For eksempel så kan dermed Ci6/i8 fettsyreelongasen som er beskrevet her uttrykkes i sammenheng med et eller flere PUFA biosyntetiske reaksjonsveigener som koder for PUFA enzymer slik at en rekke reaksjoner finner sted som produserer et ønsket PUFA produkt. I en foretrukket utførelsesform så kan for eksempel en vertorganisme kotrans-formeres med 1) et kimært gen som koder fraM alpina C16/18 fettsyreelongasen i den foreliggende oppfinnelsen og 2) en vektor som omfatter tilleggsgener som koder den PUFA biosyntetiske reaksjonsveien (for eksempel A9 desaturase, A12 desaturase, A6 desaturase, C18/20fettsyreelongase, A5 desaturase, Al 7 desaturase, C20/22 fettsyreelongase, A4 desaturase, Al 5 desaturase, A9 fettsyreelongase og/eller A8 desaturase). Denne transformantvert bør forventes å produsere økede mengder av co-3 og/eller co-6 fettsyrer (for eksempel LA, ALA, EDA, GLA, STA, ETrA, DGLA, ETA, ARA, EP A, DPA og DHA, (se fig. 3), i forhold til det som vil finne sted i den samme transformant-verten som ikke uttrykte et kimært gen som koder for M alpina Ci6/i8fettsyreelongasen i den foreliggende oppfinnelsen. De bestemte genene som er inkludert innen en bestemt uttrykskassett vil være avhengig av vertscellen (og dets PUFA profil og/eller desaturase/elongaseprofil), tilgjengeligheten til substrat og det ønskede sluttproduktet eller produktene.

I alternative utførelsesformer så kan det være nyttig å ødelegge en vertsorganismes native C16/18fettsyreelongase basert på de fullstendige sekvensene som er beskrevet her, komplementer av de fullstendige sekvensene, vesentlige deler av de sekvensene, kodonoptimaliserte desaturase utledet fra dem og de sekvenser som vesentlig er homologe til dem. For eksempel så produserer den målrettede ødeleggingen av Ci6/18fettsyreelongasen i en vertsorganisme en mutant stamme som ikke er i stand til å syntetisere stearinsyre og som dermed krever suplementering av Cl 8 fettsyrer for overlevelse.

I en alternativ utførelsesform så kan en transformant vertsorganisme som omfatter en ødeleggelse eller inaktivering av dets native Ci 6/18 fettsyreelongase deretter bli fordel-aktig transformert til å uttrykke en hetereolog C16/18fettsyreelongase (for eksempel hvis den heterologe C16/18fettsyreelongasen har forskjellig substratspesifisitet i forhold til den native C16/18fettsyreelongasen). Denne manipulering bør redusere substrat-konkurranse mellom den native og den heterologe C16/18fettsyreelongasen. Dermed kunne uttrykk av en heterolog C16/18fettsyreelongase (dvs. SEK ID NR 2) sammen med en knockout av det korresponderende native Yarrowia lipolytika C16/18fettsyreelongase signifikant øke de totale langkjedede co-3/co-6 PUFAer som produseres i transformat Y. lipolytika vertsceller konstruert for PUFA biosyntesen.

For genødeleggelse så blir et fremmed DNA fragment (vanligvis et selektert markørgen) satt inn i det strukturelle genet som skal ødelegges for å ødelegge dets kodende sekvens og dermed funksjonelt innaktivere genet. Transformering av den ødelagte kassetten inn i vertscellen resulterer i erstatning av det funksjonelle native genet ved homolog rekombinering med ikke-funksjonelle ødelagte gener (se for eksempel Hamilton et al., J. Bacteriol 171 4617-4622 (1989), Balbas et al., Gene 136 211-213 (1993), Gueldener et al., NucleicAcids Res 24 2519-2524 (1996), og Smith et al., Methods Mol. CellBiol 5 270-277(1996))

Antisensteknologi er en annen fremgangsmåte for nedregulering av gener når sekvensen av målgenet er kjent. For å utføre dette så blir et nukleinsyresegment fra det ønskede genet klonet og operativt koblet til en promotor slik at antisenstråden til RNA vil transkriberes. Denne konstruksjonen blir så introdusert inn i vertscellen og antisenstråden til RNA blir produsert. Antisens RNA hemmer genuttrykk ved å forhindre akkumuleringen av mRNA som koder for proteiner av interesse. En fagperson vil vise at spesielle betraktninger er assosiert med anvendelsen av antisensteknologier for å redusere uttrykk av bestemte gener. For eksempel så kan det passende nivået av uttrykk av antisensgener kreve anvendelsen av forskjellige kimære gener som benytter forskjellig regulatoriske elementer som er kjent av fagfolk.

Selv om målrettet genødeleggelse og antisensteknologi tilbyr effektive måter for å nedregulere gener der hvor sekvensen er kjent så er andre mindre spesifikke metodologier blitt utviklet som ikke er sekvensbaserte (for eksempel mutagenese via UV stråling/kjemiske midler eller ved anvendelse av transposerbare elementer/transposoner; se USSN 10/840579).

Uttrykssystemer, kassetter or vektorer

Genet og genproduktet i de foreliggende sekvenser som er beskrevet her kan produseres i heterologe mikrobielle vertsceller, spesielt i cellene til oljeaktige gjær (for eksempel Yarrowia lipolytika).

Mikrobielle uttrykkssystemer og uttrykksvektorer som inneholder regulatoriske sekvenser som styrer høyt nivå uttrykk av fremmede proteiner er velkjent for fagfolk. Ethvert av disse kunne anvendes for å konstruere kimære gener for produksjon av genproduktet i den foreliggende fettsyreelongasesekvensen. Disse kimære gener kunne så introduseres inn i passende mikroorganismer via transformasjon for å tilveiebringe høyt nivå uttrykk av de kodede enzymene.

Vektorer eller DNA kassetter som er nyttige for transformasjonen av passende vertsceller er velkjente i fagfeltet. Det spesifikke valget av sekvenser som er til stede i konstruksjonen er avhengig av de ønskede uttrykksproduktene ( supra), naturen til vertscellene og de foreslåtte måtene for å separere transformerte celler i forhold til ikke-transfomerte celler. Vanligvis så inneholder imidlertid vektoren eller kassetten sekvenser som styrer transkripsjon og translasjon av det relevante genet eller genene, en selekterbar markør og sekvenser som tillater autonom replikering eller kromosomal integrering. Passende vektorer omfatter en region 5' for genet som kontrollerer transkripsjonen initiering og en region 3' for DNA fragmentet som kontrollerer transkripsjonen terminering. Det er mest å foretrekke når begge kontrollregioner er utledet fra gener fra den transformerte vertscellen selv om det må forstås at slike kontrollregioner ikke trenger være utledet fra genene som er native for den spesifikke arten som er valgt som en produksjonsvert (se for eksempel USSN 10/840579 for en oversikt over nyttige initieringskontrollregioner og terminatorer). I noen foretrukne utførelsesformer så blir imidlertid de transkripsjonelle initieringsregulatoriske regionene skaffet til veie fra glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (USSN 10/869630, samtidig behandlende USA patent søknadsnummer 11/183664), fosforglyseratmutase (USSN 10/869630), fruktosebisfosfataldolase (USSN 10/987548), glycerol-3-fosfat O-acyltransferase (USA patentsøknadsnummer 60/610060), ammoniumtransportørproteiner (samtidig behandlede USA patentsøknadsnummer 11/185301) og translasjonselongeringsfaktor EF l-a (TEF) proteinet (USA 6.265.185).

Som en fagperson er klar over så vil ikke en innsetting av et gen inn i en kloningsvektor sikre at den vil bli vellykket uttrykt på det nivået som er nødvendig. Som respons for

behovet for en høy uttrykshastighet, så er mange spesialiserte uttryksvektorer blitt laget ved å manipulere en rekke forskjellige genetiske elementer som kontrollerer aspekter av transkripsjon, translasjon, proteinstabilitet, oksygenbegrensning og utskillelse fra vertscellen. Mer spesifikt så inkluderer noen av de molekylære trekkene som er blitt manipulert til å kontrollere genuttrykk 1) naturen til den relevante transkripsjonelle promotoren og terminatorsekvenser, 2) antallet kopier av det klonede genet og om genet er plasmidbåret eller integrert inn i genomet til vertscellen, 3) den endelige cellulære lokaliseringen av det syntetiserte fremmede proteinet, 4) effektiviteten av translasjon i vertsorganismen, 5) den indre stabiliteten til det klonede genproteinet innen vertscellen; og 6) kodonbruken innen det klonede genet slik at dets frekvens nærmere seg frekvensen som er foretrukket kodonbruk av vertscellen. Hver av disse typer med modifikasjoner er beskrevet heri som måter for videre å optimalisere uttrykk av Ci6/i8fettsyreelongasen som er beskrevet her.

Foretrukne mikobielle verter for rekombinant uttrykk av C16/ 18 fettsyreelongaser

Vertsceller for uttrykk av det foreliggende C16/18fettsyreelongasegenet og nukleinsyrefragmenter kan inkludere mikrobielle verter som gror på en rekke næringsstoffer, inkludert enkle eller komplekse karbohydrater, organiske syrer og alkoholer og/eller hydrokarboner over et vidt område med henblikk på temperatur og pH verdier. Selv om genet som er beskrevet i den foreliggende oppfinnelsen er blitt isolert for uttrykk i en oljeaktig gjær og spesielt i Yarrowia lipolytika, så blir det overveid at fordi transkripsjon, translasjon og protein biosynteseapparatet er veldig konservert, så vil enhver bakterie, gjær, alger og/eller filamentøs sopp være en passende vert for uttrykk av de foreliggende nukleinsyrefragmentene.

Foretrukne mikrobielle verter er oljeaktige organismer slik som oljeaktig gjær. Disse oljeaktige organismer er naturlig i stand til oljesyntese og akkumulering, hvor det totale oljeinnholdet kan omfatte mer enn ca 25 % av den cellulære tørrvekten, mer ønskelig mer enn ca 30 % av den cellulære tørrvekten og mest ønskelig mer enn ca 40 % av den cellulære tørrvekten. I tillegg så er det en basis for anvendelsen av disse organismer for produksjonen av PUFAer som ses i USSN 10/840579 og samtidig behandlende USA patent søknadsnummer 60/624812.

Slekter som vanligvis identifiseres som oljeaktig gjær inkluderer men er ikke begrenset til Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon og Lipomyces. Mer spesifikt, illustrativ oljesyntetisering gjær inkluderer Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkeyii, L lipoferus, Candida revkauft, C pulcherrima, C tropicalis, C utilis, Trichosporon pullans, T cutaneum, Rhodotorula glutinus, R graminis og Yarrowia lipolytica (tidligere klassifisert som Candida lipolyticd).

Mest foretrukket er den oljeaktige gjæren Yarrowia lipolytika; og i en videre utførelses-form så er de Y. lipolytika stammene som er mest foretrukne benevnet som ATCC #20362, ATCC #8862, ATCC #18944, ATCC #76982, ATCC #90812 og/eller LGAM S(7)l (Papanikolaou S, and Aggelis G., Bioresour. Technol 82(1) 43-9 (2002))

Transformasjon av mikrobielle verter

Med en gang DNAet som koder for et polypeptid som er passende for uttrykk i en oljeaktig gjær er blitt skaffet til veie så blir det plassert i en plasmidvektor som er i stand til autonom replikering i en vertscelle eller så blir det direkte integrert inn i genomet til vertscellen. Integrering av uttrykkskassetter kan skje tilfeldig innen vertsgenomet eller de kan være målrettet gjennom anvendelsen av konstruksjoner som inneholder regioner med homologi med vertsgenomet som er tilstrekkelig til målrettet rekombinasjon med vertens lokus. Der hvor konstruksjonene er målrettet til et endogent lokus, så kan alle eller noen av de transkripsjonelle og translasjonelle regulatoriske regionene tilveiebringes av det endogene lokuset.

Der hvor to eller flere gener uttrykkes fra separate replikerende vektorer så er det ønskelig at hver vektor har en forskjellig måte å selekteres på og bør mangle homologi med den andre konstruksjonen eller konstruksjonene for å opprettholde stabilt uttrykk og forhindre gjensortering av elementer blant konstruksjoner. Kjønnsomt valgt av regulatoriske regioner, seleksjonsmåter og fremgangsmåter for propagering av den introduserte konstruksjonen eller konstruksjonene kan eksperimentelt bestemmes slik at alle introduserte gener uttrykkes i de nødvendige nivåene for å tilveiebringe syntesen av de ønskede produktene.

Konstruksjoner som omfatter Ci6/i8fettsyreelongasegen av interesse kan introduseres inn i en vertscelle ved hjelp av enhver standard teknikk. Disse teknikker inkluderer transformasjon (for eksempel litiumacetattransformasjon[Me^//o^i$, in Enzymology, 194 186-187 (1991)]), protoplastfunksjon, biolistisk sammenstøt, elektroporering, mikro-injeksjon eller enhver annen fremgangsmåte som introduserer gener av interesse inn i vertscellen. Mer spesifikke læringer som er brukbare for oljeaktig gjær (dvs. Yarrowia lipolytika) inkluderer USA patentnumrene 4.880.741 og 5.071.764 og Chen, D C et al., ( ApplMicrobiol Biotechnol 48(2) 232-235 (1997)).

For letthetsskyld så vil en vertscelle som er blitt manipulert ved hjelp av enhver fremgangsmåte som tar opp en DNA sekvens (for eksempel en uttrykkskassett) refereres til som "transformert" eller "rekombinant" her. Den transformerte verten vil ha minst en kopi av uttrykkskonstruksjonen og kan ha to eller flere, avhengig av om genet er integrert inn i genomet, oppformert eller er til stede på et ekstrakromosomalt element som har flere kopinummer. Den transformerte vertscellen kan identifiseres ved forskjellige seleksjonsteknikker som beskrevet i USSN 10/840579 og USSN 10/869630. Noen foretrukne seleksjonsfremgangsmåter for anvendelser her er resistens for kana-mycin, hygromycin og aminoglykosid G418 så vel som evnen til å gro i media som mangler uracil, leucin, lysin, tryptofan og histidin.

Etter transformering så kan substrater som er passende for den foreliggende C16/18fettsyreelongasen (og valgfritt andre PUFA enzymer som kouttrykkes innen vertscellen) produseres av verten enten naturlig eller transgent eller så kan de tilveiebringes eksogent.

Fermenteringsprosesser for stearinsvreproduksion

Den transformerte mikrobielle vertscellen dyrkes under betingelser som optimaliserer aktivitet av fettsyrebiosyntetiske gener og produserer det største og mest økonomiske utbytte av fettsyrer (for eksempel stearinsyre som igjen kan øke produksjonen av forskjellige co-3 og/eller co-6 fettsyrer). Generelt så inkluderer mediebetingelser som kan optimaliseres typen og mengden karbonkilde, typen og mengden nitrogenkilde, karbon-til-nitrogen forholdet, oksygennivået, veksttemperatur, pH, lengde av biomasse-produksjonsfasen, lengde av oljeakkumuleringsfasen og tidspunktet for cellehøsting. Mikroorganisme av interesse slik som oljeaktig gjær, styrkes i kompleksmedium (for eksempel gjærekstrakt-pepton-dekstrosebuljong (YPD)) eller et definert minimalt medium som mangler en komponent som er nødvendig for vekst som dermed tynger seleksjon av de ønskede uttrykkskassertene (for eksempel Yeast Nitrogen Base (DIFCO Laboratories, Detroit, MI)).

Fermenteringsmedium i den foreliggende oppfinnelsen må inneholde en passende karbonkilde. Passende karbonkilder kan inkludere men er ikke begrenset til mono-sakkarider (for eksempel glukose, fruktose), desakkarider (for eksempel laktose eller sukrose), oligosakkarider, polysakkarider (for eksempel stivelse, cellulose eller blandinger av dem), sukkeralkoholer (for eksempel glyserol) eller blandinger fra forny-bare næringsstokker (for eksempel ostemysepemeat, mais"steep"brennevin, sukkerbete-melasse, byggmalt). I tillegg så kan karbonkilder inkludere alkaner, fettsyrer, estere av fettsyrer, monoglyserider, diglyserider, triglyserider, fosfolipider og diverse kommersielle kilder for fettsyrer som inkluderer vegetabilske oljer (for eksempel soyabønneolje) og dyrefett. Videre så kan karbonsubstratet inkludere en-karbon substrater (for eksempel karbondioksid eller metanol) som metabolsk omdannelse til nøkkelbiokjemiske intermediater er blitt vist for. Følgelig så blir det overveid at kilden for karbon benyttet i den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte en rekke karbon-inneholdende substrater og vil kun være begrenset av valget av vertsorganismen. Selv om alle av de ovenfor nevnte karbonsubstratene og blandingene av dem er forventet å være passende i den foreliggende oppfinnelsen så er foretrukne karbonsubstrater sukkere og/eller fettsyrer. Mest foretrukket er glukose og/eller fettsyrer som inneholder mellom 10-22 karboner.

Nitrogen kan leveres fra en uorganisk (for eksempel (NEL^SCh) eller organisk (for eksempel urea eller glutamat) kilde. I tillegg til passende karbon og nitrogenkilder så må fermenteringsmediene også inneholde passende mineraler, salter, kofaktorer, buffere, vitaminer og andre komponenter som er kjent for fagfolk, passende for vekten av mikroorganismer og som fremmer de enzymatiske reaksjonsveiene som er nødvendig for PUFA produksjon. Spesiell oppmerksomhet er gitt til flere metallioner (for eksempel Mn _l_2 , Co ~\~' 2i , Zn ~f~2 , Mg j ry) som fremmer syntesen av lipider og PUFAer (Nakahara, T et al., IndAppl. Single Cell Oils, D J Kyle and R Colin, eds s. 61-97

(1992)).

Foretrukne vekstmedia i den foreliggende oppfinnelsen er vanlige kommersielt lagde medier slik som gjærnitrogenbase (DIFCO Laboratories, Detroit, MI). Andre definerte eller syntetiske vekstmedia kan også anvendes og det passende medie for vekst av den bestemte mikroorganismen vil være kjent av fagfolk innen mikrobiologi eller fermenteringsvitenskap. Et passende pH område for fermenteringen er vanligvis mellom ca pH 4,0 til pH 8,0 mens pH 5,5 til pH 7,0 er foretrukket som område for de initielle vekstbetingelsene. Fermenteringen kan utføres under aerobe eller anaerobe betingelser, mens mikroaerobe betingelser er foretrukket.

Vanligvis så krever akkumulering av høye nivåer av PUFAer i oljeaktige gjærceller en totrinns prosess fordi den metabolske tilstanden må være "balansert" mellom vekst og syntese/lagring av fett. Mest ønskelig så er dermed en totrinns fermenteringsprosess nødvendig for produksjonen av PUFAer i oljeaktig gjær. Denne tilnærmingsmåten er beskrevet i WO 2004/101757 det er også forskjellige passende fermenteringsprosess-design (dvs. batch, forings-batch og kontinuerlig) og betraktninger under vekst.

Rensing av PUFAer

Fettsyrer, som inkluderer PUFAer, kan finnes i vertsmikroorganismen som frie fettsyrer eller i esterifiserte former slik som acylglyceroler, fosfolipider, sulfolipider eller glykolipider og kan ekstraheres fra vertscellen gjennom en rekke velkjente måter i fagfeltet. En oversikt over ekstraksjonsteknikker, kvalitetsanalyse og akseptable standarder for gjær lipider er den til Z Jacobs ( Critical Reviews in Biotechnology 12(5/6) 463-491 (1992)) Et kort overblikk over nedstrømsprosessering er også tilgjengelig ved A Singh and O Ward ( Adv. Appl. Microbiol 45 271-312 (1997)).

Generelt så kan måter for rensingen av PUFA inkludere ekstraksjon med organiske løsemidler, sonikering, superkritisk væskeekstraksjon (for eksempel ved å anvende karbondioksid), saponifisering og fysikalske måter slik som presser eller kombinasjoner dem. Man refererer til læringene til WO 2004/101757 for tilleggsdetaljer.

BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

Det ultimate mål med arbeidet som er beskrevet her er utviklingen av en oljeaktig gjær som akkumulerer oljer som er anriket i co-3 og/eller co-6 PUFA. For å nå dette mål så må fettsyreelongaser identifiseres som fungerer effektivt i oljeaktig gjær, for å mulig-gjøre syntese og høy akkumulering av foretrukne PUFAer i disse verter. I tidligere arbeid så overuttrykte søkerne et rotte Ci6/i8fettsyreelongaseprotein (rEL02 fra Rattus norvegicus, GenBank tilgangsnummer AB071986) og selv om rEL02 var vellykket uttrykt i Yarrowia lipolytika som en måte for å øke produksjonen av nedstrøms PUFAer (USA patentsøknadsnummer 60/624812), så bidro ikke tilstedeværelsen av dette gen i den transformerte verten til tilgangen av regulatoriske godkjenninger. Som et resultat av dette så ble det foreliggende arbeidet gjort for å identifisere en mer passende C16/18fettsyreelongase.

Et cDNA fragment ble identifisert i et eid Mortierella alpina cDNA bibliotek basert på BLAST analyser. Den kodende regionen av genet (tentativ kaldt "elo3") ble overuttrykt i Yarrowia lipolytika under kontrollen av en sterk nativ promotor og resulterte dermed i transformanter som produserte 35 % mer Cl8 fettsyrer (18:0, C18:l,C18:2og GLA) og 31 % mindre Cl6 fettsyrer enn kontrollstammene. Disse data viste dermed atM alpina EL03 anvender Cl6 fettsyrer som substrater for å produsere Cl 8 fettsyrer.

Det er forventet avM alpina EL03 vil være passende for å øke karbonstrømmen inn i den co-3/co-6 fettsyrebiosyntetiske reaksjonsveien og dermed øke lenger kjedefettsyre-oljeinnhold i konstruerte Yarrowia stammer. En utførelsesform i oppfinnelsen er dermed en fremgangsmåte for å forandre fettsyreprofiler i en oljeaktig gjær hvor detM alpina EL03 uttrykkes alene eller i kombinasjon med andre PUFA biosyntetiske reaksjonsveier (for eksempel A9 desaturase, Al 2 desaturase, A6 desaturase, C18/20fettsyreelongase, A5 desaturase, Al 7 desaturase, C20/22fettsyreelongase, A4 desaturase, Al 5 desaturase, A9 fettsyreelongase og/eller A8 desaturase) for å muliggjør øket produksjon av langkjede PUFA (for eksempel LA, ALA, EDA, GLA, STA, ETrA, DGLA, ETA, ARA, EP A, DPA og/eller DHA)

EKSEMPLER

Den foreliggende oppfinnelsen er videre definert i de følgende eksempler. Det bør forstås at disse eksempler mens de indikerer foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, kun er gitt for illustrasjon.

GENERELLE FREMGANGSMÅTER

Standard rekombinante DNA og molekylære kloningsteknikker anvendt i eksemplene er velkjente i fagfeltet og beskrevet av 1) Sambrook, J, Fritsch, E F and Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY (1989) (Maniatis); 2) T J Silhavy, M L Bennan, and L W Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY (1984), og 3) Ausubel, F M et al., Current Protocols in Molecular Biology, publisert av Greene Publishing Assoc and Wiley-lnterscience (1987).

Materialer og fremgangsmåter som er passende for opprettholdelsen og veksten av bakterielle kulturer er velkjent i fagfeltet. Teknikker som er passende for anvendelse i de følgende eksemplene kan finnes satt frem i Manual of Methods for General BacterioloRv (Philhpp Gerhardt, R. G E Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W Nester, Willis A Wood, Noel R Krieg and G Briggs Phillips, Eds), American Society for Microbiology Washington, D C (1994)), eller ved Thomas D Brock i Biotechnology A Textbook of Industrial Microbiologv. 2. utg., Sinauer Associates Sunderland, MA

(1989). Alle reagenser, restriksjonsenzymer og materialer anvendt for veksten og opprettholdelsen av bakterielle celler ble skaffet til veie fra Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) eller Sigma Chemical Company (St Louis, MO), med mindre annet er spesifisert.

E. coli TOP10 celler og E. coli Elektromax DH10B celler ble skaffet til veie fra Invitrogen (Carlsbad, CA) Max Efficiency kompetente celler fra E. coli DH5a ble skaffet tilveie fra GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) E. coli (XLl-Blue) kompetente celler ble kjøpt fra Stratagene Company (San Diego, CA). Alle E. coli stammer ble vanligvis dyrket ved 37°C på Luria Bertani (LB) plater.

Generell molekylær kloning ble utført i henhold til standard fremgangsmåter (Sambrook et al., supra). Oligonukleotider ble syntetisert ved Sigma-Genosys (Spring, TX) PCR produkter ble klonet inn i Promega's pGEM-T-easy vektor (Madison, WI).

DNA sekvens ble generert på en ABI automatisk sekvensmaskin ved å anvende farge-terminator teknologi (U S 5.366.860, EP 272.007) ved å anvende en kombinasjon av vektor og innskuddsspesifikke primere. Sekvensredigering ble utført i Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Alle sekvenser representerer dekning minst to ganger i begge retninger. Sammenligning av genetiske sekvenser ble utført ved å anvende DNASTAR software (DNASTAR Inc., Madison, WI).

Betydningen av forkortelser er som følger: "sec" betyr sekund eller sekunder, "min" betyr minutt eller minutter, "h" betyr time eller timer, "d" betyr dag eller dager, "ul" betyr mikro liter, "ml" betyr milliliter, "1" betyr liter, "uM' betyr mikromolar, W betyr millimolar, "M' betyr molar, "mmol" betyr millimol, "umol" betyr mikromol, "g" betyr gram, "ug" betyr mikrogram, "ng" betyr nanogram, "U" betyr enhet eller enheter, "bp" betyr basepar og "kb" betyr kilobase eller kilobaser.

Dyrking av Yarrowia lipolytika

Yarrowia lipolytika stammer ATCC #76982 og ATCC #90812 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) Y lipolytika stammer ble vanligvis styrket ved 28°C på YPD agar (1 % gjærekstrakt, 2 % baktopepton, 2 % glukose, 2 % agar).

Transformering av Yarrowia lipolytika ble utført i henhold til fremgangsmåten til Chen, D C et al. ( Appl. MicrobiolBiotechnol 48(2) 232-235 (1997)) med mindre annet er skrevet. I korthet så ble Yarrowia strøket ut på en YPD plate og dyrket ved 30°C i ca 18 timer. Flere store øser med celler ble skrapet fra platen og resuspendert i 1 ml trans-formeringsbuffer som inneholdt 2,25 ml 50 % PEG, gjennomsnittlig MW 3350, 0,125 ml 2 M Li acetat, pH 6,0, 0,125 ml 2 M DTT, og 50 ug fragmentert laksesperm DNA. Deretter så ble ca 500 ng linearisert plasmid DNA innkubert i 100 ul resuspenderte celler og ble opprettholdt ved 39°C i 1 time med vorteksblanding ved 15 minutters inter-valler. Cellene ble platet på seleksjonsmediumplater og opprettholdt ved 30°C i 2 til 3 dager.

For seleksjon av transformanter så ble minimalt medium ("MM') vanligvis anvendt hvor sammensetningen av MM er som følger: 0,17 % gjær nitrogenbase (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) uten ammoniumsulfat eller aminosyrer, 2 % glukose, 0,1 prolin, pH 6,1). Uracil ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,01 % (dermed ble "MMU" seleksjonsmedium produsert, laget med 20 g/l agar).

Alternativt så ble transformanter valgt på 5-fluoroorotinsyre ("FOA", også 5-fluoruracil-6-karboksylsyremonohydrat) seleksjonsmedium som omfatter 0,17 % gjær nitrogenbase (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) uten ammoniumsulfat eller aminosyrer, 2 % glukose, 0,1 % prolin, 75 mg/l uracil, 75 mg/l uridin, 900 mg/l FO A (Zymo Research Corp, Orange, CA) og 20 g/l agar.

Til slutt ble mediumet høy glukose ("HGM") laget som følger: 14 g/l KH2P04, 4 g/lK2HP04, 2 g/l MgS047H20, 80 g/l glukose (pH 6,5). Dette medium ble designet for å fremme betingelser for oljeaktighet.

Fettsvreanalvse av Yarrowia lipolytika

For fettsyreanalyse så ble celler samlet ved sentrifugering og lipder ble ekstrahert som beskrevet i Bligh, E G & Dyer, W J. (Can. J. Biochem. Physiol. 37.911-917 (1959)). Fettsyremetylestere ble laget ved transesterifisering av lipidekstraktet med natriummetoksid (Roughan, G, and Nishida I Arch Biochem Biophys 276(1) 38-46 (1990)) og deretter analysert med en Hewlett-Packard 6890 GC tilpasset med en 30-m X 0,25 mm (i d ) HP-INNOWAX (Hewlett-Packard) kolonne. Ovnstemperaturen var på 170°C (25 min hold) til 185°C ved 3,5°C/min.

For direkte basetransesterifisering så ble Yarrowia kultur (3 ml) høstet, vasket en gang i destillert vann og tørket under vakuum i en Speed-Vac i 5-10 min. Natriummetoksid (100 ul av 1 %) ble tilsatt til prøven og deretter ble prøven vortekset og ristet i 20 minutter. Etter tilsetting av 3 dråper 1 M NaCl og 400 ul heksan ble prøven vortekset og spunnet. Det øverste laget ble fjernet og analysert med GC som beskrevet over.

EKSEMPEL 1

Konstruksjon av et Mortierella alpina cDNA bibliotek

Det foreliggende eksempelet beskriver konstruksjonen av et cDNA bibliotek av Mortierella alpina ved å anvende BD-Clontech Creator Smart<®>cDNA bibliotekkittet (Mississauga, ON, Kanada), i henhold til produsentens protokoll.

Spesifikt så bleM alpina stamme ATCC #16266 dyrket i 60 ml i YPD medium (2 % Bakto-gjærekstrakt, 3 % baktor-pepton, 2 % glukose) i 3 dager ved 23°C. Cellene ble pelletert ved sentrifugering ved 3750 rpm i en Beckman GH3 8 rotor i 10 minutter og resuspendert i 6X 0,6 ml Trizolreagens (Invitrogen). Resuspenderte celler ble overført til seks 2 ml rør med skrukork som hver inneholdt 0,6 ml 0,5 mm glasskuler. Cellene ble homogenisert med HOMOGENISERING settingen på en Biospec (Bartlesville, OK) mini kule banker i 2 minutter. Rørene ble kort spunnet for å bunnfelle kulene. Væske ble overført til 4 nye 1,5 ml mikrofugerør og 0,2 ml kloroform/isoamylalkohol (24:1) ble tilsatt til hvert rør. Rørene ble ristet for hånd i 1 minutt og sto i 3 minutter. Rørene ble så spunnet ved 14.000 rpm i 10 minutter ved 4°C. Det øvre laget ble overført til fire nye rør. Isopropyl:alkohol (0,5 ml) ble tilsatt til hvert rør. Rørene ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter, etterfulgt av sentrifugering ved 14.000 rpm og 4°C i 10 minutter. Pelletsene ble vasket med 1 ml hver av 75 % etanol (laget med RNase-fritt vann) og lufttørket. Total RNA prøven ble så oppløst i 500 ul vann og mengden RNA ble valgt ved A260 nm ved å anvende 1:50 fortynnet RNA prøve. Totalt så ble 3,14 mg RNA skaffet tilveie.

Denne totale RNA prøve ble videre renset med Qiagen RNeasy totalt RNA Midikitt ved å følge produsentens protokoll. Den totale RNA prøven ble dermed fortynnet til 2 ml og blandet med 8 ml buffer RLT med 80 ul P-merkaptoetanol og 5,6 ml 100 % etanol. Prøven ble delt i 4 deler og ladet på RNeasy midikolonner. Kolonnen ble så sentrifugert 1 5 minutter ved 4500Xg. For å vaske kolonnene så ble 2 ml buffer RPE ladet og kolonnene ble sentrifugert i 2 minutter ved 4500Xg. Vasketrinnet ble repetert en gang unntatt at sentrifugeringstiden ble utvidet til 5 minutter. Total RNA ble eluert med å bruke 250 ul RNasefritt vann på hver kolonne, vente 1 minutt og sentrifugere ved 4500Xg i 3 minutter.

PolyA(+)RNA ble så isolert fra den ovenfor nevnte total RNA prøven ved å følge protokollen til Amersham Biosciences' mRNA rensekitt. I korthet så ble 2 oligo-dT-cellulosekolonner anvendt. Kolonnene ble vasket to ganger med 1 ml hver med høy buffer med høyt saltinnhold. Total RNA prøven fra det tidligere trinnet ble fortynnet til 2 ml totalt volum og justert til 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA. Prøven ble varmet ved 65°C i 5 minutter og deretter plassert på is. Prøvebuffer (0,4 ml) ble tilsatt og prøven ble så ladet på 2 oligo-dT-cellulosekolonner med naturlig fall. Kolonnene ble sentrifugert ved 350Xg i 2 minutter, vasket to ganger med 0,25 ml hver med buffer med høyt saltinnhold, hver gang etterfulgt av sentrifugering med 350Xg i 2 minutter. Kolonnene ble videre vasket tre ganger med en buffer med lavt saltinnhold etterfulgt av den samme sentrifugeringsrutinen. Poly(A)+RNA ble eluert ved å vaske kolonnen 4 ganger med 0,25 ml hver av elueringsbuffer som på forhånd var varmet til 65°C, etterfulgt av den samme sentrifugeringsprosedyren. Hele renseprosessen ble repetert en gang. Renset poly(A)+RNA ble skaffet tilveie med en konsentrasjon på 30,4 ng/ul. cDNA ble generert ved å anvende LD-PCR fremgangsmåten spesifisert av BD-Clontech og 0,1 jig polyA(+) RNA prøve. Spesifikt så ble for første tråd cDNA syntese, 3 ul poly(A)+RNA prøve blandet med en mikroliter SMART IV oligonukleotid (SEK ID NR 3) og 1 ul CDSin/3' PCR primer (SEK ID NR 4). Blandingen ble varmet ved 72°C 1 2 minutter og nedkjølt på is i 2 minutter. Til røret ble det tilsatt følgende: 2 ul første trådbuffer, 1 ul 20 mM DTT, 1 ul 10 mM dNTP blanding og 1 ul Powerscript revers transkriptase. Blandingen ble innkubert ved 42°C i 1 time og nedkjølt på is.

Første tråd cDNA synteseblandingen ble anvendt som templat for PCR reaksjonen. Spesifikt så inneholdt reaksjonsblandingen følgende: 2 ul av første tråd cDNA blandingen, 2 ul 5'-PCR primer (SEK ID NR: 5), 2 ul CDSIU/3'-PCR primer (SEK ID NR: 4), 80 ul vann, 10 u 10X Advantage 2 PCR buffer, 2 ul 50X dNTP miks og 2 ul 50XAdvantage 2 polymerase blanding. Termosykleringsbetingelsene ble satt for 95°C i 20 sekunder etterfulgt av 14 sykler med 95°C i 5 sekunder og 68°C i 6 minutter på et GenAmp 9600 instrument. PCR produkt ble kvantifisert ved hjelp av agarosegel elektroforese og etidiumbromidfarging. 75 ul av de ovenfor nevnte PCR produktene (cDNA) ble blandet med 3 ul 20 ug/ul proteinase K supplementert med kittet. Blandingen ble innkubert ved 45°C i 20 minutter og deretter ble 75 ul vann tilsatt og blandingen ble ekstrahert med 150 ul fenol:kloro-form:isoamylalkohol blanding (25:24:1). Den vandige fasen ble videre ekstrahert med 150 ul kloroform:isoamylalkohol (25:1). Den vandige fasen ble så blandet med 15 ul 3 M natriumacetat, 2 ul 20 ug/ul glykogen og 400 ul 100 % etanol. Blandingen ble øye-blikkelig sentrifugert ved romtemperatur i 20 minutter ved 14.000 rpm i en mikrofuge. Pelleten ble vasket en gang med 150 ul 80 % etanol, lufttørket og oppløst i 79 ul vann.

Oppløst cDNA ble deretter kuttet med Sfil (79 ul av cDNA ble blandet med 10 ul 10X Sfil buffer, 10 ul Sfil enzym og 1 ul 100X BSA og blandingen ble innkubert ved 50°C i 2 timer). Xylen cyanolfarge (2 ul av 1 %) ble tilsatt. Blandingen ble så fraksjonert på Chroma Spin-400 kolonne tilveiebrakt med kittet etter produsentens nøyaktige prose-dyre. Fraksjoner samlet fra kolonnen ble analysert på agarosegelelektroforese. De første tre fraksjonene som inneholdt cDNA ble slått sammen og cDNA presipitert med etanol. Det presipiterte cDNA ble oppløst igjen i 7 ul vann og ligert inn i det kittleverte pDNR-LIB.

Bibliotekssekvensering

Ligeringsproduktene ble anvendt for å transformere E. coli XL-1 Blue elektroporerings-kompetente celler (Stratagene). En estimert totalmengde på 2 x IO6 kolonier ble skaffet tilveie. Sekvensering av cDNA biblioteket ble utført ved Agencourt Bioscience Corporation (Beverly, MA) ved å anvende en Ml 3 fremover primer (SEK ID NR: 6).

EKSEMPEL 2

Identifikasjon av en delvis fettsvreelongasesekvens fra Mortierella alpina

Det foreliggende eksempelet beskriver identifiseringen av en cDNA fragment (SEK ID NR: 7) som koder for en del av en M. alpina fettsyreelongase, fra blant 9984 cDNA sekvenser.

Identitet av sekvensen ble bestemt ved å utføre BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul, S F , et al., J Mol Biol 215403-410 (1993)) søk avM alpina cDNA sekvenser for likhet med sekvenser som finnes i BLAST "nr" databasen (som omfatter alle ikke-overflødige GenBank CDS translasjoner, sekvenser utledet fra den 3-dimensjonale struktur Brookhaven Protein Data Bank, the SWISS-PROT protein-sekvensdatabasen, EMBL og DDBJ databaser). cDNA sekvenser ble translatert i alle leserammer og sammenlignet for likhet til alle offentlig tilgjengelige proteinsekvenser som finnes i "nr" databasen ved å anvende BLASTX algoritmen (Gish, W and States, D J Nature Genetics 3 266-272 (1993)) tilveiebrakt av NCBI. Et cDNA fragment (SEK ID NR 7) bar signifikant homologi til en rekke fettsyreelongaser og ble dermed tentativt identifisert som en elongase.

Resultatene til BLAST sammenligningen som oppsummerer sekvensen som SEK ID NR: 7 har den største likheten med er rapportert i henhold til % identitet, % likhet, og forventet verdi. "% identitet" er definert som prosenten av aminosyrer som er identiske mellom de to proteinene. "% likhet" er definert som prosenten av aminosyrer som er identiske eller konserverte mellom de to proteinene. "Forventet verdi" estimerer den statistiske signifikansen av treffet, og spesifiserer antallet treff med en gitt skår som er forventet i et søk i en database av denne størrelse absolutt ved tilveldighet. Dermed så hadde den translaterte aminosyresekvensen i SEK ID NR: 7 32 % identitet og 46 % likhet med proteinsekvensen til en potensiell fettsyreelongase fra Candida albicans SC5314 (GenBank tilgangsnr EAL04510 1, annotert som en av tre potensielle fettsyre-elongasegener lignende S. cerevisiae EUR4, FEN1 og ELOl), med en forventet verdi på 4 x IO"13.1 tillegg så hadde SEK ID NR: 7 35 % identitet og 53 % likhet med ELOl fra Saccharomyces cerevisiae (GenBank tilgangsnummer NC 001142, baser 67849-68781 på kromosom X). S. cerevisia ELOl er beskrevet som en medium kjede acylelongase som katalyserer karboksyterminal elongering av umettede C12-C16 fett acyl-CoAs til C16-C18 fettsyrer.

På basis av homologien som er rapportert over så ble Yarrowia lipolytica genproduktet i SEK ID NR 7 betegnet her som "elongase 3" eller "EL03".

EKSEMPEL 3

Sekvensering av det fullstendige M. alpina EL03

Analyse av den delvise fettsyreelongase cDNA sekvensen (SEK ID NR: 7) indikerte at de 5' og 3'-endene var begge ufullstendige. For å skaffe tilveie de manglende regionene så ble genomspaseringsteknikker benyttet.

Genomspasering for å isolere den 3'- enderegionene tilM alpina ELQ3

Et Clontech Universal Genome Walker™ kitt ble anvendt for å skaffe tilveie en del av genomets DNA som korresponderer til den 3'-enderegionene avM alpina EL03.1 korthet så ble 2,5 ug hver avM alpina genomisk DNA fordøyd med Dral, EcoRV, Pvull eller Stul individuelt, de fordøyde DNA prøvene ble renset ved å anvende Qiagen Qiaquick PCR rensekittene og eluert med 30 ul hver av kittbuffer EB og de rensede prøvene ble så ligert med genomspaseringadaptor (SEK ID NR: 8 [topptråd] og 9 [bunntråd]), som vist under:

Hver ligeringsreaksjonsblanding inneholdt 1,9 ul 25 uM genomspaseringsadaptor, 1,6 ul 10X ligeringsbuffer, 0,5 ul T4 DNA ligase og 4 ul av en av de rensede kuttede genomiske DNA prøvene. Reaksjonsdanningene blir innkubert ved 16°C over natt. Reaksjonen ble terminert ved innkubering ved 70°C i 5 minutter. Deretter ble 72 ul 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 buffer tilsatt til hver ligeringsreaksjonsblanding.

Fire separate PCR reaksjoner ble utført som hver anvendte en av de fire ligerings-blandingene som templat. PCRreaksjonsblandingene inneholdt 1 ul ligeringsblanding, 0,5 ul 20 uM primer MA Elong 3'1 (SEK ID NR: 10), 1 ul 10 uM kittprimer API (SEK ID NR: 11), 22,5 ul vann og 25 ul ExTaq premiks Taq 2X PCR løsning (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, 520-2193, Japan). PCR reaksjonene ble utført i 32 sykluser ved å anvende de følgende betingelsene: denaturering ved 94°C i 30 sekunder, annealing ved 55°C i 30 sekunder og elongering ved 32°C i 3 minutter. En sluttelongeringssyklus ved 72°C i 7 minutter ble utført etterfulgt av reaksjonsterminering ved 4°C.

Produktene til hver PCR reaksjon ble fortynnet 1:50 individuelt og anvendt som templater for en andre runde med PCR. Hver reaksjonsblanding inneholdt 1 ul av en de fortynnede PCR produktene som templat, 0,5 ul 20 uM primer MA elong 3'2 (SEK ID NR: 12), 1 ul 10 uM kitt primer AP2 (SEK ID NR: 13), 22,5 ul vann og 25 ul ExTaq premiks Taq 2X PCR løsning (TaKaRa). PCR reaksjoner ble utført i 32 sykluser ved å anvende de samme termosykleringsbetingelsene som er beskrevet over.

Et 1041 bp DNA fragment ble skaffet tilveie fra den andre runden med PCR (SEK ID NR: 14). Dette fragment ble renset og klonet inn i pCR2 1-TOPO og sekvensert. Sekvensanalyse viste at fragmentet inneholdt den 3'-enden til EL03 inkludert~640 bp nedstrøms av 'TAA' stopp kodonet til genet.

Genomspasering for å isolere den 5'- enderegionene tilM. alpina ELQ3

Det samme settet med fire ligeringsblandinger anvendt i Clontech 3'-ende RACE ( supra) ble også anvendt for å skaffe tilveie den 5'-enderegionene avM alpina EL03. Spesifikt så ble en første runde med PCR som anvendte de samme komponentene og betingelsene som beskrevet over utført med det unntak at MA Elong 5' 1 (SEK ID NR: 15, nested ved den 5' enden) og API ble anvendt som primere (dvs. i stedet for primere MA Elong3'l og API). Den andre runden med PCR anvendte MA Elong 5'2 (SEK ID NR: 16, nested ved 5'-ende) og AP2 som primer. Et 2223 bp DNA fragment (SEK ID NR: 17) ble skaffet tilveie. Det ble renset og klonet inn i pCR2 1-TOPO og sekvensert. Analyse av sekvensen viste at det inneholdt den 5' regionene til EL03 genet.

Dermed så ble hele cDNA sekvensen tilM alpina EL03 (SEK ID NR: 1) skaffet tilveie ved å kombinere den opprinnelige delvise cDNA sekvensen (SEK ID NR: 7) med de overlappende 5' og 3'-sekvensene skaffet tilveie ved hjelp av genomspasering (henholdsvis SEK ID NR: 14 og 17, grafisk illustrert i fig. 1). Dette ga en sekvens på 3557 bp, identifisert her som SEK ID NR: 18, og omfattet 2091 bp oppstrøms for det putative

'ATG' translateringsinitieringskodonettil EL03, 828 bp EL03 ORF (dvs. SEK ID NR

1, korresponderer til baser 2092-2919 i SEK ID NR: 18) og 638 bp nedstrøms av EL03 stopp kodonet (som korresponderer til baser 2920-3557 i SEK ID NR: 18).

Den korresponderende genomiske sekvensen tilM aplina EL03 er lenger enn cDNA fragmentet tilveiebrakt som SEK ID NR: 18. Spesifikt så ble et 542 bp intron (SEK ID NR: 19) funnet i det genomiske DNAet som inneholdt EL03 genet ved 318 bp i ORF; dermed er det genomiske DNA fragmentet som tilveiebringes her som SEK ID NR: 29 4099 bp (Fig. 1).

Den translaterte EL03 proteinsekvensen (SEK ID NR: 2) hadde den følgende homologien til kjente fettsyreelongaser, basert på BLAST programanalyse { supra, Eksempel 2). 37 % identitet og 51 % likhet med den potensielle fettsyreelongasen fra Candida albicans SC5314 (GenBank tilgangsnummer EAL04510 1), med den forventede verdien på 4e-43.1 tillegg så delte det translaterte EL03 33 % identitet og 44 % likhet med proteinsekvensen i XP 331368 (annotert her som et "hypotetisk protein") fra Neurospora crassa med en forventet verdi på 3e-44.

EKSEMPEL 4

Generering av Yarrowia lipolytika ATCC # 20362 Stamme Y2031

Det foreliggende eksempelet beskriver konstruksjonen av stamme Y2031 utledet fra Yarrowia lipolytika ATCC #20362. Y2031 stamme ble generert ved integrering av et TEF Y A 12. Pex20 kimært gen fra plasmid pKUNT2 inn i Ura3 genlokuset til ATCC #20362 som dermed resulterte i en Ura-genotype. Plasmid pKUNT2 inneholdt de følgende komponentene:

pKUNT2 plasmidet ble kuttet med AscI/ SphI og deretter anvendt for transformasjon av villtype Y. lipolytika ATCC #20362 i henhold til de generelle fremgangsmåtene. De transformerte cellene ble på FOA seleksjonsmediumplater og holdt ved 37°C i 2 til 3 dager. De FOA resistente koloniene ble plukket og strøket ut på MM og MMU seleksjonsplater. Koloniene som kunne gro på MMU plater men ikke på MM plater ble selektert som URA-stammer. Enkle kolonier (5) av C/iL4-stammer ble så innokkulert inn i flytende MMU ved 30°C og ristet ved 250 rpm/min i 2 dager. Cellene ble samlet ved sentrifugering, lipider ble ekstrahert og fettsyremetylestere ble laget ved transesterifisering og deretter analysert med en Hewlett-Packard 6890 GC.

GC analyser viste at det var ca 45 % LA i to t/ra-stammer (stamme #2 og #3); sammenlignet med ca 20 % LA i villtype ATCC #20362. Transformantstamme #2 ble betegnet som stamme "Y2031".

EKSEMPEL 5

Heterologt uttrykk av Morterielle alpina fettsyre ELQ3 i

Yarrowia lipolytika stamme Y2031

Det foreliggende eksempelet beskriver overuttrykket avM alpina EL03 ORF i et kimært gen under kontrollen av en Y. lipolytika promotor i Y. lipolytika stamme Y2031, og effekten av overuttrykket bestemt ved en analyse av TAG innhold.

Konstruksjon av plasmid pZUF6S- E3WT. som omfatter et FBAIN ELQ3 PEX16- 3' Kimært gen. M. alpina fettsyre EL03 ORF ble klonet som følger. Primere MA Elong 5' Ncol 3 og MA Elong 3" Noti (SEK ID NR 23 og 24) ble anvendt for å oppformere EL03 ORF fra cDNA tilM. alpina (eksempel 1) ved hjelp av PCR. Reaksjonsblandingen inneholdt en mikroliter av cDNA, en mikroliter hver av primerne, 22 ul vann og 25 ul ExTaq premiks 2 X Taq PCR løsning (TaKaRa). Oppformulering ble utført som følger: initiell denaturering ved 94°C i 30 sekunder etterfulgt av 32 sykluser med denaturering ved 94°C i 30 sekunder, annealing ved 35°C i 30 sekunder og elongering ved 72°C i 120 sekunder. En sluttelongeringssyklus ved 72°C i 7 minutter ble utført etterfulgt av reaksjonsterminering ved 4°C. Et~830 bp DNA fragment ble skaffet tilveie fra PCR reaksjonen. Det ble renset ved å anvende et Qiagen (Valencia, CA) PCR rensekitt i henhold til produsentens protokoll. Det rensede PCR produktet ble oppdelt i 2 alikvoter hvor av en ble kuttet med Ncol og Nspl mens det andre ble kuttet med Nspl og Noti. De~270 bp Ncol- Nspl og~560 bp Nspl- Notl fragmentene ble klonet inn i pZF5T-PPC vektoren som var kuttet med Ncol- Notl (figur 2A; SEK ID NR 25) ved tredelsligering slik at genet var under kontrollen av Y. lipolytika FBAIN promotoren og den PEX16-3' terminatorregionen (GenBank tilgangsnummer U75433) i den autoreplikerende vektoren for uttrykk i Y. lipolytika. "FBAIN promotoren" refererer til den 5' oppstrøms ikke translaterte regionene foran "ATG" translasjoninitieringskodonet til et fruktose-bifosfat aldolaseenzym (EC 4 1 2 13) som kodes for av fbal genet og som er nødvendig for uttrykk, plus en del av den 5' kodede regionene som har et intron til fbal genet (se WO 2005/049805 for videre detaljer). Korrekte transformanter ble bekreftet ved miniprepanalyse og det resulterende plasmidet ble kalt "pZF5T-PPC-E3" (SEK ID NR: 26).

Plasmid pZF5T-PPC-E3 ble kuttet med Clal og PacI og det~2,2 kB båndet (dvs. FBAIN EL03 PEX16-3' fragmentet) ble renset fra en agarosegel ved å anvende et Qiagen gel ekstraksjonskitt. Fragmentet ble klonet inn i Clal- PacI kuttet pZUF6S figur 2B, SEK ID NR: 27), et autoreplikeringsplasmid som inneholder Mortierella alpina A6 desaturase ORF ("D6S" GenBank tilgangsnummer AF465281) under kontrollen av FBAIN promotoren med en Pex20-3' terminator (dvs. et FBAIN D6S. Pex20 kimært gen) og et Ura3 gen. Korrekte transformanter ble bekreftet ved miniprepanalyse og det resulterende plasmidet ble betegnet "pZUF6S-E3WT" (SEK ID NR: 28, Figur 2C).

Analyse av lipidinnhold i transformant Y . lipolytika som overuttrykker M alpina ELQ3

Y. lipolytika stamme Y2031 ble transformert med plasmid pZUF6S (kontroll som inneholder et FBAIN D6S Pex20 kimært gen) og plasmid pZUF6S-E3WT (som inneholder et FBAIN D6S Pex20 kimært gen og FBAIN EL03 PEX16 kimært gen) i henhold til de generelle fremgangsmåtene. Transformanter ble dyrket i to dager i syntetisk MM supplementert med aminosyrer, etterfulgt av 4 dager i HGM. Fettsyreprofilen til seks kloner som inneholdt pZUF6S (kloner #1-6, fra en enkel transformasjon) og 22 kloner (fra fire forskjellige transformasjoner [dvs. # 3, 5, 6 og 7]) som inneholder pZUF6S-E3WT er vist under i tabell 4 basert på GC analyse (som beskrevet i de generelle fremgangsmåtene). Fettsyrer er identifisert som 16:0 (palmitat), 16:1 (palmitoleinsyre), 18:0, 18:1 (oleinsyre), 18:2 (LA) og GLA og sammensettingen av hver er presentert som en prosent av de totale fettsyrene.

Noen av prøvene (merket i uthevet og kursiv) avvek fra forventede lesinger. Spesifikt så produserte verken Y2031+pZUF6S-E3WT #3-3 eller Y2031+pZUF6S-E3WT #5-6 GLA. På samme måte så hadde Y2031+pZUF6S-E3WT #7-1, #7-3 og #7-4 GC feil, hvor 16:0 og 16:1 toppene ble lest med GC som en enkel topp. Som et resultat av disse variantresultater så rapporterer tabell 5 den gjennomsnittlige lipide i kontrollen og transformantstammene som uttrykker EL03. Spesifikt så viser tabell 5 gjennomsnittet fra fettsyreprofilen i tabell 4 selv om linjene indikert ved uthevet og kursiv som å være ukorrekt i tabell 4 ikke ble inkludert når disse gjennomsnittene ble beregnet. "Total C16" representerer summen av gjennomsnittsområdene av 16:0 og 16:1 mens "total Cl8" reflekterer summen av gjennomsnittsområdene av 18:0, 18:1, 18:2 og GLA.

Basert på dataene rapportert over så resulterte overuttrykk avM alpina EL03 i en øket prosent av Cl8 og en redusert prosent av Cl6 når den ble samtidig uttrykt med enM alpina A6 desaturase i Yarrowia lipolytika stamme Y2031, i forhold til en kontroll-stamme med Y2031 som overuttrykker kun M. alpina A6 desaturasen. Dette indikerte at M. alpina EL03 virkelig var en Ci6/i8fettsyreelongase.

Det vil være klart for en fagperson at andre kimære gener kunne kouttrykkes medM alpina EL03 genet i konstruert Yarrowia for å øke produksjon av forskjellige andre fettsyrer. I tillegg til M alpina EL03 (som valgfritt kunne være kodon optimalisert for øket uttrykk), så kunne man for eksempel lett uttrykke en C14/16fettsyreelongase og/eller en A9 desaturase som en måte for å tillate oppreguleringen av karbonstrømning inn i lipidmetabolismen. I alternative utførelsesformer så kunne M alpina EL03 lett samtidig uttrykkes med enhver av de følgende PUFA biosyntetiske reaksjonsveigenene som inkluderer for eksempel en Al2 desaturase, en Al 5 desaturase, en A6 desaturase, en A5 desaturase, en A17 desaturase, en A9 fettsyreelongase, en A8 desaturase, en C18/20fettsyreelongase, en C20/22fettsyreelongase og/eller en A4 desaturase for å muliggjøre øket produksjon av forskjellige PUFAer (fig. 3).

Claims

1. Isolert nukleinsyremolekyl som koder for et Ci6/i8fettsyreelongase enzym,karakterisert vedat enzymet har minst 90 % identitet med en aminosyresekvens som satt frem i SEK ID NR: 2, eller et isolert nukleinsyremolekyl som er fullstendig komplementært dertil.

2. Isolert nukleinsyremolekyl ifølge krav 1karakterisertv e d at det er valgt fra gruppen som består av SEK ID NR: 1 SEK ID NR: 18 og SEK ID NR: 29.

3. Isolert nukleinsyremolekyl ifølge krav 1,karakterisertv e d at nevnte isolerte nukleinsyremolekyl koder for en aminosyresekvens som satt frem i SEK ID NR: 2.

4. Polypeptid,karakterisert vedat det kodes for av det isolerte nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.

5. Polypeptid ifølge krav 4,karakterisert vedat polypeptidet har en aminosyresekvens som satt frem i SEK ID NR: 2

6. Isolert nukleinsyremolekyl ifølge krav 1,karakterisertv e d at a) C16/18fettsyreelongaseenzymet omfatter minst 275 aminosyrer som har minst 90 % identitet basert på BLAST fremgangsmåten for oppstilling når sammenlignet med et polypeptid som har sekvensen satt frem i SEK ID NR: 2; eller b) nukleotidsekvensen omfatter komplementet til nukleotidsekvensen i a).

7. Transformert vertscelle som omfatter et kimært gen,karakterisert vedat nevnte kimære gen omfatter en regulatorisk sekvens som er operativt koblet til det isolerte nukleinsyremolekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller 6, hvori den regulatoriske sekvensen og nukleinsyremolekylet ikke finnes sammen i naturen.

8. Transformert vertscelle ifølge krav 7,karakterisertv e d at den er valgt fra gruppen bestående av alger, bakterier, sopp og gjær.

9. Transformert vertscelle ifølge krav 8,karakterisertv e d at vertscellen er en oljeaktig gjær.

10. Transformert vertscelle ifølge krav 9,karakterisertv e d at vertscellen er Yarrowia lipolytika.

11. Fremgangsmåte for produksjon av stearinsyre,karakterisertv e d at fremgangsmåten omfatter a) å tilveiebringe en oljeaktig gjær som omfatter en isolert nukleinsyre som koder for et polypeptid som har Ci6/i8fettsyreelongaseaktivitet som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller 6 under kontrollen av passende regulatoriske sekvenser, b) å tilveiebringe en kilde for elongasesubstrat som omfatter palmitat, c) å dyrke den oljeaktige gjæren fra trinn (a) med elongasesubstratet i (b) under betingelser hvor stearinsyre produseres; og d) valgfritt å gjenvinne stearinsyren i trinn (c).

12. Fremgangsmåte for produksjonen av polyumettede fettsyrer,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: a) å tilveiebringe en oljeaktig gjær som omfatter (I) en isolert nukleinsyre som koder for et polypeptid som har Ci6/18 fettsyreelongaseaktivitet som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller 6; og (II) gener som koder for en funksjonell polyumettet fettsyrebiosyntetisk reaksjonsvei, b) å tilveiebringe en kilde for elongasesubstrat som omfatter palmitat; og c) å dyrke den oljeaktige gjæren i trinn (a) med elongasesubstratet i (b) under betingelser hvor polyumettede fettsyrer produseres; og d) valgfritt å gjenvinne de polyumettede fettsyrene i trinn (c).

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat de polyumettede fettsyrene er valgt fra gruppen som består av linoleinsyre, gamma-linoleinsyre, eikosadienoinsyre, dihomo-gamma-linolensyre, arkidonsyre, alfa-linolensyre, stearidonsyre, eikosatrienoinsyre, eikosatetranoinsyre, eikosapentanoinsyre, dokosapentanoinsyre og dokosaheksanoinsyre.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat genene som koder for en funksjonell polyumettet fettsyre biosyntetisk reaksjonsvei koder for enzymer valgt fra gruppen som består av: delta-9 desaturase, delta-12 desaturase, delta-6 desaturase, Cig/20fettsyreelongase, delta-5 desaturase, delta-17 desaturase, C20/22fettsyreelongase, delta-4 desaturase, delta-15 desaturase, delta-9 fettsyreelongase og delta-8 desaturase.