NO334878B1

NO334878B1 - Dyremodell for rask identifikasjon av farmasøytiske aktive forbindelser in vivo

Info

Publication number: NO334878B1
Application number: NO20054554A
Authority: NO
Inventors: Janine Arts; Ann Trudo Jose Belien; Ann Odette Adolf Marien; Annemie Francine Valckx
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2003-03-05
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2014-06-30
Also published as: AU2004217817A1; JP2007523606A; NO20054554D0; CN102766602A; CA2516519C; US7666670B2; US20060147377A1; NZ542577A; WO2004078984A1; CA2516519A1; AU2004217817B2; NO20054554L; EP1601775B1; ATE516359T1; IL170611A; JP4545142B2; ES2368328T3; WO2004078985A1; CN1756846A; EP1601775A1

Abstract

I et første aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse en tumorcellelinje som er stabilt transfektert med en ekspresjonsvektor inneholdende et reportergen, fortrinnsvis et fluorescent protein, operativt knyttet til en promoter som også kontrollerer ekspresjon av et protein som er assosiert med tumorregresjon, stabilisering av tumorvekst eller inhibering av metastatisk vekst, og som er særpreget ved at nevnte cellelinje er i stand til å danne en tumor når implantert eller injisert i det ikke-humane dyr. Sammenlignet med tradisjonelle in vivo-modeller er foreliggende oppfinnelse forskjellig ved at reportergenet ikke blir konstituitivt uttrykt, men kun etter eksponering til en forsøksforbindelse som resulterer i ekspresjonen av et protein eller enzym som er assosiert med tumorregresjon, stabilisering av tumorvekst eller inhibering av metastatisk vekst. Kun når en forbindelse som skal undersøkes, kommer inn i sirkulasjonen og infiltrerer tumoren, kan den generere reportersignalet, forutsatt at den fremmer ekspres3onen av et protein assosiert med tumorregresjon, og promoteren av nevnte protein er operativt knyttet til reportergenet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en dyremodell for neoplastisk vekst, spesielt kreft-artet vekst. Særskilt muliggjør dyremodellen identifikasjon av farmasøytisk aktive forbindelser in vivo, noe som omfatter anvendelsen av tumorceller som er stabilt transfektert med en ekspresjonsvektor omfattende et reportergen operativt forbundet med en promoter som også kontrollerer ekspresjon av et protein assosiert med tumorregresjon, stabilisering av tumorvekst eller inhibering av metastase. De aktuelle tumorceller er slike som er angitt i krav 1 og den aktuelle gnagermodell er av en slik type som er angitt i krav 6. Oppfinnelsen angir videre en gnagermodell som angitt i krav 6 som en fremgangsmåte for fremstilling av en slik gnager som angitt i krav 8. Det er dessuten beskrevet en fremgangsmåte for in vitro screening av forbindelser med anti-neoplastisk aktivitet eller farmasøytisk aktivitet som angitt i krav 10 og 11.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Det har lenge eksistert et behov for en representativ dyremodell for å undersøke effektiviteten av foreslåtte nye antineoplastiske substanser uten å måtte utføre langtids xenograft-studier. Foreliggende in vivo modeller med hvilke potensielle anti-neoplastiske materialer blir testet, involverer implantasjon av tumorceller i et ikke-humant dyr, behandle dyret med det forslåtte nye anti-neoplastiske middel og så overvåke dyrene for å bestemme effekten av behandlingen på veksten av tumoren. For å assistere visualisering av tumorceller mot bakgrunnen hos vertsdyrene anvender mange in wVo-modeller tumorceller som er stabilt transfektert med et reportergen så som luciferase-familien og aequorin-familien av bioluminescente molekyler.

En hovedulempe med disse in wVo-modeller ved utviklingen av antitumor-midler er den begrensede gjennomløpstid, d.v.s. et stort antall dyr og store mengder foreslått antitumorforbindelse er nødvendig. Videre er disse in wVo-modeller tidskre-vende idet de kan kreve tilstrekkelig tid for den implanterte tumor å vokse i dyret. Følgelig ble en forbedret modell nylig foreslått av Lassota P. i internasjonal patent-søknad (PCT/EP02/00106) publisert som WO 02/055742 den 18. juli 2002. I denne modell blir tumorcellene med et reportergen, som blir aktivert av det antitumorale middel, dyrket i en biokompatibel semipermeabel innkapslingsanordning som blir implantert i det ikke-humane dyr og fjernet etter eksponering av dyret til forbindelsen som skal undersøkes. Imidlertid, i betraktning av det kunstige miljø av tumorcellene, er det et åpent spørsmål hvorvidt responsen av tumorcellene korrekt etter- ligner in wVo-situasjonen hvor en forbindelse må komme inn i sirkulasjonen, infilt-rere tumorvevet og utøve sin biologiske effekt.

Det er kjent fra WO02055742 A2 en cellelinje fra humant cellecancer som er transfektert med et reportergen nedstrøms for en p2i<WAF/C>FP1 promoter hvor luciferase nevnes som eksempel på et reportergen.

Det er fra artikkelen "Histone deacetylase inhibition selectively alters the activity and expression of cell cycle proteins leading to specific chromatin acetylation and antiproliferative effects" av Sambucetti LS et al., the Journal of Biological Chemistry

(1999), vol. 237, side 49, side 34940-34947, kjent humane cancer cellelinjer med

p21<wAF/c>i<p->i promoter delesjonsmutanter og fra artikkelen "Sodium butyrate induces NIH3T3 cells to senescence-like state and enhances promoter activity of p2i<WAF/CIP1>in p53-independent manner" av Xiao H. et al., Biochemical and biophysical research communication (1997), vol. 237, side 457-460, er det kjent effekten av natriumbu-tyrat, some r en histon deacetylase inhibitor, på p2i<WAF/C>IP_1 promoter in vitro.

Således, for å tilfredsstille behovet for en dyremodell for human neoplastisk syk-dom og som er uten de ovennevnte ulemper, beskriver foreliggende oppfinnelse en ny dyremodell som har egenskapen å faktisk etterape den farmakologiske aktivitet av en foreslått anti-neoplastisk forbindelse in vivo. En modell som tillater overvåk-ning av den anti-neoplastiske aktivitet av en forbindelse på en ikke-invasiv måte og som omfatter anvendelsen av stabilt transformerte tumorceller som har blitt transfektert med en ekspresjonsvektor inneholdende et reportergen definert ved SEQ ID NO:l operativt forbundet til en promoter som også kontrollerer ekspresjon av et protein som er assosiert med tumor-regresjon. For å fremskaffe den ønskede dyremodell bør cellene: opprettholde egenskapen å danne en tumor når implantert eller inji sert i dyret;

danne et signal som er lik den endogene respons av et protein assosiert med tumor-regresjon;

danne et signal med et godt signal-til-støy-forhold for å tillate sanntidsanalyse av den kinetiske effekt av medikamentsubstanser in vivo;

danne et signal med en god reproduserbarhet for å gi en lav variabili-tet mellom dyr; og

danne et signal som tillater ikke-invasiv avbildning av den induserte respons.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I et første aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse en tumorcellelinje stabilt transfektert med en ekspresjonsvektor inneholdende et reportergen, som er et fluorescent protein, operativt forbundet med en promoter omfattende et p21 promoterfragment definert ved SEQ ID NO:l som også kontrollerer ekspresjon av et protein som er assosiert med tumor-regresjon,karakterisert vedat nevnte cellelinje er i stand til å danne en tumor når implantert eller injisert i det ikke-humane dyr.

I forhold til tradisjonelle in wVo-modeller skiller foreliggende oppfinnelse seg fra

disse ved at reportergenet ikke blir uttrykt konstituitivt, men kun etter eksponering til en forsøksforbindelse som resulterer i ekspresjon av et protein eller enzym assosiert med tumor-regresjon. Kun når en forbindelse som skal testes kom inn i sirkulasjonen og infiltrerte tumoren kan den danne reportersignalet, forutsatt at den fremmer ekspresjonen av et protein assosiert med tumor-regresjon og promoteren av nevnte protein er operativt knyttet til reportergenet.

Modellen er meget gunstig i forhold til tidligere in wVo-modeller siden utførelsesti-den ti å undersøke den in vivo farmasøytiske aktivitet av foreslåtte anti-neoplastiske forbindelse blir redusert. I de tradisjonelle in wVo-modeller tar det typisk 4 til 5 uker å oppnå et resultat, mens det i foreliggende modell, når tumoren en gang er dannet i det ikke-humant dyr, er mulig å se effektene av en forsøksfor-bindelse etter et par dager. Videre, i betraktning av klarheten og reproduserbarhe-ten av det fluorescente signal, kan tumorene bli observert gjennom huden og målt ved å bruke et automatisk hel-kropps-avbildnignssystem. Som en følge av dette er et mindre antall dyr nødvendig for å oppnå statistisk signifikante effekter. En ytterligere fordel med foreliggende dyremodell er følsomheten og responsiviteten av det fluorescente signal innen et bredt konsentrasjonsområde av forsøksforbindelse. Denne kombinasjon tillater å utføre en kinetisk sanntidsanalyse for in vivo-aktiviteten av forsøksforbindelsen og å forutsi den antitumorale effektivitet av for-søksforbindelsen når kombinert med endringen i den observerte tumorvekt. Den kombinasjon av særtrekk tillater ikke-invasiv avbildning etter begrensede mengder dosering med forsøksforbindelsen (4 dager i stedet for den tradisjonelle periode på 30 dager), noe som fører til en minskning av forsøkstid og således forsøksforbindel-se, samt å minske lidelsen hos dyr og bruk av dyrefasiliteter.

Promoteren består av p21-promoteren. p21-proteinet virker som en inhibitor på cyklin-avhengig kinase-aktivitet og stopper effektivt cellecyklus-progresjon. Det har blitt vist en mengde antitumorale midler som aktiverer p21-promoteren innbefattende DNA-skadende midler og histon deacetylase-inhibitorer som aktiverer henholdsvis p21-promoteren via det p53-responsive element (beliggende ved - 4500 bp til -1300 bp-området i forhold til TATA-boksen) eller spl-seter (beliggende ved -60 bp til +40 bp-området i forhold til TATA-boksen), og som fører til øket ekspresjon av p21-proteinet. I en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse består p21-promoteren av et p21 promoterfragment definert ved SEQ ID NO:l. Følgelig, basert på den anvendte promoter, fremskaffer foreliggende oppfinnelse en modell som er selektiv for de in vivo farmakologiske effekter av enten DNA-skadende midler og/eller av histondeacetylase-inhibitorer. Eller generelt, avhengig av de neoplastiske midler av interesse, kan alternative responselementer bli brukt.

Det er også et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en in v/fro-metode for å undersøke en forbindelse for anti-neoplastisk aktivitet omfattende trinnene å: sette tumorcellene i henhold til oppfinnelsen i kontakt med forbindel sen som skal undersøkes; og

måle ekspresjonen av reportergenet;

hvor en økning av reportergenekspresjon i forhold til kontrollnivåene identifiserer forbindelsen til å inneha anti-neoplastisk aktivitet. Reportergenet er et fluorescent protein og ekspresjonen av reportergenet blir målt som mengden av emittert fluorescent lys. I en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er in vitro un-dersøkelsesmetoden selektiv for histondeacetylase-inhibitorer og omfatter tumorceller som er stabilt transfektert med en ekspresjonsvektor omfattende et p21 promoterfragment definert ved SEQ ID NO:l.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer foreliggende oppfinnelse ikke-humane dyr for undersøkelse av den farmasøytiske aktivitet av en forbindelse, hvor nevnte dyr omfatter en stabilt transformert tumorcelle i henhold til oppfinnelsen. Nevnte tumorcelle bør være kirurgisk implantert eller injisert som en tumorcellesuspensjon under huden av det ikke-humane dyr for å gi en subkutan modell, inn i organet av tumoropprinnelse (for eksempel lungetumorceller inn i lungene) for å gi en ortop-tisk modell, inn i bukhulerommet av det ikke-humane dyr for å gi en periotoneal modell, eller inn i blodkarene av det ikke-humane dyr for å gi metastase-modellen. I en foretrukket utførelsesform blir tumorcellene injisert subkutant for å gi den sub-kutane modellen.

Det e således et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en fremgangsmåte for å undersøke en forbindelse for farmasøytisk aktivitet omfattende trinnene å: administrere tumorceller i henhold til oppfinnelsen til et ikke-humant dyr i en mengde som er tilstrekkelig til å fremskaffe produksjon av en tumor i nevnte ikke-humane dyr;

tillate tumorcellene tilstrekkelig tid til å danne en tumor i nevnte ikke-humane dyr;

administrere en potensielt aktiv forbindelse til nevnte ikke-humane

dyr; og

vurdere effekten av nevnte forbindelse på tumorcellene ved å måle ekspresjonen av reportergenet.

Inkubering med farmasøytisk aktive forbindelser vil resultere i en økning av reportergenekspresjon i forhold til kontrollnivåene.

Dette og ytterligere aspekter av foreliggende oppfinnelse vil bli forklart nedenfor i større detalj.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 A: Doserespons av p21-promoterkonstruksjonen overfor DNA-skadende midler og histondeacetylase-inhibitorer (HDACi) av klon 1. Celler blir behandlet i 24 timer med de angitte forbindelser, d.v.s. de DNA-skadende midler kampotecin (camp.), bleomycin (bleo) og doksorubincin (dox) og HDACi-forbindelsene TSA, Mitsui, forbindelse X og SAHA. Fluorescens ble målt ved å bruke Ascent Fluorskan som beskrevet i M&M. Induksjonsmengden ble regnet ut som fluorescens etter induksjon delt på fluorescens av DMSO-behandlede celler. Klon 1 viste en 5 gangers induksjon etter behandling med IO"<7>M TSA; 2 gangers induksjon overfor IO"<6>M Mitsui og 3 gangers induksjon overfor IO"<6>M forbindelse X.

Figur 1 B: Doserespons av p21-promoterkonstruksjonen overfor DNA-skadende midler og histondeacetylase-inhibitorer (HDACi) av klon 5. Celler blir behandlet i 24 timer med de indikerte forbindelser, d.v.s. de DNA-skadende midler kamptotecin (camp.), bleomycin (bleo) og doksorubicin (dox) og HDACi-forbindelsene TSA, Mitsui, JNJ99 (Comp.X) og SAHA. Fluorescens ble målt ved å bruke Fluoroskan som beskrevet i M&M. Induksjonsmengden ble regnet ut som fluorescens etter induksjon delt på fluorescens av DMSO-behandlede celler. Klon 5 viste en 5 gangers induksjon etter behandling med IO"<7>M TSA; 2 gangers induksjon overfor IO"<6>M Mitsui og 4 gangers induksjon overfor IO"<6>M forbindelse X. Figur 2. In vivo visualisering av xenograft-fluorescens. Klon 1 ble injisert subkutant (IO<7>celler/200ul) i siden av nakne mus. Fra dag 12 ble dyr dosert daglig i løpet av 6 dager med Solvent, Mitsui (20 mpk) eller forbindelse X (40 mpk). Tumorer i levende mus ble vurdert for fluorescens i det lokalt utviklede Automated Body Imaging System og fluorescens-intensitet ble sammenlignet. Induksjon av ZsGreen var meget klar 3 dager etter administrasjon av første dose og nådde et platå 5 dager etter start av behandlingen. Figur 3. Respons av p53RE promoterkonstruksjonen overfor det DNA-skadende middel aktinomycin D i A2780- og HCT116-kloner. Celler blir behandlet i 24 timer med aktinomycin D. Fluorescens ble målt ved å bruke Fluoroskan som beskrevet i eksempel 2. Grad av induksjon ble regnet ut som fluorescens etter induksjon delt på fluorescens av DMSO-behandlede celler. A2780 klon 36 viste en 2 gangers induksjon etter behandling med 10 mg/ml aktinomycin D; en 2 til nesten 4 gangers induksjon ble observert med HCT116-klonene. Figur 4. p2i<waf>'<cipl>promoter-ZsGreen-modell forutsier den biologiske effekt av HDAC-inhibitorer in vitro. Klon 5 av A2780 ovarietumorceller transfektert med pG13-basic-ZsGreen-1300 ble behandlet i 24 timer med de indikerte konsentrasjo-ner av HDAC-inhibitorer SAHA (<*>), MS-275 (A), LAQ-824 ( ) og TSA (•), eller med oppløsningsmiddel (0,1% DMSO). Fig. 4A viser p21 protein-induksjon av klon 5 som målt ved å bruke et p21 ELISA. Fig. 4B representerer den induserte fluorescens i klon 5 som målt ved å bruke Ascent Fluoroskan. Induksjonsmønsteret for p21 er identisk med induksjonsmønsteret for den p21-responsive ZsGreen ekspresjonsvektoren pG13-basic-ZsGreen-1300. Figur 5. p21waf, cipl promoter-ZsGreen-modellen forutsier anti-tumoral effekt av MS-275 i enkelte mus in vivo. Nakne mus ble injisert subkutant med humane A2780p21H,a/:'c''':!ZsGreen ovarietumorceller (IO<7>celler/mus) og fra dag 4 etterføl-gende behandlet p.o. med vehikkel (kontrollgruppe, 20% hydroksypropyl-p-cyklodekstrin) eller MS-275 (QD) ved de indikerte doser. Tumorvekt og fluorescens av individuelle tumorer ble vurdert på dag 28 ved å bruke Automated Whole Body Imaging System.

Figur 6. 53RE_TK/pGL3-basic-ZsGreen ekspresjonsvektor

DETALJERT BESKRIVELSE

Vektorer

Foreliggende oppfinnelse angår en vektor omfattende et reportergen operativt knyttet til en promoter som angitt i krav 1 og som også kontrollerer ekspresjonen av et protein eller enzym hvis ekspresjonsnivå er assosiert med en fysiologisk tilstand.

Operativt knyttet, som benyttet heri, betyr funksjonelt å fusere en promoter til et gen i den korrekte leseramme under kontroll av promoteren. Som benyttet heri, betyr "reportergen" et gen som koder for et genprodukt som kan bli identifisert ved å bruke enkle, billige metoder eller reagenser som kan bli operativt knyttet til pro-moterområdet eller et aktivt fragment derav. Reportergener som sådan, f.eks. en ildflueluciferase, p-galaktosidase, alkalisk fosfatase, den bakterielle kloramfenikol-acetytl-transferase eller et fluorescent protein reportergen, kan bli brukt til å bestemme transkripsjonen aktivitet i undersøkelsesassays i henhold til oppfinnelsen (se foreksempel Goeddel (ed.), Methods Enzymol., Vol. 185, San Diego: Academic Press, Inc. (1990); se også Sambrook, supra). I en foretrukket utførelsesform er reportergenet et fluorescent protein, spesielt et fluorescent protein valgt fra gruppen bestående av BGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, YsYellow, HcRed eller destabiliserte fluorescente proteiner så som pDsRed, pHcRedl, pd2EGPF eller pd2EYFP. I en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er reportergenet det fluorescente protein ZsGreen. Nevnte reportermolekyler og gensekvensene derav er kjent innen faget og er kommersielt tilgjengelige så som det fluorescente protein solgt av Clontech, San Diego, California.

Teknikkene og metodene for manipuleringen av nukleinsyrer, for eksempel ved fremstilling av nukleinsyrekonstruksjoner, sekvensering, introduksjon av DNA i celler og genekspresjon, samt analyse av proteiner, er beskrevet i detalj i Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1997.

Vektorene i henhold til oppfinnelsen kan bli valgt eller konstruert fra kommersielt til gjengelige vektorer så som pCAT3, pGL2, pGL3 eller pSV-p-galaktosidase, og omfatter typisk passende regulatoriske sekvenser så vel som et eller flere utvelgbare markørgener, for eksempel et ampicillin resistensgen i tilfelle av et bakterielt plas-mid eller et neomycin resistensgen for en pattedyrvektor. Som eksemplifisert nedenfor, blir vektoren i en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse konstruert fra pGL3 utgangsvektoren. Nevnte vektorsekvenser er kjent innen faget og er kommersielt tilgjengelige så som pGL3 utgangsvektoren solgt av Promega, Madison, WI. Spesielt inneholder vektorene benyttet ifølge foreliggende oppfinnelse som en av de regulatoriske sekvenser, en promotersekvens definert ved SEQ ID NO:l som ikke bare er kompatibel med vertscellen for hvilken ekspresjonsvektoren er utformet, men også følsom overfor forbindelser, innbefattende proteiner, peptider, oligonukleotider og små molekyler som er kjent for å ha en ønsket fysiologisk effekt i den responsive vertscelle. Følgelig omfatter promotersekvensene i de aktuelle eks-presjonsvektorene minst et regulatorisk sekvenselement, også kjent som responsivt element, særpreget ved at det regulerer ekspresjon av det tilknyttede reportergen, og blir aktivert grunnet bindingen eller frigjøringen av en transkripsjonsfaktor, hvor tilstedeværelsen eller fraværet av nevnte transkripsjonsfaktor er korrelert til den ønskede fysiologiske tilstand hos vertscellen. For eksempel dersom den ønskede fysiologiske tilstand består av å indusere stans av cellecyklus og differensie-ring i vertscellen, kan promotersekvensen omfatter de GC-rike strukturer funnet i den proksimale del av p21<WAP>1/Cip<l->promoteren som er kjent for å bli aktivert ved eksponering til p21-aktivatorer så som transkripsjonsfaktorene Spl og Sp3 så vel som andre indusere av stans i cellecyklus og celledifferensiering så som steroid-hormoner, nervevekstfaktorer, tumor nekrosefaktor-a, forbolestere, fosfataseinhibi-torer, interferon y og Smad tumor suppressor-proteiner.

Følgelig kan promoteren benyttet heri enten være en naturlig forekommende promoter så som p21<WAP>1/Cip<l->promoteren som også kontrollerer ekspresjonen av et protein hvis ekspresjonsnivå er avhengig av den ønskede fysiologiske tilstand, eller fragmenter derav som har promoteraktivitet så som p21 1300 bp promoterfragmentet som beskrevet i eksemplene nedenfor. I en spesiell utførelsesform består promotersekvensen av en rekombinant DNA-konstruksjon som omfatter et av de tidligere nevnte regulatoriske sekvenselementer så som de p53 responsive elementer operativt knyttet til minimale promoterelementer så som den minimale interleukin 6 (IL6) promoter (phu.IL6Pluc+ Plaisance et al. (1997) MCB 17, 3733-3743), den minimale ElB-promoter (PMCSIuc kommersielt tilgjengelig fra Stratagene) eller den kommersielt tilgjengelige TK-promoter for luciferase (pTKIuc Promega), og fortrinnsvis består promoteren av p21 1300 bp promoterfragmentet som beskrevet nedenfor, eller av den HSV-TK minimale promoter omfattende det p53 responsive element som beskrevet nedenfor. I en annen utførelsesform vil promotersekvensen være en promoter som også kontrollerer ekspresjon av et protein som er assosiert med tumor-regresjon eller et fragment derav som har promoter-aktivitet. Promoteren består av et p21 promoterfragment definert ved SEQ ID NO:l.

Målceller

I et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse en målcelle som er stabilt transformert med en ekspresjonsvektor omfattende et reportergen operativt knyttet til en promoter som også kontrollerer ekspresjonen av et protein eller enzym hvis ekspresjonsnivå er assosiert med en fysiologisk tilstand.

Vektorkonstruksjonene som er beskrevet ovenfor, kan bli introdusert i målcellene ved hjelp av enhver kjent metode så som transfeksjon eller transduksjon, fortrinnsvis ved å bruke standard transfeksjonsmetoder så som liposomer, kalsiumfos-fat-utfelling, elektroporering og bruk av en genpistol.

Idet det er et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en ikke-human dyremodell for neoplastisk vekst, spesielt kreftrelatert vekst, vil vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse bli introdusert i målceller som er i stand til å danne en tumor når implantert eller injisert i det ikke-humane dyr. Eksempler på egnede cellelinjer innbefatter melanomer, lungetumorlinjer, nyretumorlinjer, tarmtumorlin-jer, prostatatumorlinjer, ovarietumorlinjer, brysttumorlinjer, sentralnervesystem-tumorlinjer, leukemicelletumorlinjer, etc. I en utførelsesform består målcellene av en ovarietumorcellelinje, spesielt A2780 (ECACC Nr. 93112520), i en annen utførel-sesform består målcellene av en kolorektal karsinomcellelinje, spesielt HCT116 (ATCC Nr. CCL-247). Ytterligere målceller kan bli valgt fra forskjellige cellelinjer som innbefatter forskjellige pattedy reel lelinjer, spesielt humane cellelinjer. Det bør bemerkes at målcellene som er benyttet heri, innbefatter enhver av de tidligere nevnte celler som allerede er transformert med et ekspresjonssystem for en selek-sjonsmarkør så som neomycin, et terapeutisk protein så som metioinase eller et reportergenprodukt. For eksempel er, i en alternativ utførelsesform av oppfinnelsen, målcellene som er i stand til å danne en tumor når administrert til et ikke-humant dyr, allerede transformert med et ekspresjonssystem som koder for et re-porterprotein så som ildflueluciferase eller et fluorescent protein (se ovenfor). Disse celler kan bli transformert med en vektor i henhold til oppfinnelsen forutsatt at emisjonsbølgelengdene av de luminescente proteiner, dvs. reportergenet som gir den grunnleggende farge og vektoren i henhold til oppfinnelsen som gir den induserbare farge, ikke overlapper hverandre. Mulige kombinasjoner innbefatter blant annet DsRed med de forsterkede fluorescente proteiner EBFP, ECFP, EGFP og EYFP; ZsGreen med DsRed; EGFP med EYFP; EGFP med EBFP; EBFP med EYFP eller ECFP med EYFP. Når de en gang er transformert med vektorene i henhold til oppfinnelsen, tillater disse celler en effektiv påvisning av hele tumoren, for eksempel for å etablere når de administrerte tumorceller hadde tilstrekkelig tid til å danne en tumor i nevnte ikke-humane dyr, i kombinasjon med det induserbare system beskrevet heri for å studere den anti-neoplastiske aktivitet av en forsøksforbindelse. Spesielt for å studere hvorvidt forbindelsen som skal undersøkes, trenger inn i tumoren via passiv diffusjon og/eller angiogenese. I alle tilfeller vil valget av målcellen av-henge av den fysiologiske tilstand som skal undersøkes. Alternativt har ekspresjonsvektoren i henhold til oppfinnelsen en lav, men påviselig basalekspresjon av reportergenet med en god induksjonsfaktor for å oppnå signifikans. I denne utfø-relsesform kan den lave basale ekspresjon bli brukt til å etablere når de administrerte tumorceller hadde tilstrekkelig tid til å danne en tumor i nevnte ikke-humane dyr. Således er ingen dobbeltransfeksjon av målcellene nødvendig. Denne fordel-aktige utførelsesform inntraff når vektoren i henhold til oppfinnelsen omfatter ZsGreen som reportergen.

Det er således et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en stabilt transformert tumorcellelinje som har blitt transfektert med en ekspresjonsvektor inneholdende et reportergen operativt knyttet til en promoter som også kontrollerer ekspresjon av et protein som er assosiert med tumorregresjon. Spesielt er dette en stabilt transformert ovariekarsinomcellelinje, fortrinnsvis A2780-celler omfattende en ekspresjonsvektor inneholdende en nukleinsyresekvens som koder for et fluorescent protein operativt knyttet til en promoter som reagerer på p21-aktivatorer, hvor nevnte promoter fortrinnsvis omfatter 1300bp p21 promotersekvensen (SEQ ID NO. 1), enda mer foretrukket består nevnte promotersekvens av 1300 bp p21 promotersekvensen (SEQ ID NO. 1). I en ytterligere utførelsesform er det fluorescente protein valgt fra gruppen bestående av EGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, YsYellow, HcRed eller destabiliserte fluorescente proteiner så som pDsRed, pHcRedl, pd2EGFP eller pd2EYFP, og i en spesiell utførelsesform består det fluorescente protein av ZsGreen. I en foretrukket utførelsesform er de stabilt transformerte celler valgt fra kloner deponert hos the Belgian Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM) 20. januar 2003 som pGL3-basic-ZsGreen-1300-clone 1 og pGL3-basic-ZsGreen-1300-clone 2 med de respektive tilgangsnumre LMBP 5958CB og LMBP 5959CB. Nevnte kloner omfatter en ekspresjonsvektor avledet fra den kommersielt tilgjengelige pGL3-vektor og inneholder en nukleinsyresekvens som koder for ZsGreen operativt knyttet til en promoter som kan reagere på p21-aktivatorer, hvor nevnte promoter omfatter 1300 bp p21 promotersekvensen (SEQ ID NO. 1), hvor nevnte kloner erkarakterisert vedat de har en lav basal fluorescensekspresjon som ved induksjon med kjente indusere av cellecyklusstans og celledifferensiering så som Mitsui (også kjent som MS-275 - Shering - Registreringsnummer 209783-80-2) og som tillater påvisning av fluorescensen ved hjelp av et helkropps-avbildningssystem.

I betraktning av disse karakteristika, dvs.

egenskapen å danne en tumor når implantert eller injisert i et ikke-humant dyr,

lav basal fluorescens,

en fluorescens som er induserbar ved eksponering til kjente indusere av cellecyklusstans og celledifferensiering på en spesifikk måte, og

det til et nivå som er påviselig ved å bruke ikke-invasive helkropps avbild-ningsteknikker,

representerer nevnte kloner et viktig verktøy for å studere den in vivo farmasøytis-ke aktivitet av foreslåtte anti-neoplastiske forbindelser. Sammenlignet med tradisjonelle in wVo-modeller tillater anvendelse av disse celler i ikke-humane dyr, spesielt laboratoriedyr så som kaniner, marsvin, mus, rotter og hunder, fortrinnsvis gnagere, forbindelser å bli vurdert ved tidligere tidspunkter i medikamentoppdagelsesprosessen uten å utføre tids- og forbindelses-krevende farmakokinese-(PK) og farmakodynamikk- (PK) studier.

I en alternativ utførelsesform er cellelinjene transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en promotersekvens bestående av en rekombinant DNA-konstruksjon omfattende et av de tidligere nevnte regulatoriske sekvenselementer, så som p53 responsive elementer operativt knyttet til minimale promoterelementer så som den minimale interleukin 6 (IL6) promoter (phu.IL6Pluc+ Plaisance et al. (1997) MCB 17, 3733-3743), den minimale ElB-promoter (pMCSIuc kommersielt tilgjengelig fra Stratagene) eller den kommersielt tilgjengelige TK-promoter for luciferase (pTKIuc Promega). Spesielt er denne en stabilt transformert kolorektal karsinomcellelinje eller ovariekarsinomcellelinje, fortrinnsvis HCT116-celler eller A2780-celler omfattende en ekspresjonsvektor inneholdende en nukleinsyresekvens som koder for et fluorescent protein operativt knyttet til en promoter som kan reagere på p53-aktivatorer. I en ytterligere utførelsesform er det fluorescente protein valgt fra gruppen bestående av EGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, YsYellow, HcRed eller destabiliserte fluorescente proteiner så som pDsRed, pHcRedl, pd2EGFP eller pd2EYFP og i en spesiell utførelsesform består det fluorescente protein av ZsGreen. I en spesiell utførelsesform består de stabilt transformerte celler av A2780- eller HCT116-celler transfektert med å53RE_TK/pGL3-Basic-ZsGreen-vektoren (Fig) avledet fra den kommersielt tilgjengelige pGL3-vektor og inneholdende en nukleinsyresekvens som koder for ZsGreen operativt knyttet til en promoter som reagerer på p53-aktivatorer, hvor nevnte kloner erkarakterisert vedat de har en lav basalfluo-rescensekspresjon som ved induksjon med p53-aktivatorer så som eksponering til DNA-skadende midler, hypoxia, nukleotidfjerning eller onkogen aktivering, tillater påvisning av fluorescensen ved hjelp av et automatisk helkropps avbildningssys-tem.

I lys av disse særtrekk, dvs.

egenskapen å danne en tumor n år implantert eller injisert i et ikke-humant dyr,

lav basal fluorescens,

en fluorescens som er induserbar ved eksponering til kjente indusere av cellecyklus-stans og celledifferensiering på en spesifikk måte, og

hvor nevnte kloner utgjør et viktig verktøy til å studere den in vivo farmasøytiske aktivitet av foreslåtte anti-neoplastiske forbindelser. Sammenlignet med de tradisjonelle in wVo-modeller tillater bruk av disse celler i ikke-humane dyr, spesielt laboratoriedyr så som kaniner, marsvin, mus, rotter og hunder, fortrinnsvis gnagere, forbindelser å bli vurdert ved tidligere tidspunkter i medikamentoppdagelsesprosessen uten å utføre tids- og forbindelseskrevende farmakokinese- (PK) og farmakodynamikk- (PD) studier.

Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse i en ytterligere utførelsesform stabilt transformerte tumorcellelinjer som har blitt transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholder et reportergen operativt knyttet til en promotersekvens definret ved SEQ ID NO:l. Forbindelser som benyttet heri innbefatter proteiner, peptider, oligonukleotider og små molekyler.

Assays

Det er også et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe anvendelsen av de ovenfor nevnte cellelinjer i et in vitro undersøkelsesassay for å identifisere farma-søytisk aktive forbindelser, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å sette de stabilt transformerte celler ifølge oppfinnelsen i kontakt med forbindelsen som skal under-søkes, og måle ekspresjonen av reportergenet. Farmasøytisk aktive forbindelser, som benyttet heri, refererer til forbindelser som er i stand til å aktivere promotersekvensen som er tilstede i ekspresjonsvektoren.

I den spesielle utførelsesform med å identifisere forbindelser med anti-neoplastisk aktivitet, omfatter de stabilt transformerte celler i den tidligere nevnte undersøkel-sesmetode en ekspresjonsvektor inneholdende et reportergen som er operativt knyttet til en promotersekvens som reagerer på forbindelser assosiert med tumor-regresjon. Det er således et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en in vitro fremgangsmåte for å identifisere forbindelser med antineoplastisk aktivitet, hvor nevne fremgangsmåte omfatter å sette stabilt transformerte tumorceller i henhold til oppfinnelsen i kontakt med forbindelsen som skal undersøkes og måle ekspresjonen av reportergenet.

I en foretrukket utførelsesform av den ovenfor nevnte in vitro undersøkelsesmetode består de stabilt transformerte tumorceller av stabilt transformerte ovariekarsinomceller, fortrinnsvis A2780-celler omfattende en ekspresjonsvektor inneholdende en nukleinsyresekvens som koder for et fluorescent protein operativt knyttet til en promoter som reagerer på p21-aktivatorer, hvor nevnte promoter fortrinnsvis omfatter 1300 bp p21 promotersekvensen (SEQ ID NO. 1), enda mer foretrukket består nevnte promotersekvens av 1300 bp p21 promotersekvensen (SEQ ID NO. 1), hvor i en ytterligere utførelsesform det fluorescente protein er valgt fra gruppen bestående av EGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, ZsYellow, HcRed eller destabiliserte fluorescente proteiner så som pDsRed, pHcRedl, pd2EGFP eller pd2EYFP og i en spesiell utførelsesform består det fluorescente protein av ZsGreen eller ZsRed. I en mer foretrukket utførelsesform er de stabilt transformerte tumorceller benyttet i in vitro undersøkelsesmetoden, valgt fra klonene deponert ved BCCM med depone-ringsnummere LMBP 5958CB og LMBP 5959CB. I en ytterligere utførelsesform av den ovenfor nevnte in vitro undersøkelsesmetode består de stabilt transformerte tumorceller av stabilt transformerte kolorektalkarsinomceller eller stabilt transformerte ovariekarsinomceller, fortrinnsvis A2780-celler eller HCT116-celler, omfattende en ekspresjonsvektor inneholdende en nukleinsyresekvens som koder for et fluorescent protein operativt knyttet til en promoter som reagerer på p53-aktivatorer, hvor i en ytterligere utførelsesform det fluorescente protein er valgt fra gruppen bestående av EGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, YsYellow, HcRed eller destabiliserte fluorescente proteiner så som pDsRed, pHcRedl, pdEGFP eller pd2EYFP og i en spesiell utførelsesform består det fluorescente protein av ZsGreen. I en spesiell utførelsesform består de stabilt transformerte celler benyttet i in wtro-metoden av A2780- eller HCT116-celler transfektert med p53RE_TK/pGL3-Basic-ZsGreen-vektoren (Fig. 6).

Det vil lett bli forstått av fagpersonen at det tidligere nevnte assay kan bli tilpasset til høyhastighets-undersøkelsesprogrammer. For eksempel kan assayene hvor antineoplastisk aktivitet blir vurdert ved å måle endring i fluorescens, bli utformet omkring et instrument kalt en Fluorescence Imaging Plate Reader ((FLIPR®, Molecular Devices Corporation). I sin vanligste konfigurasjon eksiterer og måler det fluorescens sendt ut av fluorescente forbindelser. Det bruker en argonionelaser til å danne høyenergetisk eksitasjon av en fluorofor, et optisk system for raskt å svei-pe over bunnen av en 96-/384-brønners plate og et følsomt avkjølt CCD-kamera til å fange inn den emitterte fluorescens. Det inneholder også et 96-/384-brønners pipetteringshode som tillater instrumentet å avlevere oppløsninger av forsøksrea-genser til brønnene av en 96-/384-brønners plate. FLIPR-assayet er utformet for å måle fluorescens-signaler fra populasjoner av celler før, under og etter tilsetning av forbindelser i sanntid fra alle 96-/384-brønner samtidig. FLIPR-assayet kan bli brukt til å søke etter og karakterisere forbindelser som er funksjonelt aktive i de stabilt transformerte tumorceller i henhold til oppfinnelsen.

Et høyhastighets undersøkelsesassay som er spesielt anvendelig til å identifisere p21- eller p53-aktivatorer, kan bestå av et enkelttrinnsarrangement hvor ovariekarsinomcellene, spesielt A2780-cellene stabilt transformert med en ekspresjonsvektor i henhold til oppfinnelsen, blir inkubert med en forsøksforbindelse, og etter tilstrekkelig tid til å tillate interaksjon (8 - 24 timer, typisk 12 - 24 timer, spesielt 24 timer) blir endringen i relative fluorescensenheter målt ved å bruke en automatisk fluorescensplateleser så som FLIPR eller Ascent Fluoroskan (kommersielt tilgjengelig fra Thermo Labsystems, Brussel, Belgia).

Ikke- human dyremodell

Det er også en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse å fremskaffe ikke-humane dyr omfattende en målcelle i henhold til oppfinnelsen. Spesielt å fremskaffe en ikke-human dyremodell for neoplastisk vekst, spesielt kancerøs vekst.

De aktuelle stabilt transformerte tumorceller kan også benyttes for å fremstille en ikke-human dyremodell for neoplastisk vekst, hvor det ikke-humane dyr kan admi-nistreres en mengde av stabilt transformerte tumorceller i henhold til oppfinnelsen og som er tilstrekkelig til å fremskaffe dannelsen av en tumor i nevnte ikke-humane dyr, hvor nevnte ikke-humane dyr for bruk som modell fortrinnsvis er pattedyrindi-vider, mest foretrukket passende laboratoriedyr så som marsvin, kaniner, rotter og mus og liknende. For en nærmere analogi med mennesker kan primater også bli brukt. Spesielt anvendelig er individer som er mottakelige for tumorvekst så som individer med svekkede immunsystemer, typisk nakne mus eller SCID-mus. Ethvert passende virveldyrindivid kan bli brukt, hvor valget i hovedsak blir diktert av egnethet og likhet med systemet av endelig interesse. Den ikke-humane dyremodell er fortrinnsvis en gnager så som nakne mus, og mengden av celler til å fremskaffe produksjon av en tumor ligger typisk i områder fra IO<6>til IO<8>celler (se for eksempel US 6.251.384). Foretrukket er slik administrasjon subkutan og tumorene blir dannet i faste masser.

De ovennevnte dyremodeller kan bli brukt for undersøkelse av forbindelser med anti-neoplastisk aktivitet. Fortrinnsvis består tumorcellene administrert til nevnte ikke-humane dyr av stabilt transformerte ovariekarsinomceller, fortrinnsvis A2780-celler omfattende en ekspresjonsvektor inneholdende en nukleinsyresekvens som koder for et fluorescent protein operativt knyttet til en promoter som reagerer på p21-aktivatorer, foretrukket hvor nevnte promoter omfatter 1300 bp p21 promotersekvensen (SEQ ID NO. 1), enda mer foretrukket hvor nevnte promotersekvens består av 1300 bp p21 promotersekvensen (SEQ ID NO. 1), hvor, i en ytterligere utførelsesform, det fluorescente protein er valgt fra grippen bestående av EGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, ZsYellow, HcRed eller destabiliserte fluorescente proteiner så som pDsRed, pHcRedl, pd2EGFP eller pd2EYFP, og i en spesiell utførelsesform består det fluorescente protein av ZsGreen eller ZsRed. I en mer foretrukket utfø-relsesform er de stabilt transformerte tumorceller benyttet i in vivo-undersøkelsesmetoden, valgt fra klonene deponert ved BCCM med deponeringsnummer LMBP 5958CB og LMBP 5959CB.

I en alternativ utførelsesform er tumorcellene benyttet i in vivo undersøkelsesme-toden transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en promotersekvens bestående av en rekombinant DNA-konstruksjon omfattende en av de tidligere nevnte regulatoriske sekvenselementer så som de p53-responsive elementer operativt knyttet til minimale promoterelementer så som den minimale interleukin 6- (IL6) promoter (phu.IL6Pluc+ Plaisance et al. (1997) CMB 17, 3733-3743), den minimale ElB-promoter (pMCSIuc kommersielt tilgjengelig fra Stratagene) eller den kommersielt tilgjengelige TK-promoter for luciferase (pTKIuc Promega). I en utførelsesform består de stabilt transformerte tumorceller benyttet i in wVo-undersøkelsen av stabilt transformerte kolorektale karsinomceller eller stabilt transformerte ovariekarsinomceller, fortrinnsvis A2780-celler eller HCT116-celler, omfattende en ekspresjonsvektor inneholdende en nukleinsyresekvens som koder for et fluorescent protein, operativt knyttet til en promoter som reagerer på p53-aktivatorer, hvor i en ytterligere utførelsesform det fluorescente protein er valgt fra gruppen bestående av EGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, ZsYellow, HcRed eller destabiliserte fluorescente proteiner så som pDsRed, pHcRedl, pd2EGFP eller pd2EYFP, og i en spesiell utfø-relsesform består det fluorescente protein av ZsGreen. I en spesiell utførelsesform består de stabilt transformerte celler benyttet i in wVo-metoden av A2780- eller HCT116-celler transfektert med p53RE_TK/pGL3-Basic-ZsGreen-vektoren (Fig. 6).

Følgelig fremskaffer oppfinnelsen i en ytterligere utførelsesform anvendelsen av stabilt transformerte tumorcellelinjer som har blitt transfektert med en ekspresjonsvektor inneholdende et reportergen operativt knyttet til en promotersekvens bestående av en rekombinant DNA-konstruksjon omfattende et regulatorisk sekvenselement operativt knyttet til et minimalt promoterelement, definert ved SEQ ID NO:l hvor nevnte promotersekvens reagerer på forbindelser assosiert med tumorregresjon i en in vivo utvelgelsesmetode i henhold til oppfinnelsen.

Når benyttet ved in vivo undersøkelsesmetoder, bør de stabilt transformerte tumorceller administrert til nevnte ikke-humane dyr ha hatt tilstrekkelig tid til å danne en tumor i nevnte ikke-humane dyr. En tumor og spesielt en fast tumor som kan må-les med passer, blir typisk dannet 7-20 dager etter administrasjon av de stabilt transformerte tumorceller til det ikke-humane dyr. I en spesiell utførelsesform blir, ved å bruke de A2780 transformerte celler i henhold til oppfinnelsen og spesielt ved å bruke ovariekarsinomceller deponert ved BCCM med deponeringsnummer LMBP 5958CB eller LMBP 5959CB, en passermålbar svulst oppnådd 12 dager etter injek-sjonen av cellene.

Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse i en ytterligere utførelsesform en framgangsmåte for å fremstille en ikke-human in vivo dyremodell for å identifisere forbindelser med anti-neoplastisk aktivitet, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene å: Administrere tumorceller i henhold til oppfinnelsen til en gnager, hvor de stabilt transformerte tumorceller i henhold til oppfinnelsen blir typisk administrert som en tumorcellesuspensjon omfattende IO<6>til IO<8>celler som blir injisert under huden på gnageren; og

Tillate tumorcellene tilstrekkelig tid til å danne en svulst i nevnte gnager, som i den spesielle utførelsesform som benytter ovariekarsinomcellene som skissert ovenfor, typisk utgjør 7-14 dager, mer foretrukket 9-12 dager og spesielt 12 dager.

Gnagermodellen som kan fremskaffes ved å følge den ovennevnte fremgangsmåte, kan etterfølgende bli brukt i en in vivo metode for å identifisere forbindelser med anti-neoplastisk aktivitet, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene å: Administrere en potensielt aktiv forbindelse til gnageren i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis en nakenmus injisert med ovariekarsinomceller som forklart ovenfor, hvor den potensielt aktive forbindelse kan bli administrert via alle klinisk relevante ruter for administrasjon innbefattende intravenøst, oralt og intraperitonealt; og

Vurdere effekten av nevnte potensielt aktive forbindelse på tumorcellene ved å måle ekspresjonen av reportergenet.

Gjennom foreliggende beskrivelse skal uttrykkene "standard metoder", "standard protokoller" og "standard prosedyrer", når benyttet i sammenheng med molekylær- biologiske teknikker, bli forstått som protokoller og prosedyrer funnet i vanlige la-boratoriemanualer så som: Current Protocols in Molecular Biology, utgivere F. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. 1994 eller Sambrook J., Fritsch E. F. Og ManiatisT., Molecular Clonin: A Laboratory Manual", 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.

Foreliggende oppfinnelse vil bli bedre forstått under henvisning til Forsøksdetaljer som følger. I tillegg er gjennom søknaden forskjellige publikasjoner angitt.

EKSEMPEL 1

MATERIALER OG METODER

Celledyrkning og reagenser

A2780-celler (ATCC) ble dyrket i RPMI 1640-medium supplementert med 10% FCS, 2 mM L-glutamin og gentamycin ved 37°C i en fuktig inkubator med 5% C02. HCT116-celler (ATCC) ble dyrket i McCoy's 5a medium supplementert med 10% FCS, 2 mM L-glutamin og gentamycin ved 37°C i en fuktig inkubator med 5% C02. Alle celledyrkningsoppløsninger er fremskaffet av Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). Andre materialer er fremskaffet av Nunc.

Fremstilling av et 4500 kb p21 promoterfragment og 1300 kb p21 promoterfragment

Genomisk DNA ble ekstrahert fra voksende A2780-celler og brukt som templat for nestet PCR-isolering av p21-promoteren. Den første amplifikasjon ble utført i 20 cykler ved en sammenkoblingstemperatur på 55°C ved å bruke oligonukleotidparet

GAGGGCGCGCGGTGCTTGG (SEQ ID NO. 2) og TGCCGCCGCTCTCTCACC (SEQ ID

NO. 3) med det genomiske DNA som templat. Det resulterende 4,5 kb fragment inneholdende -4551 til +88 fragmentet i forhold til TATA-boksen, ble re-amplifikert med oligonukleotidene TCG GGTACCGAGGGGCGCGGTGCTTGG (SEQ ID NO. 6) og ATA CTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC (SEQ ID NO. 7) i 20 cykler med sammenkob-ling ved 88°C, noe som resulterer i et 1,3 kb-fragment inneholdende -1300 til +88 fragmentet i forhold til TATA-boksen. Restriksjonssetene Xhol og Kpnl som er til stede i oligonukleotidene (understreket sekvens) ble brukt for subkloning.

P21 promoterkonstruksjon

Luciferase-reporteren ble fjernet fra pGL3-basic og erstattet med ZsGreen-reporteren (fra pZsGreen-Nl-plasmidet) ved Kpnl og Xbal restriksjonssetene. pGL3-basic-ZsGreen-1300 ble konstruert via innsetting av det ovennevnte 1,3 kb fragment av det humane p21 promoterområde inn i pGL3-basic-ZsGreen ved Xhol-og Kpnl-setene. Alle restriksjonsenzymer er fremskaffet av Boehringer Mannheim (Tyskland).

Transient transfeksjon og stabil transfeksjon

A2780-celler ble plassert i en 6-brønners plate ved en tetthet på 2xl0<5>celler, inkubert i 24 timer og transfektert medd 2 ug av pGL3-basic-ZsGreen-1300 og 0,2 ug av pSV2neo-vektoren ved å bruke Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Brussel, Belgia) som beskrevet av forhandler. De transfekterte celler ble selektert i 10 dager med G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) og enkeltcellesuspensjoner ble dyrket. Etter tre uker ble 80 enkle kloner oppnådd.

Induksjon av p21 promoteraktivitet

Det A2780-transfekterte materiale og de utvalgte 80 kloner ble ekspandert og sådd ut ved 1000 celler per brønn i 96-brønners-plater. 24 timer etter utsåing ble cellene behandlet i ytterligere 24 timer med målforbindelser (som påvirker spl-setene i den proksimale p21-promoterregion) eller DNA-skadende midler (som påvirker p53-responsive elementer). Etterfølgende ble celler fiksert med 4% PFA i 30' og motfarget med Hoechst-fargestoff. p21-promoteraktiveringen som fører til ZsGreen-produksjon og således fluorescens, ble overvåket av Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Brussel, Belgia) og med fluorescensmikroskop (Zeiss).

In vivo- evaluering

Den utvalgte klon ble injiserte subkutant (10<7>celler/200ul) i siden på nakne mus og en passer-målbar tumor ble oppnådd etter 12 dager. Fra og med dag 12 ble dyr dosert oralt daglig i løpet av 6 dager med oppløsningsmiddel, 20 mpk Mitsui (under navnet MS-275 - Shering - registreringsnummer 209783-80-2) eller 40 mpk JNJX (henholdsvis 10, 10 og 4 dyr). Tumorer ble vurdert for fluorescens med det lokalt utviklede Automated Whole Body Imaging System (fluorescent stereomikroskop type Olympus<®>SZX12 utstyrt med et GFP-filter og koblet til et CCD-kamera type JAI<®>CV-M90 kontrollert av en programpakke basert på IMAQ Vision Software fra National Instruments<®>).

RESULTATER

Induksjon av p21 1300 bp promoterfragment av HDAC- inhibitorer in vitro

A2780 stabilt transfektert sammenslått materiale og de utvalgte 80 kloner ble behandlet med TSA (IO<7>M), bleomycin (15 mU) og Mitsui (IO<6>M) som beskrevet i M&M. Av 80 kloner reagerte 6 kloner på TSA- og Mitsui-behandling. Fire av disse kloner viste så lav basal fluorescensekspresjon at det ikke var påviselig med Fluoroskan, men kunne bli valgt ut ved minimal evaluering av ZsGreen-produksjon ved å bruke fluorescensmikroskopet. De to andre kloner kunne bli målt og viste en 5 gangers induksjon med TSA (IO<7>) og en 1,2 - 1,5 ganger med Mitsui (IO<6>).

Disse 6 kloner ble evaluert i en doserespons overfor DNA-skadende midler (camp-totecin, bleomycin og doksorubicin) og HDAC-inhibitorer (TSA, Mitsui, forbindelse X og Saha). Klon 1 viste en 5 gangers induksjon som svar på IO"<7>TSA, 1,8 ganger på IO"<6>M Mitsui og 3 ganger på IO"<6>M JNJX (Figur 1). DNA-skadende midler var ikke i stand til å aktivere 1300 bp-fragmentet av p21-promoteren (Figur 1). Klon 5 viste identisk reaksjon (Figur 1). Induksjonen av klon 2, 3, 4 og 6 kunne ikke bli målt med Fluoroskan grunnet sensitivitetsproblemene hos systemet, men økning i fluorescens kunne bli synliggjort ved å bruke fluorescensmikroskopet (data ikke vist).

Induksjon av p21- promoter med HDAC- inhibitorer in vivo

Musene ble injisert med kloner 1, 2, 3 og 5 og dosert med forbindelse (oppløs-ningsmiddel, 20 mpk Mitsui eller 40 mpk JNJ'99) som beskrevet i M&M. Basal ZsGreen-ekspresjon og induksjon var for lav i klon 2 og 3 til å bli påvist med Automated Whole Body Imaging System. Basal fluorescens av klon 1 og 5 kunne bli målt og induksjon av ZsGreen var meget klar 3 dager etter administrasjon av den første dose og nådde et platå etter 5 dager (figur 2).

DISKUSJON

Det har blitt vist at flere kjente histon-deacetylase-inhibitorer så som TSA, Mitsui og SAHA induserer transaktivering av den murine p21<H>,<a/T>'<c>'<pI->promoter via -60 bp til +40 bp-regionen i forhold til TATA-boksen. Denne region er til stede i foreliggende p21wafI, cipI 1300 bp promoterkonstrukt. Foreliggende data bekrefter at disse materialer induserer ZsGreen-produksjon i de pGL3-basic-ZsGreen-1300-transfekterte A2780-celler in vitro. DNA-skadende midler (Campthotecin, bleomycin og doksorubicin) utøver sin aktivitet via p53-avhengig regulering av p21H,a/T'c'pJ-promoteren. De p53-responsive elementer ligger mer nedstrøms i p21<H>,<aff,c>",J-promoteren ved områder som ikke er til stede i 1300 bp-promoterfragmentet. Dette forklarer ikke-responsiviteten til systemet overfor DNA-skadende midler. Fra disse data blir det konkludert at foreliggende reportersystem fremskaffer en modell for å undersøke de molekylære hendelser som angår histondeacetylering og åpenbarer spesifisite-ten av reportersystemet in vitro. Dette konsept kan også bli brukt til å undersøke DNA-skadende midler spesifikt eller enhver annen droge ved å tilpasse det responsive element.

In wVo-virkningen av en forbindelse er mye mer kompleks og trenger arbeidskre-vende dyrestudier for å bestemme om forbindelsen kommer inn i sirkulasjonen, når tumoren i en aktiv form og om konsentrasjonen inne i tumoren er høy nok til å ut-øve sin biologiske aktivitet. Det har blitt vist i mer kompliserte PK/PD-studier at Mitsui-forbindelsen kan nå tumoren og at konsentrasjonen som blir nådd i tumoren er høy nok til å stoppe tumoren fra å vokse. I denne rapport vises det at Mitsui-forbindelsen induserer fluorescens i pGL3-basic-ZsGreen-1300-transfekterte A2780 xenografter etter 4 dager behandling, noe som implikerer at forbindelsen når tumoren og utøver sin biologiske aktivitet in vivo. Dette bekrefter at dette systemet er et meget kraftig in vivo verktøy som tillater raske og nøyaktige konklusjoner angå-ende aktivitet in vivo, noe som tillater forbindelser å bli evaluert ved tidligere tidspunkter i medikamentoppdagelsesprosessen uten å utføre tids- og forbindelseskrevende PK/PD-studier.

EKSEMPEL 2

MATERIALER OG METODER

Celledyrkning og reagenser

A2780-celler (ATCC) ble dyrket i RPMI 1640-medium supplementert med 10% FCS, 2 mM L-glutamin og gentamycin ved 37°C i en fuktig inkubator med 5% C02. HCT116-celler (ATCC) ble dyrket i Mccoy's 5a-medium supplementert med 10% FCS, 2 mM L-glutamin og gentamycin ved 37°C i en fuktig inkubator med 5% C02. Alle cellekulturoppløsninger er fremskaffet av Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). Andre materialer er fremskaffet av Nunc.

Produksjon av et p53- responsivt element

De følgende oligo p53RE fremadrettet

p53RE revers

TCGAGCCCAGGCAAGTCCAGGCAGGGTCGACCCAGGCAAGTCCAGGCAGGGAGCT (SEQ

ID NO: 9) ble bestilt fra Eurogentec. Oligonukleoitodparet ble sammenkoblet med en trinnvis senkning av sammenføringstemperaturen hvert 5. minutt ved å starte ved 65°C over 50°C, 40°C, 30°C til en sluttemperatur på 20°C i sammenkoblingsbuf-fer (150 mM tris pH 7,6, 15 mM MgCI2, 23 mM DTT). Et fragment med Sacl/Xhol-overheng for kloningsformål ble dannet (responsivt element er understreket sekvens) (SEQ ID NO. 10):

Konstrukt

Luciferasereporteren ble fjernet fra pGL3-basic og erstattet med ZsGreen-reporteren (fra pZsGreenl-Nl-plasmidet) ved Kpnl og Xbal restriksjonssetene. Den minimale HSV-TK-promoter (tymidinkinase basal promoter av herpes simplex-viruset) ble oppnådd med PCR, pTK Luc-plasmidet (Clontech #6252-1) ble brukt som templat. Primere ble utformet for å amplifikere den minimale HSV-TK-promoter sammen med det multiple kloningssete av pTK Luc-plasmidet. Amplifike-ringen ble utført i 30 cykler ved en sammenkoblingstemperatur på 58°C ved å bruke oligonukleotidparet GTACC GAGCTCTTACGCGTG (SEQ ID NO. 11) og G TGGATCCCTGCTTCATCCCCGTGGC (SEQ ID NO. 12) med plasmidet som templat. Expanded High Fidelity PCR-systemet var fremskaffet av Roche. Restriksjonssetene SacI og BamHI som er til stede i oligonukleotidsekvensene (understrekt sekvens), ble brukt til subkloning. Via innsetting av det ovennevnte 197 bp PCR-fragment i pGL3-basic-ZsGreenl-Nl ved SacI/Bglll-setene ble konstruktet TK/pGL3-basic-ZsGreen konstruert. Alle restriksjonsenzymer er fremskaffet av Roche (Tyskland). Det p53-responsive element ble så klonet i Sacl/Xhol kloningssetene av TK/GL3-basic-ZsGreen-vektoren foran TK-promoteren for å oppnå konstruktet p53RE_TK/pGL3-basic-ZsGreen (Fig. 6).

Stabil transfeksjon

A2780-celler og HCT116-celler ble utsådd i en 6-brønners plate ved en tetthet på 4xl0<5>celler, inkubert i 24 timer og transfektert med 2ug av p53RE_TK/pGL3-basic-ZsGreen og 0,2 ug av pMCI-neo-Poly A-vektor ved å bruke Lipofectamine og Plus Reagent (Invitrogen, Brussel, Belgia) som beskrevet av forhandler. De transfekterte cellene ble selektert i 16 dager med G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) og enkeltcellesuspensjoner ble dyrket. Etter tre uker ble 60 enkle kloner oppnådd fra de transfekterte HCT116-celler og 40 enkle kloner ble oppnådd fra de transfekterte A2780-celler.

Induksjon av p53RE_ tk- aktivitet

A2780 og HCT116 transfektert sammenslått materiale og de utvalgte kloner ble ekspandert og utsådd ved 20000 celler per brønn i 96-brønners-plater. 24 timer etter utsåing ble cellene behandlet i ytterligere 24 timer med DNA-skadende midler (som påvirker p53-responsive elementer). p53RE_tk-aktiveringen som fører til ZsGreen-produksjon og således fluorescens, ble overvåket med Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Brussel, Belgia) og med fluorescensmikroskop (Zeiss).

RESULTATER

Induksjon av p53RE_ tk av et DNA- skadende materiale in vitro

HCT116 og A2780 stabilt transfektert sammenslått materiale og de utvalgte kloner ble behandlet med actinomycinD (10 ng/ml). Av de utvalgte kloner reagerte 6 HCT116-kloner og 2 A2780-kloner på actinomycinD-behandling. Av disse 8 kloner var minst to ganger induksjon av fluorescens påviselig med Fluoroskan som svar på behandling. Spesielt A2780-klon 36 og HCT116-kloner 5 og 36 viste en påviselig lav basal fluorescensekspresjon med en sterk induksjonsfaktor som svar på acti-nomycin-behandling (Fig. 3).

Claims

1. Stabilt transformert tumorcelle som har blitt transfektert med en ekspresjonsvektor inneholdende et reportergen operativt knyttet til en promoter, hvor reportergenet består av et fluorescent protein, og hvor nevnte promoter består av et p21 promoterfragment definert ved SEQ ID NO. 1.

2. Tumorcelle ifølge krav 1, hvor de stabilt transformerte tumorceller består av stabilt transformerte ovariekarsinomceller eller kolorektale karsinomceller.

3. Tumorcelle ifølge krav 1 eller 2, hvor det fluorescente protein er valgt fra gruppen bestående av EGFP, EYFP, DsRed, ZsGreen, ZsYellow, HcRed eller destabiliserte fluorescente proteiner så som pDsRed, pHcRedl, pd2EGFP eller pd2EYFP.

4. Tumorcelle ifølge ethvert av kravene 1 til 3 deponert hos the Belgian Coordinated Collection of Microorganisms som pGL3-basic-ZsGreen-1300-clone 1 den 20. januar 2003 med deponeringsnummer LMBP 5958CB.

5. Tumorcelle ifølge ethvert av kravene 1 til 3 deponert hos the Belgian Coordinated Collection of Microorganisms som pGL3-basic-ZsGreen-1300-clone 2 den 20. januar 2003 med deponeringsnummer LMBP 5959CB.

6. Gnagermodell for screening av den farmasøytiske aktivitet av en forbindelse, hvor nevnte gnagermodell omfatter en stabilt transformert tumorcelle ifølge ethvert av kravene 1 til 5.

7. Gnagermodell ifølge krav 6, omfattende gnager hvor de stabilt transformerte tumorceller er kirurgisk implantert eller injisert under huden på gnageren.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en gnagermodell ifølge krav 6 eller 7 omfattende gnager, hvilken fremgangsmåte omfatter å administrere til nevnte gnager en mengde av celler ifølge ethvert av kravene 1 til 5 som er tilstrekkelig til å fremskaffe produksjon av en tumor i nevnte gnager.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor gnageren er genetisk immunokompro-mittert eller syngenisk med nevnte tumor.

10. In vitro fremgangsmåte for screening av en forbindelse for anti-neoplastisk aktivitet, omfattende trinnene å: sette tumorcellene ifølge ethvert av kravene 1 til 5 i kontakt med forbindelsen som skal testes; og måle ekspresjonen av reportergenet.

11. Fremgangsmåte for screening av en forbindelse for farmasøytisk aktivitet, omfattende trinnene å: tilveiebringe en gnager ifølge krav 6 eller 7 hvortil en potensielt aktiv forbindelse har blitt administrert; og vurdere effekten av nevnte forbindelse på tumorcellene ved å måle ekspresjonen av reportergenet.