EA014077B1

EA014077B1 - Применение 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты

Info

Publication number: EA014077B1
Application number: EA200702336A
Authority: EA
Inventors: Майкл Траунер; Алан Хофманн; Питер Фикерт
Original assignee: Медицинише Университет Грац
Priority date: 2005-05-12
Filing date: 2005-05-12
Publication date: 2010-08-30
Also published as: CY1116831T1; ES2547127T3; EP2392335A3; US20090163459A1; DK2392335T3; DK2392336T3; HRP20151091T1; RS55180B1; DK2392337T3; EA200702336A1; ME02544B; NO20076405L; RS54185B1; PL2392337T3; HUE025409T2; US8951995B2; PL2392336T3; EP2392337B1; EP1890705B1; PL2392335T3

Abstract

Данное изобретение относится к применению 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний печени, преимущественно хронических заболеваний печени.

Description

Данное изобретение относится к новым применениям 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты (норУДХК).

Урсодеоксихолевая кислота (УДХК), встречающаяся в природе желчная кислота, которая может быть обнаружена в малых количествах в желчи и крови людей, является широко применимым лекарственным препаратом для лечения болезней печени, при этом одним из наиболее важных областей назначения УДХК является растворение желчных камней и лечение первичного билиарного цирроза (ПБЦ) первичного склерозирующего холангита (ПСХ). УДХК явялется встречающейся в природе желчной кислотой с цитопротективным, мембраностабилизирующим и антиапоптозным эффектами. Более того, УДХК снижает в сыворотке уровни билирубина, трансаминаз и алкалиновой фосфатазы как маркера холестаза (Тгаипег & Сга/1абс1 1999, Веиегк & РаишдаПпег 2002).

Исследования УДХК на пациентах, страдающих от заболеваний печени, особенно ПБЦ пациентов, показали, что введение УДХК увеличивает скорость оттока желчи от гепатоцитов, тем самым борясь с холестазом и разбавляя и ингибируя токсические желчные кислоты, которые главным образом отвечают за повреждение гепатоцитов. Более того, УДХК также способна ингибировать иммунный ответ в печени, снижая иммунологическое повреждение желчных протоков и печени. УДХК, как отмечалось выше, является постоянно применяемой для лечения ПСХ и ПБЦ.

ПСХ, который поражает главным образом мужчин, является воспалительным заболеванием желчных протоков, которое может приводить к холестазу (блокированию транспорта желчи к желчному пузырю). Блокирование желчных протоков приводит к аккумулированию желчной кислоты в печени и желчи, повреждениям печени и в конечном итоге приводит к печеночной недостаточности. Большинство пациентов, страдающих от ПСХ, демонстрируют также хроническое воспаление толстой кишки (например, язвенный колит). Воспаление желчного протока может также поражать окружающую ткань печени и приводить к рубцеванию малых или больших желчных протоков, которое будет приводить к сужению желчных путей. Следовательно, такое сужение приводит к нарушенной секреции желчной жидкости, приводящее к разрушению печени. Вследствие этого может развиться цирроз печени и холангиокарцинома. Также ПБЦ представляет собой воспалительное заболевание желчных протоков, которое повреждает вначале более мелкие желчные протоки и которое, в конечном счете, приводит к циррозу печени. В отличие от ПСХ, ПБЦ поражает индивидуумов женского пола и не коррелирует с воспалительными заболеваниями толстой кишки.

Наиболее эффективный способ лечения ПБЦ и ПСХ представляет собой трансплантацию печени. До сегодняшнего момента только перспективное фармакологическое лечение обоих заболеваний включало применение УДХК. В настоящее время УДХК представляет собой только лекарственное средство, одобренное для лечения холестатичеких заболеваний печени (РаишдаПиег & Веиегк 2002). УДХК применяется при ПБЦ в дозе 12-15 мг/кг/день (в общем, 1000-1500 мг), при введении перорально один или два раза в день. Это применение одобрено Управлением по продовольствию и лекарствам США. Колхицин добавляли к лечению УДХК. Колхицин назначали в дозе 0,6 мг дважды в день из-за его потенциального противовоспалительного и антифиброзного эффектов. Некоторые исследования показывали умеренные улучшения в тестах на печени с применением колхицина. Тем не менее, не было обнаружено преимуществ по отношению к гистологии печени или выживания больных ПБЦ. Метотрексат, иммуносупрессорный агент, является другим лекарственным препаратом, который был протестирован в ПБЦ. Он вводился в дозе 15 мг в неделю. В небольших исследованиях метотрексат облегчал симптомы, печеночные анализы крови и изменения гистологии при применении на протяжении нескольких лет. Тем не менее, метотрексат вызывает тяжелые побочные эффекты, включая супрессию костного мозга, ухудшение заболевания печени и потенциально летальный фиброз легких.

УДХК имеет ограниченную эффективность при ПСХ и не показала пролонгированной выживаемости (без от трансплантации печени Тгаипег & Οπιζί- аба 1999, РаишдаПпег & Веиегк 2002). Текущие исследования тестируют, может ли высокая доза УДХК быть более эффективной. В особенности УДХК снижает риск рака толстой кишки у больных с ПСХ и язвенным колитом. Основываясь на гипотезе, что ПСХ имеет иммунологическую причину, тестировались кортикстероиды и другие иммуносупрессоры. Пероральные кортикостероиды давали начальное улучшение в биохимическом профиле. Тем не менее, отсутствие доказательств о продолжительном преимуществе, а также деминерализация кости, явилось аргументом против применения такого способа лечения. Другие лекарственные средства, такие как азатиоприн, циклоспорин, которые тестировались в комбинации с кортикостероидами и УДХК, никогда не исследовались отдельно в терапии ПСХ. Метотрексат и И-пеницилламин также показали свою неэффективность. Таким образом, фармацевтическая терапия для ПСХ до сих пор нуждается в оптимизации (Тгаииег & Οπ·ιζίη6α 1999, Веиегк & РаишдагШег 2002).

Эндоскопическое лечение ПСХ пациентов с симптоматическими доминантными стриктурами, камнями в желчном пузыре или инородными веществами рассматривается как существенная альтернатива в дополнении к медицинскому лечению. ПСХ пациенты, подвергающиеся эндоскопическому лечению, имели повышенную выживаемость, которая была намного выше, чем это предполагалось из моделей выживаемости.

Ортотопическая трансплантация печени является эффективной терапией для ПСХ и до настоящего

- 1 014077 времени единственной альтернативой, спасающей жизнь на последней стадии заболевания. После трансплантации, тем не менее, ПСХ имеет тенденцию к рецидиву у 15-30% пациентов, и существует также высокая частота рецидива билиарных стриктур, хронического отторжения и рефлюкс-холангита. К сожалению, применение иммуносупрессоров не улучшает выживаемость и рецидив заболевания. Таким образом, существует неотложная необходимость в эффективном лекарственном лечении, предотвращающем прогрессирование заболевания ПСХ, а также рецидив после трансплантации печени (Тгаипег & Сга/1айс1 1999, Веиега & РаитдаПпет 2002).

Хотя УДХК, которая является хорошо переносимой за исключением редких случаев диареи и почесухи (Тгаипег & Сга/1айе1 1999, Веиега & Раитдайпет 2002), преимущественно использовалась для лечения холестатических заболеваний печени, эффективность УДХК при ПСХ и у пациентов с заболеваниями печени, такими как прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз типа 3, является очень ограниченной (Тгаипег & Сга/1айе1 1999, 1асс.|ие1шп. Неттапк, е1 а1. 1997, 1асс.|ие1шп 2000, Птай, Кайешкк!, е1 а1. 1999).

В европейском патенте ЕР 0652773 В1 описано применение производных нор-и гомо-желчных кислот, необязательно конъюгированных с таурином, глицином или аланином, в качестве усилителей абсорбции для медикаментов энтеральным или непарэнтеральным путями. Эти производные демонстрировали липофильные и детергентные свойства и не метаболизируются кишечной бактериальной флорой.

Европейский патент ЕР 0624595 В1 раскрывает димерные нор-производные желчных кислот для применения медикамента, особенно подходящего для лечения гиперлипидемии. Вещества, раскрытые в данном патенте, состоят из двух отдельных производных желчной кислоты, которые ковалентно связаны друг с другом.

Патент США 4892868 раскрывает 22-метил-нор-урсодеоксихолевую кислоту и 23-метилурсодеоксихолевую кислоту для применения в лечении расстройств гепатобилиарной функции, с отдельной ссылкой на холестерольный метоболизм и продукцию желчи (например, для лечения холестаза).

Объект данного изобретения обеспечивает альтернативные фармацевтические агенты для лечения заболеваний печени, преимущественно хронических заболеваний печени, которые являются более эффективными, чем известные лекарства, такие как урсодеоксихолевая кислота, и демонстрируют меньше побочных эффектов, чем метотрексат.

Таким образом, данное изобретение относится к применению 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний печени, преимущественно хронических заболеваний печени.

Неожиданно обнаружили, что медикамент или фармацевтическая композиция, включающая 24-норурсодеоксихолевую кислоту, С23 аналог с укороченной боковой цепью встречающейся в природе С24 желчной кислоты урсодеоксихолевой кислоты (УДХК), и/или ее фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры, может успешно применяться для лечения различных заболеваний печени, потому что эти аналоги влияют на физиологические свойства желчных кислот (НоГтапп 1999, Зсйтакктапп, НоГтапп, е1 а1. 1990, Уооп, Надеу, е1 а1. 1986, Сойеп, НоГтапп, е1 а1. 1986). Хотя оба вещества структурно очень похожи, оба вещества демонстрируют различные характеристики при введении млекопитающим (см., например, Уооп ΥΒ, Надеу ЬВ, е1 а1., 1986).

24-нор-урсодеоксихолевая кислота, а также ее соли и сложные эфиры приводят к индукции билиарной секреции бикарбонатов, которая разбавляет токсический состав желчи и защищает эпителиальные клетки желчного протока от окислительного стресса, так как бикарбонат является сильным акцептором реактивных видов кислорода. Это приводит к восстановлению барьерной функции холангиоцитов и будет останавливать протекающий перихолагнит и последующий перидуктальный фиброз путем минимизации повреждения клеток желчных протоков в просвете желчного протока. Более того, обнаружено, что 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры имеют также противовоспалительный и антифиброзный эффекты.

В отличие от 24-нор-деоксихолевой кислоты и ее солей и сложных эфиров, урсодеоксихолевая кислота улучшает только перидуктальный фиброз лобулярных желчных протоков и увеличивают уровни в сыворотке аланин аминотрансферазы (АЬТ) и индуцирует инфаркты желчного происхождения. Тем не менее, урсодеоксихолевая кислота не улучшает заболевание малых портоков. Противоположные эффекты обеих желчных кислот в отношении поражения печени могут быть связаны с отличиями в уровне секреции желчи, а именно в том, что 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры стимулируют первичную секрецию протоков, тогда как урсодеоксихолевая кислота стимулирует секрецию канальцев, расположенных выше пораженных протоков.

Введение 24-нор-деоксихолевой кислоты и ее солей и сложных эфиров вызывает детоксификацию желчной кислоты путем гидроксилирования, сульфатации и глюкуронидации, приводящих к лучшей растворимости в воде и, таким образом, менее токсичным метаболитам желчной кислоты, которые разбавляют токсичные желчные кислоты в протоковой желчи и вызывают протоковое образование желчи, насыщенной бикарбонатом, который снимает окислительный стресс.

Образование желчи, насыщенной бикарбонатом 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты и ее солей и

- 2 014077 сложных эфиров имеет также терапевтические назначения при холангиопатиях человека (например, ПСХ, ПБЦ, хроническое отторжение трансплантата печени, негнойный деструктивный холангит), как холегепатическое шунтирование, приводящее к длительному потоку молекул через эпителий желчных протоков, который помогает управлять токсическим/окислительным стрессом в измененных желчных протоках. Например, сулиндак, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП или Ν8ΆΙΌ), который также подвергается холегепатическому шунтированию у людей, показал улучшение печеночных ферментов у ПБЦ пациентов с неполным ответом на лечение УДХК.

Способы для приготовления 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты и ее солей и сложных эфиров известны для специалиста в данной области и могут преимущественно быть приготовленными с помощью способа, описанного в ЗсЫейщаП СЭ и НоЕтапп АР (1. Ыр. Век. 29 (1988): 1387-1395).

Конечно, лекарственное средство согласно данному изобретению может быть использовано у людей, а также млекопитающих (например, свиньи, лошади, приматов, крупного рогатого скота, кошки, собаки).

Заболевание печени, которое должно лечиться лекарственным средством согласно данному изобретению, представляет собой холестатическое заболевание печени, преимущественно первичный склерозирующий холангит (ПСХ), первичный билиарный цирроз (ПБЦ) или прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз, в частности или прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз типа 1, 2 и 3, кистозный фиброз, холестаз, вызванный лекарственным средством, или нехолестатическое заболевание печени, такое как хронический вирусный гепатит (В, С, Ό), алкогольный и неалкогольный стеатогепатит, аутоиммунный гепатит, гемохроматоз, болезнь Вильсона и дефицит альфа-1антитрипсина. Более того, лекарство, включающее 24-нор-деоксихолевую кислоту и ее соли, и сложные эфиры, может использоваться для профилактики/химиопрофилактики карциномы печени, преимущественно гепатоцеллюлярной карциномы и холангиокарциномы. Также хроническое отторжение трансплантата и негнойный деструктивный холангит может лечиться указанным лекарственным средством.

В особенности заболевания, которые являются результатом или имеют следствием повреждение желчных протоков, могут лечиться лекарственным средством, включающим 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту и ее соли и сложные эфиры.

Нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП), такой как ибупрофен, снижает портальное и лобулярное воспаление в печени (которе приведет к перидуктальному фиброзу и протоковой пролиферации) и формирование гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК или НСС) (Р1каткку, Рота!, е! а1. 2004). так как 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры проявляют также противовоспалительные свойства, 24-нор-урсодеоксихолевая кислота может использоваться отдельно или в комбинации с другими противовоспалительными препаратами, такими как НПВП (например, ибупрофен, сулиндак (ВоИет, Тгапд, е! а1., 1999)).

Согласно другому преимущественному варианту осуществления данного изобретения заболевание печени представляет собой первичный склерозирующий холангит (ПСХ). Более того, заболевание печени представляет собой преимущественно первичный билиарный цирроз (ПБЦ). 24-норурсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры может применяться особенно для лечения ПСХ и ПБЦ.

Лекарственное средство, включающее 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту и/или ее соли или сложные эфиры могут особенно применяться для лечения первичного склерозирующего холангита (ПСХ) и первичного билиарного цирроза (ПБЦ).

Согласно преимущественному варианту осуществления данного изобретения 24-норурсодеоксихолевая кислота и ее соли и сложные эфиры могут быть сформулированы для перорального или внутривенного введения, где формуляции дополнительно содержат фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, наполнители и/или разбавители.

Твердые дозированные формы для перорального введения могут включать таблетки, преимущественно шипучие или жевательные таблетки, капсулы, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах, 24-нор-урсодеоксихолевая кислота может смешиваться с обычно применяемыми соединениями, такими как сахароза, маннитол, сорбитол, крахмал и производные крахмала, лактоза, смазывающие вещества (например, стеарат магния), дезинтегранты и буферирующие агенты. Таблетки и пилюли могут также быть приготовлены вместе с энтеросолюбильными покрытиями для того, чтобы предотвратить воздействие на 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту желудочных кислот и ферментов. Как таблетки немедленного высвобождения, эти композиции могут дополнительно содержать микрокристаллическую целлюлозу и/или дикальция фосфат.

Жидкие дозированные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии и сиропы, включающие инертные разбавители, обычно применяемые в области техники, такие как вода. Эти дозированные формы могут содержать микрокристаллическую целлюлозу для придания объема, альгиновую кислоту или натрия альгинат как суспендирующий агент, метилцеллюлозу как усилитель вязкости и подсластители/ароматизаторы. При введении с помощью назального аэрозоля или ингаляции, композиции согласно данному изобретению могут быть приготовлены как растворы в солевом растворе с применением бензилового спирта или других соответствую

- 3 014077 щих консервантов, стимуляторы абсорбции для усиления биодоступности, фторуглероды и/или другие солюбилизаторы или диспергирующие агенты.

Суппозитории для ректального введения 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты могут быть приготовлены путем смешивания соединений или композиций с соответствующим нераздражающим наполнителем, таким как масло какао и полиэтиленгликоли, которые являются твердыми при комнатной температуре, но становятся жидкими при ректальной температуре, из условия, что они будут растворяться в прямой кишке и высвобождать 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту и необязательно другие активные соединения, присутствующие в указанных суппозиториях.

Препараты для инъекции, например стерильные инъецируемые водные или масляные суспензии, могут быть также сформулированы согласно известному уровню техники с применением соответствующих диспергирующих агентов, увлажнителей и/или суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может также быть стерильным инъецируемым раствором или суспензией в нетоксическом парентерально приемлемом разбавителе или растворителе. Среди приемлемых разбавителей и растворителей, которые могут использоваться, вода и изотонический раствор натрия хлорида. Стерильные нелетучие масла также обычно применяются в качестве растворителя или среды суспендирования.

Согласно данному изобретению дозированные формы, включающие 24-нор-урсодеоксихолевую кислоту, могут дополнительно включать типичные наполнители, преимущественно фармацевтически приемлемые соединения органических или неорганических носителей, которые не реагируют с активным соединением. Соответствующие фармацевтически приемлемые носители включают, например, воду, солевые растворы, спирт, масла, преимущественно растительные масла, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, поверхностно-активные вещества, парфюмерное масло, жирнокислотные моноглицериды и диглицериды, жирные кислоты, расторенные в петролейном эфире, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и подобное. Фармацевтические препараты могут быть стерилизованы и, если необходимо, смешаны с вспомогательными агентами, такими как смазочные вещества, консерванты, стабилизаторы, увлажнители, эмульсификаторы, соли для влияния на осмотическое давление, буферы, красители, вкусовые и/или ароматические соединения и подобное, которые не опасно реагируют с активными соединениями. Для парентерального введения отдельные приемлемые разбавители состоят из растворов, преимущественно масляных или водных растворов, а также суспензий, эмульсий или имплантатов.

Различные системы доставки являются известными и могут быть использованы для введения 24нор-урсодеоксихолевой кислоты, включая, например, инкапсулирование в липосомы, эмульсии, микрочастицы, микрокапсулы и микрогранулы (например, европейский патент ЕР 1317925). Необходимая доза может быть введена как одноразовая или в форме длительного высвобождения.

Биодоступность 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты может быть увеличена путем микронизации формуляций с применением типичных методик, таких как мелкое дробление, помол и сушка распылением в присутствии приемлемых наполнителей или агентов, таких как фосфолипиды или поверхностноактивные вещества.

Согласно изобретению 24-нор-урсодеоксихолевая кислота может быть сформулирована в форму фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира. Фармацевтически приемлемые соли 24-норурсодеоксихолевой кислоты включают преимущественно ионы металлов, в частности соли щелочных металлов, или другие фармацевтически приемлемые соли. Пригодные фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических кислот, таких как хлороводородная, бромоводородная, йодоводородная, азотная, угольная, серная и фосфорная кислота, или органических кислот, таких как алифатического, циклоалифатического, ароматического, гетероциклического, карбонового и сульфонового классов органических кислот, таких как муравьиная, уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, глюконовая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, глюкуроновая, малеиновая, фумаровая, пировиноградная, аспарагиновая, глютаминовая, бензойная, этансульфоновая, оаминобензойная, мендалевая, метансульфоновая, салициловая, р-гидроксибензойная, фенилуксусная, метансульфоновая, бензолсульфоновая, пантотеновая, толуолсульфоновая, 2-гидроксиэтансульфоновая, альгиновая, сульфаниловая, стеариновая, р-гидроксимасляная, циклогексиламиносульфоновая, галактаровая и галактуроновая кислота и подобное. Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли включают металлические соли, приговленные из лития, алюминия, кальция, магния, калия, натрия и цинка, или органические соли, приготовленные из первичных, вторичных и третичных аминов и циклических аминов. Все соли 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты могут быть получены способами, известными из уровня техники (например, путем реакции 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты с соответствующей кислотой или основанием). Сложные эфиры 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты представляют собой нетоксические сложные эфиры, преимущественно алкил сложные эфиры, такие как метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, бутиловый, изобутиловый или пентиловый сложные эфиры или ариловые сложные эфиры. Эстерификация карбоновых кислот, таких как 24-нор-урсодеоксихолевая кислота, проводят с помощью различных общепринятых технологий, включая реагирование карбоксильной группы с соответствующим спиртом. Эти реакции известны специалисту в данной области.

Способы для получения лекарственного средства согласно данному изобретению, включая 24-нор

- 4 014077 урсодеоксихолевую кислоту, и сформулированного для введения, как отмечалось в данном описании, могут быть найдены, например, в НапбЬоок оГ Рйагтасеибса1 МапиГасШппд Рогти1абоп8 (ЗагГагах К Νίαζί, СК.С Рге§8 ЬЬС, 2004).

Лекарственное средство включает преимущественно эффективное количество 24-норурсодеоксихолевой кислоты и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

Согласно преимущественному варианту осуществления данного изобретения медикамент включает 10-8000 мг, преимущественно 25-5000 мг, более преимущественно 50-1500 мг, в частности 250-500 мг 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты.

В среднем 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и/или ее фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры могут преимущественно быть введены пациенту в количестве 25 мг - 5 г, преимущественно 100 мг - 2,5 г, в частности 80,0 мг - 1,5 г в день. Тем не менее, пациенту преимущественно вводят 1 г 24нор-урсодеоксихолевой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров. Также отмечено, что 24-нор-урсодеоксихолевая кислота и/или ее фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры могут быть введены в индивидуума в количестве 1-100 мг/кг/день, преимущественно 5-50 мг/кг/день, более преимущественно 10-25 мг/кг/день, в частности 12-15 мг/кг/день. Указанные количества вводят однократно или преимущественно в более чем одной дозе (по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 10 дозах) в день. Лекарственное средство или фармацевтическая композиция согласно данному изобретению может вводиться на протяжении более чем одной недели, преимущественно более чем четыре недели, более преимущественно более чем шесть недель, наиболее преимущественно более чем один год, в частности в течение всей жизни.

24-нор-урсодеоксихолевая кислота может вводиться не только в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями и в дозированных формах как описано в данном описании, но, конечно, также в комбинации с одним или более дополнительными активными ингредиентами (например, урсодеоксихолевая кислота, НПВП, например, сулиндак и ибупрофен), для которых также известно, что они эффективны против такого же или сходного заболевания, которое необходимо вылечить (например, урсодеоксихолевая кислота), или против другого заболевания, которое может быть преимущественно результатом заболевания печени.

Согласно данному изобретению для лечения и/или профилактики заболеваний печени, описанных в данном описании, может использоваться не только нор-УДХК, но также и другие желчные кислоты, имеющие любую другую модификацию боковой цепи, которая предотвращает эффективное Νациламидирование (может быть проанализировано любым соответствующим способом, известным из уровня техники, особенно с помощью способов, описанных 1о11П5оп. М., е! а1. Апа1. Вюсйет., (1989) 182:360-365; Уооп, Надеу, е! а1. 1986), таких как следующие, но не ограничиваясь ими: увеличенная длина (например, нор и динор-желчные кислоты), добавление алкильной группы (особенно метил-, этил-, порпил-, бутил-, пентил- и гексилгруппы) к альфа или бета углероду. Эти УДХК-производные приводят к фармацевтическим и терапевтическим свойствам, подобным тем, которые характерны для нор-УДХК, особенно для лечения и профилактики ПБЦ и ПСХ.

Данное изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими фигурами и примерами, не ограничиваясь ими.

Фиг. 1. норУДХК излечивает склерозирующий холангит у Мбг2^- мышей. (А) Гистология печени (Н&Е окрашивание) в контрольных Мбг2^- мышах, получающих диетическое питание (КО), Мбг2^- мышей, получающих УДХК с пищей (КО+УДХК), и Мбг2^- мышей, получающих норУДХК с пищей (КО+норУДХК) (Увеличение х 10). Выраженное заболевание большого желчного протока в КО (стрелки), которое существенно снижается в КО+УДХК (стрелки) и отсутствует в КО+норУДХК. (В) Склерозирующий холангит в КО с перидуктальным фиброзом, измененные эпителиальные клетки желчного протока и смешанный воспалительный инфильтрат. Эти признаки улучшались в КО+УДХК и отсутствовали в КО+норУДХК (Увеличение х 40). (С) Окрашивание Сириус красным, показывающее существенный фиброз с перидуктальными нитями коллагена (красный) в КО. Умеренное уменьшение фиброза в КО+УДХК и даже более выраженное уменьшение в КО+норУДХК (Увеличение Гог Ь, с х 40); Ьб, желчный проток.

Фиг. 2. норУДХК существенно уменьшает содержание гидроксипролина в печени в Мбг2^-/-. Содержание гидроксипролина в печени у дикого типа (АТ), контрольных Мбг2^-/-мышей, получающих диетическое питание (КО), Мбг2^-/-мышей, получающих УДХК с пищей (КО+УДХК), и Мбг2^-/- мышей, получающих Нор-УДХК с пищей (КО+норУДХК). Содержание гидроксипролина в печени существенно повышается в КО по сравнению с АТ и снижается до базовых уровней в КО+норУДХК. Значения представляют собой среднее ± ЗЕМ (стандартная ошибка среднего) из п=5 на группу. р<0,05, АТ против КО; КО против КО+норУДХК.

Фиг. 3. норУДХК существенно уменьшает инфильтрацию портальными нейтрофилами/кровоизлияние в Мбг2^-/-. Иммуногистохимия для СИНЬ (красный, окрашенные нейтрофилы) контрольной Мбг2^-/- мыши, получающей диетическое питание (КО), Мбг2^-/- мыши, получающей УДХК с пищей (КО+УДХК), и Мбг2^-/-мыши, получающей норУДХК с пищей (КО+норУДХК) (А) интерлобулярных и (В) лобулярных желчных протоков. (С) Количественная оценка СО11Ь-позитивных клеток на 20

- 5 014077 портальных областей. норУДХК существенно уменьшает количество СБЛЬ-позитивных клеток в Мбг2^-/-. Значения представляют собой среднее ± 8ЕМ (стандартная ошибка среднего) из п=3 на группу; р<0,05.

Фиг. 4. норУДХК ингибирует экспрессию молекулы адгезии портального сосудистого эндотелия (УСАМ) в Мбг2^-/- мышах. Иммуногистохимия для УСАМ (красный) в интерлобулярных (А) и лобулярных (В) желчных протоках контрольной Мбг2^-/- мыши, получающей диетическое питание (КО), Мбг2^-/мыши, получающей УДХК с пищей (КО+УДХК), и Мбг2^-/- мыши, получающей норУДХК с пищей (КО+норУДХК). (А) Нет наблюдаемого различия в экспрессии портальной УСАМ между КО и КО+УДХК, где КО+норУДХК демонстрирует существенно более низкую экспрессию в пролифератах желчного протока. (В) На уровне лобулярных желчных протоков как УДХК, так и норУДХК снижают экспрессию холангиоцеллюлярной УСАМ.

Фиг. 5. норУДХК ингибирует пролиферацию гепатоцитов и холангиоцитов у Мбг2^-/- мышей. Иммуногистохимия для Κί-67 (красный) в гепатоцитах (А) и холангиоцитах (В) контрольной Мбг2^-/- мыши, получающей диетическое питание (КО), Мбг2^-/- мыши, получающей УДХК с пищей (КО+УДХК), и Мбг2^-/- мыши, получающей норУДХК с пищей (КО+норУДХК). (А) Множество Κί-67 позитивных гепатоцитов в КО и КО+УДХК и рассеянное позитивное ядро в КО+норУДХК. (В) Множество Κί-67 позитивных холангиоцитов в КО, несколько позитивных холангиоцитов (стрелки) в КО+УДХК и О+норУДХК, соответственно. (С) Количество Κί-67 позитивных гепатоцитов на 30 НРЕк и (Ό) количество Κί-67 позитивных холангиоцитов на 20 портальных областей. Только норУДХК существенно снижает количество пролиферирующих гепатоцитов и холангиоцитов. Значения представляют собой среднее ±8ЕМ (стандартная ошибка среднего) от и=3 на группу. р<0,05, *\УТ против КО; 1 АУТ против КО+УДХк4кО против КО+норУДХК.

Фиг. 6. Положительная зависимость между выходом бикарбоната желчи и выделением желчи в Мбг2^-/-. Выход бикарбоната желчи нанесен на график против выделения желчи у контрольных Мбг2^-/мышей, находящихся на диете (контроль, неокрашенные кружки), Мбг2^-/- мыши, получающие с пищей УДХК (УДХК, неокрашенные треугольники), и Мбг2^-/- мыши, получающие с пищей норУДХК (норУДХК, окрашенные кружки). Отмечена положительная зависимость между выходом бикарбоната и выделением желчи, а также группирование животных, получающих лечение норУДХК, демонстрирующих самый высокий выход бикарбоната в верхнем правом углу.

Фиг. 7. Предположительные терапевтические механизмы норУДХК у Мбг2^-/-мышей. норУДХК поглощается гепатоцитами и секретируется в проточек и желчные протоки, где она поглощается холангиоцитами, что приводит к протоковой секреции бикарбоната. норУДХК секретируется обратно в сосудистое сплетение около желчных протоков и шунтируется обратно в гепатоциты (холегепатическое шунтирование). норУДХК вызывает экспрессию 8иЙ2а1 с1е. и Мгр3 и Мгр4, которые детоксифицируют желчные соли и делают их пригодными для почечного выведения.

Фиг. 8. Химическая структура норУДХК (3-альфа, 7-альфа-дигидрокси-24-нор-5-бета-холан-23оевая кислота).

Примеры 1.

У мышей с направленным нарушением Мбг2 (АЬсЬ4) гена, кодирующего каналикулярную фосфолипидную флиппазу развивается склерозирующий холангит с макроскопическими и микроскопическими признаками, очень сходными с таковыми, наблюдаемыми при склерозирующем холангите человека, например, первичном склерозирующем холангите, ПСХ) (Еккей, ΖοΙΙηβΓ, с1 а1. 2002, Еккей, ЕисйкЬкЫег, с1 а1. 2004). Повреждение желчного протока у этих мышей связано с дефективной билиарной секрецией фосфолипидов, приводящей к возросшей концентрации свободных немицеллярных желчных кислот, которые впоследствии вызывают повреждение эпителиальной клетки желчных протоков (холангиоцита), перихолангит, перидуктальный фиброз с протоковой пролиферацией и в конечном итоге склерозирующий холангит (Еккей, ЕисйкЬкЫег, е1 а1. 2004, Еаттей, ^апд, е1 а1. 2004). Кроме возможности изучения новых стратегий лечения ПСХ эта модель может касаться тестовых способов лечения для широкого спектра заболеваний печени человека, являющихся результатом МБК.3 мутаций (человеческий ортолог Мбг2) от неонатального холестаза до заболеваний печени взрослого (1ап§еп & 81игт 2003).

В настоящее время УДХК является единственным препаратом, одобренным для лечения холестатических заболеваний печени (Раитдайпег & Веиега 2002). Хотя эффективность УДХК при ПСХ и у пациентов с заболеваниями печени, обусловленными МБК.3 мутациями (например, прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз типа 3), ограничена (Тгаипег & Сга/1абе1 1999, .Тасдиетт, Негтапк, е1 а1. 1997, .ксдиетт 2000, Нтай, 1<а1кш5кг е1 а1. 1999). Укорочение боковой цепи УДХК может повысить ее терапевтическую эффективность, так как эта модификация существенно влияет на физиологические свойства желчных кислот (НоГтапп 1999, Зсйтакктапп, НоГтапп е1 а1. 1990, Уооп, Надеу, е1 а1. 1986, Сойеп, НоГтапп, е1 а1. 1986). норУДХК, С₂₃ аналог УДХК с укороченной боковой цепью, является эффективным желчегонным агентом у различных грызунов (например, хомяк, крыса, морская свинка), подвергающаяся экстенсивному холегепатическому шунтированию и вызывающая билиарную секрецию бикарбоната на уровне желчного протока (Уооп, Надеу, е1 а1. 1986, Сойеп, НоГтапп, е1 а1. 1986). В отличие от УДХК, эффекты норУДХК на холестаз никогда ранее не исследовались. Для изуче

- 6 014077 ния гипотезы о том, что холегепатическое шунтирование нетоксической желчной кислоты может быть успешным в лечении холангиопатий, исследовали эффекты норУДХК у Мбг2^-/- мышей как модели склерозирующего холангита (Нскей, ЕисйзЫсЫег, с1 а1. 2004). В этом примере исследовали положительные эффекты норУДХК при лечении заболеваний печени человека, вызванных МИК.3 мутациями, и холангиопатий человека, таких как склерозирующий холангит (например, ПСХ).

1.1. Материалы и методы

1.1.1. Эксперименты на животных.

М62^-'^- мыши (исходная линия ЕУВ/Ν) были получены из Лаборатории 1аскзои (Тйе 1аскзои ЬаЬога1огу. Ваг НагЬог, МЕ, И8А). Мышей поместили с 12-часовым светотемновым циклом и неограниченным доступом к воде и стандартной диетой для мышей (δηίίί, 8оеЫ, Сегшаиу).

1.1.2. Кормление желчной кислотой Мбг2^-/- мышей.

Двух-месячные Мбг2^-/- (временной отрезок, когда склерозирующий холангит в полной мере проявился у этих животных (Нскей, 2о11иег, е1 а1. 2002) получали либо диету с добавкой норУДХК (0,5%, вес/вес) или УДХК в качестве клинического препарата сравнения (0,5%, вес/вес) в течение 4 недель и сравнивались с контролями: Мбг2^-/-, получающими стандартную диету, и диким типом.

1.1.3. Гистология печени.

Для общепринятой световой микроскопии печени были фиксированы в 4% нейтральном забуференном растворе формальдегида и помещены в парафин. Срезы (4 мкм толщиной) были окрашены Н&Е и красителем Сириус красный, соответственно. Срезам присвоили коды, и они были исследованы патоморфологом (Н. И.), неосведомленным о лечении животных.

1.1.4. Стандартная биохимия сыворотки.

Образцы сыворотки хранили при -70°С, пока анализ аланинтрансаминазы (АЛТ) и алкалин фосфотазы (АР) с помощью стандартной клинической химии провели на анализаторе НйасЫ 717 (Воейпидег Маиийет, Маиийе1ш, Сегшаиу). Для определения общих уровней желчных кислот в сыворотке применялся серийный анализ 3-альфа-гидростероид дегидрогеназы (Есойие 8+; И1а8уз, Нокйеш, Сегшаиу).

1.1.5. Иммуногистохимия альфа-8МА.

Иммуногистохимию альфа-8МА (антигладкомышечный) проводили на обработанных микроволнами (0,01 ммоль/л цитратного буфера рН 6,0) парафиновых срезах (4 мкм толщиной) с применением альфа-8МА моноклонального антитела мыши (разведение 1:500, 81дша, 81. Ьоик, МО). Связывание антитела определяли с использованием АВС системы (Иако, С1о81гир, Иеишагк), применяя в-амино-9-этилкарбазол (АЕС; Иако) в качестве субстрата.

1.1.6. Иммуногистохимия маркера пролиферации Κί-67.

Иммуногистохимию Κί-67 проводили на обработанных микроволнами (0,01 ммоль/л цитратного буфера рН 6,0) парафиновых срезах (4 мкм толщиной) с применением анти-К1-67 поликлонального антитела кролика (разведение 1:750, ШтосаЛи-г №теаЫ1е ирои Туие, ИК). Связывание антитела определяли с использованием АВС системы (Иако), применяя АЕС (Иако) в качестве субстрата. Количество пролиферирующих гепатоцитов вычисляли путем подсчета позитивных ядер в 30 полях зрения микроскопа под большим увеличением в срезах 3 животных в каждой группе. Количество пролиферирующих эпителиальных клеток желчных протоков рассчитывали путем подсчета позитивных ядер в 20 портальных областях в срезах 3 животных в каждой группе.

1.1.7. Иммуногистохимия маркера нейтрофилов СИ-ИЬ.

Для подсчета нейтрофилов СИ йЬ-позитивных клеток определили, как описано ранее (Еюкей, ЕисйзЫсЫег, е1 а1. 2004) с модификацией: связывание антитела определяли с применением системы АВС (Иако), используя АЕС (Иако) как субстрат. Количество нейтрофилов было вычислено путем подсчета позитивных клеток в 20 портальных областях в срезах 3 животных в каждой группе.

1.1.8. Иммуногистохимия молекулы адгезии сосудистого эндотелия (УСАМ).

Иммуногистохимию УСАМ проводили на фиксированных в ацетоне срезах замороженных тканей с применением анти-СИ106 моноклональных антител крысы (УСАМ-1, разведение 1:30, РйагМшдеи, 8аи И1едо, СА, И8А) и связывание антитела определяли с использованием системы АВС (Иако), применяя АЕС (Иако) в качестве субстрата.

1.1.9. Иммуногистохимия аддуктов 4-гидроксиноненаль-белок.

Срезы печени депарафинизировали и затем инкубировали с иммуночистым супрессором пероксидазы (Р1егсе, Восккогб, 1Ь) в течение 30 мин и затем провели блокирование протеина (ИАКО, СагреШепа, СА) в течение 2 ч. После этого провели инкубацию в течение ночи с первичным анти-4гидроксиноненаль антителом (Са1Ыосйеш, 8аи И1едо, СА) при комнатной температуре и связывание антитела определяли с применением системы АВС (Иако) с АЕС (Иако) в качестве субстрата.

1.1.10. Определение гидроксипролинового содержимого в печени.

Для количественной оценки фиброза печени в нашей модели определяли гидроксипролиновое содержимое печени. Правую долю печени гомогенизировали в 6-нормальной НС1 (200 мг ткани печени/4 мл НС1) и гидролизировали при 110°С в течение 16 ч. После фильтрования 50 мкл добавили к 450 мкл 2,2% ΝηΟΗ растворенного в цитратно-ацетатном буфере (50 г лимонной кислоты х Н₂О, 12 мл уксусной

- 7 014077 кислоты, 120 г натрия ацетата х 3Н₂О, 34 г ΝαΟΗ в 1 л дистиллированной воды; рН 6,0). После добавления 250 мкл перхлорной кислоты и 12 мин инкубации при комнатной температуре добавили 250 мкл раствора р-диметиламинобензальдегида и инкубировали при 60°С в течение 20 мин. Содержание гидроксипролина измеряли при 565 нм с применением гидроксипролиновой стандартной кривой.

1.1.11. мРНК анализ и ПЦР ключевых генов фиброза.

Выделение РНК, синтез кДНК и Тацшап® ПЦР в реальном времени проводили, как описано ранее (Аадпег, Б!скег1, е! а1. 2003). Применяли следующие праймеры и 5' РАМ, 3' ТЛМКЛ меченые зонды: Со11а1 ί\ν<1 (прямая последовательность): саа!дсаа1даадаас1ддас1д! (8ец И) Νο. 1), Со11а1 геу (обратная последовательность): !сс!аса1с11с!дадШдд1да (8ец И) Νο. 2) и зонд Со11а1: садааадсасадсас!сдссс!сс (8ец И) Νο. 3); ΤΙΜΡ-Ι ίνά: са!ддааадсс1с1д!дда1а1д (8ец И) Νο. 4), ΤΙΜΡ-Ι геу: аадс1-дсаддса11да1д!д (8ец И) Νο. 5) и зонд ΤΙΜΡ-Ι: с!са!сасдддссдсс1ааддаас (8ец И) Νο. 6); ΜΜΡ-2 ίννά: с111дадаадда1ддсаад1а1дд (8ец И) Νο. 7), ΜΜΡ-2 геу: 11д1аддадд1дссс1ддаа (8ец И) Νο. 8) и зонд ΜΜΡ-2: сада!ддасадссс1дсаад11ссс (8ец И) Νο. 9).

1.1.12. Измерение выделения желчи.

Выделение желчи измеряли гравиметрически и нормализовали вес печени как описано выше (Р1скей, Ζο11^Γ, е! а1. 2001). Концентрацию фосфолипидов в желчи определяли с применением коммерчески доступного набора (ΡΗο8ρΗο1ΐρΐά В; \\+Ι\ο, \еи88, Сегшапу) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию холестерола в желчи определяли с применением коммерчески доступного набора (^οίβ81е1ю1 1ίςπίοο1οΓ; Нитап, А1е8Ьайеп, Сегшапу) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию глутатиона в желчи (С8Н) определяли после осаждения протеина в 5% метафосфорной кислоты с применением Набора для Анализа Глутатиона (Са1Ьюсйеш, 8ап ^^едο, И8) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию желчных кислот в желчи анализировали с применением анализа 3-альфагидроксистероид дегидрогеназы (Б^Ипе 8ΐ, И1а8у8) в соответствии с инструкцией производителя.

1.1.13. Статистический анализ.

Данные записывались как среднее арифметическое +/- 8И (стандартное отклонение). В каждой группе изучалось от 4 до 6 животных. Статистический анализ проводили с применением ΐ-теста Стьюдента или ΑΝΟνΑ с поправкой Бонферрони при сравнении трех или более групп. Значение р <0,05 принималось как значимое.

1.2. Результаты

1.2.1. норУДХК существенно улучшает повреждение печени, уменьшает фиброз и лечит склерозирующий холангит у Μάί2^-/- мышей.

Уровни АЛТ и АР в сыворотке (как биохимические маркеры повреждения печени и холестаза) были существенно повышены у Μάί2^-/-, получающих стандартную диету, по сравнению с контролями дикого типа (табл. 1).

Таблица 1. Биохимия сыворотки и уровни желчной кислоты при различных экспериментальных условиях

	АЛТ (ед/литр)	АР (ед/литр)	Желчь
ΨΤ	71+19	92+13	0,09+0,03
ко	405+187	235+55	0,32+0,11
КО+УДХК	576+175*	399+73*	0,55+0,19
КО+норУДХК	165+23*$	162+25*#	0,23+0,2$

Примечание. Значения выражены как среднее + 8И от п = 5 на группу. АЛТ, аланин трансаминаза; АР, алкалин фосфатаза; 8ВА, желчные кислоты сыворотки, АТ, мыши дикого типа; КО, Μάί2 нокаутные мыши, КО+УДХК, Μάί2 нокаутные мыши, получающие УДХК с пищей; КО+норУДХК, Μάί2 нокаутные мыши, получающие норУДХК с пищей.

*р<0,05, КО против КО+УДХК и КО против КО+норУДХК (ΑΝΟνΑ с поправкой Бонферрони) #р<0,05, КО+УДХК против КО+норУДХК (ΑΝΟνΑ с поправкой Бонферрони) норУДХК существенно улучшала уровни АЛТ и АР в сыворотке по сравнению с Μάί2^-/-, получающими стандартную диету (табл. 1). Параллельно Μάί2^-/-, получающими стандартную диету, выявляли ярко выраженный склерозирующий холангит (фиг. 1) с дуктулярной пролиферацией и фиброзом печени, что отражалось в существенно увеличенном содержании гидроксипролина в печени (фиг. 2). Μάί2^-/-, получающими норУДХК с пищей, демонстрировали нормальные желчные протоки больших и средних размеров с отсутствием или только ограниченным перидуктальным фиброзом (фиг. 1); дуктуральная пролиферация полностью отсутствовала (не показано). В соответствии с гистологическими изменениями норУДХК существенно снижала содержание гидроксипролина в печени у Μάί2^-/- (фиг. 2), что наблюдалось наряду со значительным уменьшением экспрессии печеночного коллагена 1 и 3 мРНК (табл. 2).

- 8 014077

Таблица 2. Последовательности праймера (5'-3) ПЦР в реальном времени

	Прямая	Обратная
Сур2Ы0	СААТССОААССТТСОААСА	ТОАТССАТСОААОАООААС
СурЗа11	ССАССАСТАОСАСАСТТТСС	ТТСС АТСТСС АТС АС АСТАТС А
1ЫВ	СТОСТСТСТСАССТТСССАТТА	ССОАСАОСАСОАООСТТТ
1Ь-1К	СССАССгАССССТСАСАОА	ТСССТСОАСТОТТАОТСААОС А
1Ь-6	ОСССАССААСААСОАТАСТСА	СААСтССААСТССАТССААСТ СТ
ММРЗ	СССАССААСТСТААСТСТСТССА А	ОООТОСТСАСТОСАТСАААО А
ΜΙΡ-2	ССТСААССОААСААССАААОАС	СТСАОАСАОСОАООСАСАТС
МгрЗ	ОССАСООССАСАСТСАСТ	АОТССТСАОАТСТСАОССТАО ТСА
Мгр4	ТТАСАТСОСССТСТСОТТСТ	ОСССАСААТТССААТТССААС стт
Ϊ-ΝΟ8	АСАТСАОСТСССССАТСАСТ	СОТАССООАТСАОСТСТСАА ТТ
Ргосо11а§еп 1	ССАОООТТССААССАТОТТО	ОСАОССАТСОАСТАООАСАО А
Ргосо11а§еп 3	ССТССТТТТСАСТТСАССТАТОС	СТООАААОААОТСТОАООАА ТСС
Т6Г-ЬеЩ	ТСОАСАТОСАОСТСОТОААА	СТСССОАСССТТАОТТТССА
ТХГ-а1р11а	СгАСССТСАСАСТСАСАТСАТСТТ СТ	ССТССАСТТССТССТТТССТ
ΤΝΡ-Κ1	ТССАСТАААСАССАСААСССАС	ТТССТСАОССТСАТССАСТС
8и112а1	ООААОСАССАСОАСТСАТААС	ОАТТСТТСАСААООТТТСТСТ ТАСС
и§11а1	ТСТСАССССТССАТСТАТСТС	ССССАОАООСОТТОАСАТА

Лечение УДХК Мбг2^-- в качестве клинического препарата сравнения и общепринятое стандартное лечение холестатических заболеваний печени (включая ПСХ) исследовали одновременно. В отличие от норУДХК, УДХК существенно повышает активность АЛТ и АР у Мбг2^-- (табл. 1) и 2 из 5 животных показывали инфаркты желчного происхождения в соответствии с предыдущими наблюдениями (Г1скег!, 2о11пег, е! а1. 2002). Установлено, что УДХК снижает перидуктальный фиброз лобулярных и интерлобулярных желчных протоков (фиг. 1), но она показывала лишь тенденцию в снижении содержания гидроксипролина в печени без достижения статистической значимости (фиг. 2). Эти сведения точно определяют, что норУДХК (но не УДХК) существенно уменьшает повреждение печени, перихолангит и перидуктальный фиброз у Мбг2^--, что в конечном итоге приводит к излечению склерозирующего холангита.

1.2.2. норУДХК уменьшает воспаление, окислительный стресс и клеточную пролиферацию у Мбг2^-мышей.

Так как портальное воспаление может представлять главный фактор развития перидуктального фиброза у Мбг2^-/- (Р1кагзку, Рога!, е! а1. 2004), было анализировано снижение портального воспаления с норУДХК. Мбг2^--, получающие стандартную диету, имели существенно увеличенное количество портальных нейтрофилов по сравнению с контролями дикого типа (фиг. 3). норУДХК также улучшала перихолангит у Мбх2^--, что отражается в существенно уменьшенном количестве портальных нейтрофилов по сравнению с Мбг2^--, получающими стандартную диету (фиг. 3). Эти видимые противовоспалительные эффекты норУДХК были наряду с существенно более низкой экспрессией УСАМ в эпителиальных клетках желчных протоков интерлобулярных и лобулярных желчных протоков у Мбг2^--, получающих УДХК с пищей (фиг. 4). Так как прежде было показано, что воспаление запускает также пролиферацию в печени у Мбг2^-/- (Р1кагзку, Рога!, е! а1. 2004), было проанализировано, оказывает ли на этот факт влияние норУДХК. Мбг2^--, получающие стандартную диету, показали существенно повышенное количество Κί-67 позитивных гепатоцитов и холангиоцитов по сравнению с контролями дикого типа (фиг. 5). норУДХК существенно снижала степень пролиферации гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков практически до уровней, наблюдаемых у контролей дикого типа (фиг. 5). УДХК не имела значительных эффектов на портальное воспаление (фиг. 3), экспрессию УСАМ (фиг. 4) и пролиферацию гепатоцитов

- 9 014077 (фиг. 5). Однако УДХК снижала пролиферацию эпителиальных клеток желчных протоков в больших желчных протоках (фиг. 5). Кроме того, эти данные означают, что противовоспалительный и антипролиферативный эффекты норУДХК превосходят таковые у УДХК.

1.2.3. норУДХК вызывает билиарную секрецию бикарбоната у М4г2 мышей. Для определения того, может ли образование насыщенной бикарбонатом желчи, вызванное холегепатическим шунтированием норУДХК, быть ответственным за наблюдаемые терапевтические эффекты, были исследованы выделение желчи и составы (табл. 3).

Таблица 3. Выделение желчи и билиарная экскреция желчных кислот, холестерола, фосфолипидов и глутатиона при различных экспериментальных условиях

		ко	КО+УДХК	КО+норУДХК
		п=4	п=6	п=5
Выделение желчи	мкл/г/мин	2,3+0,3	2,4+0,3	3,5+0,3
Желчные кислоты	нмоль/г/мин	23,0+5,9	37,2+7,6*	29,5+2,3
Холестерол	нмоль/г/мин	0,2+0,1	0,3+0,1	0,2+0,04
Фосфолипиды	нмоль/г/мин	0,4+0,1	0,3+0,03	0,3+0,1
Глутатион	нмоль/г/мин	4,6+2,0	5,6+1,1	5,8+1,2
Бикарбонат	нмоль/г/мин	60,9+8,0	67,1+10,0	98,8+14,6#

Примечание. Значения выражены как среднее + 8Ό. КО, Мйг2 нокаутные мыши; КО+УДХК, Мйг2 нокаутные мыши, получающие УДХК с пищей; КО+норУДХК, Мйг2 нокаутные мыши, получающие норУДХК с пищей.

*р<0,05, КО против КО+УДХК (ΑΝΟνΑ с поправкой Бонферрони) #р<0,05, КО против КО+норУДХК (ΑΝΟνΑ с поправкой Бонферрони)

По сравнению с контрольными М4г2, получающие диету, и УДХК с пищей, норУДХК существенно вызывает билиарную секрецию бикарбоната совместно с предположением, что норУДХК подвергается относительному холегепатическому шунтированию у Мйг2’^/ (ВоМег, Тгапд, е! а1. 1999). УДХК, но не норУДХК, стимулировала билиарную экскрецию желчных кислот. Не наблюдались значительные эффекты на продукцию желчной кислоты, холестерола, фосфолипидов и глутатиона в желчи. Эти сведения показывают, что норУДХК приводит к промыванию поврежденных желчных протоков менее токсичной желчью, насыщенной бикарбонатом у М4г2.

1.2.4. норУДХК вызывает фазу II путей детоксификации и альтернативные экскреторные пути для желчных кислот у М4г2 мышей.

Для анализа гипотезы о том, что индукция фазы Ι/ΙΙ путей биотрансформации и альтернативных путей выкачивания потенциально токсичных желчных кислот может также вносить свой вклад в наблюдаемые благоприятные эффекты норУДХК у Мйг2, были исследованы экспрессия ключевых ферментов метаболизма (табл. 4) и состав желчных кислот в сыворотке, печени и желчи у Мйг2, получающих норУДХК с пищей.

Таблица 4. ПЦР в реальном времени для подсчета относительных уровней экспрессии ключевых метаболических ферментов и транспортных белков при различных экспериментальных условиях.

КО

КО+УДХК

КО+норУДХК

КО КО+УДХК КО+норУДХК

Сур2Ъ10	100+103	751+245*	1294+418*#
СурЗа11	100+46	246+72*	241+45*
8и112а1	н.о.	100+46	24157+14948*#
и§11а1	100+54	137+55	304+81#
Сур7а1	100+78	9+4*	60+30#
МгрЗ	100+33	194+55	207+73*
Мгр4	100+30	357+95	590+193*

Примечание. Значения выражены как среднее + 8Ό; п=5 в каждой группе, и.о., не обнаружено; КО, Мйг2 нокаутные мыши; КО+УДХК, Мйг2 нокаутные мыши, получающие УДХК с пищей; КО+норУДХК, М4г2 нокаутные мыши, получающие норУДХК с пищей.

*р<0,05, КО против КО+УДХК и КО против КО+норУДХК (ΑΝΟνΑ с поправкой Бонферрони) #р<0,05, КО+УДХК против КО+норУДХК (ΑΝΟνΑ с поправкой Бонферрони)

Особое внимание было уделено 8и112а1 и Мгр4, так как сульфатация и транспорт сульфатированных

- 10 014077 соединений взаимосвязан с формированием направлено регулируемого пути для экскреции сульфатированных стероидов и желчных кислот (8с1ше1х. 8!гот. е! а1. 2001). норУДХК не имела значительных эффектов на экспрессию мРНК систем гепатоцеллюлярного захвата (№ср. Оа1р1) и каналикулярного оттока (Вкер. Мгр2) для желчных кислот и органических анионов (данные не показаны). Хотя норУДХК приводила к устойчивой индукции ферментов детоксификации фазы I и II (табл. 4) с более выраженными эффектами на экспрессию 8и112а1. Кроме того. норУДХК сильно увеличивала экспрессию альтернативных базолатеральных систем оттока. таких как Мгр4 и. в меньшей степени. МгрЗ (табл. 4. фиг. 7). Эффекты УДХК были менее выражены (табл. 4. фиг. 7). Эта управляемая индукция путей биотрансформации и систем оттока с помощью норУДХК сопровождалась появлением глюкуронидов. а также сульфатов желчной кислоты. отражая функциональные аспекты наблюдаемых изменений экспресии.

1.3. Обсуждение

Может быть показано. что норУДХК лечит склерозирующий холангит у Мбг2^-/-мышей. по хорошо описанной модельной системе для ПСХ. в течение 4 недель. Кроме того. может быть продемонстрировано. что норУДХК является существенно более эффективной. чем УДХК.

Развитие склерозирующего холангита у Мбг2^-/- напрямую зависит от недостаточной билиарной фосфолипидной секреции и одновременно повышенных уровней немицеллярно связанных токсических желчных кислот в желчи. вызывающих повреждение желчных протоков и перихолангит (Нскей. 2о11иег. е! а1. 2002. Искей. ЕисйзЫсЫег. е! а1. 2004). Индукция билиарной секреции бикарбоната Мбг2^-/- у мышей. получающих норУДХК с пищей. представленная в данном примере. строго согласуется с холегепатическим шунтированием норУДХК (НоГтапп 1977. Υοοη. Надеу. е! а1. 1986). Повышенная билиарная секреция бикарбоната (ί.) разводит токсическое содержимое желчи у Мбг2^-/- и (И) защищает эпителиальные клетки желчных протоков от окислительного стресса. так как бикарбонат является сильным акцептором реактивных видов кислорода. норУДХК останавливает. таким образом. существующий перихолангит и последующий перидуктальный фиброз у Мбг2^-/- путем минимизации повреждения эпителиальных клеток желчных протоков из просвета желчного протока. Это приводит к восстановлению барьерной функции холангиоцитов. что означает. что наблюдаемые противовоспалительный и антифиброзный эффекты норУДХК у Мбг2^-/-являются вторичными. Несмотря на это. ясно. что норУДХК имеет также непосредственный противовоспалительный и антифиброзный эффекты.

Обнаруженные факты данного примера показывают. что ингибирование перидуктального фиброза при комбинации с модулированием содержимого желчи (например. увеличение содержания гидрофильных желчных кислот наряду с увеличением концентрации бикарбоната внутри протока) существенно облегчает повреждение печени у Мбг2^-/-.

В отличие от норУДХК. УДХК улучшает только перидуктальный фиброз лобулярных желчных протоков. но не увеличивает уровни АЛТ в сыворотке и не индуцирует инфаркты желчного происхождения у Мбг2^-/-. В предыдущих исследованиях с более коротким временем лечения пришли к выводу. что это в первую очередь связано с холеретическими эффектами УДХК в присутствии нерешенной билиарной обструкции по сравнению с фактами. обнаруженными у СВББ мышей. получающих УДХК с пищей (Нскей. 2о11пег. е! а1. 2002). В отличие от этого предыдущего предположения. обнаружена лишь тенденция к повышению потока желчи у Мбг2^-/-. получающих УДХК- и даже более выраженно у получающих норУДХК с пищей в данном исследовании с использованием более низких доз. Несмотря на то. что УДХК не улучшает заболевание малых протоков у Мбг2^-/-. это не исключает возможности повышения билиарного давления на уровне канальцев Геринга у Мбг2^-/-. получающих УДХК с пищей. что могло приводить к наблюдаемым инфарктам желчного происхождения. Противоположные эффекты обеих желчных кислот по отношению к повреждению печени связаны с отличиями в уровне билиарной секреции. например. норУДХК стимулирует в первую очередь протоковую секрецию. тогда как УДХК стимулирует секрецию желчи канальцев. расположенных выше пораженных протоков.

Причинная связь между портальным и лобулярным воспалением. приводящая к перидуктальному фиброзу и дуктулярной пролиферации. а также к формированию гепатоцеллюлярной карциноме (НСС или ГЦК) у Мбг2^-/-. была недавно продемонстрирована (Искей. ЕисйкЫсЫег. е! а1. 2004. Р1каг§ку. Рога!. е! а1. 2004). В данном исследовании норУДХК нормализовала пролиферацию гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков. Р1каг§ку е! а1. показали уменьшение воспаления и связанного формирования ГЦК с применением нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП) ибупрофена в данной модели (Р1каг§ку. Рога!. е! а1. 2004). Терапевтические эффекты НПВП и норУДХК могут быть комбинированы и даже усиливаться сулиндаком. НПВП. который подвергается холегепатическому шунтированию у крыс (Во1бег. Тгапд. е! а1. 1999).

Натуральные желчные кислоты эффективно подвергаются Ν-ацил амидированию (конъюгированию) в амидной связи с глицином или таурином и далее секретируются в желчный каналец. В отличие от этого нор (С23) желчные кислоты проявляют отличия в их биотрансформации и физиологических свойствах при сравнении с их натуральными (С₂₄) гомологами. Показано. что норУДХК приводит к организованной и устойчивой индукции 8и1!2а1 (трансфераза. которая предпочтительно сульфатирует стероиды и желчные кислоты) и Мгр4 (транспортер сульфатированных стероидов и желчных кислот) (8с1ше1х. 8!гот. е! а1. 2001. Ζе1се^. РеЛ. е! а1. 2003). Функциональные аспекты обнаруженных фактов подтверждаются

- 11 014077 появлением сульфатов и глюкуронидов желчной кислоты в моче Мбг2^-/-, получающих норУДХК с пищей. Приспособительная индукция детоксификации желчных кислот с помощью норУДХК путем фазы I (гидроксилирование) и II (сульфатация, глюкуронидация) метаболизма может привести к лучшей водорастворимости и тем самым менее токсичным метаболитам желчных кислот, котороые должны выводиться с помощью альтернативных гепатоцеллюлярных выкачивающих насосов (например, Мгр4) после их почечной экскреции, как показано в данном примере. Индукция таких механизмов с помощью норУДХК была более выраженой, чем для УДХК (в данном примере) или лигандов-агонистов САК, о которых сообщалось ранее (Аккет е! а1. 2004). Это исследование показало, что норУДХК сильно индуцирует детоксификацию желчных кислот, вызванную 8и1!2а1, и выводит с помощью приспособительной сверхэкспрессии Мгр4, тогда как сама по себе норУДХК подвергается продолжительному холегепатическому шунтированию. Это имеет двойной благоприятный эффект путем (ί) вытеснения и разведения токсических желчных кислот в протоковой желчи и (ίί) индуцирования образования протоковой желчи, насыщенной бикарбонатом, которое уменьшает окислительный стресс.

Образование желчи, насыщенной бикарбонатом, с помощью норУДХК имеет также терапевтические назначения при холангиопатиях человека (например, ПСХ, ПБЦ, хроническое отторжение трансплантата печени, негнойный деструктивный холангит), так как холегепатическое шунтирование приводит к длительному потоку молекул через эпителий желчных протоков, который помогает управлять токсическим/окислительным стрессом в измененных желчных протоках. Например, сулиндак, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП или Ν8ΑΙΌ), который также подвергается холегепатическому шунтированию у людей, показал улучшение печеночных ферментов у ПБЦ пациентов с неполным ответом на лечение УДХК.

Существуют две представляющие интерес параллели в метаболизме норУДХК между мышами и людьми, которые противопоставляются предыдущим наблюдениям на других грызунах и экспериментальных животных (например, крысы с желчной фистулой, хомячки, морские свинки). Во-первых, оба вида, мыши и люди, демонстрируют сопоставимую почечную экскрецию норУДХК. Кроме того, также было обнаружено, что основным метаболитом норУДХК у мышей был глюкуронид, что также было обнаружено у людей.

Во-вторых, в отличие от крыс (Υοοη, Надеу, е! а1. 1986) предполагаемая желчегонная эффективность норУДХК у мышей и людей приблизительно в три раза выше, чем нормальное выделение желчи у обоих видов. Хотя норУДХК индуцировала выделение желчи у крыс в намного большей степени (160 мл/мин/кг). Тем не менее, взятые вместе эти обнаруженные факты должны показать, что эффекты норУДХК у Мбг2^-/- могут быть прямо экстраполированы на холестатические заболевания печени людей.

В заключение должно быть показано, что норУДХК излечивает склерозирующий холангит у Мбг2^-/норУДХК представляет собой эффективное соединение для холестатических заболеваний печени, в частности для ПСХ людей и заболеваний печени, связанных с мутациями МОК3.

Claims

1. Применение 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты и/или ее фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний печени.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что заболевание печени представляет собой холестатическое заболевание печени, преимущественно первичный склерозирующий холангит (ПСХ), первичный билиарный цирроз (ПБЦ) или прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз, в частности прогрессирующий наследственный внутрипеченочный холестаз типа 1, 2 и 3, кистозный фиброз, холестаз, вызванный лекарственным средством.

- 12 014077

3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что лекарственное средство сформулировано для перорального, парентерального, подкожного, внутривенного, внутримышечного, назального, местного или ректального введения.

4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что медикамент содержит эффективное количество 24-нор-урсодеоксихолевой кислоты, ее фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что медикамент содержит 10-8000, преимущественно 25-5000, более преимущественно 50-1500, в частности 250-500 мг, 24-нор- урсодеоксихолевой кислоты и/или по меньшей мере ее одну фармацевтически приемлемую соль и/или сложный эфир.