NO340318B1 - Anvendelse av 24-nor-UDCA - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår nye anvendelser av 24-norursodeoksykolsyre (norUDCA), og er definert i patentkravene.

Ursodeoksykolsyre (UDCA), den naturlig forekommende gallesyren, som finnes i små mengder i gallen og i blodet hos mennesker, er et meget anvendt medikament for behandling av leversykdommer, hvor ett av de viktigste indikasjons områdene for UDCA, er oppløsning av gallesteiner og behandling av primær skrumplever (PBC) og primær skleroserende kolangitt (PSC). UDCA er en naturlig forekommende gallesyre med cytobeskyttende, membranstabiliserende og anti-apoptotiske effekter. Videre senker UDCA serumnivåer av bilirubin, transaminaser og alkalisk fosfatase som en markør på kolestase (Trauner & Graziadei 1999, Beuers & Paumgartner 2002).

Undersøkelser av UDCA hos pasienter som lider av leversykdommer, spesielt PBC-pasienter, har vist at administreringen av UDCA øker hastigheten av gallen fra hepatocyttene, og dette bekjemper kolestase og fortynner og hemmer toksiske gallesyrer, som i alt vesentlig er ansvarlig for de skader som oppstår på hepatocyttene. Videre er UDCA også i stand til å hemme immunresponsen ved leverreduserende immunologiske skader på gallegangene og leveren. UDCA, er som angitt ovenfor, regelmessig brukt for å behandle PSC og PBC.

PSC som i alt vesentlig oppstår eller angriper menn, er en inflammatorisk sykdom i gallegangene, som kan føre til kolestase (blokkering av galletransporten til tarmkanalen). Blokkeringen av gallegangene fører til akkumulering av gallesyre i leveren og i galleblæren, skader leveren og kan eventuelt forårsake leversvikt. De fleste av de pasienter som lider av PSC har også en kronisk inflammasjon i kolon (for eksempel colitis ulcerosa). Inflammasjonen av gallegangen kan også påvirke det omkringliggende levervevet og føre til arrdannelse på de små og store gallegangene, noe som fører til en forsnevring av gallegangen. En slik sammensnevring fører følgelig til en forstyrret utskillelse av galle som ytterligere skader leveren. Under selve leversykdommen kan det så utvikle seg cirrhose og kolangiokarsinom. PBC er også en inflammatorisk sykdom i gallegangene som først påvirker de små gallegangene men vil til slutt resultere i levercirrhose. I motsetning til PSC, så angriper PBC i alt vesentlig kvinner og er ikke korrelert med inflammatoriske sykdommer i kolon.

Den mest effektive fremgangsmåten for å behandle PBC og PSC er transplantasjon av leveren. Inntil nå har den eneste lovende farmakologiske behandlingen av begge sykdommer vært å anvende UDCA. UDCA er følgelig det eneste medikamentet som er godkjent for behandling av kolestatiske leversykdommer (Paumgartner & Beuers 2002). UDCA brukes i forbindelse med PBC i en dose på 12-15 mg/kg/dag (generelt 1000-1500 mg) administrert oralt én eller to ganger daglig. Denne anvendelsen er godkjent av U.S. Food and Drug Administration. Colchicin er dessuten blitt gitt i tillegg til UDCA-behandling. Colchicin er foreskrevet i en dose på 0,6 mg to ganger daglig på grunn av sine potensielle anti-inflammatoriske og anti-fibrotiske effekter. Flere undersøkelser har vist svake forbedringer i levertester ved å bruke colchicin. Ikke desto mindre har ingen kunnet påvise at dette er en fordel når det gjelder leverhistologien eller mulig overlevelse for PBC-pasientene. Methotrexat, et immunundertrykkende middel, er et annet medikament som er blitt testet i PBC. Det er blitt administrert i en dose på 15 mg/uke. I små undersøkelser har det vist seg at methotrexat bedrer symptomene, leverblodtester og progresjon av histologi når det brukes i flere år. Methotrexat forårsaker imidlertid alvorlige bivirkninger, inklusive benmargssupresjon, forverring av leversykdommen og potensielt fatal lungefibrose.

UDCA har begrenset effekt i PSC og har ikke vist seg å forlenge overlevelse (fri for levertransplantasjon Trauner & Graziadei 1999, Paumgartner & Beuers 2002). Pågående undersøkelser tester nå hvorvidt høydose UDCA kan være mer effektivt. Spesielt har det vist seg at UDCA reduserer risikoen for koloncancer hos pasienter med PSC og ulcerøs kolitt. Basert på hypotesen at PSC har en immunologisk årsak, er kortikosteroider og andre immunosupressive midler blitt testet. Orale kortikosteroider ga i begynnelsen en viss forbedring av den biokjemiske profilen. Mangel på bevis for en langtidsfordel så vel som bendemineralisering, er imidlertid et argument mot bruken av dette regimet. Andre medisiner så som azatioprin, ciclosporin som har vært testet sammen med kortikosteroider og UDCA, er aldri blitt bedømt alene i terapien av PSC. Methotrexat og D-penicillamin har også vist seg å være ineffektive. Den farmasøytiske terapien for PSC har derfor stadig et behov for å bli optimalisert (Trauner & Graziadei 1999, Beuers & Paumgartner 2002).

Endoskopisk behandling i PSC-pasienter med symptomatiske dominante forsnevringer, gallesteiner eller gallesteinsavfall anses å være en verdifull mulighet i tillegg til medisinsk behandling. PSC-pasienter som har vært underkastet endoskopisk behandling har forhøyet overlevelse, og denne var langt høyere enn det som var beregnet fra overlevelsesmodeller.

Ortotopisk levertransplantasjon er en effektiv terapi for PSC, og har hittil vært den eneste livreddende muligheten ved sluttstadium sykdom. Etter transplantasjon har imidlertid PSC en tendens til å vende tilbake hos fra 15-30 % av pasientene, og det er dessuten også en høy tilbakefallsprosent når det gjelder galleforsnevringer, kronisk avstøtning og reflukskolangitt. Bruken av immunosupressive midler gir dessverre ikke bedret overlevelse og mindre tilbakefall av sykdommen. Det er således et meget sterkt behov for en effektiv medikamentbehandling for å hindre sykdomsutvikling av PSC så vel som tilbakefall etter levertransplantasjon (Trauner & Graziadei 1999, Beuers & Paumgartner 2002).

Skjønt UDCA er godt tolerert bortsett fra sjeldne episoder med diaré og prurigo (Trauner & Graziadei 1999, Beuers & Paumgartner 2002), som i alt vesentlig blir brukt for å behandle kolestatiske leversykdommer, så er effekten av UDCA i PSC og i pasienter med leversykdommer så som progressiv familiær intrahepatisk kolestase type 3, meget begrenset (Trauner & Graziadei 1999, Jacquemin, Hermans, et al. 1997, Jacquemin 2000, Ismail, Kalicinski, et al. 1999).

I EP 0 652 773 Bl er det beskrevet bruken av nor- og homo-gallesyrederivater, eventuelt konjugert med taurin, glysin og alanin, som absorpsjonsforsterkende midler for medikamenter ved enteral eller andre ikke-parenterale administrasjons veier. Disse derivatene har lipofile og rensende egenskaper og blir ikke metabolisert av tarmkanalens bakterieflora.

EP 0 624 595 Bl beskriver dimere norderivater av gallesyrer for bruk i et medikament, som er spesielt godt egnet for behandling av hyperlipidemi. De stoffene som er beskrevet i nevnte patent består av to enkle gallesyrederivater som er kovalent forbundet med hverandre.

US 4 892 868 beskriver 22-metyl-nor-ursodeoksykolsyre og 23-metyl-ursodeoksykolsyre som kan brukes for å behandle lidelser i forbindelse med den hepatibilære funksjonen, med spesiell referanse til kolesterolmetabolisme og galleproduksjon (feks. for behandlingen av kolestase).

Oral administrering av UDCA til CF mus resulterte i økt enterohepatisk sirkulering av bilirubin, mens oral administrasjon av nor-UDCA normaliserte hepatisk biliær pH og økt galle strøm, (Broderick Annemarie L et al: "Correcting biliary phenotype in cystic fibrosis (CF)mice: Nor-ursodeoxycholic acid (nor-UDCA), but not UDCA, normalizes hepatic bile pH and increases bile flow in G551D CF mice", Hepatology, vol. 36, no. 4 Part 2,October 2002 (2002-10-01), & 53RD annual meeting on the liver; Boston, MA,USA; November 01-05, 2002, pages 337A.

Ursofalk® er et kommersielt tilgjengelig farmasøytisk middel som inneholder UDCA for behandling av kroniske kolestatiske leversykdommer. Dette legemidlet har blitt testet i kliniske studier for behandling av primær biliær cirrhose, primær skleroserende kolangitt og cystisk fibrose relatert kolestase.

I http:// www. emedicine. com/ ped/ top382. htm har det blitt rapportert at formuleringen av ursodeoksykolsyre kan bli brukt i behandlingen av barn som lider av kronisk kolestatiske sykdom, som resulterer i en økning av galle dannelsen og antagonistisk effekt av hydrofobe gallesyrer på biologiske membraner.

EP 0 393 494 A gjør kjent gallesyrederivater, en fremgangsmåte for deres fremstilling og dessuten en farmasøytisk sammensetning for anvendelse i human terapi.Det er en hensikt med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe alternative farmasøytika for behandling av leversykdommer, fortrinnsvis kroniske leversykdommer, som er mer effektive enn de kjente medikamentene som feks. ursodeoksykolsyre, og som har mindre bivirkninger enn methotrexat.

Den foreliggende oppfinnelsen angår derfor farmasøytisk sammensetning som omfatter 24-nor-ursodeoksykolsyre og/eller farmasøytisk akseptable salter og metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, pentyl-, eller arylestere derav for anvendelse i behandling og/eller forebygging av kolestatisk leversykdom, der leversykdommen er valgt fra gruppen som består av primær skleroserende kolangitt (PSC), primær skrumplever (PBC) eller progressiv familiær intrahepatisk kolestase type 3, alkoholisk eller ikke-alkoholisk steatohepatitt, autoimmun hepatitt, hepatocellulært karsinom og kolangiokarsinom..

Det er overraskende funnet at et medikament eller en farmasøytisk sammensetning som omfatter 24-norursodeoksykolsyre, en sidekjedeforkortet C23-analog av den naturlig forekommende C24-gallesyreursodeoksykolsyren (UDCA), og/eller farmasøytisk akseptable salter eller ester av denne, kan med godt resultat brukes for behandlingen av forskjellige leversykdommer, ettersom disse analogene påvirker gallesyrenes fysiologiske egenskaper (Hofmann 199, Schmassmann, Hofmann, et al. 1990, Yoon, Hagey, et al. 1986, Cohen, Hofman, et al. 1986). Skjønt begge stoffer er strukturelt meget lik hverandre, så har begge stoffene forskjellige egenskaper når de administreres pattedyr (se feks. Yoon YB, Hagey LR, et al., 1986).

24-norursodeoksykolsyre og salter og estere av denne, fører til en induksjon av gallebikarbonatsekresjon, som fortynner det toksiske galleinnholdet og beskytter gallegangsepitelcellene mot oksidativt stress, ettersom bikarbonat har en sterk nøytraliserende effekt på reaktive oksygenforbindelser. Dette fører til rekonstituering av kolangiocyttbarrierefunksjonen og vil stoppe en pågående perikolangitt og etterfølgende periduktal fibrose, og minimalisere skader på de epiteliale cellene i gallegangene fra gallegangshulrommet. Videre har det vist seg at 24-nor-ursodeoksykolsyre og salter og estere av denne, også har anti-inflammatoriske og antifibrotiske effekter.

I motsetning til 24-nor-deoksykolsyre og salter og estere av denne, så bedrer ursodeoksykolsyre bare periduktal fibrose i de lobulære gallegangene og øker serumalaninaminotransferase (ALT) nivåene og induserer galleinfarkt. Ursodeoksykolsyre bedrer imidlertid ikke sykdommer i de små gallegangene. De divergente effektene av begge gallesyrene med hensyn til leverskade, kan skyldes forskjeller i nivået av gallesekresjon, dvs. at 24-nor-ursodeoksykolsyre og salter og estere av denne, stimulerer primær duktulær sekresjon, mens ursodeoksykolsyre stimulerer kanalikulær gallesekresjon oppstrøms for de påvirkede gallegangene.

Administreringen av 24-nor-deoksykolsyre og salter og estere av denne induserer gallesyredetoksifisering via hydroksylering, sulfatering og glukuronidering, noe som resulterer i bedre vannuløselige og derfor mindre giftige gallesyremetabolitter, noe som fortynner giftige gallesyrer i gallegangene og induserer en duktulær bikarbonatrik kolerese som reduserer det oksidative stresset.

Utviklingen av bikarbonatrik kolerese ved hjelp av 24-nor-ursodeoksykolsyre og salter og estere av denne, har også terapeutiske implikasjoner i forbindelse med humane kolangiopatier (feks. PSC, PBC, kronisk levertransplantatavstøtning, ikke- suppurativ destruktiv kolangitt), ettersom den kolihepatiske forskyvningen resulterer i en kontinuerlig fluks av molekyler på tvers av gallegangens epitel, noe som hjelper til å endre gallegangene slik at disse bedre kan behandle og motstå toksisk/oksidativt stress. F.eks. har det vist seg at sulindac, et NSAID som også blir kolihepatisk forskjøvet hos mennesker, har vist seg å bedre leverenzymene i PBC-pasienter med ufullstendig respons på UDCA-behandling.

Fremgangsmåter for fremstilling av 24-nor-ursodeoksykolsyre og salter og estere av denne, er kjent for personer med faglig innsikt, og kan fortrinnsvis fremstilles ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet i Schteingart CD og Hofmann AF (J. Lip. Res. 29(1988): 1387-1395).

Det er selvsagt at medikamentet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan brukes i mennesker så vel som i pattedyr (feks. gris, hest, primater, kveg, katter og hunder).

Den leversykdommen som kan behandles med et medikament ifølge den foreliggende oppfinnelsen er primær skleroserende kolangitt (PSC), primær skrumplever (PBC) eller progressiv familiær intrahepatisk kolestase type 3, alkoholisk og ikke-alkoholisk steatohepatitt, autoimmun hepatitt,. Videre kan et medikament som omfatter 24-nor-deoksykolsyre og salter og estere av denne, brukes for å forebygge/kjemoforebygge hepatocellulært karsinom og kolangiokarsinom. Ikke-steroid anti-inflammatoriske medikamenter (NSAID) som ibuprofen, vil kunne redusere portal og lobulær inflammasjon i leveren (som vil føre til periduktal fibrose og duktulær proliferering) og dannelsen av hepatocellulært karsinom (HCC) (Pikarsky, Porat, et al. 2004). Ettersom 24-nor-ursodeoksykolsyre og salter og estere av denne også har anti-inflammatoriske egenskaper, så kan 24-nor-ursodeoksykolsyre brukes alene eller i kombinasjon med andre anti-inflammatoriske medikamenter, som NSAIDs (f.eks. ibuprofen og sulindac (Bolder, Trang, et al. 1999)).

Ifølge en annen foretrukket utførelse av oppfinnelsen er leversykdommen en primær skleroserende kolangitt (PSC). Videre er leversykdommen fortrinnsvis primær skrumplever (PBC). 24-nor-ursodeoksykolsyre og salter og metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, pentyl-, eller arylestere av denne kan spesielt brukes for å behandle PSC og PBC.

Et medikament som omfatter 24-nor-ursodeoksykolsyre og/eller salter eller metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, pentyl-, eller arylestere av denne kan spesielt brukes for behandlingen av primær skleroserende kolangitt (PSC) og primær skrumplever (PBC).

Ifølge en foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelsen kan 24-nor-ursodeoksykolsyre og salter og estere av denne formuleres for oral eller intravenøs administrering, hvor disse formuleringene ytterligere kan omfatte farmasøytisk akseptable bærere, adjuvanser, fortynningsmidler og/eller bærevæsker.

Faste doseformer for oral administrering kan inkludere tabletter, fortrinnsvis brusende eller tyggbare tabletter, kapsler, piller, pulvere og granulater. I slike faste doseformer kan 24-nor-ursodeoksykolsyre blandes med vanlig brukte stoffer så som sukrose, mannitol, sorbitol, stivelse og stivelsesderivater, laktose, smøremidler (feks. magnesiumstearat), nedbrytningsmidler og buffere. Tabletter og piller kan også fremstilles med enteriske belegg for å hindre at 24-nor-ursodeoksykolsyren blir påvirket av magesyrer og enzymer. Som tabletter for umiddelbar frigjøring kan disse sammensetningene ytterligere omfatte mikrokrystallinsk cellulose og/eller dikalsiumfosfat.

Flytende doseformer for oral administrering kan inkludere farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner og siruper som inneholder inerte fortynningsmidler av vanlig farmasøytisk type, så som vann. Disse doseformene kan inneholde mikrokrystallinsk cellulose for å øke volumet, alginsyre eller natriumalginat som et suspenderingsmiddel, metylcellulose som et viskositetsforbedrende middel og forskjellige søtningsstoffer og smaksstoffer. Når de administreres ved nasal aerosol eller ved inhalering, så kan sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen fremstilles som saltløsninger ved å bruke benzylalkohol eller andre egnede konserveringsmidler, absorpsjonsfremmende middel for å bedre biotilgjengelighet, fluorkarboner og/eller andre løs el ighetsgj ørende eller dispergerende midler.

Stikkpiller for rektal administrering av 24-nor-ursodeoksykolsyre kan fremstilles ved å blande forbindelsene eller sammensetningene med et egnet ikke-irriterende fortynningsmiddel, så som kakaosmør eller polyetylenglykoler som er faste ved romtemperatur, men flytende ved rektal temperatur, slik at de vil smelte i rektum og frigjøre 24-nor-ursodeoksykolsyren og eventuelle andre aktive forbindelser som måtte være tilstede i nevnte stikkpiller.

Injiserbare preparater, f.eks. sterile injiserbare vandige eller oljeholdige suspensjoner kan formuleres ved hjelp av egnede dispergeringsmidler, fuktemidler og/eller suspenderingsmidler. Det sterile injiserbare preparatet kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i et ikke-toksisk parenteralt akseptabelt fortynningsmiddel eller løsemiddel. Blant akseptable bærevæsker og løsemidler som kan brukes er vann og en isotonisk natriumkloridløsning. Sterile fikserte oljer kan også hensiktsmessig brukes som et løsemiddel eller suspenderende medium.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan doseformer som omfatter 24-nor-ursodeoksykolsyre inkludere ytterligere vanlig kjente fortynningsmidler, fortrinnsvis farmasøytisk akseptable organiske eller uorganiske bærestoffer som ikke reagerer med den aktive forbindelsen. Egnede farmasøytisk akseptable bærere inkluderer feks. vann, saltløsninger, alkohol, oljer, fortrinnsvis vegetabilske oljer, polyetylenglykoler, gelatin, laktose, amylose, magnesiumstearat, overflateaktive midler, parfymeoljer, fettsyremonoglyserider og diglyserider, petroethral fettsyreestere, hydroksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon og lignende. De farmasøytiske preparatene kan steriliseres og hvis det er ønskelig blandes med forskjellige hjelpemidler, så som smøremidler, konserveringsmidler, stabilisatorer, fuktemidler, emulgeringsmidler, salter for å påvirke et eventuelt osmotisk trykk, buffere, fargestoffer, smaksstoffer og/eller aromatiske stoffer og lignende som ikke skadelig reagerer med de aktive forbindelsene. For parenteral anvendelse så vil spesielt godt egnede bærervæsker bestå av løsninger, fortrinnsvis oljeholdige eller vandige løsninger, så vel som suspensjoner, emulsjoner eller implantater.

Forskjellige kjente leveringssystemer kan brukes for å administrere nevnt 24-norursodeoksykolsyre, og inkluderer for eksempel innkapsling i liposomer, emulsjoner, mikropartikler, mikrokapsler og mikrogranulater (se feks. EP 1 317 925). Den forønskede dosen kan administreres som en enkelt enhet eller i en form for vedvarende frigjøring.

Biotilgjengeligheten av 24-norursodeoksykolsyre kan bedres i mikronisering av formuleringene ved å bruke vanlige kjente teknikker så som maling, knusing og forstøvningstørking i nærvær av egnede fortynningsmidler, så som fosfolipider eller overflateaktive midler.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan 24-norursodeoksykolsyre formuleres i form av en farmasøytisk akseptabel ester eller salt. Farmasøytisk akseptable salter av 24-nor-ursodeoksykolsyre inkluderer fortrinnsvis metallsalter, da spesielt alkalimetallsalter eller andre farmasøytisk akseptable salter. Egnede farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter kan fremstilles fra uorganiske syrer som saltsyre, hydrobromsyre, hydrojodsyre, salpetersyre, karbonsyre, svovelsyre og fosforsyre, eller organiske syrer, som feks. alifatiske, sykloalifatiske, aromatiske, heterosykliske, karboksyliske og sulfoniske grupper av organiske syrer, så som maursyre, eddiksyre, propionsyre, ravsyre, glykolsyre, glukonsyre, melkesyre, eplesyre, tartarsyre, sitronsyre, askorbinsyre, glukuronsyre, maleinsyre, fumarsyre, pyrodruesyre, asparginsyre, glutaminsyre, benzosyre, etansulfonsyre, antranilsyre, mandelsyre, mesylsyre (mesylic acid), salisylsyre, p-hydroksybenzosyre, fenyleddiksyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, pantotensyre, toluensulfonsyre, 2-hydroksyetansulfonsyre, algensyre, sulfanilsyre, stearinsyre, p-hydroksysmørsyre, sykloheksylaminosulfonsyre, galaktarsyre og galakturonsyre og lignende. Farmasøytisk akseptable baseaddisjonssalter inkluderer metallsalter fremstilt fra litium, aluminium, kalsium, magnesium, kalium, natrium og sink eller organiske salter fra primære, sekundære og tertiære aminer og sykliske aminer. Alle 24-nor-ursodeoksykolsyresalter kan fremstilles ved fremgangsmåter som i seg selv er velkjente (feks. ved å reagere 24-norursodeoksykolsyre med den passende syren eller basen). 24-norursodeoksykolsyreestere er ikke-toksiske estere, fortrinnsvis alkylestere, så som metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl og pentylestere eller arylestere. Forestring av karboksylsyrer så som 24-nor-ursodeoksykolsyre utføres med en rekke forskjellig vanlig kjente fremgangsmåter, feks. ved å reagere karboksylsyregruppen med en passende alkohol. Disse reaksjonene er velkjente innenfor den organiske kjemi.

Fremgangsmåter for fremstilling av et medikament ifølge den foreliggende oppfinnelsen som omfatter 24-nor-ursodeoksykolsyre og formulert for administrering som beskrevet her, er f.eks. beskrevet i "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations" (Sarfaraz K Niazi, CRC Press LLC, 2004).

Medikamentet omfatter fortrinnsvis en effektiv mengde av 24-nor-ursodeoksykolsyre og en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller fortynningsmiddel.

Ifølge en foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelsen vil medikamentet omfatte fra 10 til 8000 mg, fortrinnsvis 25-5000 mg, mer foretrukket fra 50-1500 mg, og mest spesielt fra 250-500 mg av 24-nor-ursodeoksykolsyre.

Som en middelverdi så kan 24-nor-ursodeoksykolsyre og/eller farmasøytisk akseptable salter og estere av denne fortrinnsvis administreres en pasient i en mengde fra 25 mg til 5 g, fortrinnsvis 100 mg til 2,5 g og mest spesielt fra 800 mg til 1,5 g pr. dag. Det er imidlertid foretrukket å administrere 1 g av 24-nor-ursodeoksykolsyre og/eller farmasøytisk akseptable salter og estere av denne til en pasient. Det skal videre bemerkes at 24-nor-ursodeoksykolsyre og/eller farmasøytisk akseptable salter og estere av denne kan administreres et individ i en mengde på fra 1-100 mg/kg/dag, fortrinnsvis 5-50 mg/kg/dag, mer foretrukket 10-25 mg/kg/dag og mest spesielt fra 12-15 mg/kg/dag. Nevnte mengde kan administreres én gang eller fortrinnsvis oppdelt i mer enn én dose (feks. minst 2, 3, 4, 5 eller 10 doser) pr. dag. Medikamentet eller den farmasøytiske sammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan administreres i mer enn én uke, fortrinnsvis mer enn fire uker, mer foretrukket i mer enn seks måneder og mest foretrukket i mer enn ett år, spesielt hele livet.

24-nor-ursodeoksykolsyre kan administreres ikke bare i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bærere og i de doseformer som er beskrevet her, men kan selvsagt også administreres i kombinasjon med én eller flere ytterligere aktive bestanddeler (f.eks. ursodeoksykolsyre, NSAID, feks. sulindac og ibuprofen) som også er kjente for å være effektive mot den samme eller lignende sykdommer som skal behandles (f.eks. ursodeoksykolsyre) eller mot andre sykdommer, som fortrinnsvis er et resultat av en leversykdom.

Ikke bare norUDCA brukes for behandling og/eller forebygging av leversykdommer av den type som er beskrevet her, men også andre gallesyrer med andre typer sidekjedemodifikasjoner, som hindrer effektiv N-acylamidering (kan analyseres ved enhver egnet kjent fremgangsmåte, f.eks. ved hjelp av de fremgangsmåter som er beskrevet av Johnson, M., et al. Anal. Biochem., (1989) 182:360-365, Yoon, Hagey, et al., 1986) så som, men ikke begrenset til forkortet lengde (f.eks. nor eller dinorgallesyrer), i tillegg til en alkylgruppe (spesielt metyl-, etyl-, propyl-, butyl-, pentyl- og heksylgrupper) ved alfa eller beta karbonatomet. Disse UDCA-derivatene resulterer i farmasøytiske og terapeutiske egenskaper som er lik de til norUDCA, spesielt for behandling og forebygging av PBC og PSC.

Den foreliggende oppfinnelsen er ytterligere illustrert ved hjelp av de følgende figurer og eksempler uten at oppfinnelsen er begrenset til disse.

Fig. 1 norUDCA helbreder skleroserende kolangitt i Mdr2"</->-mus.

(A) Leverhistologi (H&E-farging) i kontrolldiettforede Mdr2_</>--mus (KO), UDCA-forede Mdr2"</->-mus (KO+UDCA), og norUDCA-forede Mdr2"</->-mus

(KO+norUDCA) (forstørrelse x 10). Utpregede sykdommer i de store gallegangene i KO (pilhoder) som er signifikant redusert i KO + UDCA (pilhoder) og fraværende i KO+norUDCA. (B) Skleroserende kolangitt i KO med periduktal fibrose, endrede gallegangsepitelceller og blandet inflammatorisk infiltrat. Dette ble lindret i KO+UDCA og fraværende i KO+norUDCA (forstørrelse x 40). (Q Siriusrødfarging viser signifikant fibrose i periduktale kollagenfibrer (rød) i KO. Moderat reduksjon av fibrose i KO+UDCA og enda mer utpreget reduksjon i KO+norUDCA (forstørrelse for b, c x 40); bd, gallegang.

Fig. 2. nor UDCA reduserer signifikant hepatisk hydroksyprolin innhold i Mdr2_</>\ Hepatisk hydroksyprolin innhold i villtype (WT), kontrolldiettforede Mdr2"

'■-mus (KO), UDCA-forede Mdr2"</->-mus (KO+UDCA) og nor-UDCA-forede Mdr2"</_->mus (KO+norUDCA). Hepatisk hydroksyprolin innholdet ble signifikant forhøyet i KO sammenlignet med WT og redusert til basislinjenivåer i KO+norUDCA. Middelverdiene er + SEM fra n=5 pr. gruppe p<0,05, WT versus KO; KO versus KO+norUDCA.

Fig. 3. norUDCA reduserer signifikant portal

nøytrofilinfiltrering/ekstravasering i Mdr2_</>\ Immunohistokjemi for CDllb (rød. farger nøytrofiler) i kontrolldiettforede Mdr2_</>--mus (KO) UDCA-forede Mdr2_</>_-mus (KO+UDCA) og norUDCA-forede Mdr2"</->-mus (KO+norUDCA) fra (A) interlobulære og (B) lobulære galleganger. (C) Kvantifisering av CDllb-positive celler pr. 20 portalfelter. norUDCA reduserer signifikant antallet CDllb-positive celler i Mdr2_</>". Verdiene er middelverdier + SEM fra n=3 pr. gruppe, p < 0,05.

Fig. 4. norUDCA hemmer portal vaskulær celletilfestningsmolekyl (VCAM) ekspresjon i Mdr2"</_->mus. Immunohistokjemi for VCAM (rød) i interlobulære (A) og lobulære (B) galleganger i kontrolldiettforede Mdr2"</_->mus (KO), UDCA-forede Mdr2"</->-mus (KO+norUDCA) og norUDCA-forede Mdr2"</->-mus (KO+norUDCA).

(A) Ingen tydelige forskjeller med hensyn til portal VCAM-ekspresjon mellom KO og KO+UDCA, mens KO+norUDCA viser signifikant lavere ekspresjon i

gallegangsproliferater. (B) På nivå av lobulære galleganger så reduserer både UDCA og norUDCA kolangiocellulær VCAM-ekspresjon.

Fig. 5. norUDCA hemmer proliferering av hepatocytter og kolangiocytter i Mdr2_</>~-mus. Immunohistokjemi for Ki-67 (rød) i hepatocytter (A) og kolangiocytter (B) i kontrollforede Mdr2_</>--mus (KO), UDCA-forede Mdr2_</>--mus (KO+UDCA) og norUDCA-forede Md^-mus (KO+norUDCA). (A) Tallrike Ki-67-positive hepatocytter i KO og KO+UDCA og spredte positive kjerner i KO+norUDCA. (B) Tallrike Ki-67-positive kolangiocytter i KO, noen få positive kolangiocytter (pilhoder) i KO+UDCA og KO+norUDCA henholdsvis. (C) Antall Ki-67-positive hepatocytter pr. 30 HPFs og (D) antall Ki-67-positive kolangiocytter pr. 20 portalfilter. Bare norUDCA reduserer signifikant antallet prolifererende hepatocytter og cholangiocytter. Verdiene er middelverdier + SEM fra n=3 pr. gruppe. p<0,05,<*>WT versus KO; t WT versus KO+UDCA, +-KO versus KO+norUDCA. Fig. 6. Positiv korrelering mellom gallebikarbonatproduksjon og gallestrøm i Mdr2_</>\ Gallebikarbonatproduksjonen ble avsatt mot gallestrøm i kontrolldiettforede Mdr2"</_->mus (kontroll, åpne sirkler), UDCA-forede Mdr2"</_->mus (UDCA, åpne trekanter), og norUDCA-forede Mdr2"</_->mus (norUDCA, lukkede sirkler). Bemerk den positive korreleringen mellom bikarbonatproduksjon og gallestrøm foruten samlingen av norUDCA-behandlede dyr med den høyeste bikarbonatproduksjonen i det øvre høyre hjørnet. Fig. 7. Antydet terapeutisk mekanisme for norUDCA i Mdr2_</>"-mus. norUDCA tas opp av hepatocytter og skilles ut i kanalikuli og gallegangene hvor den tas opp av kolangiocytter, noe som fører til duktulær bikarbonatsekresjon. norUDCA blir så utskilt tilbake i den peribiliære pleksus og overført tilbake til hepatocytter (kolehepatisk overføring). norUDCA induserer ekspresjon av Sult2al etc. og Mrp3 og Mrp4 som detoksifiserer gallesalter og gjør dem tilpasset for nyreeliminering. Fig. 8. Kjemisk struktur for norUDCA (3-alfa, 7-alfa-dihydroksy-24-nor-5-beta-cholan-23 -oinsyre).

EKSEMPEL 1:

Mus med innstilt oppbrytning av Mdr2 (Abcb4)-genet som koder en kanikulær fosfolipidflippase utvikler skleroserende kolangitt med makroskopiske og mikroskopiske trekk som ligger meget nær de som kan observeres i forbindelse med human skleroserende kolangitt (f.eks. primær skleroserende kolangitt, PSC)

(Fickert, Zollner, et al. 2002, Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004). Gallegangsskader i disse musene er forbundet med sviktende gallefosfolipidsekresjon, noe som resulterer i en forhøyet konsentrasjon av frie ikke-miscellære gallesyrer som deretter forårsaker skade på de epiteliale cellene i gallegangene (kolangiocytter), perikolangitt, periduktal fibrose med duktulær proliferering og endelig skleroserende cholangitt (Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004, Lammert, Wang, et al. 2004). I tillegg til muligheten for å studere nye behandlingsstrategier for PSC, så kan denne modellen være relevant for å teste terapier for en rekke forskjellige

humane leversykdommer som er et resultat av Mdr3-mutasjoner (den humane ortologen til Mdr2), som varierer fra neonatal kolestase til leversykdommer hos voksne personer (Jansen & Sturm 2003).

For tiden er UDCA det eneste medikamentet som er godkjent for behandling av kolestatiske leversykdommer (Paumgartner & Beuers 2002). Effekten av UDCA i PSC og i pasienter med leversykdommer som skyldes MDR3-mutasjoner (f.eks. progressiv familiær intrahepatisk kolestase type 3), er imidlertid begrenset (Trauner & Grazidei 1999, Jacquemin, Hermans, et al. 1997, Jacquemin 2000, Ismail, Kalicinski, et al. 1999). Sidekjedeforkortning av UDCA vil forhøye dens terapeutiske effekt, ettersom denne modifikasjonen signifikant påvirker de fysiologiske egenskapene til gallesyrer (Hofmann 1999, Schassmann, Hofmann, et al. 1990, Yoon, Hagey, et al. 1986, Cohen, Hofmann et al. 1986). norUDCA, en sidekjedeforkortet C23-analog av UDCA, er et potent kolerektisk middel i forskjellige gnagere (f.eks. hamster, rotter, marsvin), hvor det foregår en omfattende kolehepatisk forsyning og dette induserer gallekarbonatsekresjon i gallegangene (Yoon, Hagey, et al. 1986, Cohen, Hofmann, et al. 1986). I motsetning til UDCA, så er effektene av norUDCA aldri blitt undersøkt i kolestase. For å teste hypotesen at kolehepatisk forsyning av en ikke-toksisk gallesyre vil kunne være fordelaktig ved behandlingen av kolangiopatier, så undersøkte en effektene av norUDCA i Mdr2"</>_-mus som en modell på skleroserende kolangitt (Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004). I dette eksemplet undersøkte en de positive effektene av norUDCA ved behandlingen av humane leversykdommer som var forårsaket av MDR3-mutasjoner og humane kolangiopatier så som skleroserende kolangitt (f.eks. PSC).

1.1. Materialer og metoder

1.1.1. Dyreeksperimenter

Mdr2"</_->mus (FVB/N-bakgrunn) ble kjøpt fra Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Musene ble plassert i en 12:12 timers lys-mørke syklus og hadde fri adgang til vann og en standard musediett (Sniff, Soest, Tyskland).

1.1.2. Gallesyrefdring i Mdr2"/_-mus.

To måneder gamle Mdr2_</>"(på et tidspunkt da skleroserende kolangitt var fullt utviklet i disse dyrene (Fickert, Zollner, et al. 2002), ble enten foret en diett supplert med norUDCA (0,5 % vekt/vekt) eller UDCA for klinisk sammenligning (0,5 %, vekt/vekt) i fire uker og sammenlignet med standarddiettforede Mdr2_</>"og villtypekontroller.

1.1.3. Leverhistologi

For vanlig lysmikroskopi ble leverne fiksert i 4 % nøytralbufret formaldehydløsning og innleiret i parafin. Snitt (4 n tykke) ble farget med H&E og sirius rødfarge henholdsvis. Snittene ble kodet og undersøkt av en patolog (H.D.) som ikke var informert om dyrenes behandling.

1.1.4. Rutinemessig serumbiokjemi.

Serumprøver ble lagret ved -70°C inntil de ble analysert for alanintransaminase (ALT) og alkalisk fosfatase (AP) ved hjelp av rutinemessige klinisk kjemiske undersøkelser utført ved hjelp av et Hitachi 717 analyseapparat (Boehringer Mannheim, Mannheim, Tyskland). For bestemmelse av de totale serumgallesyrenivåene, ble det brukt en kommersiell 3-alfa-hydroksysteroid dehydrogenaseprøve (Ecoline S+; DiaSys, Holzheim, Tyskland).

1.1.5. Immunohistokjemi for alfa-SMA.

Immunohistokjemisk undersøkelse for alfa-SMA ble utført på mikrobølgebehandlede (0,01 mmol/1 sitratbuffer pH 6,0) parafinsnitt (4 nm tykke) ved å bruke det monoklonale museanti-alfa-SMA (fortynning 1:500, Sigma, St. Louis, MO). Binding av antistoffet blir påvist ved å bruke ABC-systemet (Dako, Glostrup, Danmark) og ved å anvende P-amino-9-etyl-karbazol (AEC; Dako) som substrat.

1.1.6. Immunohistokjemisk undersøkelse for prolifereringsmarkør Ki-67. Immunohistokjemisk undersøkelse for Ki-67 ble utført på mikrobølgebehandlede (0,01 mmol/1 sitratbuffer pH 6,0) parafinsnitt (4 nm tykke) ved å bruke et polyklonalt kanin anti-Ki-67-antistoff (fortynning 1:750, Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK). Binding av antistoffet ble påvist ved å bruke ABC-systemet (Dako) og ved å anvende AEC (Dako) som substrat. Antall prolifererende hepatocytter ble beregnet ved å telle positive kjerner i 30 høystyrkefelter i snitt fra 3 dyr i hver gruppe. Antallet prolifererende gallegangsepitelceller ble beregnet ved å telle positive kjerner i 20 portalfelter i snitt fra 3 dyr i hver gruppe.

1.1.7. Immunohistokjemi for nøytrofilmarkør CD-llb.

For å kvantifisere nøytrofiler ble CD llb-positive celler påvist som beskrevet tidligere (Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004) med den modifikasjon, at bindingen av antistoffet ble påvist ved å bruke ABC-systemet (Dako) og AEC (Dako) som substrat. Antall nøytrofile celler ble beregnet ved å telle positive celler i 20 portalfelter i snitt fra 3 dyr i hver gruppe.

1.1.8. Immunohistokjemi for vaskulært celletilfestningsmolekyl (VCAM). Immunohistokjemi for VCAM ble utført på acetonfikserte frysesnitt ved å bruke det monoklonale rotte-anti-CD106 (VCAM-1, fortynnet 1:30, PharMingen, San Diego, CA, USA) og bindingen av antistoffet ble påvist ved å bruke ABC-systemet (Dako) og AEC (Dako) som substrat.

1.1.9. Immunohistokjemi for 4-hydroksynonenal-proteinadukter.

Leversnitt ble deparafinisert og så inkubert med Immunopure peroksidasesupressor (Pierce, Rockford, IL) i 30 min. og så proteinblokkert (Dako, Carpenteria, CA) i 2 timer. Dette ble fulgt av en inkubering over natten med det primære anti-4-hydroksynonenal antistoffet (Calbiochem, San Diego, CA) ved romtemperatur, hvoretter bindingen av antistoffet ble påvist ved å bruke ABC-systemet (Dako) med AEC (Dako) som substrat.

1.1.10. Bestemmelse av hepatisk hydroksyprolininnhold.

For å kvantifisere leverfibrosen i den foreliggende modellen ble det hepatiske hydroksyprolin innholdet bestemt. Den høyre leverloben ble homogenisert i 6-normal HC1 (200 mg levervev/4 ml HC1) og hydrolysert ved 110°C i 16 timer. Etter filtrering ble 50 ni tilsatt 450 ni 2,2 % NaOH oppløst i sitrat-acetatbuffer (50 g sitronsyre x H2O, 12 ml eddiksyre, 120 g natriumacetat x 3 H2O, 34 g NaOH og 1 liter destillert vann, pH 6,0). Etter tilsetning av 250 ni perklorsyre og 12 min. inkubering ved romtemperatur ble 250 ni p-dimetylaminobenzaldehydløsning tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 60°C i 20 min. Hydroksyprolin innholdet ble målt ved 565 nm ved å bruke en hydroksyprolin standardkurve.

1.1.11. mRNA-analyse og PCR av nøkkelfibrosegener.

RNA-isolering, cDNA-syntese og Tawman<®>sanntids PCR ble utført som beskrevet tidligere (Wagner, Fickert, et al. 2003). De følgende primere og 5' F AM, 3' TAMRA-merkede prober ble brukt: Collal forover: caatgcaatgaagaactggactgt (SEKV. ID nr. 1), Collal bakover: tcctacatcttctgagtttggtga (SEKV. ID nr. 2) og Collal-probe: cagaaagcacagcactcgccctcc (SEKV. ID nr. 3), TIMP-1 forover: catggaaagcctctgtggatatg (SEKV. ID nr. 4), TIMP-1 bakover: aagctgcaggcattgatgtg (SEKV. ID nr. 5) og TIMP-1-probe: ctcatcacgggccgcctaaggaac (SEKV. ID nr. 6), MMP-2 forover: ctttgagaaggatggcaagtatgg (SEKV. ID nr. 7), MMP-2 bakover: ttgtaggaggtgccctggaa (SEKV. ID nr. 8) og MMP-2-probe:

cagatggacagccctgcaagttccc (SEKV. ID nr. 9).

1.1.12. Måling av gallestrøm.

Gallestrømmen ble bestemt gravimetrisk og normalisert til levervekt som beskrevet tidligere (Fickert, Zollner, et al. 2001). Konsentrasjonen av fosfolipidene i gallen ble bestemt ved å bruke et kommersielt tilgjengelig sett (fosfolipid B; Wako, Neuss, Tyskland) ved å følge fabrikantens instruksjoner. Konsentrasjonen av kolesterol i gallen ble bestemt ved å bruke et kommersielt tilgjengelig sett (kolesterol liquidcolor; Human, Wiesbaden, Tyskland) ifølge fabrikantens instruksjoner. Konsentrasjonen av glutation (GSH) i gallen ble bestemt etter proteinutfelling i 5 % metafosforsyre ved å bruke glutationprøvesettet (Calbiochem, San Diego, US) ved å følge fabrikantens instruksjoner. Konsentrasjonen av gallesyre i gallen ble analysert ved å bruke en 3-alfa-hydroksysteroid dehydrogenaseprøve (Ecoline St. DiaSys) ved å følge fabrikantens instruksjoner.

1.1.13. Statistisk analyse.

Dataene er angitt som aritmetiske middelverdier +/- standardavvik. 4-6 dyr ble undersøkt i hver gruppe. Den statistiske analysen ble utført ved å bruke Students t-test når dette var passende, eller ANOVA med Bonferroni posttesting når tre eller flere grupper ble sammenlignet. En p-verdi som var < 0,05 ble ansett å være signifikant.

1.2. Resultater

1.2.1. norUDCA bedrer signifikant leverskade, reduserer fibrose og helbreder skleroserende kolangitt i Mdr2~<7>~-mus.

Serum ALT- og AP-nivåene (som biokjemiske markører på leverskade og kolestase) var signifikant forhøyet i standarddiettforede Mdr2_</>" sammenlignet med villtypekontrollene (tabell 1).

Note. Verdiene er uttrykt som middelverdier + standardavvik for n = 5 pr. gruppe. ALT, alanintransaminase, AP, alkalisk fosfatase, SPA, serumgallesyre, WT, villtypemus, KO, Mdr2 knockoutmus, KO+UDCA, UDCA-forede Mdr2 knockout mus; KO+norUDCA, norUDCA-forede Mdr2 knockoutmus. •<*>p<0,05, KO versus KO-UDCA og KO versus KO+norUDCA (ANOVA med Bonferroni post-testing) • #p<0,05, KO+UDCA versus KO+norUDCA (ANOVA med Boferroni post-testing) norUDCA bedret signifikant serum ALT- og AP-nivåene sammenlignet med standard diettforede Mdr2_</>"(tabell 1). Parallelt hadde standard diettforede Mdr2"</_->mus en utpreget skleroserende kolangitt (fig. 1), med duktulær proliferering og leverfibrose, noe som er reflektert ved et signifikant forhøyet hepatisk hydroksyprolin innhold (fig. 2). norUDCA-forede Mdr2"</_->mus viste regelmessige store og middels store galleganger uten eller med bare moderat periduktal fibrose (fig. 1); duktulær proliferering var så å si fraværende (ikke vist). Parallelt med disse histologiske forandringene, så reduserte norUDCA signifikant det hepatiske hydroksyprolin innholdet i Mdr2"</_->mus (fig. 2), som var parallelt med en signifikant reduksjon av hepatisk kollagen 1 og 3 mRNA-ekspresjon (tabell 2).

UDCA-behandling av Mdr2"</>"-mus for klinisk sammenligning foruten standardbehandling av kolestatiske leversykdommer (inklusive PSC) ble undersøkt samtidig. I motsetning til norUDCA, så ga UDCA en signifikant økning av ALT- og AP-aktivitet i Mdr2_</>" (tabell 1) og 2 av 5 dyr hadde galleinfarkt, noe som er i overensstemmelse med tidligere observasjoner (Fickert, Zollner et al. 2002). UDCA syntes å redusere periduktal fibrose i de lobulære og interlobulære gallegangene (fig. 1), men viste bare en tendens til lavere hepatisk hydroksyprolin innhold uten å nå statistisk signifikans (fig. 2). Disse resultatene indikerer klart at norUDCA (men ikke UDCA) signifikant reduserer leverskade, perikolangitt og periduktal fibrose i Mdr2"</>_-mus, noe som til slutt gir en heling av skleroserende kolangitt.

1.2.2. norUDCA reduserer inflammasjon, oksidativt stress og celleproliferering i Mdr2"</_->mus.

Ettersom portal inflammasjon kan representere den viktigste utløseren for periduktal fibrose i Mdr2"</>_-mus (Pikarsky, Porat, et al. 2004), så ble en reduksjon av portal inflammasjon med norUDCA analysert. Kontrolldiettforede Mdr2_</>" hadde signifikant forhøyet antall portale nøytrofile celler sammenlignet med villtypekontrollene (fig. 3). norUDCA bedret også perikolangitt i Mdr2"</>_-mus, som vist ved et signifikant redusert antall av portale nøytrofile celler sammenlignet med standard diettforede Mdr2"</>_-mus (fig. 3). Disse tilsynelatende anti-inflammatoriske effektene av norUDCA opptrådte parallelt med en signifikant lavere VCAM-ekspresjon i gallegangsepitele celler i de interlobulære og lobulære gallegangene hos norUDCA-forede Mdr2"</>_-mus (fig. 4). Ettersom det tidligere er vist at inflammasjon også utløser proliferering i leverne hos Mdr2"</>_-mus (Pikarsky, Porat, et al. 2004), så ble det testet hvorvidt dette også var påvirket av norUDCA. Standarddiettforede Mdr2"</>_-mus hadde et signifikant forhøyet antall Ki-67-positive hepatocytter og kolangiocytter sammenlignet med villtypekontroller (fig. 5). norUDCA reduserte signifikant graden av hepatocytt og gallegangepitelcelleproliferering til nesten villtypekontrollnivåene (fig. 5). UDCA hadde ingen signifikante effekter på portal inflammasjon (fig. 3), VCAM-ekspresjon (fig. 4) og proliferering av hepatocytter (fig. 5). UDCA reduserte imidlertid prolifereringen av gallegangsepitele celler i de store gallegangene (fig. 5). Disse data indikerer igjen at de anti-inflammatoriske og anti-proliferative effektene av norUDCA er bedre enn de til UDCA.

1.2.3. norUDCA induserer gallebikarbonatsekresjon i Mdr2~<7>~-mus.

For å bestemme hvorvidt bikarbonatrik kolerese som var et resultat av kolyhepatisk overføring av norUDCA kunne være ansvarlig for de observerte terapeutiske effekter, ble gallestrøm og sammensetning bestemt (tabell 3).

Note: Verdiene er uttrykt som middelverdi + standardavvik. KO, Mdr2 knockoutmus, KO+UDCA, UDCA-for Mdr2 knockoutmus; KO-norUDCA, norUDCA-for Mdr2 knockoutmus.

•<*>p<0,05, KO versus KO+UDCA (ANOVA med Bonferroni post-testing)

• #p<0,05, KO versus KO-norUDCA (ANOVA med Bonferroni post-testing)

Sammenligninger mellom kontrolldiettforede og UDCA-forede Mdr2"</>_-mus, viste at norUDCA signifikant induserte gallebikarbonatsekresjon, noe som er i overenstemmelse med forståelsen at norUDCA underkastes en relevant kolehepatisk forskyvning i Mdr2"</>_-mus (Boldner, Trang et al. 1999). UDCA, men ikke norUDCA stimulerte gallesyreutskillelse. Det ble ikke observert noen signifikante effekter på gallesyre, kolesterol, fosfolipid og glutationproduksjon. Disse observasjonene viser at norUDCA fører til en utvasking av de skadede gallegangene i bikarbonatanriket, mindre toksisk galle i Mdr2_</>".

1.2.4. norUDCA induserer fase II detoksifiseringsreaksjonsveier og alternative ekskretoriske veier for gallesyrer i Mdr2~7~-mus.

For å teste hypotesen om at en induksjon av fase I/II

biotransformeringsreaksjonsveier og alternative utløpsveier for potensielt giftige gallesyrer også kan bidra til de observerte fordelaktige effektene av norUDCA i Mdr2"</>_-mus, så ble ekspresjonen av nøkkelmetabolske enzymer (tabell 4) ble sammensetningen av serum, foruten leversyrer og gallesyrer i norUDCA-forede Mdr2"</>_-mus undersøkt.

•<*>p<0,05 KO versus KO-UDCA og KO versus KO-norUDCA (ANOVA med Bonferroni posttesting) • #p<0,05, KO+UDCA versus KO+norUDCA (ANOVA med Bonferroni posttesting)

Sult2al og Mrp4, spesiell oppmerksomhet, ettersom sulfatering og transport på sulfaterte forbindelser er interrelatert til å danne en koordinert regulert reaksjonsvei for utskillelse av sulfaterte steroider og gallesyrer (Schuetz, Strom, et al. 2001). norUDCA hadde ingen signifikante effekter på mRNA-ekspresjon på de hepatocellulære opptak (Ntcp, Oatpl) og de kanikulære utløps (Bsep, Mrp2) systemene for gallesyrer og organiske anioner (data ikke vist). norUDCA resulterte imidlertid i en robust indikasjon av fase I og II detoksifiseringsenzymer (tabell 4), med de mest utpregede effekter på Sult2al-ekspresjon. I tillegg til dette øket norUDCA i vesentlig grad ekspresjonen av alternative vasolaterale utløpssystemer, så som Mrp4 og i mindre grad - Mrp3 (tabell 4, fig. 7). Effektene av UDCA var mindre fremtredende (tabell 4, fig. 7). Denne koordinerte induksjonen av biotransformeringsreaksjonsveier og utløpssystemer av norUDCA var fulgt av en forekomst av gallesyreglukoronider foruten sulfater, noe som reflekterer de funksjonelle implikasjonene av de observerte ekspresjonsforandringene.

1.3. Diskusjon

Det er blitt vist at norUDCA helbreder skleroserende kolangitt i Mdr2"</>_-mus, et godtkarakterisertmodellsystem for PSC, i løpet av 4 uker. I tillegg ble det vist at norUDCA er signifikant mer effektivt enn UDCA.

Utviklingen av skleroserende kolangitt i Mdr2_</>"er direkte relatert til sviktende gallefosfolipidutskillelse og samtidig forhøyede gallenivåer av ikke-miscellære-bundne toksiske gallesyrer, noe som forårsaker gallegangsskader og pericholangitt (Fickert, Zollner, et al. 2002, Fickert, Fuschsbichler, et al. 2004). Induksjon av gallebikarbonatutskillelse i nor UDCA-forede Mdr2"</>_-mus vist ved dette eksemplet, er i sterk overenstemmelse med den kolihepatiske forskyvningen av norUDCA (Hofmann 1977, Yoon, Hagey, et al. 1986). Den forhøyede gallebikarbonatutskillelsen (i) fortynner det toksiske galleinnholdet i Mdr2"</>_-mus, og (ii) beskytter gallegangsepitele celler mot oksidativt stress, ettersom bikarbonat er et sterkt nøytraliserende middel for reaktive oksygenforbindelser. norUDCA stopper derfor en pågående perikolangitt og en etterfølgende periduktal fibrose med Mdr2"</_->mus, å minimaliserer derfor gallegangsepitelcelleskader fra gallegangshulrommet. Dette fører til rekonstitueringen av kolangiocyttbarrierefunksjonen som betyr at de observerte anti-inflammatoriske og antifibrotiske effektene av norUDCA i Mdr2"</>_-mus, er sekundære. Det er imidlertid innlysende at norUDCA også har direkte anti-inflammatoriske og antifibrotiske effekter.

Resultatene i dette eksemplet viser at hemmingen av periduktal fibrose, når dette er fulgt av en modulering av galleinnholdet (dvs. å øke innholdet av hydrofile gallesyrer sammen med en forhøyet bikarbonatkonsentrasjon i gangene), signifikant bedrer leverskader i Mdr2"</_->mus.

I motsetning til norUDCA, så bedret UDCA bare periduktal fibrose i de lobulære gallegangene, men øket serum ALT-nivåene og induserte galleinfarkt i Mdr2"</>_-mus. I en tidligere undersøkelse med kortere behandlingsperiode ble det konkludert at dette primært var relatert til de kolerektiske effektene av UDCA i nærvær av uoppløst gallegangsobstruksjon, sammenlignet med observasjoner i CBDL UDCA-forede mus (Fickert, Zollner et al. 2002). I motsetning til denne tidligere antagelse ble det bare funnet en tendens til forhøyet gallestrøm i UDCA- og enda mer i norUDCA-forede Mdr2"</_->mus i den foreliggende undersøkelse hvor det ble anvendt lavere doser. Ettersom UDCA ikke bedrer sykdommer i de små gallegangene i Mdr2"</_->mus, så utelukker dette imidlertid ikke muligheten for et forhøyet galletrykk på nivå med trykket i Herringkanalene i UDCA-forede Mdr2_</>", som skulle ha ført til de observerte galleinfarktene. De divergente effektene av gallesyrer med hensyn til leverskade er relatert til forskjellene i nivået av gallesekresjon, dvs. at norUDCA primært stimulerer duktulær sekresjon, mens UDCA stimulerer kanikulær gallesekresjon oppstrøms for de påvirkede gangene.

Et kausalt forhold mellom portal og lobulær inflammasjon fører til periduktal fibrose og duktulær proliferering så vel som dannelsen av hepatocellulært karsinom (HCC) i Mdr2_</>- er nylig blitt påvist (Fickert, Fuchsbichler, et al. 2004, Pikarsky, Porat, et al. 2004). I den foreliggende undersøkelsen så normaliserte norUDCA hepatocytt og gallegangsepitelcelleproliferering. Pikarsky et al. har vist en reduksjon av inflammasjon og relatert HCC-dannelse ved å bruke det ikke-steroid anti-inflammatoriske medikamentet (NSAID) ibuprofen i denne modellen (Pikarsky, Porat, et al. 2004). De terapeutiske effektene av NSAIDs og norUDCA kan kombineres og endog forsterkes av sulindak, et NSAID, som går gjennom en kolehepatisk overføring i rotter (Bolder, Trang, et al. 1999).

Naturlige gallesyrer er effektivt N-acylamidert (konjugert) i en amidbinding med glysin eller taurin, og blir så utskilt i gallegangene. I motsetning til dette så har nor (C23) gallesyrer en markant forskjell med hensyn til sin biotransformering og fysiologiske egenskaper sammenlignet med deres naturlige C24-homologer. Det er påvist at norUDCA resulterer i en koordinert og robust induksjon av Sult2al (en transferase som fortrinnsvis sulfaterer steroider og gallesyrer) og Mrp4 (en transportør av sulfaterte steroider og gallesyrer) (Schuetz, Strom, et al. 2001, Zelcer, Reid, et al. 2003). De funksjonelle implikasjonene av disse observasjonene er understøttet av en forekomst av gallesyresulfater og glukoronider i urinen fra norUDCA-forede Mdr2"</_->mus. Adaptiv induksjon av gallesyredetoksifisering av norUDCA via fase I (hydroksylering) og II (sulfatering, glukuronidering) metabolismen kan resultere i bedre vannløselige og derfor mindre toksiske gallesyremetabolitter som blir eliminert ved alternative hepatocellulære utløpspumper (f.eks. Mrp4), fulgt av deres nyere utskillelse som vist i dette eksemplet. Induksjonen av slike mekanismer av norUDCA var langt mer fremtredende enn for UDCA (i dette eksempel) eller agonistiske ligander av CAR som rapportert tidligere (Assem et al. 2004). Dette viser at norUDCA i vesentlig grad induserer Sult2al-mediert gallesyredetoksifisering og eksport av adaptiv overekspresjon av Mrp4, mens norUDCA i seg selv går gjennom en fortsatt kolihepatisk overføring. Dette har en dobbeltfordelaktig effekt ved (i) erstatte og fortynne toksiske gallesyrer i den gallen som befinner seg i gallegangene, og (ii) indusere en duktulær biokarbonatrik kolerese som reduserer oksidativt stress.

Utviklingen av en bikarbonatrik kolerese av norUDCA, har også terapeutiske implikasjoner i humane kolangiopatier (f.eks. PSC, PBC, kronisk leverimplantatavstøtning, ikke-suppurativ destruktiv kolangitt), ettersom den kolihepatiske forskyvningen eller overføringen resulterer i en kontinuerlig fluks av molekyler på tvers av gallegangsepitelet, noe som hjelper endrede galleganger til bedre å behandle toksisk/oksidativt stress. Det er f.eks. vist at sulindac, et NSAID som også går gjennom kolohepatiske overføring i mennesker, bedrer leverenzymene i PBC-pasienter med ufullstendig respons på UDCA-behandling.

Av interesse så eksisterer det to paralleller i norUDCA-metabolismen mellom mus og mennesker, noe som står i kontrast med tidligere observasjoner i andre gnagere og eksperimentdyr (f.eks. gallegangsfistulære rotter, hamstere og marsvin). For det første så har både mus og mennesker en betydelig nyreutskillelse av norUDCA. I tillegg ble det også funnet at den viktigste metabolitten av norUDCA i mus, var et glukoronid, noe som også er i overenstemmelse med observasjoner i mennesker.

For det andre, i motsetning til rotter (Yoon, Hagey, et al. 1986), så er den beregnede kolerektiske styrken på norUDCA i mus og mennesker, ca. tre ganger over den normale gallestrømmen i begge arter. norUDCA induserte imidlertid gallestrømmen i langt høyere grad i rotter (160 ml/min.-kg). Ikke desto mindre så viser disse observasjonene samlet at effektene av norUDCA i Mdr2"</>_-mus kan direkte ekstrapoleres til humane kolestatiske leversykdommer.

Samlet kunne det påvises at norUDCA helbreder skleroserende kolangitt i Mdr2"</_->mus. norUDCA er en effektiv forbindelse for kolestatiske leversykdommer, spesielt for human PSC og leversykdommer som er relatert til MDR3-mutasjoner.

REFERANSER:

Boldar et al. Gastroenterology 1999; 117(4):962-971.

Cohen et al. Gastroenterology 1986; 91(1):189-197.

Fickert et al. Gastroenterology 2001; 121(1):170-183. Fickert et al. Gastroenterology 2002; 123(4):1238-1251. Fickert et al. Gastroenterology 2004; 127{1):261-274. Hofmann et al. Pediatr Transplant 1999; 3(3):219-224. Jacquemin et al. Hepatology 1997; 25(3):519-523.

Jacquemin E. Clin Liver Dis 2000; 4(4):753-763.

Janaen et al. Liver mt 2003; 23(5):315-322.

Laminert et al. Hepatology 2004; 39(1) :117-128.

Paumgartner et al. Hepatology 2002; 36(3):525-531.

Pikarsky et al. Nature 2004; 431(7007) :461-466.

Schmassmann et al. Hepatology 1990; 11(6):989-996.

Trauner M et al. Allment Pharmacol Ther 1999; 13(8):979-996. Wagner et al. Gastroenterology 2003; 125(3):825-838.

Yoon et al. Gastroenterology 1986; 90(4):837-852.

Claims (5)

1. Farmasøytisk sammensetning omfattende 24-nor-ursodeoksykolsyre og/eller farmasøytisk akseptable salter og estere derav for anvendelse i behandling og/eller forebygging av kolestatisk leversykdom der leversykdommen er valgt fra gruppen som består av primær skleroserende kolangitt (PSC), primær skrumplever (PBC) eller progressiv familiær intrahepatisk kolestase type 3, alkoholisk eller ikke-alkoholisk steatohepatitt, autoimmun hepatitt, hepatocellulært karsinom og kolangiokarsinom.

2. Sammensetning ifølge krav 1, omfattende 24-nor-ursodeoksykolsyre og/eller farmasøytisk akseptable salter og metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl-, pentyl-, eller arylestere derav for anvendelse i behandling og/eller forebygging av kolestatisk leversykdom der leversykdommen er valgt fra gruppen som består av primær skleroserende kolangitt (PSC) og primær skrumplever (PBC).

3. Sammensetning for anvendelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat sammensetningen er formulert for oral, parenteral, subkutan, intravenøs, intramuskulær, nasal, topisk eller rektal administrering.

4. Sammensetning for anvendelse ifølge krav ltil 3, karakterisert vedat sammensetningen omfatter en effektiv mengde av 24-norursodeoksykolsyre, farmasøytisk akseptable salter og estere av denne, og minst én farmasøytisk akseptabel bærer og/eller fortynningsmiddel.

5. Sammensetning for anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 4,karakterisert vedat sammensetningen omfatter fra 10-8000 mg, fortrinnsvis 25-5000 mg, foretrukket 100-2500 mg, spesielt 800 - 1500 mg, mer foretrukket 50-1500 mg, og spesielt 250-500 mg av 24-nor-ursodeoksykolsyre og/eller minst ett farmasøytisk akseptabelt salt og/eller ester av denne.