NO337092B1

NO337092B1 - Aminosyrekopolymerer for suppresjon av autoimmunsykdommer, preparat og enhetsdoseform samt deres anvendelse

Info

Publication number: NO337092B1
Application number: NO20041759A
Authority: NO
Inventors: Jack L Strominger; Masha Fridkis-Hareli
Original assignee: Harvard College
Priority date: 2001-10-03
Filing date: 2004-04-29
Publication date: 2016-01-18
Also published as: IL161121A0; JP5525749B2; US7381790B2; JP2009185057A; NO20041345L; JP2012162545A; IL161121A; JP2005511518A; HUP0401863A3; US20110286959A1; EP1438061A4; US9028835B2; CA2462459C; AU2002362445B2; US20040038887A1; HUP0401863A2; JP5010798B2; US20080241099A1; NO20041759L; NZ532199A

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår kopolymerer med spesielle aminosyrer i spesifikke po-lare forhold, syntetisert til polypeptider med på forhånd bestemt lengde og i stand til å undertrykke symptomer og frekvensen av gjenopptredende episoder av en autoimmun sykdom, preparat og enhetsdoseform omfattende nevnte kopolymer, samt anvendelse derav.

Oppfinnelsens bakgrunn

Multippel sklerose (MS) er en inflammatorisk sykdom i sentralnervesystemet som påvirker 0,1 % av populasjonen og er i nord-europeiske caukasoid MS pasienter assosiert med HLA-DR-2 (DRB1<*>1501) haplotypen (O. Olerup, et al. i "Tissue Antigens" 38:1-15 (1991)). En dyremodell på MS, eksperimentell, autoimmun encefalomyelitt (EAE), er en T-celle-mediert, autoimmun sykdom. EAE kan induseres ved subkutan injeksjon av peptider avledet fra myelinkomponenter som myelinbasisprotein (MBP; L.S. Madsen et al. i "Nat. Genet." 23:343-347 (1999)), proteoliptidprotein (PLP; J.M. Greer et al. i "J. Immunol." 149:783-788 (1992)) eller myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG; I Mendel et al. i "Eur. J. Immunol." 25:1951-1959 (1995)).

Under forløpet av EAE gjenkjenner autoreaktivt CD4<+>T-celler selv-antigener som presenteres av murinklasse IIMHC molekyler (for eksempel H-2A<S>), noe som til slutt fører til patologiske forandringer som kan overvåkes som kliniske tegn på sykdom. EAE tilveiebringer et godt studert system for å teste effektiviteten av potensielle terapeutiske forbindelser for å undertrykke sykdommen. Disse forbindelser har inkludert cytokiner (J.P. Leonard et al. i "Ann. N.Y. Acad. Sei." 795:216-226 (1996)), peptidantigener som induserer anergi (Gaur, A. et al. i "Science" 258:1491-1494 (1992)) eller som induserer oraltoleranse (K.J. Kennedy et al. i "J. Immunol." 159:1036-1044 (1997); H.L.Weiner i "Immunol. Today" 18:335-343 (1997)), eller endrede peptidligander (C. Pfeiffer et al. i "J. Exp. Med." 181:1569-1574 (1995); L.B. Nicholson et al. i "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 94:9479-9284 (1997)).

Kopolymer 1 (Copl; Copaxone<®>; YEAK) er en vilkårlig aminosyre kopolymer av alanin (A), lysin (K), glutamin (E) og tyrosin (Y) i et molforhold på rundt 5:3:1,5:1. Copl er syntetisert i oppløsning ved bruk av N-karboksyaminosyreanhydrider (D. Teitelbaum et al. 1971 i "Eur. J. Immunol." 1:242-248 (1971)). Til å begynne med ble denne og andre relaterte kopolymerer benyttet for å definere den genetiske basis av immunre- sponsiviteten, kjent som klasse IIMHC gener (H.O. McDevitt og M. Sela i "J. Exp. Med." 122:517-532 (1965); H.O. McDevitt og M. Sela. i "J. Exp. Med." 126:969-978

(1967)). Copl, også kjent som poly (Y,E,A,K) eller YEAK ble funnet å være effektiv både når det gjelder suppresjon av eksperimentell, allergisk encefalomyelitt (D. Teitelbaum et al. i "Eur. J. Immunol." 1:242-248 (1971); D. Teitelbaum et al. i "Eur. J. Immunol." 3:273-279 (1973); D. Teitelbaum et al. i "Clin. Immunol. Immunopathol." 3:256-262 (1974); R. Aharoni et al. i "Eur. J. Immunol." 23:17-25 (1993)) og ved behandling av relapserende former av multippel sklerose (MS; M.B. Bornstein et al. i "N. Engl. J. Med." 317:408-414 (1987); K.P. Johnson et al. i "Neurology" 45:1268-1276

(1995); K.P. Johnson et al. i "Neurology" 50:701-708 (1998)).

Strominger et al., WO 00/05249, publisert 3. februar 2000, viser terpolymerer av tre aminosyrer med vilkårlige sekvenser. Strominer viser også syntetiske peptider av definerte aminosyresekvenser. De vilkårlige syntetiske heteropolymerene består av tre eller fire aminosyrer valgt fra Y,E, A og . Gaeta el al, WO 92/02543, publisert 20. februar 1992, beskriver syntetiske peptider for å inhibere T-celle aktivering, der hver har en aminosyresekvens som er et kjernebindingsområde for binding i et MHC-molekyl. De syntetiske peptidene beskrevet i Gaeta et al. og i Strominger et al. har definerte aminosyresekvenser som er de samme fra molekyl til molekyl for hele sammensetningen så sekvensene er ikke vilkårlige.

Copl er godkjent som terapi for MS og er i dag i utstrakt anvendelse. Mens imidlertid Copl reduserer MS relapseringsgraden eliminerer den ikke relapsering og er ikke kura-tiv for sykdommen. Det er viktig å utvikle forbedrede preparater og metoder for bruk ved behandling av MS og andre autoimmune sykdommer.

Oppsummering

Et trekk ved oppfinnelsen er en aminosyrekopolymer, kjennetegnet ved at den er en lineær, vilkårlig kopolymer YFAK omfattende aminosyrene tyrosin (Y), fenylalanin (F), alanin (A) og lysin (K) i et molforhold (Y+F):A:K på rundt 1:5:3, eller i et molforhold Y:F:A:K på rundt 0,2:0,8:5:3, eller rundt 0,5:0,5:5:3, eller rundt 0,8:0,2:5:3.

Uttrykket "(Y+F)" betyr summen av de molare forhold av Y og F sammenlignet med de molare forhold for hver av A og K.

I en utførelsesform er molforholdet F:Y rundt 1, minst 2 eller rundt 4, for eksempel er molforholdet Y:F større enn 1, minst 2, eller minst 4. Kopolymeren kan omfatte minst 25, minst 35, minst 50 eller minst 70 aminosyrerester. Aminosyrene kan polymeriseres ved en fastfasereaksjon eller ved oppløsningskjemi, fortrinnsvis ved en fastfasereaksjon. I en utførelsesform omfatter kopolymeren en aminosyremodifikasjon på en restlokasjon som øker inhibering av proteolytisk nedbrytning av kopolymeren i et individ sammenlignet med den ikke-modifiserte kopolymer.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et preparat, kjennetegnet ved at det omfatter en kopolymer som angitt ovenfor og minst ett ytterligere terapeutisk middel.

Det ytterligere terapeutiske middel er valgt blant et antistoff, en enzyminhibitor (fortrinnsvis valgt blant en proteaseinhibitor og en cyklooksygenaseinhibitor), et antibakterielt middel, en antiviralt middel, et steroid, et ikke-steroid antiinflammatorisk middel, en antimetabolitt, et cytokin (fortrinnsvis valgt blant P-interferon, interleukin-4 og interleukin-10), et cytokinblokkeringsmiddel, et adhesjonsmolekylblokkerende middel og en oppløselig cytokinreceptor.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en enhetsdoseform, kjennetegnet ved at den omfatter en kopolymer som angitt ovenfor eller et preparat som angitt ovenfor.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en kopolymer som angitt ovenfor eller et preparat som angitt ovenfor eller en form som angitt ovenfor, eventuelt med en farma-søytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et medikament for behandling av en autoimmun sykdom.

I en utførelsesform er kopolymeren valgt for inhibering av binding av et autoantigenisk peptid til et MHC klasse II protein assosiert med den autoimmune sykdom eller for å inhibere en klasse II-spesifikk T-celle respons til et MHC klasse U protein-peptid kompleks.

I en utførelsesform er den autoimmune sykdom valgt blant Hashimotos tyroiditt; idiopatisk myksødem, en alvorlig hypotyroidisme; multippel sklerose, en demyelinerende sykdom; myastenia gravis; Guillain-Barre syndrom; systemisk lupus erytematosis; uveitt; autoimmun ooforitt; kronisk immun trombocytopenisk purpurea; kolitt; diabetes; Graves sykdom; psoriasis; pemfigus vulgaris; og rheumatoid artritt.

Det kan også beskrives en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer VFAK omfattende valin (V), fenylalanin (F), alanin (A) og lysin (K). Videre kan det beskrives en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer VW AK omfattende valin (V), tryptofan (W), alanin (A) og lysin (K), en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer VY AK omfattende valin (V), tyrosin (Y); alanin (A) og lysin (K) og en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer FAK omfattende fenylalanin (F), alanin (A) og lysin (K), i et molar forhold F: A:K på omtrent 1:5:3. Ytterligere kan det beskrives en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer VAK omfattende valin (V), alanin (A) og lysin (K) i et molart forhold V:A:K på omtrent 1:5:3, en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer WAK omfattende tryptofan (W), alanin (A) og lysin (K) i et molart forhold W:A:K på omtrent 1:5:3 og en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymerVWAK omfattende valin (V), tryptofan (W), alanin (A) og lysin (K) i et molart forhold (V+w):A:K på rundt 1:5:3. Uttrykket "(V+W)" betyr summen av de molare forhold av V og W sammenlignet med de molare forhold av hver av A og K.

Det kan også beskrives en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer VW AK omfattende valin (V), tryptofan (W), alanin (A) og lysin (K) i et molart forhold V:W:A:K på rundt 0,5:0,5:5:3, en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer VEAK omfattende valin (V), glutaminsyre (E), alanin (A) og lysin (K) i et molart forhold V:E:A:K på rundt 1:1,5:5:3, en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer FE AK omfattende fenylalalnin (F), glutaminsyre (E), alanin (A) og lysin (K), omfattende F:E:A:K i et molart forhold på rundt 1:1,5:5:3 og en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer VY AK omfattende valin (V), tyrosin (Y), alanin (A) og lysin (K) i et molart forhold (V+Y):A:K på rundt 1:5:3. Uttrykket "(V+Y)" betyr summen av de molare forhold av V og Y, sammenlignet med de molare forhold for hver av A og K. Videre kan det beskrives en lineær, vilkårlig aminosyre kopolymer VY AK omfattende valin (V), tyrosin (Y), alanin (A) og lysin (K) i et molart forhiold V: Y:A:K på rundt 0,5;0,5:5:3. Videre kan et hvilket som helst av de her beskrevne preparater tilveiebringes i en farmasøytisk akseptabel buffer og/eller i en enhetsdose.

De her beskrevne kopolymerer består av aminosyrer som beskrevet og anses videre å være ekvivalente med kopolymerer som deler aminosyrepreparatene som beskrevet ovenfor og som også inneholder en eller flere ytterligere substituenter, for eksempel som har en eller flere ytterligere aminosyrer slik at den resulterende kopolymer har omtrent den samme funksjon. For eksempel anser en kopolymer FEAK, FAK, VW AK, VY AK, YFAK eller et hvilket som helst av kopolymerpreparatene som beskrevet her, og som består i det vesentlige av dette preparat, det vil si minst rundt 60 %, eller minst rundt 70 %, eller minst rundt 80 %, eller minst rundt 90 %, eller minst rundt 95 %, eller minst rundt 99 % av den her beskrevne sammensetning, og som har omtrent samme funksjonelle egenskaper som en kopolymer som tilveiebragt her, å være ekvivalent med sammensetningen som beskrevet her. Funksjonen anses å være omtrent den samme hvis en dosering av en slik sammensetning som her beskrevet og som er effektiv for behandling av en autoimmun sykdom, er omtrent den samme som en dose av en kopolymer omfattende i det vesentlige de samme substituenter som en blanding som beskrevet her, for behandling av en autoimmun sykdom.

Kopolymersammensetningene som beskrives her kan kombineres med minst ett ytterligere terapeutisk middel. Det ytterligere terapeutiske middel kan være et antistoff, en enzyminhibitor, et antibakterielt, antiviralt, steroid, ikke-steroid, anti-inflammatorisk, anti-metabolitt-, cytokin- eller cytokinblokkerende middel, et adhesjonsmolekylblokkerende middel eller en oppløselig cytokinreceptor. For eksepel kan cytokinet være valgt fra gruppen bestående av P-interferon, interleukin-4 og interleukin-10.

Det kan fremstilles et preparat som omfatter en hvilken som helst av de vilkårlig, lineæ-re aminosyre kopolymerer FAK, YFAK, VY AK, VW AK, VE AK og FEAK. Generelt har kopolymeren en lengde på rundt 50 rester, for eksempel minst rundt 70 rester. Videre kan preparatet omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer. Videre kan anvendelse involvere administrering av preparatet i en effektiv dose. En "effektiv dose" er en mengde av preparatet som lindrer enten en eller begge kliniske symptomer og frekvensen på gjenopptreden av en autoimmun sykdom. Før administrering velges kopolymeren for inhibering av bindingen av et autoantigenisk peptid til et MHC klasse II protein assosiert med den autoimmune sykdom. For eksempel velges kopolymeren som inhiberer en klasse U-spesifikk T-cellerespons til et MHC klasse U-protein-peptidkompleks. Den autoimmune sykdom er valgt fra gruppen bestående av Hashimotos tyroiditt; idiopatisk myksødem, en alvorlig hypotyroidisme; multippel sklerose, en demyelerende sykdom; myastenia gravis; Guillain-Barre syndrom; systemisk lups erytematose; uveitt; autoimmun ooforitt; kronisk immun trombocytopenisk purpurea; kolitt; diabetes; Graves sykdom; psoriasis; pemfigus vulgaris; og rheumatoid artritt, og andre. Foretrukket er den autoimmune sykdom multippel sklerose; er den autoimmune sykdom rheumatoid artritt; eller er den autoimmune sykdom diabetes. Et ytterligere terapeutisk middel kan ko-administreres, for eksempel er det ytterligere, terapeutiske middel et antistoff, en enzyminhibitor, et antibakterielt middel, et antiviralt middel, et steroid, et ikke-steroid, antiinflammatorisk middel, en antimetabolitt, et cytokin, et cytokinblokkerende middel, et adhesjonsmolekylblokkerende middel eller en oppløselig cytokinreceptor. Cytokinet er: interferon-P, interleukin-4 eller interleukin-10. Enzyminhibitoren er en proteaseinhibitor eller en cyklooksygenaseinhibitor.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er et sett av plater med diagrammer som viser inhibering av HLA-DR-2-begrenset BMP 84-102-spesifikke T-cellelinjer 2E12 (plate A), 8073 (plate b) og HylB (plate C), i nærvær av de vilkårlige kopolymerer. Bestrålte L466 (A)- eller MGAR (B, C)-celler ble ko-inkubert i duplikat med MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) ved en sluttkonsentrasjon på 4 uM (A) eller 12,5 uM (B, C) og forskjellige konsentrasjoner av hver av de vilkårlig kopolymerer som antydet i 2 timer ved 37 °C, hvoretter T-celler ble tilsatt og inkubert i 24 timer ved 37 °C. 30 ul supernataner ble inkubert med IL-2-avhengige, cytolytiske T-celle-lymfocytter (CTLL) fulgt av merking med H-tymidin (1 uCi/brønn) i 12 timer. Figur 2 er et sett av linjediagrammer (A) som viser inhibering av HLA-DR-2-begrenset PLP 40-60-spesifikke human T celler 106 A og et sett av stolpediagrammer (B og C) som viser inhibering av H-2s<->begrenset PLP 139-151-spesifikke muse T celle hybridomer (hPLP/1 henholdsvis hPLP/c4) i nærvær av vilkårlige kopolymerer. Bestrålt L466 (figur 3A) eller splenocytter fra SJL/J (B og C) mus ble ko-inkubert med proteolipid protein peptidet PLP 40-60 (SEQ ID NR.: 3) ved en sluttkonsentrasjon på 60 uM (A) og konsentrasjoner av forskjellige kopolymerer som antydet langs abscissen, eller med PLP 139-151 peptid (SEQ ID NR.: 4; i B og C) ved sluttkonsentrasjonen 24 uM, og de forskjellige kopolymerer (28 uM) i 2 timer ved 37 °C, derefter ble T-celler tilsatt og inkubert i 24 timer ved 37 °C. 30 ul supernatanter ble inkubert med IL-2-avhengig CTLL fulgt av merking med H-tymidin (1 u Ci/brønn) i 12 timer.<*>angir 0 % inhibering. Figur 3 er et sett av diagrammer som viser suppresjon ved forskjellige vilkårlige kopolymerer VEAK, FEAK og Copaxone<®>av EAE indusert med PLP 139-151 (SEQ IDNO: 4) peptid. SJL/J mus ble ko-injisert subkutant med 50 ug PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) peptid og 500 ug av de antydede, vilkårlige kopolymerer, eller med PLP 139-151 (SEQ ID NR.:4) alene. Sykdomsforløpet ble overvåket på opptredenen av kliniske symptomer, bedømt langs ordinaten, for antallet dager vist langs abscissen. Resultatene vist langs ordinatene representerer den midlere, daglige bedømmelse av kliniske symptomer. Figur 4 er et diagram som viser inhibering av bindingen av biotinylert MBP 86-100 (SEQ ID NR.: 1) til HLA-DR-2 molekyler ved de vilkårlige kopolymerer FAK, YFAK (0,8:0,2), YFAK (0,2:0,8), YFAK (0,5:0,5) og Cop 1. Rekombinante, vannoppløselige HLA-DR-2 molekyler ble inkubert med biotinylert MBP 86-100 (SEQ ID NR.: 1; 0,13 uM) og med de ikke-merkede, vilkårlige kopolymerer eller den syntetiske, ikke-merkede peptidkontroll MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) ved konsentrasjoner som vist langs abscissen. Inkuberingene ble gjennomført i duplikat ved pH 7,0 i 40 timer ved 37 °C. Resultater som er vist som inhibering av bindingen langs ordinaten representerer ett av to uavhengige forsøk. Spesifikk binding uttrykkes som prosentandel inhibering ved bruk av formelen: prosent inhibering = 100 % - [(absorbans ved 40 nm med kompetitor - bakgrunn)/absorbans uten kompetitor - bakgrunn) x 100]. Signalene ved 410 nm uten kompetitor var 0,8-0,9 og bakgrunnen var 0,1. Figur 5 er et sett av diagrammer som viser inhiberingen av HLA-DR-2-begrenset MBP 84-102-spesifikke T-celler for hver av cellelinjene 2E12, 8073 og HylB i nærvær av vilkårlige kopolymerer FAK, YFAK (0,8:0,2), YFAK (0,2:0,8), YFAK (0,5:0,5) og Cop 1. Bestrålte MGAR celler ble ko-inkubert i duplikater med MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) ved sluttkonsentrasjon 12,5 uM og forskjellige konsentrasjoner av de vilkårlige kopolymerer i 2 timer ved 37 °C, derefer ble T-celler tilsatt og inkubert i 24 timer ved 37 °C. 30 ul supernatanter ble inkubert med hver av de IL-2-avhengige CTLL cellelinjer som antydet og ble merket med<3>H-tymidin (1 uCi/brønn) i 12 timer. Figur 6 er et sett av diagrammer som viser suppresjon med forskjellige vilkårlige kopolymerer FAK, YFAK 0,2:0,8, YFAK 0,8:0,2, YFAK 0,5:05, eller Copaxone<®>av EAE indusert med PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) peptid. SJL/J mus be ko-injisert subkutant med 50 ug PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) peptid og 500 ug av de antydede, vilkrålige kopolymerer, eller immunisert med PLLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) alene. Sykdoms-forløpet ble overvåket på opptredenen av kliniske symptomer dagene efter sykdomsinduksjonen som vist langs abscissen. Figur 6A viser resultatene av den midlere, daglige bedømmelse av kliniske symptomer som vist på ordinaten for hver gruppe på fem til ni mus per gruppe i hvert av to forsøk. Figur 6B viser data for hver individuelle mus, med kopolymer behandlingen av gruppen angitt ved toppen av hver kolonne, og den maksimale, kliniske bedømmelse observert for musen indikert i det øvre høyre hjørne i hver boks for et representativt forsøk. Figur 7 er et sett av linjediagrammer som viser suppresjon med forskjellige vilkårlige kopolymerer YFAK, VWAK, VWAK, eller Cop 1, av EAE indusert med MBP 85-89 (SEQ ID NR.: 2) peptid og kontrollmus som ikke var behandlet med kopolymer. Humaniserte mus (L.S. Madsen et al. i "Nat. Genet." 23(3): 343-347 (1999); og D. Altman, D

Hafler og V. Kuchroo, upublisert) bærer transgenene HLA DR-2 (DRA<*>0101 og DRB1<*>1501) og TCR fra MS pasient Ob, som er et V(D)J rearrangement av TCRa og TCRp forsterket fra klon Ob.lA12.

Ko-immuniserte mus ble ko-injisert på dag 0 med 500 ug av kopolymen eller kontroll-materialet som antydet og 50 jig av det EAE induserende peptid MBP 85-89 (SEQ ID NR.: 2). For-immuniserte mus ble forinjisert med kopolymerene to dager før EAE in-duksjonen. Kopolymerene VY AK henholdsvis VWK hadde molforholdet 0,5:0,5:5:3 for V:Y:A:K henholdsvis V:W:A:K. Datapunktene antyder progresjon av sykdommen ved bedømmelse av kliniske symptomer på ordinaten for hver av dagene 3, 5, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 22, 25, 28, 32, 37,40, 43 og 50 langs abscissen.

Figur 8 er et sett av linjediagrammer, replottet sammen fra data for tre av gruppene av dyr fra figur 7: ruter er kontroll EAE-induserte mus som ikke fikk videre kopolymer behandling; kvadrater er EAE-induserte mus behandlet med YFAK 0,5:0,5; og triangler er EAE-induserte mus behandlet med Copl. Hver behandling i denne figur ble administrert to dager før EAE induksjon, det vil si vaksinasjon mot sykdom.

Beskrivelse av spesifikke utførelsesformer

Hvis ikke konteksten krever- annet har uttrykk slik de benyttes i beskrivelse og krav de følgende betydninger: Uttrykket "autoimmun tilstand" eller "autoimmun sykdom" betyr en sykdomstilstand forårsaket av en gal immunrespons som er rettet mot en selvkodet enhet som er kjent som et autoantigen. Kopolymerforbindelsene kan benyttes for å behandle symptomer på en autoimmun sykdom, en klasse lidelser som inkluderer Hashimotos tyroiditt; idiopatisk myksødem, en alvorlig hypotyroidisme; multippel sklerose, en demyelenerende sykdom markert ved puter eller herdet vev i hjerne eller ryggmargen; myastenia gravis som er sykdom med en progressiv svekkelse av musklene forårsaket av autoimmunt angrep på acetylkolinreceptorene ved neuromuskulære koblinger; Guillain-Barre syndrom, en polyneuritt; systemisk lupus erytematose; uveitt; autoimmun ooforitt; kronisk immun trombocytopenisk purpurea; kolitt; diabetes; Graves sykdom, som er en form for hypotyroidisme; psoriasis; pemfigus vulgaris; og rheumatoid artritt (RA).

Uttrykket "demyelinerende tilstand" inkluderer en sykdomstilstand der en del av myelin-omhyllingen, bestående av plasmamembran viklet rundt en langstrakt del av nerve- cellen, er fjernet ved nedbrytning. En demyelineringstilstand kan oppstå efter vaksine-ring, efter anti TNF-behandling, som postviral infeksjon og ved MS.

Uttrykket "derivat" av en aminosyre betyr en kjemisk relatert form av denne aminosyre med en ytterligere substituent, for eksempel en N-karboksyanhydridgruppe, en y-benzylgruppe, en e,N-trifluoracetylgruppe, eller en halogenidgruppe, bundet til et atom av aminosyren.

Uttrykket "analog" betyr en kjemisk relatert form av denne aminosyre med en annen konfigurasjon, for eksempel en isomer, eller en dekonfigurasjon i stedet for en L-konfigurasjon, eller et organisk molekyl med den egnede størrelse, ladning og form for aminosyren eller en aminosyre med modifikasjon av atomene som er involvert i peptid-bindingen, slik at kopolymeren med analogresten er mer proteaseresistent enn en ellers tilsvarende kopolymer som mangler en slik analog, uansett om analogen er innvendig eller lokalisert ved en terminus av kopolymeren, sammenlignet med kopolymeren uten analogen.

Uttrykket "aminosyre" og "aminosyrekopolymer" kan inkludere en eller flere komponenter som er aminosyrederivater og/eller aminosyreanaloger som definert her, idet de-rivatet eller analogen omfatter en del av helheten av restene for en hvilken som helst en eller flere av de 20 naturlig forekommende aminosyrer antydet ved denne sammensetning. I en aminosyrekopolymer hvis sammensetning har en eller flere tyrosinrester kan for eksempel en del av en eller flere av disse rester være erstattet med homotyrosin. Videre er en aminosyrekopolymer med en eller flere ikkepeptid- eller peptidomimetiske bindinger mellom to naborester innenfor rammen av denne definisjon.

Uttrykket "hydrofob" aminosyre betyr alifatiske aminosyrer alanin (A eller ala), glycin (G eller gly), isoleucin (I eller ile), leucine (L eller leu), metionin (M eller met), prolin (P eller pro) og valin (V eller val), der uttrykkene i parentes i form av en enkelt bokstav eller en standard kode tre bokstaver er forkortelser for hver enkelt aminosyre, og aromatiske aminosyrer tryptofan (W eller trp), fenylalanin (F eller phe) og tyrosin (Y eller try). Disse aminosyrer gir hydrofobisiet som en funksjon av lengden av alifatene og størrelsen av de aromatiske sidekjeder når de finnes som rester i en kopolymer eller et annet polypeptid.

Uttrykket "ladet" aminosyre betyr aminosyrene aspartinsyre (D eller asp), glutaminsyre (E eller glu), arginin (R eller arg) og lysin (K eller lys) som gir en positiv (lys og arg) eller negativ (asp eller glu) ladning ved fysiologiske pH-verdier i en vandig oppløsning av en kopolymer eller en annen aminosyreblanding inneholdende en eller flere rester av disse aminosyrer. Histidin (H eller his) er hydrofob ved pH 7 og ladet ved pH 6.

Uttrykket "anergi" betyr ikke-responsivitet i immunsystemet hos et individ mot et antigen.

Uttrykket "individ" slik det her benyttes antyder et pattdyr inkludert et menneske.

Uttrykket "heterolog celle" betyr en celle for produksjon av et MHC protein som ikke er relatert til en celle hos et individ, for eksempel er den heterologe celle ikke en pattedyr-celle. Den heterologe celle kan for eksempel være fra koldblodige dyr, for eksempel fra en invertebrat; den heterologe celle er en innsektscelle eller en celle av en mikroorgan-isme som en gjærcelle.

Uttrykket "overflater av klasse II MHC HLA-DR-2 protein" inkluderer delene av proteinmolekylet i sin tredimensjonale konfigurasjon som er i kontakt med dens eksterne omgivelse inkludert de trekk ved proteinet som interagerer med vandige oppløsnings-midler og er i stand til binding til andre cellekomponenter som nukleinsyrer, andre proteiner, og peptider.

Uttrykkene "Pl lomme" og "P4 lomme" inkluderer tredimensjonale, polymorfe områder på peptidbindingsoverflaten av klasse U MHC proteinmolekylet som huser aminosyrer-estsidekj edene fra et peptid som er bundet til klasse II MHC proteinet (M. Fridkis-Hareli et al. i "J. Immunol." 160:4386-4397 (1998); M. Fridkis-Hareli et al. i "Human Immunol." 61:640 (2000); M. Fridkis-Hareli et al. i "Human Immunol." 62:753-763

(2001)), inkludert et bundet, naturlig forekommende antigen eller en epitop, og et bundet syntetisk peptid eller kopolymer.

Uttrykken "P-l posisjon" og "P-5 posisjon" henviser til aminosyrerester på klasse II MHC proteinmolekylpeptidkomplekset som direkte er i kontakt med T-celle-receptoren (M. Fridkis-Hareli et. al. i "Human Immunol." 61:640 (2000); M. Fridkis-Hareli et al. i "Human Immunol." 62:753-763 (2001)). P-l posisjon henviser til aminosyren som ligger foran aminosyreresten i peptidet som opptar P-l lommen. P-5 posisjonen henviser til aminosyreresten som følger den aminosyrerest som opptar P4 lommen.

Uttrykket "antigen bindingsspor" henviser til et tredimensjonalt, antigen interaktivt sete på overflaten av klasse II MHC proteinmolekylet (L.J. Stern et. al. i "Nature" 368:215

(1994)) som dannes av overflater av både a- og P-subenhetene av klasse U MHC proteinmolekylet.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabel bærer" inkluderer et hvilket som helst og alle opp-løsningsmidler, dispergeringsmedia, belegg, antimikrobielle stoffer som antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende sjikt og lignende som er fysiologisk kompatible. Fortrinnsvis er bæreren egnet for intravenøs, intramuskulær, oral, intraperitoneal, transdermal eller subkutan administrering og den aktive bestanddel kan være belagt i et materiale for å beskytte det fra inaktivering ved påvirkning av syrer eller andre ugunstige, naturlige tilstander.

En autoimmun sykdom oppstår når en verts immunrespons svikter når det gjelder å ad-skille fremmedantigener fra egenmolekyler (autoantigener) for derved å elicitere en feil-aktig immunrespons. Immunresponsen mot egenmolekyler i en autoimmun sykdom resulterer i et avvik fra den normale tilstand av selvtoleranse som involverer destrue-ringen av T-celler og B-celler som er i stand til å reagere mot autoantigener, som er for-hindret ved evenementer som opptrer i utviklingen av immunsystemet tidlig i livet. Cel-leoverflateproteiner som spiller en sentral rolle i reguleringen av immunresponser via sin evne til å binde og presentere prosesserte peptid til T-celler, er de vesentlige histo-kompatibilitetskompleks (MHC)molekyler (J.B. Rothbard et al. i" Annu. Rev. Immunol." 9:527 (1991)).

I tillegg til MS er andre demyelinerende tilstander funnet å inntre, for eksempel postviral infeksjon, post-vaksinasjon, post-encefalomyelitt (K.W. Wucherpfennig et al. i "Immunol. Today" 12:277-282 (1991)) og efter administrering av visse anti-TNF midler ("FDA Talk Paper", Food and Drug Administration Public Health Service, Rockville, MD, http:// www. fda. gov/ bbs/ toopics/ ANSWERS/ ANSDQ954. htmn.

Kopolymerer av aminosyrer som terapeutiske midler mot autoimmune sykdommer

Metoder inkluderer bruken av en klasse midler som kan binde til klasse U MHC proteiner kodet av spesielle alleler. Et slikt middel kan binde til et spesielt klasse U MHC protein og derved inhibere og/eller forhindre bindingen av et autoantigen involvert i en autoimmun sykdom, eller ved binding kan induere anergi, slik at det ikke er noen respons i immunsystemet mot autoantigenet.

Et antall terapeutiske midler har vært utviklet for å behandle autoimmune sykdommer. For eksempel er det utviklet midler som ved inhibering av en cyklooksygenase kan forhindre dannelse av lavmolekylvektsinflammatoriske forbindelser. Videre er det midler tilgjengelige som kan virke ved inhibering av en proteinmediator for inflammasjon, ved sekvestering av den inflammatoriske protein tumor nekrosefaktor (TNF) med et anti-TNF spesifikt, monoklonalt antistoff fragment, eller med en oppløselige form av TNF-receptoren. Til slutt er det tilgjengelige midler som kan siktes inn mot og inhibere funksjonen av et protein på overflaten av en T-celle (CD4-receptoren eller celleadhesjonsre-ceptoren ICAM-1) for derved å forhindre en produktiv interaksjon med en antigen presenterende celle (APC). Imidlertid kan preparater som er naturlig foldede proteiner som terapeutiske midler medføre problemer ved produksjon, formulering, lagring og avlevering. Videre kan naturlige proteiner være kontaminert med patogene midler som viruser og prioner.

Et ytterligere mål for inhibering av en autoimmun respons er det sett av lymfocyttover-flateproteiner som representeres ved MHC-molekylene. Spesifikt kodes disse proteiner av klasse U MHC gener angitt som HLA (human leukocytt antigen) -DR, -DQ og -DP. Hvert av MHC genene finnes i et stort antall av alternative eller alleliske former i en mammal populasjon. Genomene hos individer som er affektert med visse autoimmune sykdommer, for eksempel MS og rheumatoid artritt (RA), har mer sannsynlig en eller flere karakteristiske klasse II MHC alleler til hvilken sykdommen er knyttet.

En potensiell kilde for midler for behandling av MS og andre demyelinerende tilstander er å identifisere peptider som binder selektivt in vitro til et renset klasse U MHC allel-proteinmolekyl, spesielt til et protein som er et produkt av en klasse II MHC allel assosiert med demyelinerende betingelser. I tillegg bør midlet binde til dette protein når det opptrer på overflatene av antigenpresenterende celler in vivo og derved blokkere, aner-gisere, eller inaktivere, klassen av T-celler som er ansvarlig for demyelineringstilstan-den, for eksempel MS.

Klasse U MHC protein består av to omtrentlig like store sub-enheter, a og P, som er transmembranproteiner. En peptid-bindingskløft som er dannet av proteintrekk fra både a- og P-subenhetene, er sete for presentering av antigenet til T-celler. Det er minst tre typer klasse U MHC-molekyler: HLA-DR, -DQ og -DP og det er tallrike alleler av hver type. Klasse U MHC molekylene uttrykkes predominant på overflatene av B-lymfocytter og antigenpresenterende celler som makrofager og dendritiske celler (L. Mengle-Gaw i "The Major Histocompatibility Complex" (MHC) i "Encyclopedia of Molecular Biology", Oxford; Blackwell Science Ltd., s. 602-606 (1994)).

En kopolymer ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres ved bruk av Fmoc- eller t-boc initierende aminosyreanaloger, eller lignende, som er immobilisert på en harpiks i en automatisert peptid synteseapparatur for ytterligere polymerisering (fasttilstandssyntese). Aminosyrene polymeriseres i molforhold som kan justeres for å gi en kopolymer med optimale bindingskarakteristika.

Synteseprosedyrene kan inkludere og tilveiebringe en oppløsning som er en blanding av de valgte aminosyrer i en aktivert form, for eksempel aktivert som et N-karboksyanhydrid, i de egnede molforhold for hver av de hensiktsmessige derivatiserte aminosyreforløpere (derivatisert for å beskytte visse funksjonelle grupper som s amino-gruppen i L-lysin, for eksempel forløperen e,N-trifluoracetyl-L-lysin). Alternativt kan synteseprosedyren involvere online blanding under synteseprosedyren av derivatiserte forløpere av de valgte aminosyrer i de foretrukne molare forhold. Heteropolymersyn-tesetjenester kan oppnås kommersielt, for eksempel hos Chiron Technologies, Clayton, Australia, Harvard Medical School Biopolymer Laboratory, Boston, MA, og hos Advanced chemTech, Inc., Louisville, KY.

Eksempler på slike harpiksbærere for peptidsyntese inkluderer en Merrifield harpiks,

klormetylert polystryen med 1 % DVB fornetninger; en Fmoc aminosyre Wang harpiks, 4-benzyloksybenzylalkohol idet harpiksene er forbeladet med en aminosyre (for eksempel Fmoc-D-trp(boc)-Wang harpiks). Harpikser er tilgjengelige i forskjellige mesh stør-relser, for eksempel 100-200 mesh, og sterkt beladede eller lite beladede densiteter når det gjelder funksjonalisering av den initierende aminosyre.

En oppløsning av de forskjellige, derivatiserte aminosyrer som skal polymeriseres til oppfinnelsens preparat, fortrinnsvis beskyttet som vanlig i peptidsynteser, settes til en mengde kuler, for eksempel Fmoc. Reagenser for syntese, deblokkering og for spalting av de ferdige kopolymermolekyler for fjerning fra harpiksen er tilgjengelige fra appara-turprodusenten (Applied Biosystems Peptide Synthesizer, Foster City, CA eller Advanced ChemTech, Louisville, KY); se for eksempel M. Bodansky i "Principles of Peptide Synthesis", 2. utg., Springer-Verlag, 1991, hvortil det vises når det gjelder detaljer. Ytterligere aminosyrer eller analoger eller derivater av aminosyrer kan settes til de minst tre aminosyrer som er valgt for å utgjøre kopolymerene for å erstatte en liten del av disse aminosyrer for for eksempel å gi en kopolymer med øket proteaseresistens og derfor med forbedrede farmakologiske egenskaper som lengre in vivo levetid. Eksempler på analoger er homotyrosin, eller andre substituerte tyrosinderivater, og aminosmørsyre, begge tilgjengelige som Fmoc derivat fra Advanced ChemTech.

Terapeutiske preparater

En farmasøytisk akseptabel bærer inkluderer et hvilket som helst og alle oppløsnings-midler, dispergeringsmedia, belegg, antimikrobielle midler som antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler og lignende som er fysiologisk kompatible. Fortrinnsvis er bæreren egnet for intravenøs, intramuskulær, oral, intraperitoneal, transdermal eller subkutan administrering og den aktive forbindelse kan være belagt i et materiale for å beskytte den mot inaktivering ved innvirkning av syrer eller andre ugunstige, naturlige tilstander.

Metodene inkluderer innarbeiding av en kopolymer i et farmasøytisk preparat egnet for administrering til et individ. Et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres ved et antall metoder som velkjente i teknikken slik fagmannen vil vite. Den aktive forbindelse kan fremstilles med bærere som vil beskytte mot hurtig frigivning, for eksempel formuleringer med kontrollert frigivning inkludert implantater, transdermale puter og mikroinnkapslede avleveringssystemer. Mange metoder for fremstilling av slike formuleringer er patentert og generelt velkjente for fagfolk på området, se for eksempel "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson, utg., Marcel Dekker, Inc., NY, 1978. Terapeutiske preparater for avlevering i en farmasøy-tisk akseptabel bærer er sterile og fortrinnsvis stabile under betingelsene under fremstilling og lagring. Preparatene kan være formulert som oppløsninger, mikroemulsjoner, liposomer eller en hvilken som helst annen struktur som er egnet for høy medikament-konsentrasjon.

Doseregimene kan justeres for å gi den optimale, ønskede respons (for eksempel en terapeutisk respons). For eksempel kan det administreres en enkelt bolus, flere oppdelte doser kan administreres over lengre tid eller dosen kan reduseres proporsjonalt eller økes på samme måte som antydet ved tegnene på sykdomssituasjonen.

Generelt kan det administreres en egnet daglig dose av et terapeutisk kopolymerpreparat som vil være den laveste effektive dose for å gi en terapeutisk effekt, for eksempel miti-gering av symptomer. De terapeutiske heteropolymerforbindelser administreres fortrinnsvis i en dose per individ per dag på minst rundt 2 mg, minst 5 mg, minst 10 mg eller sogar minst 20 mg som egnet minimal startdose. Generelt kan forbindelsene i den effektive dose av preparatet administreres i en mengde innen området rundt 50 til rundt 400 mikrogram av forbindelsen per kilo individ per dag.

En lege eller veterinær med vanlig fagkunnskap på området kan lett bestemme og fore-skrive den effektive dose av det farmasøytiske preparat som kreves. For eksempel kan legen eller veterinærene starte doseringen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen ved et lavere nivå enn det som er nødvendig for å oppnå den ønskede terapeutiske effekt og så å øke doseringen med tiden inntil denne effekt oppnås.

Det farmasøytiske preparat kan også omfatte et ytterligere terapeutisk middel. Eksempler på materialer som kan benyttes som kombinasjonsterapeutika med kopolymerene for behandling av autoimmune sykdommer og artrittiske tilstander som ytterligere terapeutiske midler inkluderer: et antistoff eller et antistoff-fragment som kan binde spesifikt til et inflammatorisk molekyl eller et uønsket cytokin som interleukin-6, interleukin-8, granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor, og tumur nekrosefaktor-a; en enzyminhibitor som kan være et protein, for eksempel oci-antitrypsin eller aprotinin; en enzyminhibitor som kan være en cyklooksygenaseinhibitor; et konstruert bindingsprotein, for eksempel et konstruert protein som er en proteaseinhibitor, for eksempel en konstruert inhibitor av et kallikrein; et antibakterielt middel som kan være et antibiotikum som amoksycillin, rifampici, erytromycin; et antiviralt middel som kan være et lavmolekyl-vekstkjemikalium som acyklovir; et steroid, for eksempel et kortikosteroid, eller et kjønnssteroid som progesteron; et ikke-steroid, antiinflammatorisk middel som aspirin, ibuprofen eller acetaminofen; et anticancermiddel som metotreksat eller adriamycin; et cytokinblokkerende middel; et adhesjonsmolekylblokkerende middel; eller et cytokin.

Et ytterligere terapeutisk middel kan være et cytokin som, slik det her benyttes, inkluderer uten begrensning midler som er naturlig forekommende proteiner eller varianter og som virker som vekstfaktorer, lymfokiner, interferoner og særlig interferon-P, tumor nekrosefaktorer, angiogeniske eller antiangionesiske faktorer, erytropoietiner, trombo-poietiner, interleukiner, matureringsfaktorer, kjemotaktiske proteiner og lignende. Et ytterligere middel for tilsetning til en kopolymer av aminosyrer kan være en annen kopolymer, for eksempel Copaxone som er en YEAK, er Copl, eller en kopolymer omfattende et subsett av disse eller andre aminosyrer (Aharoni et al. WO 00/05250, PCT/US99/16747) eller et oligopeptid eller peptidderivat (Strominger et al. WO 00/05249, PCT/US99/16617; WO 02/59143, PCT/US02/02071). Foretrukne, terapeu tiske midler for bruk i kombinasjn med et preparat og som er cytokiner, inkluderer interferon-p, interleukin-4 og interleukin-10.

Et terapeutisk middel for anvendelse med preparatene kan være et konstruert bindingsprotein, kjent for fagmannen på området remodellering av et protein som kovalent er festet til et virionbelegningsprotein på grunn av en genetiske funksjon (R. Ladner et al., US 5 233 409; R. Ladner et al., US 5 43 484) og som kan fremstilles i henhold til i og for seg kjente metoder. Et protein som binder en hvilken som helst av en varietet av andre mål kan konstrueres og benyttes som et terapeutisk middel i kombinasjon med en heteropolymer.

En forbedring i symptomene som et resultat av slik administrering noteres ved en reduksjon i frekvensen av gjenopptredenen av episoder av MS, ved en reduksjon i sym-ptomenes alvor og ved en eliminering av gjenopptredende episoder for et visst tidsrom efter administreringens begynnelse. En terapeutisk effektiv dose reduserer fortrinnsvis symptomene og tilbakefallsfrekvensen med minst rundt 20 %, for eksempel minst rundt 40 %, minst rundt 60 %, minst rundt 80 % eller ved rundt 100 % eliminering av ett eller flere symptomer, eller eliminering av gjenopptredenen av den autoimmune sykdom i forhold til ikke-behandlende individer. Tidsrommet kan være minst rundt en måned, minst rundt 6 måneder eller minst rundt ett år.

Metoder for anvendelse av vilkårlige, syntetiske kopolymerer kan være basis for behandling av andre autoimmune sykdommer som er assosiert med HLA-DR genproduk-ter ved å konkurrere med kandidatautoantigener for binding til disse proteinreceptormo-lekyler, eller ved å indusere T-celleanergi eller sogar T-celleapoptose eller ved suppresjon av T-celler, slik at efterfølgende T-cellerespons på et autoantigen inhiberes in vivo. Videre kan syntetiske kopolymerer med en eller flere ytterligere komponenter, for eksempel aminosyreanalaoger eller -derivater, tilsatt i varierende mengder til polyme-riserignsreaksjonen, være effektive inhibitorer av en varietet av autoimmune T-celleresponser.

Aktiviteten av Copl synes som et første trinn å involvere binding til overflaten av antigenpresenterende celler (APC), for eksempel klasse JJ MHC proteiner (M. Fridkis-Hareli et al. "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 91:4872-4876 (1994)), hvoretter effektiviteten kan skyldes enten konkurranse med myelinantigener (for eksempel MBP, PLP, MOG) for aktivering av en spesifikk effektor T-celler som gjenkjenner peptidepitoper avledet fra disse proteiner (A. Ben-Nun et al. "J. Neurol." 243: s. 14-22 (1996); D.

Teitelbaum et al. "J. Neuroimmunol." 64:209-217 (1996)), og/eller induksjon av antigen-spesifikke, regulatoriske T-celler (R. Aharoni et al. "Eur. J. Immunol." 23:17-25

(1993)).

Undersøkelsen av ytterligere kopolymerer og undersøkelsen av mekanismene som er involvert i deres aktiviteter kan potensielt resultere i informasjon som kan føre til forbedrede terapeutiske reagenser. Nylige studier har vist at så å si alle av den store varietet av kopolymerer som finnes i den vilkårlige blanding av YEAK bundet til rensede molekyler av hvert av human HLA-DR1-, -DR-2- og -DR4-molekyler, noe som viser at YEAK generelt binder til rensede klasse II MHC proteiner (M. Fridkis-Hareli og J.L. Strominger "J. Immunol." 160:4386-4397 (1998). Copl konkurrerer videre for binding av MBP 85-99 til HLA-DR-2 (DRB1<*>1501) og inhiberer responser av DR-2-begrensede T-celler til MBP 85-99. En studie av bindingen til klasse U MHC molekyler av vilkårlige kopolymerer inneholdende kun 3 av de 4 aminosyrer av Copl, for eksempel YAK, har vist at YAK er mest effektiv (M. Fridkis-Hareli et al. "Int. Immunol." 11:635-641 (1999)).

Bindingsdelen av Copl til det MS-assosierte molekyl HLA DR-2 (DRB1<*>1501) viser E ved P-2, K ved P-l og Y ved Pl, uten at noen preferenser er observert ved andre posi-sjoner (M. Fridkis-Hareli et al. "J. Immunol." 162:4697-4704 (1999)). Videre er A over-representert ved Pl. Da Pl er ankerposisjonen var binding av Y ved denne posisjon ikke anticipert. Pl-lommen i proteinene kodet av DR-2 allelen er liten (på grunn av nærværet av p86Val i stdet for f}86Gly) og overrepresentasjonen av A ved denne posisjon kan skyldes dette. Effekten av K ved P-l synes å skyldes stabilisering av bindingen ved interaksjon av K med rester i toppen av al heliksen, tilsvarende resten K ved P-l av HA 306-318 kompleksert med HLA-DRl som kan interagere med sidekjedene av al heliks-resteneved Sa53 eller Ea55 (L.J. Sternetal. "Nature" 368:215-221 (1994)).

Kopolymerer konstruert i henhold til bindingsdelen av MBP 85-99 (K.W. Wucherpfennig et al. "J. Exp. Med." 179:279-290 (1994)) kan være bedre terapeutiske midler enn Copl. Som tilveiebragt her ble flere vilkårlige tre- og fire-aminosyrekopolymerer, hver syntetisert som 14-, 35- og 50-merer hva lengden angår, fremstilt ved fastfasemetoden. Konstruksjonen av disse kopolymerer skjedde primært ved valg av aminosyrer under henvisning til ankerrestene av MBP 85-99 bundet til HLA-DR-2 (DRB1<*>1501) (K.W. Wucherpfennig et al. "J. Exp. Med." 179:279-290 (1994); K.J. Smith et al. "J. Exp. Med." 19:1511-1520 (1998.)), særlig Pl ankeret, for å forbedre effektiviteten av kopolymerene. Effekter av disse kopolymerer på autoantigen-spesifikke T-celleresponser i MS, og på sykdomsprogresjonen av EAE, en dyremodell av MS, er vist i eksemplene nedenfor.

Et hovedformål ved behandlingen av autoimmune sykdommer har vært utviklingen av antigen-spesifikke immunomodulerende terapi som interfererer med den trimolekylære interaksjon av den autoreaktive T-cellereceptor (TCR) med de autoantigeniske peptider som presenteres ved selv MHC receptorer på overflaten av antigen-presenterende celler. Disse immunoterapier av T-celle-mediert autoimmunsykdommer har vært vellykket i dyremodeller med kjente målantigener (se for eksempel H.L. Weiner "Immunol. Today" 18-335-343 (1997); L.B. Nicholson et al. "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 94:9279-9284 (1997)). Bruken av endrede peptidligander (APL) har vært benyttet både for å behandle EAE (L.B. Nicholson et al. "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 94:9279-9284 (1997); S. Brocke et al. "Nature" 379:343-346 (1996)) og i den senere tid for å behandle MS (B. Bielekova et al. "Nat. Med." 10:1167-1175 (2000); L. Kappos et al. "Nat. Med." 10:1176-1182 (2000)) med kontradiktoriske funn.

Copl (Copaxone<®>) en godkjent terapi for relapserende-remitterende MS, ble foreslått virke som en promiskøs binder til klasse II MHC molekyler (M. Fridkis-Hareli og J.L. Strominger i "J. Immunol." 160:4386-4397 (1998)), som en antagonist for TCR (R. Aharoni et al. i "Proe. Natrl. Acad. Sei. USA" 96:634-639 (1999)), og/eller som en in-dusør av suppressorceller (R. Aharoni et al. i "Eur. J. Immunol." 23:17-25 (1993)). Capoxone er i dag i utstrakt anvendelse, har vist liten eller ingen toksisitet og har opp-rettholdt effektivitet i MS-pasienter over et tidsrom på 6 år (K.P. Johnson et al. i "Mult. Seler." 6:255-266 (2000)). Imidlertid ble dette middel funnet å redusere frekvensen av relapsering med 30 % men eliminerte ikke slik relapsering. Utvikling av nye forbindelser kan gi forbedrede, terapeutiske midler mot MS og eventuelt mot andre autoimmune lidelser.

I eksemplene 1 -6 ble en optimal størrelse for kopolymerer som beskrevet her bestemt ved å benytte kopolymerer som er 14-, 35- eller 50-merer lange. Fordi 50-merene er vist her som de mest effektive for binding av HLA-DR-2 og inhibering av MBP-spesifikke T-celleresponser ble ytterligere kopolymerer som benyttet i eksemplene 7-11 alle syntetisert som 50-merer. En størrelse på 50 aminosyrer eller mer, her funnet å gi effektiv inhibering av antigenpresentasjonen og supprsjon av EAE, antyder at de vilkårlige kopolymerer som beskrives her virker ved binding til og så å clustre klasse U MHC molekyler i en del av cellemembranen tilsvarende Copaxone<®>(M. Fridkis-Hareli et al. i "Int. Immunol." 9:925-34 (1997)) eller oligomerisert T-celle epitoper (O. Rotzschke et al. i "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 94: 14642-14674 (1997)).

Restene i de vilkårlige kopolymerer i eksemplene 7-11 nedenfor ble konstruert hovedsakelig på basis av ankerrestene i den immunodominante T-celle epitop MBP 85-99 peptid (SEQ ID NR.: 2). Y'en i kopolymer 1 ble funnet i den antatte Pl-lomme av HLA DR-2 (DRBl<*>15019)molekylet (M. Fridkis-Hareli et al. i "J. Immunol." 162: 4697-4704 (1999)) selv om Y kan være for stor for denne lomme som har en god tilpasning med F, og huser V89 i MBP85-99. Videre er F92 i MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) i P4-lommen (K.J. Smith et al. i "J. Exp. Med." 19: 1511-1520 (1998)), men Y eller W kan være tettere tilpasset for denne lomme. Intersammenhengen mellom disse to rester i Y-og F-holdige kopolymerer som tilveiebragt her er undersøkt ved bruk av kopolymerer syntetisert med forskjellige forhold Y:F. Videre er V- og W-holdige kopolymerer og V-og Y-holdige kopolymerer, valgt for syntese på basis av behovet for forskjellige store aromatiske grupper for tilpasning til de forskjellige store Pl - og P4-lommer, er vist i eksempel 11 å være spesielt effektiv ved behandling av EAE-symptomer. Med dagens kunnskap til størrelse, form og ladningsfordeling for hver av Pl - og P4-lommer og data på V- og W-holdige polymerer som terapeutiske midler for EAE, er det mulig å konst-ruere aminosyrer med nye organiske sidekjeder som kan erstatte V og W respektivt i syntesen av en kopolymer for derved å gi et middel med en ekvivalent eller ennu tettere tilpasning av sidekjeden inn i disse seter enn V og W. En kopolymer inneholdende en slik forbindelse kan være et ennu mer brukbart terapeutisk middel mot en autoimmun sykdom som EAE eller MS.

EKSEMPLER

Materiell og metoder

Kopolymerer, peptider og antistoffer: Poly (Y,E,A,K) angitt som YEAK, poly (V,E,A,K) eller VEAK; og poly(F,E,A,K) eller FEAK, i molare forhold som ligger nær de som finnes i Copl (der V og F er til stede i samme molforhold som Y i Copl) ble syntetisert ved fastfasemetoden som 14-, 35- og 50-merer (Chiron Technologies, Clayton, Australia) ved bruk av Fmoc aminosyrer blandet i de ønskede forhold i hver cyklus. Copl sats 52596 i molforholdet 1 Y: 1,5 E: 4,3 A: 3,3 K (antydet her som Y:E:A:K med et molforhold på 1:1,5:4,4:3,3, med en midlere molekylvekt (MW) på 8.150 (D. Teitelbaum et al. i "Eur. J. Immunol." 1:242-248 (1971) ble oppnådd fra Teva Pharmaceutical Industries (Petach Tikva, Israel). Glatirameracetat (Copl, Copaxone<®>) ble oppnådd fra Teva Marion Partners, Kansas City, MO. Biotinylering av Copl ble gjennomført med et overskudd av N-hydroksysuccinimidbiotin (Sigma) i DMSO som beskrevet (M. Fridkis-Hareli et al. i "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 91:4872-4876 (1994)). Ikke omsatt biotin ble fjernet ved dialyse (Spectra/Por membran MWCO 500; Spectrum Medical Industries, Laguna Hills, CA).

Peptider ble syntetisert ved bruk av fastfaseteknikker (G. Barany og R. Merrifield. i "Academic Press", New York, NY (1979)) på en Applied Biosystems Peptide Synthesizer og renset ved revers-fase HPLC(RP-HPLC). Peptidsekvensene var MBP (human basisk myelinprotein) 86-100, NPWHFFKNIVTPRT (SEQ ID NR.: 1); MBP 85-99, ENPWHFFKNIVTPR (SEQ ID NR.: 2), MW 1795; PLP (human proteolipidprotein) 40-60, TGTEKLIETYFSKNYQDYEYL (SEQ ID NR.: 3), MW 2603; og PLP 139-151, HSLGKWLGHPDKF (SEQ ID NR.: 4), MW 1520, enten umerket eller merket med biotin bundet til N-terminus med spaceren SGSG og fri syre ved C-terminus.

FAK (molforhold 1:5:3), YFAK (molforhold 0,2:0,8:5:3), YFAK (molforhold 0,8:0,2:5:3) og YFAK (molforhold 0,5:0,5:5:3) ble syntetisert ved fastfasekjemi som 50-merer (Chiron Technologies, Clayton, Australia). En varians på rundt 10 % fra in-putmolarforholdene og observerte aminosyresammensetninger av de resulterende polymerer ble funnet konsistent med tidligere rapporterte data fra bruk av denne prosedyre.

Protein ekspresjon og -rensing: Oppløelige HLA-DR-2-molekyler ble uttrykt i Drosop-hila S2-celler og renset som beskrevet (A. Kalandadze et al. i "J. Biol. Chem." 271:20156-20162 (1996). Cellene ble dyrket ved 26 °C i rullekolber i ExCell 401 me-dium (JRH Biosciences, Lenexa, KS) supplert med 0-5 % føtal bovin serum (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Cellene ble høstet 4-5 dager efter induksjon med 1 mM CUSO4. Supernatant fra høstede celler ble sekvensielt ført gjennom Protein A-, Protein G- og Protein A-LB3.1 kolonner fulgt av eluering av det bundne HLA-DR med 50 mM 3-[cykloheksylamino]-l-propansulfonsyre (CAPS), pH 11,5 og nøytralisert med 200 mM fosfat (pH 6,0). Proteiner ble konsentrert på en Centriprep 10 membran (Amicon, Beverly, MA).

HPLC separering og mikrosekvensering: Forskjellige kopolymerer ble separert og pool sekvensert som tidligere beskrevet (M. Fridkis-Hareli et al. i "J. Immunol." 162:4697-4704 (1999)). Kort sagt skjedde fraksjoneringen ved mikrobore HPLC ved bruk av en Zorbaz Cig 1,0 mm revers-fasekolonne på en Hewlett-Packard 1090 HPLC med 1040 diodearraydetektor. Kopolymerene ble eluert ved en strømningshastighet på 54 ul/min med en gradient på 0,055 % trifluoreddiksyre (TF A) i acetonitril (0 % ved 0 til 10 min, 33 % ved 73 min og 60 % ved 105 min). Strategier for peakvalget, reversfaseseparering og Edman mikrosekvensering er tidligere beskrevet (R.M. Chicz et al. i "J. Exp Med." 178: 27-47 (1993). Sammenslåtte fraksjoner ble underkastet automatisert Edman nedbrytning på en Hewlett-Packard Gl 005A (Palo Alto, CA) proteinsekvensør ved bruk av produsentens rutine 3.5.

Analyser for peptidbinding til klasse II MHC proteiner:

( A) . Oppløsninger. Oppløsningene som ble benyttet i denne analyse er de følgende: bin-dingsbuffer er 20 mM 2-[N-morfolino]etansulfonsyre (MES), 140 mM NaCl, 0,05 % NaN3, pH 5,0 hvis ikke annet er sagt; PBS er 150 mM natriumklorid, 7,5 mM natriumfosfat, dibasisk, 2,5 mM natriumfosfat, monobasisk, pH 7,2; TBS er 137 mM natriumklorid, 25 mM Tris pH 8,0, 2,7 mM kaliumklorid; TTBS er TBS pluss 0,05 % Tween-20.

( B) . Mikrotiter analyseplatepreparering. Immunoanalyseplater (96-brønners mikrotiter, PRO-BIND™, Falcon, Lincoln Park, NJ) ble belagt med 1 ug/brønn affinitetsrenset LB3,1 monoklonale antistoffer i PBS (100 ul totalt) i 18 timer ved 4 °C. Brønnene ble så blokkert med TBS/3 % BSA i 1 time ved 37 °C og vasket tre ganger med TTBS. Før prøvetilsetning ble 50 ul TBS/ 1 % BSA satt til hver brønn.

( C) . Inhiberingsreaksjoner. Biotinylert peptid MBP 86-100 (SEQ ID NR.: 1), sluttkonsentrasjon 0,13 uM i 50 ul av bindingsbufferen, ble ko-inkubert med ikke-merkede inhibitorer (vilkårlige kopolymerer av MBP 85-99, SEQ ID NR.: 2) og HLA-DR-2-molekyler i 40 timer ved 37 °C.

( D.) Detektering av klasse IIMHC protein/ peptid komplekser. Bundet peptid-biotin ble detektert ved bruk av streptavidin-konjugert alkalisk fosfatase som følger. Plater ble vasket tre ganger med TTBS og inkubert med 100 ul streptavidin-konjugert alkalisk fosfatase (1:3000, BioRad, Richmon, CA) i 1 time ved 37 °C fulgt av tilsetning av p-nitofenylfosfat i trietanolaminbuffer (BioRad). Absorbansen ved 410 nm ble overvåket ved hjelp av en mikroplateleser (modell MR4000; Dynatech, Chantilly, VA).

Antigenpresentasjonsanalyser. HLA-DR-2-begrensede T-celler var MBP 84-102-spesifikke transfektanter som bar genene for TCR oppnådd fra pasienter med relapserende-remitterende MS med DR-2 (8073, pasient Ob (DRB1<*>1501) og HylB, pasient Hy (DRB1<*>1602)) inn i BW 58 TCR a"/p"-celler (M. Fridkis-Hareli et al. i "Human Immunol." 62: 753-763 (2001)); og MBP 84-102-spesifikke (2E12) og PLLP 40-60-spesifikke (106A) hybridomer fra HLA-DR-2-transgeniske mus (L.S. Madsen et al. i "Nat. Genet." 23:343-347 (1999). Muse T-celle hybridomene var PLP 139-151-spesifikk H-2s<->begrenset (hPLP/1 og hPLP/c4, L. Santambrogio et al. i" J. Immunol." 151: 1116(1993). Antigenpresenterende celler (APC) var L466 (L-celler transfektert med HLA-DR-2b (DRB1<*>1501)), L416 (L-celler transfektert med HLA-DR-2a (DRB5<*>0101)), MGAR (EBV-transformerte B-celler som var homozygøse for DRB1<*>1501) og splenocytter fra SJL/J (H-2<S>) mus. T-cellestimuleringsforsøkene ble gjennomført i et totalvolum på 200 ul i 96-brønners mikrotiterplater. Bestrålt (3000 rad) APC (2,5 x 10<4>/brønn) ble ko-inkubert med MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2), PLP 40-60 (SEQ ID NR.: 3) eller PLPL 139-151 (SEQ ID NR.: 4) og de vilkårlige kopolymerer, ved konsentrasjoner som antydet, i 2 timer ved 37 °C. Derefter ble T-celler (5 x 10<4>/brønn) tilsatt og platene inkubert i 24 timer ved 37 °C. 30 ul av supernatantene ble tatt og inkubert med IL-2-avhengig CTLL (5 x 10<4>/brønn) i 12 timer, fulgt av merking med H-tymidin (1 uCi/brønn) i 12 timer. Platene ble høstete og radioaktiviteten overvåket ved bruk av en 1450 mikrobeta Plus væskescintillasjonsteller (Wallac, Gaithers-burg, MD).

Musestammer. SJL/J (H-2<2>) mus med alder 8-12 uker ble ervervet fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og holdt i dyrefasilitetene ved Harvard University i henhold til retningslinjene fra "Committee on Animals of Harvard University" og "Committee on Care and Use of Laboratory Animal Resources", det nasjonale forskningsråd (Depart-ment of Health and Human Services Publication 5-23, revidert 1987). Humaniseret mus (L.S. Madsen, et al. i "Nat. Genet." 23(3): 343-347 (1999)); og D. Altman, D. Hafler, og V. Kuchroo, upublisert) med transgener HLA DR-2 (DRA<*>0101 og DRB1<*>1501) og TCR fra MS pasient Ob som er en V(D)J omarrangering av TCRa og TCRP forsterket fraklonOb.lA12.

Induksjon og suppresjon av EAE. Musene ble injisert subkutant både ved haleroten og nakkegropen med enten helryggradshomogenat (WSCH, 500 ug/mus, fremstilt som beskrevet tidligere (L. Santambrogio et al. i "J. Immunol." 151:1116-1127 (1993)) eller med PLP 139-151 peptid (50 jig/mus) sammen med 400 ug "Mycobacterium tuberculo-sis" H37 Ra (BD Difco Laboratories, Sparks, MD) i en emulsjon inneholdende like an-deler PBS og komplett Freunds adjuvant (CFA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Pertussis toxin (List Biological Laboratories, Campbell, CA, 200 ng) ble injisert intra-venøst i halen en dag efter immunisering. Musene ble bedømt daglig med henblikk på kliniske tegn på EAE efter en skala 1 -5 i henhold til alvoret av sykdomssymptomene som beskrevet tidligere (L. Santambrogio et al. i "J. Immunol." 151:1116 (1993)). For bestemmelse av suppresjonen av EAE ble hver kopolymer i en mengde av 500 ug/mus blandet og injisert med en encefalitogeniske emulsjon som beskrevet ovenfor.

Neuropatologi. For bedømmelse av inflammasjon og demyelinering ble musene per-fusert under anestesi gjennom den stigende aorta med 40 ml Trumps fiksativ (4 % para-formaldehyd, 1 % glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4). Snitt av hjernen og rygg-raden ble postfiksert i kold 1 % osmiumtetroksyd i 1 time og ble dehydratisert gjennom en gradert serie av oppløsningsmidler med økende mengde etanol og ble så innleiret i epoksyharpiks. Snitt på en um ble oppnådd og farvet med toluidinblått og undersøkt ved lysmikroskopi.

Eksempel 1. Syntese og mikrokjemisk analyse av nye kopolymerer.

Vilkårlige fire-aminosyrekopolymerer YEAK, VEAK og FEAK, hver av 14-, 35- og 50-merer lengde, ble syntetisert ved fastfasemetoden. V eller F ble valgt for å erstatte Y på grunn av den følgende strukturelle informasjon: Pl-lommen i DRB1<*>1501 inkluderer P86V og resulterer i en liten lomme som kan ta opp V eller F men ikke Y som er for stor til opptak (bortsett fra ved høypeptidkonsentrasjon; Kriger, J.I. et al. 1991. "J. Immunol." 146:2331-2340); resten som opptrer ved Pl i bindingen av MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) er V, og F kan gi en tettere tilpasning; og resten som opptrer ved P4 i MBP 85-99 er F.

For å bestemme hvorvidt fastfasesynteseprosedyren gir kopolymerer som er like når det gjelder aminosyresammensetning, fordeling, hydrofobisitet og størrelse, sammenlignet med kopolymerer som tidligere er generert kun ved oppløsningskjemi, ble de nye forbindelser underkastet aminosyreanalyse, RP-HPLC separering og mikrosekvensiering.

Aminosyreanalyse viste at molare forhold for Y, V, F, E og K i forskjellige kopolymerer var like de forutsagte forhold bortsett fra A hvis molare forhold var øket i alle kopolymerer og særlig i 35- og 50-merene. I 50-meren av VEAK ble for eksempel det molare forhold funnet å være 1,0 V: 2,1 E: 10,7 A: 2,9 K sammenlignet med de ventede verdier på 1,0 V: 1,5 E: 5,0 A: 3,0 K. Separering av kopolymerene ved HPLC ved bruk av en acetonitrilgradient viste en bred topp med flere mindre topper som spredte seg mellom rundt 40 og rundt 120 minutters elueringstid tilsvarende det til ikke-behandlet Copl (M. Fridkis-Hareli og J.L. Strominger i "Hum. Immunol." 62: 753-763 (2001)). Edman sekvensering av de første 10 aminosyrer viste konstante forhold ved hver cyklus tilsvarende de som ble funnet ved aminosyreanalyse, og antydet at sekvensene for aminosyrene i kopolymerene var vilkårlige.

Eksempel 2. Binding av de nye, vilkårlige kopolymerer til HLA- DR2 molekyler.

Copl og visse tre aminosyrevilkårlige kopolymerer som var syntetisert i oppløsning ved bruk av N-karboksyamiosyreanhydrider (D. Teitelbaum et al. i "Eur. J. Immunol." 1:242-248 (1971), det vil si de som inneholdt tre av aminosyrene Y, E og K, var vist å binde til renset HLA-DR-2 og å konkurrere for binding med MBP 85-99 (M. Fridkis-Hareli og J.L. Strominger i "J. Immunol." 160:4386-4397 (1998)); M. Fridkis-Hareli et al. i "Int. Immunol." 11:635-641 (1999)).

For å bestemme hvorvidt kopolymerene som var syntetisert ved fastfasemetoden også konkurrerte med denne autoantigeniske epitop for binding til HLA-DR-2 ble kompetitive bindingsanalyser gjennomført med biotinylert MBP 86-100 (SEQ ID NR.: 1) og de ikke-merkede peptider og vilkårlige kopolymerer. Binding av biotinylerte MBP 86-100 (SEQ ID NR.: 1) til HLA-DR-2 molekyler ble inhibert mest effektivt av 50-merene av YEAK, det ikke-merkede MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) peptid eller med Copl. Alle andre vilkårlige kopolymerer som her var testet, det vil si de med 14 og 35 aminosyrerester i lengde, var mindre effektive i denne analyse.

Eksempel 3. Proliferative responser på MBP- spesifikke T- celler i nærvær av de vilkårlige kopolymerer.

En serie prolifereringsanalyser ble gjennomført for å bestemme biologisk aktivitet for hver av de vilkårlige kopolymerer med flere MBP 84-102-spesifikke T-cellekloner (se Materialer og Metoder).

Tre typer APC der hver uttrykket HLA-DR-2 molekyler, ble testet for å bestemme hvilken som presenterte MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) peptidet mest effektivt. Høyere proli-fereringsnivåer ble observert når dette peptid ble presentert av den humane B-cellelinje MGAR [DR-2b (DRBl<*>1501)-uttrykkende] enn med L466 (DR-2b-uttrykkende L-celletransfektante) celler. Når L416 [DR-2a (DRB5<*>0101)-uttrykkende L-celler] ble benyttet ble ingen respons detektert, noe som bekreftet at alle T-celle kloner var begren-set til DR-2b (DRB1<*>1501) allelen. Derfor ble derefter MGAR celler er noen ganger L466 celler benyttet i antigen presentasjonsanalysene som beskrevet nedenfor. Inhiberingen av prolifereringen i nærvær av forskjellige kopolymerer av tre forskjellige T-celle kloner på grunn av MBP 85-99 peptidet ble undersøkt. Generelt var 14-merene ikke inhibitoriske uansett testet T-celle klon, mens 35- og 50-merene viste høyere inhiberingsnivåer. For alle kloner var YEAK 50-meren omtrent ekvivalent med Copl (som i gjennomsnitt er en 70-mer). Inhiberingen sank merkbart med YEAK 35-meren og var meget lav med YEAK 14-meren.

Inhibering av proliferering av 2E12 T-celle klonen var effektiv i nærvær av 35- og 50-merene av FEAK og i nærvær av Copl (figur IA, nedre venstre plate). VEAK inhiberte ikke 2E12 klonen (figur IA, nedre høyre plate). 50-meren av FEAK var noe mindre inhibitorisk enn Copl. Når det gjelder Hy IB klonen var Copl den beste inhibitor og lavere nivåer av inhibering ble observert for 50-merene av FEAK og VEAK (figur 1C).

Kombinasjonen av V, E, A og K resulterte i en lav affinitetsbinding til HLA-DR-2 molekyler og lave nivåer av inhibering av HLA-DR-2-begrensede MBP 85-99-spesifikke T-celler. Dette på tross av den observasjon at i MBP 85-99/HLA-DR-2 komplekset er V ankerresten i posisjon 89 i peptid (SEQ ID NR.: 2) som interagerer med 086Val i Pl-lommen av HLA-DR-2 proteinet (K.J. Smith et al. i "J. Exp. Med." 19:1511-1520

(1998)). F sidekjeden passer også inn i P4-lommen og gjør derfor FEAK til et bedre bindingsmiddel. Resten A kan interagere med Pl-lommen og Y med P4-lommen (K.J. Smith et al. i "J. Exp. Med" 19:1511-1520 (1998)). MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) kan være et relativt lavaffinitetspeptid på grunn av V89.

Resten K i FEAK er mest sannsynlig viktig for interaksjon med TCR tilsvarende K i posisjon 93 av MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2; KW. Wucherpfennig et al. i "J. Exp. Med." 179-279-290 (1994); K.J. Smith et al. i "J. Exp. Med." 19:1511-1520 (1998). På den annen side kan K lokalisert nær N-terminus av kopolymeren i bindingssetet bidra til stabile interaksjoner med HLA-DR molekylene og TCR tilsvarende resten K ved P-l i HA 306-318 (SEQ ID NR.: 5) bundet til HLA-DR1 som kan interagere med sidekjedene av al heliksrestene ved Sa53 eller Ea55 (L.J. Stern et al. i "Nature" 368:215-221

(1994)).

Eksempel 4. Proliferering av PLLP- spesifikke T- celle kloner.

For å bestemme hvorvidt de vilkårlige kopolymerer var i stand til å inhibere presentasjonen av et annet, potensielt autoantigen i MS, nemlig PLP, ble to forskjellige PLP epitoper benyttet: human PLP 40-60 (SEQ JD NR.: 3) som binder til DRB1<*>1501 (M. Krogsgaard et al. i "J. Exp. Med." 191:1395-1412 (2000) og muse PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) peptid som binder til H-22 og som er encefalitogenisk i SJL/J mus (V.K. Tuohy et al. i "J. Immunol." 142:1523-1527 (1989)). T-cellene som ble benyttet i denne analyse var 106A (PLP 40-60-spesifikke hybridomer fra HLA-DR-2-transgene mus; L.S. Madsen et al. i "Nat. Genet." 23:343-347 (1999)), og hPLP/1 og hPLP/c4 (PLP 139-151-spesifikke H-2s<->begrensede hybridomer fra SJL/J mus; L. Santambrogio et al. i "J. Immunol." 151:1116-1127 (1993)). Proliferering av T-celle hybridomene ble indusert ved de tilsvarende peptider på doseavhengig måte. Hver av de forskjellige kopolymerer ble så satt til antigen presentasjonsanalysen.

Presentasjonen av PLP 40-60 (SEQ ID NR.: 3) epitopen med L466 APC til 106A T-celler ble inhibert mest effektivt med 35- og 50-merene av FEAK (figur 2A, nedre plate). Inhiberingsnivåene var noe høyere enn i nærvær av Copl. På samme måte som når det gjaldt MBP-spesifikke T-celler nærmet YEAK 50-meren seg Copl (figur 2A, øvers-te plate) mens VEAK inhiberte PLP 40-60-spesifikke T-celler kun ved de høyeste konsentrasjoner (figur 2A, midtre plate).

Proliferering av use H-2<2->begrenset PLP 139-151-spesifikk T-celle hybridoma hPLP/1 ble best inhibert med Copl. FEAK eller VEAK var noe mindre effektive (figur 2B). hPLP/c4 hybridoma ble best inhibert med 50-merene av FEAK og Copl (figur 2C).

Uten å ønske å være bundet av noen spesiell teori er flere mekanismer postulert der kopolymerene kan undertrykke en cellereaktiv T-celle respons: MHC/TCR blokkering, konkurranse, anergiinduksjion, apoptose og "bystander" suppresjon. De første to mekanismer implikerer en effekt av kopolymerene på den tidlige fase av induksjonsfasen mens autoreaktive T-celler begynner å øke i antall. Bystander suppresjon kan virke både på induksjons- og effektorfasene, for å fremme utvikling av regulatoriske T-celler, eller ekspansjon av kryssreaktive T-celler og derved undertrykke selvreaktive encefalitogeniske T-celler. Under ex-vivo proliferering utviklet T-celler av mus som var immunisert med PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) en respons kun til det immuniserende peptid uten noen kryssreaktivitet til de testede kopolymerer. Når imidlertid PLP 139-151 T-celler ble utfordret in vitro i nærvær både av selvpeptidene og kopolymeren var responsen for T-cellene på PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) sterkt fraværende. Også i flere ko-immuniserte mus prolifererte T-celler i respons på PLLP139-151 (SEQ ID NR.: 4) så vel som kopolymerene.

Kopolymerene som når de var administrert in vivo, viste den største suppresjon av EAE i eksemplene nedenfor er også de beste når det gjelder å uttrykke T-celle proliferativ respons på PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) in vitro. I lys av dette synes det som om den mest sannsynlige virkningsmekanisme for kopolymerene er blokkering av MHC og konkurranse for antigen presentasjon.

Eksempel 5. In vivo effekt av VEAK- og FEAK- vilkårlige kopolymerer på EAE indusert av WSCH.

For å finne ut om hvorvidt VEAK- og FEAK-vilkårlige kopolymerer påvirket det kliniske forløp av EAE i SJL/J mus ble det gjennomført et antall in vivo forsøk. Protokollen for sykdomsinduksjon var subkutan injeksjon for å koimmunisere med både WSCH (500 ug) og hver kopolymer (500 ug) tilsvarende protokollen for tidligere studier på suppresjon av EAE med Copl (D. Teitelbaum et al. i "J. Neuroimmunol." 64:209-217

(1996)). Efter sykdomsinduksjon ble musene observert daglig i 40 dager for opptredenen av typiske kliniske tegn på EAE (tabell 1).

Data viser at mus som var injisert med WSCH utviklet EAE rundt dag 14-15 (tabell 1, linje 1) og hadde en maksimal, klinisk bedømmelse på rundt 2,2 (innsidens: 18/32, mortalitet: 3 %). Ko-immunisering med 35- eller 50-mer VEAK (tabell 1, linje 6 henholdsvis 4) påvirket ikke signifikant forløpet av EAE og resulterte i en innsidens og maksimal score tilsvarende gruppen som var injisert kun med WSCH selv om starten av sykdommen i disse koimmunisete mus kan ha vært noe forsinket.

I motsetning til dette uviklet mus som var behandlet med enten 35-mer eller 50-mer av FEAK (tabell 1, linjene 7 henholdsvis 5) ikke engang symptomer på EAE. Behandling med Copaxone (Tabell 1, linje 2) undertrykket EAE. En av fjorten av musene som var behandlet med Copaxone<®>utviklet sykdommen på dag 20 med en maksimal score på 3,0. På tilsvarende måte utviklet to av seksten mus som var injisert med 50-meren av YEAk (Tabell 1, linje 3) en mild EAE på dag 14 med en maksimal score på 1,0.

For å bestemme graden av inflammasjon og demyelinering i mus injisert med hver av de forskjellige kopolymerer ble sentralnervesystemimmunohistokjemi gjennomført på ryggmargsprøver. Prøver fra lumbarstrengen av syke mus injisert med kun WSCH eller med WSCH og VEAK 50-mer, viste utstrakt submeningeal, perivaskulær og parenky-mal infiltrering så vel som demyelinering. I motsetning til dette ble ingen symptomer på infiltrering eller demyelinering detektert i prøver fra de mus som ikke hadde utviklet noen tegn på sykdom efter behandling med de andre kopolymerer.

Blant forskjellige vilkårlige kopolymerer som er syntetisert ogkarakteriserti eksemplene her var FEAK mest effektiv med henblikk på å undertrykke EAE indusert av WSCH.

Eksempel 6. Behandling med VEAK- eller FEAK- vilkårlige kopolymerer av EAE indusert med PLP 139- 151 peptid ( SEQ ID NR. : 4).

For å finne ut hvorvidt vilkårlige kopolymerer som tilveiebragt her påvirker utviklingen av kronisk-relapserende EAE ble mus injisert subkutant med 50 ug PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4; den encefalitogeniske epitop i SJL/J stammen) alene, eller med 50 ug PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) og 500 ug av kopolymeren. Musene ble undersøkt på daglig basis i 90 dager efter induksjon av sykdommen.

Immunisering med PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) epitopen alene i CF A resulterte i EAE med mer alvorlige kliniske tegn (figur 3 A) sammenlignet med EAE indusert av WSCH (tabell 1). For eksempel utviklet fem av åtte mus alvorlige symptomer på EAE med en mortalitet på 33 %. Det første angrep opptrådte ved rundt dag 14 efter immunisering med en maksimal klinisk score på 4,0, fulgt av efterfølgende fluktuering i syk-domsangrep med en topp omtrent ved dagene 30, 50, 70 og 85.

Ko-injeksjon med de forskjellige kopolymerer reduserte på forskjellig grad de kliniske tegn av EAE. I den VEAK 50-mer-behandlede gruppe (figur 3B), viste fire av åtte mus kliniske tegn på EAE (mortalitet: 12 %). Det første angrep utviklet seg dag 13 og toppet seg rundt dag 20 (midlere maksimal score: 1,6).

Ko-injeksjon med FEAK 50-meren (figuren 3C) resulterte i tre syke mus av åtte (mortalitet: 0 %). Det første angrep var forsinket og var mindre symptomatisk alvorlig (dagene 23-25, midlere maksimal score 1,1) sammenlignet med kontrollen som fikk kun peptidet, eller med den VEAK-behandlede gruppe. Kliniske symptomer var så å si helt lind-ret ved rundt dag 40.

Behandling med Copaxone<®>(figur 3D) førte til en forsinkelse av det første angrep (start dag 26, topp ved dag 34 og maksimal midlere score: 1,25), tilsvarende de resultater som ble oppnådd med FEAK. I Copaxone® gruppen utviklet to av åtte mus EAE med en mortalitet på 12 %.

Data i tabell 1 og figur 3 indikerer at EAE som var indusert med enten WSCH eller med PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) peptidet effektivt ble undertrykket av FEAK 50-merene. Videre viser disse data at 50-merene av FEAK undertrykket EAE som var indusrt med enten WSCH eller PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) peptidet mer effektivt enn Copl. Denne observasjon var klar når både det encefalitogeniske materiale og kopolymeren ble injisert samtidig i SJL/J mus. Copl inhiberer EAE indusert med enten WSCH eller med syntetiske PLP peptider og interferer med PLP-spesifikke T-celle responser kun når musene var ko-immunisert med begge antigener (D. Teitelbaum et al. i" J. Neuroimmunol." 64:209-217 (1996)), noe som antyder at de konkurrerer om binding til klasse II MHC molekyler.

Uten å ønske å være bundet av noen spesiell teori kan mekanismen for aktivitet for 50-mer vilkårlige kopolymerer slik de her tilveiebringes være tilsvarend den til Copl og føre til inhibering av bindingen av potensielle autoantigeniske peptider til klasse U MHC proteiner, og etterfølgende T-celle suppresjon.

Eksempel 7. Syntese og mikrokjemisk analyse av Y- og F- holdige kopolymerer.

Det er vist ovenfor at 50-merer, sammenlignet med 14- eller 35-merer av vilkårlige kopolymerer bestående av aminosyrene Y, E, A og K, er potente inhibitorer av bindingen av human immunodominante epitoper MBP 85-99 (SEQ ID NR: 2) til MS-assosiert HLA-DR-2 (DRB1<*>1501). Noen av disse kopolymerer inhiberte responsen av HLA DR-2-begrensede MBP 84-102-spesifikke T-celler og undertrykket også EAE i den til-bøyelige SJL/J stamme indusert av den encefalitogeniske epitop PLP 139-151 (SEQ IN NO: 4).

Her er analysen for hver aminosyresammensetning og hvert aminosyreforhold i kopolymerene vist for en vilkårlig tre-kopolymer FAK 50-mer og for fire-aminosyre-kopolymeren YFAK ved forskjellige forhold Y:F (de " Y- og F-holdige" polymerer), hver 50-mer kopolymer syntetisert som 50-mer ved fastfasemetoden. Aminosyrer som omfatter disse kopolymerer ble valgt i henhold til ankerrestene av MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) epitopen bundet til HLA-DR-2 (DRB1<*>1501) molekylene.

Kopolymerer med forskjellige forhold mellom Y og F ble konstruert i henhold til de følgende kriterier: Pl-lommen av DRB1<*>1501 som inkluderer 086V resulterer i en liten lomme som kan ta opp F men der Y er for stor til å kunne tas opp; således vil F gi en tettere tilpasning for Pl selv om resten som opptrer ved Pl i bindingen av MBP 85-99 er V; og resten som opptrer ved P4 i MBP 85-99 er F, men denne lomme er stor nok til å ta opp Y som også kan gi bedre tilpasning enn F. For å bestemme hvorvidt synteseprosedyren gir substanser som er tilsvarende når det gjelder aminosyresammensetning, fordeling, hydrofobisitet og størrelse, sammenlignet med de som genereres ved tidligere teknikker, ble de nye forbindelser underkastet aminosyreanalyse, RP-HPLC separering og mikrosekvensering.

Amiosyreanalyse viste at de molare forhold mellom Y, F og K i hver av de forskjellige kopolymerer var tilsvarende de ventede molare inputforhold bortsett fra A hvis molare forhold var øket i alle kopolymerer. HPLC separering av kopolymerene ved bruk av en acetonitrilgradient er tidligere beskrevet for Copl (M. Fridkis-Hareli et al. i" J. Immunol." 162, 4697-4704 (1999)), viste en bred topp med flere mindre topper som eluerte ved mellom 40 og 80 minutter tilsvarende eluering av ikke-behandlet Copl.

Pool sekvensering av de første diverse aminosyrer for hver kopolymer som var syntetisert her viste vilkårlige mønstere med signifikant høyere nivåer av A i forhold til nivåe-ne av hver av Y, F eller K, noe som tilsvarer de opprinnelige høyere molare forhold for A som ble funnet ved å analyser sammensetningen av disse vilkårlige kopolymerer. Ingen sekvensspesifisitet eller preferensiell posisjonering for noen av aminosyrene i kopolymerene ble observert, noe som antyder at polymerene hadde en vilkårlig sekvens.

Eksempel 8. Binding av Y- og F- holdige vilkårlige kopolymerer til HLA- DR- 2 molekyler.

For å bestemme hvorvidt Y- og F-holdige kopolymerer som her ble syntetisert ved fastfasemetoden kan konkurrere med autoantigenisk MS-assosiert epitop MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) for binding til HLA-DR-2 molekyler ble kompetitive bindingsanalyser gjen-nomført med biotinylert MBP 86-100 (SEQ ID NR.: 1) og hver av de ikke-merkede,

vilkårlige kopolymerer.

Binding av biotinylert MBP 86-100 til HLA-DR-2 molekyler ble effektivt inhibert av FAK 50-meren og av YFAK 50-mer kopolymerer (med molforholdet Y0,8:F0,2; figur 4). Således konkurrer de Y- og F-holdige 50-mer vilkårlige kopolymer med den MS-relaterte epitop (SEQ ID NR.: 2) for binding til MS-assosierte HLA-DR-2 molekyler. Eksempel 9. Proliferative responser på MBP- spesifikke T- celler i nærvær av de vilkårlige 50- mer kopolymerer.

Effekter av nærværet av hver av 50-mer kopoymerene FAK, YFAK (0,2:0,8), YFAK (0,5:0,5) og YFAK (0,8:0,2) på prolifereringen av tre forskjellige T-celle kloner som respons på MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) peptidet ble undersøkt og resultatet fra to uavhengige forsøk er vist i figur 5.

Data viser at for hver av tre MBP-spesifikke HLA-DR-2 begrensede kloner var tre Y-og F-holdige YFAK kopolymerer og FAK kopolymeren effektive inhibitorer. Blant disse kopolymerer var YFAK 0,2:0,8, YFAK 0,5:0,5 og FAK bedre inhibitorer enn YFAK 0,8:0,2 og var overlegen Copl.

De overlegne inhibitoraktiviteter for de tre YFAK kopolymerer ved forskjellige Y:F forhold og FAK kopolymeren ble observert ved lavere konsentrasjoner (for eksempel ved rundt 20 uM) av hver av disse bedre inhibitorer for klonen 2E12, og ved flere lav-kopolymerkonsentrasjoner med andre T-celle kloner. Ved høyere konsentrasjoner, for eksempel større enn rundt 100 uM, var de observerte inhiberingsnivåer like for alle kopolymerene som ble testet i dette eksempel (figur 5).

Eksempel 10. Behandling av EAE indusert med PLP 139- 151 ( SEQ ID NR. : 4) med Y-og F- holdige kopolymerer.

In vivo forsøk ble gjennomført for å bestemme hvorvidt Y- og F-holdige 50-mer vilkårlige kopolymerer ville påvirke det kliniske forløp av EAE i SJL/J mus. Som i eksemplene ovenfor var protokollen for ko-immunisering subkutan injeksjon av SJL/J mus med, i dette eksempel, den encefalitogeniske epitop PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4; 50 ug) og et kopolymerpreparat (500 ug). Efter sykdomsinduksjonen ble musene observert daglig på opptredenen av typiske tegn på EAE under et tidsrom på 70 dager.

Immunisering med PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) epitop alene i CF A resulterte i kronisk-relapserende EAE (figur 6; tabell 2). Alle 13 mus som mottok denne behandling utviklet alvorlige EAE med en mortalitet på 77 %. De første tegn dukket opp rundt dag 11 fulgt av etterfølgende fluktuering i sykdomsangrepet med en midlere maksimal score på 4,6 (figur 6).

Ko-injeksjon av vilkårlige kopolymerer ifølge oppfinnelsen reduserte på forskjellig må-te de kliniske tegn på EAE. I den YFAK 0,2:0,8-behandlede gruppe viste kun to av 16 mus kliniske tegn på EAE (mortalitet 6 %) og disse kliniske tegn opptrådte med en forsinkelse i det første angrep som opptrådte på rundt dag 37 (midlere maksimal score: 0,6; figur 6, tabell 2) i stedet for dag 11 som i den ikke-behandlede gruppe.

På samme måte ble i den YFAK 0,5:05-behandlede gruppe en syk mus av 16 observert (mortaliet: 0 %) med det første angrep utviklet på dag 33. Videre utviklet åtte av 17 mus EAE av de som var behandlet med YFAK 0,8:0,2 uten mortalitet. I denne gruppe var den observerte midlere, maksimale kliniske score på 1,5 og tiden for start (dag 27) begge indikative på en mindre terapeutisk fordel enn de data som ble oppnådd for mus behandlet med YFAK-preparatet med lavere forhold mellom Y og F som vist ovenfor.

Ko-injeksjon med FAK resulterte i tre syke av 17 med 12 % mortalitet, en midlere maksimal score på 0,9 og en midlere start på dag 25 (tabell 2, linje 5). Copaxone<®>, ko-injisert med PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4), resulterte i at 12 av 16 mus utviklet EAE, med en midlere start ved dag 22 og en midlere klinisk score på 2,6 (tabell 2, linje 6).

Observasjon av kliniske symptomer i individuelle mus i andre forsøk (figur 6B) viser at YFAK 0,5:0,5 behandling eliminerte alle symptomer i hele gruppen av mus behandlet med denne kopolymer. Fra disse data på individuelle mus er det klart at F-holdige kopolymerer er mer effektive med henblikk på å lindre PLP-indusert EAE enn Cop 1, og at et høyere molart forhold F: Y er assosiert med denne overlegen remediering av EAE.

Som en oppsummering ble EAE indusert med PLP 139-151 (SEQ ID NR.: 4) effektivt undertrykket av de tre forskjellige YFAK kopolymerer og av FAK med en effektivitets-rekkefølge YFAK 0,5:0,5>YFAK 0,2:0,8>FAK>YFAK 0,8:0,2. De F-holdige kopolymerer remedierte PLP-indusert EAE mer effektivt enn Cop 1.

De Y- og F-holdige vilkårlige aminosyrekopolymerer som var syntetisert og analysert som beskrevet her er mer potente når det gjelder binding til HLA-DR-2 molekyler, inhibering av autoantigen-spesifikke T-celler, og suppresjon av EAE, enn Cop 1 (Copaxone<®>). Disse kopolymerer ble konstruert og syntetisert hovedsakelig basert på de restene av immunodominant T-celle epitop MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) som interager-te med de MS-assosierte HLA-DR-2 (DRB1<*>1501) molekyler. Lengden av kopolymerpreparatene er her påvist å være viktige for aktiviteten der 50-merene er mest effektive. Lengre polypeptider kan også være i stand til å binde naboklasse II molekyler.

50-meren vilkårlig kopolymeren FAK og YFAK 50-mer kopolymeren med forskjellige molforhold mellom Y og F som beskrevet her er mer potente enn kontrollen Copaxone<®>i de følgende funksjonelle aktiviteter: binding til HLA-DR-2 molekyler, inhibering av MBP-spesififkke DR-2-begrensede T-celler, og suppresjon av EAE. Vilkårlig kopolymer VEAK viste lav affinitetsbinding til HLA-DR-2 molekyler, lave nivåer av inhibering av HLA-DR-2-begrensede MBP 85-99-spesifikke T-celler og ingen effekt på progresjonen av EAE, til tross for en aminosyrerest V i en posisjon som er ekvivalent til Pl i MBP 85-99 autoantigen (SEQ JD NR.: 2). Data her viser at erstatningen av V med F resulterte i en bedre, inhibitorisk forbindelse, sannsynligvis på grunn av en tettere tilpasning av F i Pl-lommen og Y i P4-lommen.

Mest signifikant er effekten av kopolymerene på progresjonen av EAE indusert av encefalitogenisk epitop PLP 139-151 (SEQ JD NR.: 4). Kliniske tegn på EAE ble signifikant redusert ved behandling med YFAK kopolymerene eller med FAK når det encefalitogeniske materiale og kopolymeren ble injisert samtidig i SJL/J mus.

Uten å ønske å være bundet til noe spesiell teori støtter disse data en mekanisme for aktiviteten av vilkårlige kopolymerer som involverer kopolymeren som effektive blokkere av anitgen presentasjonen av klasse JJ MHC molekyler som fører til inhibering av binding av de potensielle autoantigeniske peptider og efterfølgende autoimmun T-celle suppresjon.

YFAK 50-mer- og FAK 50-mer kopolymerene er kandidater for bruk ved behandling av MS, en sykdom der 60 % av pasientene er av HLA-DR-2 (DRB1<*>1501) haplotypen.

Gitt den promiskøse bindingsevne hos vilkårlige kopolymerer (M. Fridkis-Hareli et al. i "J. Immunol." 160: 4386-4397 (1998); M. Fridkis-Hareli et al. i "Int. Immunol." 11:635-641 (1999)), kan kopolymeren ifølge oppfinnelsen være fordelaktige også hos MS pasienter som har andre HLA-DR spesifisiteter, og kan tilveiebringe nye terapeutiske forbindelser for bruk ved andre autoimmune tilstander.

Eksempel 11. Ko/ Pre- immuniseringsbehandling med valin ( V)- og tyrosin ( Y)- eller valin ( V)- og tryptofan- ( W)- holdige kopolymerer undertrykker MBP 85- 99 ( SEQ ID NR. : 2) indusert EAE i humaniserte mus.

Peptidbindingslommene hos HLA-DR-2 DRB1<*>1501 har en (386 Val rest ved Pl og er av en størrelse som kan ta opp en rest som er en V eller F, men ikke tilstrekkelig størrel- se til å ta opp en Y eller W. I motsetning til dette inneholder den store, hydrofobe lomme P4 en 071 Ala og kan derfor ta opp en rest med større størrelse som Y eller W; og P9-lommen er promiskøs. Basert på disse strukturelle betraktninger ble kopolymerer inneholdende valin (V) og tyrosin (Y), eller valin (V) og tryptofan (W), sammen med A og K, syntetisert og testet for effekten på progresjonen og symptomene av EAE indusert med MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2).

Forsøksdyr var humaniserte mus som bar transgenene HIA DR-2 (DRA<*>0101 og DRB1<*>1501) og TCR fra MS pasient Ob, med et V(D)J omarrangement av TCRcc og TCRp, forsterket fra klonen Ob. 1A12. Mus i hver gruppe ble injisert med MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) subkutant for å indusere EAE. Som vist i figur 7 ble grupper på mus preimmunisert med en enkelt injeksjo to dager før EAE induksjon, enten med Copl, YFAK 0,5:0,5, eller kontroll MBP 85-89, eller ble samtidig ko-immunisert med Copl, YFAK 0,5:0,5, YFAK 0,2:0,8, VY AK 0,5:0,5, eller med VWAK 0,5:0,5 og med den EAE-induserende MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2). Kliniske symptomer ble overvåket over et forløp på 50 dager på de antydede dager.

Mus i kontrollgruppen som var indusert med MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) og ellers ubehandlet viste et symptomsalvor som overskred en klinisk bedømmelse på 4 rundt dag 25. Kliniske symptomer i denne gruppe steg generelt til et høyt nivå på 3-4 for åtte tidspunkter (dagene 11 til 32), før stabilisering på et alvorsnivå mellom 2 og 3. Varigheten av symptomen ble observert over en total på 14 tidspunkter (tilsvarende dag 7 til slutten av observasjonsperioden, dag 50) med symptomer stabilisert ved mellom 2 og 3 hva alvor angår.

I motsetning til dette viste mus som var indusert med MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) og ko-immunisert med VWAK minimale kliniske EAE symptomer (figur 7). Under 50 dagers forløpet av forsøket viste musene en tilbakevenden til en klinisk normal opptre-den dag 37. Symptomene som ble notert for VWAK-behandlede mus som opptrådte rundt dag 9 ble observert ved en største klinisk score på rundt eller mindre enn rundt 1. Selv om de gav en viss symptomremediering sammenlignet med MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2) kontrollen reduserte andre kopolymerer som vist i figur 7 ikke vesentlig symptomalvoret som ble bedømt fra 1 til noe over 2 (for gruppen ko-immunisert med YFAK 0,2:0,8), 1 til 2 (for gruppen pre-immunisert med YFAK 0,5:0,5) og noe større enn 1 (for gruppen ko-immunisert med YFAK 0,5:0,5).

Den største remediering av symptomer ble funnet i gruppen som ble ko-immunisert med VWAK og den korteste varighet for symptomene ble funnet i gruppen som ble pre-immunisert med YFAK 0,5:0,5.1 denne sistnevnte gruppe ble symptomene observert for til sammen kun fem tidspunkter hvorefter de kliniske symptomer forsvant. YFAK 0,5:0,5 pre-behandlingsdata er også plottet inn i figur 8 (kvadratiske symboler) for å vise kontrastene i alvor og varighet av symptomer i den YFAK 0,5:0,5-behandlede gruppe med kontrollgruppen av MBP 85-99 (SEQ ID NR.: 2; ruter-formede symboler), indusert og ellers ubehandlet, og den Copol-behandlede gruppe (figur 8, triangulære symboler). Pre-immuniseringsprotokollen som ble benyttet her er ekvivalent med vaksinasjon mot den autoimmune sykdom EAE.

Copl pre-immunisering eller ko-immunisering i den samme analyse gav, i motsetning til pre-immunisering med YFAK 0,5:0,5, og mens den remedierte symptomer, en lind-ring av symptomene til et nivå for en klinisk bedømmelse på rundt 2 til 3 (Copl ko-immunisering) eller noe større enn 3 (Copl pre-immunisering). Videre ble symptomer observert for ni tidspunkter tatt fra dagene 7 til 37 (Copl ko-immunisering) før musene ble asymptomatiske, eller over et tidsrom på 14 tidspunkter fra dagene 7 til og med 50 (Copl pre-immunisering) med mus som oppnådde et stabilt nivå av symptomer større enn rundt 1 hva alvor angår heller enn en eliminering av symptomene som når det gjaldt den YFAK-behandlede gruppe. Disse data viser at YFAK 0,5:0,5 er mest effektiv ved pre-immunisering av dyr mot utvikling av EAE sykdomstilstanden.

Disse data antyder at nærværet av W eller F i en vilkårlig kopolymer med aminosyrene V, A og K kan øke tilpasningstettheten i kopolymeren inn i en posisjon av klasse II MHC hovedspor, for eksempel i både Pl- og P4-posisjonen. Disse data viser at YFAK og VWAK er lovende potensielle terapeutiske midler mot MS, mot demyelineringstil-stander og eventuelt andre autoimmune sykdommer.

Claims

1. Aminosyrekopolymer,karakterisert vedat den er en lineær, vilkårlig kopolymer YFAK omfattende aminosyrene tyrosin (Y), fenylalanin (F), alanin (A) og lysin (K) i et molforhold (Y+F):A:K på rundt 1:5:3, eller i et molforhold Y:F:A:K på rundt 0,2:0,8:5:3, eller rundt 0,5:0,5:5:3, eller rundt 0,8:0,2:5:3.

2. Kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat molforholdet F: Y er rundt 1, er minst 2 eller er rundt 4.

3. Kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat molforholdet Y:F er større enn 1, er minst 2, eller er minst 4.

4. Kopolymer ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat den omfatter minst 25, minst 35, minst 50 eller minst 70 aminosyreresten

5. Kopolymer ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat aminosyrene polymeriseres ved en fastfasereaksjon eller ved oppløsningskjemi, fortrinnsvis ved en fastfasereaksjon.

6. Kopolymer ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisert vedat den omfatter en aminosyremodifikasjon på en restlokasjon som øker inhibering av proteolytisk nedbrytning av kopolymeren i et individ sammenlignet med den ikke-modifiserte kopolymer.

7. Preparat,karakterisert vedat det omfatter en kopolymer som angitt i et hvilket som helst av kravene 1 til 6 og minst ett ytterligere terapeutisk middel.

8. Preparat ifølge krav 7,karakterisert vedat det ytterligere terapeutiske middel er valgt blant et antistoff, en enzyminhibitor (fortrinnsvis valgt blant en proteaseinhibitor og en cyklooksygenaseinhibitor), et antibakterielt middel, en antiviralt middel, et steroid, et ikke-steroid antiinflammatorisk middel, en antimetabolitt, et cytokin (fortrinnsvis valgt blant P-interferon, interleukin-4 og interleukin-10), et cytokinblokkeringsmiddel, et adhesjonsmolekylblokkerende middel og en oppløselig cytokinreceptor.

9. Enhetsdoseform,karakterisert vedat den omfatter en kopolymer som angitt i et hvilket som helst av kravene 1 til 6 eller et preparat som angitt i krav 7 eller 8.

10. Anvendelse av en kopolymer ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 eller et preparat som angitt i krav 7 eller 8 eller en form som angitt i krav 9, eventuelt med en farma-søytisk akseptabel bærer, for fremstilling av et medikament for behandling av en autoimmun sykdom.

11. Anvendelse ifølge krav 10, der kopolymeren er valgt for inhibering av binding av et autoantigenisk peptid til et MHC klasse JJ protein assosiert med den autoimmune sykdom eller for å inhibere en klasse JJ-spesifikk T-celle respons til et MHC klasse JJ protein-peptid kompleks.

12. Anvendelse ifølge krav 10 eller 11, der den autoimmune sykdom er valgt blant Hashimotos tyroiditt; idiopatisk myksødem, en alvorlig hypotyroidisme; multippel sklerose, en demyelinerende sykdom; myastenia gravis; Guillain-Barre syndrom; systemisk lupus erytematosis; uveitt; autoimmun ooforitt; kronisk immun trombocytopenisk purpurea; kolitt; diabetes; Graves sykdom; psoriasis; pemfigus vulgaris; og rheumatoid artritt.