JP2018130076A - 線虫を用いた物質の生理活性評価法 - Google Patents
線虫を用いた物質の生理活性評価法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018130076A JP2018130076A JP2017026712A JP2017026712A JP2018130076A JP 2018130076 A JP2018130076 A JP 2018130076A JP 2017026712 A JP2017026712 A JP 2017026712A JP 2017026712 A JP2017026712 A JP 2017026712A JP 2018130076 A JP2018130076 A JP 2018130076A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- nematode
- camp
- expressed
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 94
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 title abstract 3
- 210000001184 pharyngeal muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 31
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 4
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000244201 Caenorhabditis briggsae Species 0.000 claims description 3
- 241001441810 Caenorhabditis remanei Species 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 abstract description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 14
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 6
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 5
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100459320 Caenorhabditis elegans myo-2 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 3
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700038890 G-CaMP6 Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- ZJQHPWUVQPJPQT-UHFFFAOYSA-N muscimol Chemical compound NCC1=CC(=O)NO1 ZJQHPWUVQPJPQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- NVEPPWDVLBMNMB-SNAWJCMRSA-N 1-methyl-2-[(e)-2-(3-methylthiophen-2-yl)ethenyl]-5,6-dihydro-4h-pyrimidine Chemical compound CN1CCCN=C1\C=C\C1=C(C)C=CS1 NVEPPWDVLBMNMB-SNAWJCMRSA-N 0.000 description 1
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100124488 Caenorhabditis elegans ceh-22 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000019025 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026870 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001167795 Escherichia coli OP50 Species 0.000 description 1
- HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N Levamisole Chemical compound C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 102000008089 Myosin-Light-Chain Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010074596 Myosin-Light-Chain Kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 1
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000005260 alpha ray Effects 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940005529 antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000005250 beta ray Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 1
- 230000010196 hermaphroditism Effects 0.000 description 1
- BCGWQEUPMDMJNV-UHFFFAOYSA-N imipramine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 BCGWQEUPMDMJNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004801 imipramine Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960001614 levamisole Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960005121 morantel Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150000896 myo-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008855 peristalsis Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000001908 sarcoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011273 social behavior Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
ポンピング回数を目視でカウントする方法以外には、電気生理学的な手法を用いて測定する方法があるが、1匹ずつしか測定できず、また、測定操作に対する習熟度が要求される。さらに、計測装置の初期投資とともに消耗品も高価でコストがかかる。
Kerrらは、咽頭筋の筋細胞中に蛍光カルシウムプローブであるカメレオン(cameleon)を発現させ、カルシウムイオン濃度の変化を画像化したことを報告した(非特許文献5)。カメレオンは、4つのドメイン(CFP、カルモジュリン、M13(カルモジュリン結合ドメイン)およびYFP)から構成されるカルシウムプローブで、これにより咽頭筋のカルシウムイオンの変動を検出できる。しかし、カメレオン(YC2.1)による蛍光比の変化量は野生型株で4.31±0.16%と小さく(非特許文献5)、またカメレオンは、1波長励起2波長測光タイプであるため2波長を測定できる測定装置が必要でありコストがかかってしまう。さらに、カメレオンにはCFPとYFPの2つのGFP変異体が含まれることから、これらの蛍光タンパク質間等で組み換えが起こりやすく遺伝子が不安定になりやすい問題があり、カメレオンを導入した線虫を長期的に使用する際には注意を要する。
以上、発明者らは、実験結果から良好な結果を得られたため、薬剤のスクリーニング等に使えるという考えに至った。
(1)蛍光カルシウムプローブであるCaMPの1または複数が咽頭筋の筋肉細胞内で発現しているか、または発現可能な状態である線虫。
(2)前記CaMPが下記の(a)、(b)または(c)に示される蛍光カルシウムプローブからなるグループから選択される蛍光カルシウムプローブであることを特徴とする上記(1)に記載の線虫。
(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12および配列番号14で表されるアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ、
(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12および配列番号14で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ、
(c)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12および配列番号14で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ
(3)前記線虫が、C. elegans、C. briggsaeまたはC. remaneiであることを特徴とする上記(1)または(2)に記載の線虫。
(4)下記の(a)および(b)の工程を含む、試験物質の生理活性を評価する方法。
(a)上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の線虫と試験物質を接触させる工程、
(b)前記線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程
(5)下記の(c)および(d)の工程をさらに含む、上記(4)に記載の方法。
(c)上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程、
(d)前記工程(c)のカウント数と上記(4)の工程(b)のカウント数と比較する工程
(6)下記の(a)および(b)の工程を含む、生体への放射線の影響を調べる方法。
(a)上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の線虫に放射線を照射する工程、
(b)前記線虫の咽頭筋で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程
(7)下記の(c)および(d)の工程をさらに含む、上記(6)に記載の方法。
(c)上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程、
(d)前記工程(c)のカウント数と上記(4)の工程(b)のカウント数と比較する工程
本発明の実施形態で使用される線虫の種類は、遺伝子操作が容易なものであれば、いかなるものであっても使用可能であり、例えば、C. elegans、C. briggsaeまたはC. remaneiなどを挙げることができ、好ましくは、C. elegansである。
また、本明細書中、蛍光カルシウムプローブとは、カルシウムが結合すると蛍光強度が変化するタンパク質のことである。本発明においては、蛍光カルシウムプローブとしてCaMPが使用される。上述のとおり、CaMPは、発明者らによって開発された蛍光カルシウムプローブで、カルシウムイオンと結合することで、その蛍光特性(例えば蛍光強度)が変化する特徴を有しており、例えば、細胞内におけるカルシウムイオン濃度の変化を検出するために使用することができる。CaMPの例として、(a)配列番号2(G-CaMP2)、配列番号4(G-CaMP4)、配列番号6(G-CaMP6)、配列番号8(G-CaMP7)、配列番号10(G-CaMP8)、配列番号12(R-CaMP1.07)および配列番号14(R-CaMP2)で表されるアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ、(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12および配列番号14で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ、(c)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12および配列番号14で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ、を挙げることができる。CaMPとして、特に好ましくは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10または配列番号12で表されるアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブである。
なお、本明細書中、単に「CaMP」と記載したときは、CaMPタンパク質のことを表す。
また、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な実験条件である。通常、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度は高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。核酸同士のハイブリッドの形成は、相補鎖がその融点よりやや低い環境において再アニールする能力に依存する。より具体的に述べると、低ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、37℃〜42℃の温度条件の下、5×SSC(1倍濃度のSSC溶液(1×SSC)の組成は、例えば、150mmol/L 塩化ナトリウムおよび15mmol/L クエン酸ナトリウムである)、0.1%SDS溶液中で洗浄する条件などを挙げることができる。また、高ストリンジェントな条件とは、例えば、洗浄段階において、60℃〜70℃、好ましくは65℃の温度条件の下、0.1×SSC、0.1%SDS中で洗浄する条件などが挙げられる。さらに、温度を上げる等のストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高い核酸を得ることができる。
なお、本明細書において、「発現可能な状態」には、CaMPが恒常的に発現している状態のみならず、例えば、熱ショックプロモーター等の誘導的なプロモーターにより、所望の時期にCaMPが発現可能な状態でCaMPをコードするDNAが細胞内に導入されている状態も含まれる(参考文献 Bacaj T and Shaham S: Temporal Control of Cell-Specific Transgene Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics 176: 2651-2655, 2007.)。
(a)第1の実施形態にかかる線虫と試験物質を接触させる工程、
(b)前記線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程
すなわち、下記の(a)〜(d)の工程を含む、試験物質の生理活性を評価する方法も本発明の第2の実施形態に含まれる。
(a)第1の実施形態にかかる線虫と試験物質を接触させる工程、
(b)前記線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程、
(c)第1の実施形態にかかる線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程、
および
(d)前記工程(c)のカウント数と工程(b)のカウント数を比較する工程
以上のように、線虫の咽頭筋のポンピングは試験物質の生体への影響評価する上で非常に有効である。
本発明の線虫はポンピングを行う度に、蛍光強度が変化するため、この蛍光強度の変化の回数をポンピングの回数として検出することができる(蛍光強度の1ピークの数をポンピングの数とすることができる。実施例参照のこと)。
従って、例えば、単位時間あたりの蛍光強度の変化の回数が、試験物質の有無で異なる場合には、試験物質により線虫の咽頭筋の運動に何らかの影響が及ぼされたと判断することができる。
(a)第1の実施形態にかかる線虫に放射線を照射する工程、
(b)前記線虫の咽頭筋で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程
本発明の第3の実施形態にかかる方法は、第1の実施形態にかかる線虫をモデル生物とし、その咽頭筋のポンピング回数に対する放射線の影響を調べ、その結果に基づいて、生体に与える放射線の影響を評価する方法である。放射線の影響の有無は、放射線を照射していない第1の実施形態にかかる線虫のポンピング回数と比較することで評価することができる。
すなわち、下記の(a)〜(d)の工程を含む、生体への放射線の影響を調べる方法も本発明の第3の実施形態に含まれる。
(a)第1の実施形態にかかる線虫に放射線を照射する工程、
(b)前記線虫の咽頭筋で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程、
(c)第1の実施形態にかかる線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程、
および
(d)前記工程(c)のカウント数と工程(b)のカウント数を比較する工程
ここで「放射線」とは、高い運動エネルギーをもって流れる物質粒子(イオン、電子、中性子、陽子および中間子などの粒子放射線で、α線、β線、電子線、陽子線、中性子線および重粒子線など)と高エネルギーの電磁波(γ線、X線などの電磁放射線)のことであり、特に限定はされない。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
G-CaMP2(配列番号2)を発現するトランスジェニック線虫の作成は、マイクロインジェクション法(Mello et al., EMBO J. 10, 3959-3970, 1991)に従って行った。この方法は、線虫雌雄同体の成虫の生殖巣にDNA溶液をマイクロインジェクションすることにより形質転換を行うものである。実験装置は以下のものを用いた。
実験装置
(1)実体顕微鏡:線虫のマウントに用いた。0.7-15倍程度の倍率で観察しながら、線虫をアガーパッド(スライドガラスに寒天を薄く伸ばしたもの)上にマウントした。
(2)倒立顕微鏡:線虫のマイクロインジェクションに用いた。線虫の移動をスムーズに行うために、グラインドタイプのステージを装着した。対物レンズは微分干渉用レンズ、40倍と低倍率4倍(針と線虫を近づけるため)を用いた。
(3)ニードルプラー:ガラス管を熱して細く引き、マイクロインジェクション用の針を作成した。
(4)マニピュレーター:倒立顕微鏡のステージに取り付けてマイクロインジェクション用の針を操作する装置である。
(5)マイクロインジェクションマニピュレーター:マイクロインジェクションの際の圧力を制御する装置である。
宿主となる線虫は、C. elegans野生型N2株を用いた。マイクロインジェクション用のガラス針にDNAを注入し、マイクロインジェクションマニピュレーターにセットした。雌雄同体の成虫をアガーパッドにマウントし、すみやかに生殖巣にガラス針を挿入し、DNAを生殖巣内に注入した。注入後、虫を回収し、線虫用の培養用固形培地(NGM培地)で培養した。マイクロインジェクションから3-4日後に、CaMPの蛍光やマーカー(主に蛍光)を指標にして形質転換体(F1)を識別して分離し、新しいNGM培地で培養した。さらに3-4日後に形質転換体(F2)を選別し、CaMPの蛍光やマーカーの発現が伝達しているトランスジェニックラインを得た。この方法で得られるトランスジェニック線虫は、染色体外DNAアレイをもつ細胞ともたない細胞の2種類の細胞を体内に持つキメラ体である(Exライン)。そこで、UV法に従い(Mitani Development Growth & Differentiation 37 (5) 551-557,1995)、CaMPを安定に発現するトランスジェニックライン(Isライン)を作成した。この方法は、短波長の紫外線(254nm)をExラインに照射してDNAの組み換えを惹起し、DNAアレイを染色体内に挿入するものである。Isラインは、さらに野生型株(N2)と数回戻し交配を行った。得られたトランスジェニック線虫は、解析に用いるとともに、凍結ストックを作成して保管した。
マイクロインジェクションに用いたG-CaMP4の発現ベクターは、以下のように構築した。
pFX_EGFPTベクターに制限酵素NotIとBglIIを加えて37度で2時間反応させた後、反応物を1%アガロースにて電気泳動した。電気泳動後、ゲル撮影装置にてゲル上でのDNA断片の位置を確認し、ゲル断片を切り出した。ゲルからのDNA断片の回収はMagExtractor PCR & Gel Cleanup kit(東洋紡ライフサイエンス事業部)または、FastGene Gel/PCR Extraction kit(日本ジェネティクス)を用い、キットのマニュアルに従って操作を行い、EGFP部分を含まないベクター断片を得た。G-CaMP4のDNA断片は以下の方法で調整した。pN1-G-CaMP4ベクターをテンプレートとして用いてPCR法により5’末端側にNotIサイト、3’末端側にBglIIサイトを付加した。PCR反応には以下のプライマーペアを用いた。
GCaMP4#F1: 5'-TGCGGCCGCATGCGGGGTTCTCATCATCA-3'(配列番号15)
GCaMP4#R2: 5'-TAGATCTTCACTTCGCTGTCATCATTTG-3'(配列番号16)
PCR反応後、反応液を1%アガロースゲルを用いて電気泳動し、MagExtractor PCR & Gel Cleanup kitまたは、FastGene Gel/PCR Extraction kitを用い、増幅したPCR産物を回収した。回収したPCR産物はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック)を用いて、キットのマニュアルに従って操作を行い、pCR Blunt IIベクター(サーモフィッシャーサイエンティフィック)にサブクローニングした。サブクローニングしたDNAの大腸菌からの抽出にはPlasmid mini prep kit(キアゲン)またはFastGene(登録商標)プラスミドミニキット(日本ジェネティクス)を用い、キットのマニュアルに従って操作を行った。PCR増幅したG-CaMP4のDNA配列の確認はDNAシーケンシング(GenomeLab DTCS Quick Start Kit ベックマンコールター)を用いて確認した。PCR増幅したG-CaMP4を持つpCR Blunt IIベクターに制限酵素NotIとBglIIを加えて37度で2時間反応させた後、MagExtractor PCR & Gel Cleanup kitまたは、FastGene Gel/PCR Extraction kitを用い、DNA(G-CaMP4 cDNA)をゲルから回収した。DNA Ligation kit ver 2.1 (タカラバイオ)を用いて、キットのマニュアルに従って操作を行い、NotI/BglIIで切断したEGFP部分を含まないpFX_EGFPTベクターと、NotI/BglIIで切断したG-CaMP4のPCR産物を結合させた。
Ligation反応物はOne shot Top10 chemically competent E. coliにまたはDH5αchemically competent E. coli(タカラバイオ)にトランスフェクションし、上記と同様の方法によりプラスミドを回収し、G-CaMP発現用プラスミドPmyo-2::G-CaMPを得た。
スライドガラスに3%寒天を薄く延ばして敷いたアガーパッドを作成した。このアガーパッドに咽頭筋にCaMPを発現する線虫を載せ、さらにカバーガラスを載せるかまたは載せないで観察した。4倍または10倍対物レンズを用いてレーザー顕微鏡(A1RMP ニコン)の共焦点モードで15枚〜30枚/秒(512x512ピクセルサイズ)でタイムラプス撮影した。488nmのレーザーを励起光として用いて、蛍光画像、透過光画像を撮影した。撮影後、画像解析ソフト(NIS Elements ニコンインステック)を用いたオフライン解析した。線虫の咽頭筋部分に関心領域(ROI)をとり、蛍光輝度を測定して、その時間変化をグラフ化した。
上記のPmyo-2::G-CaMPベクターを野生型線虫N2に形質導入した結果、咽頭筋内においてCaMPの発現が確認された(図1左)。このC. elegansの咽頭から得られるCaMPの蛍光を蛍光顕微鏡(レーザー共焦点顕微鏡)で測定したところ、咽頭筋の収縮運動に呼応して、蛍光強度変化が観察された(図1右)。また、蛍光測定は、蛍光顕微鏡(FN1 ニコンインステック)に装着した研究用高感度cMOSカメラ(ORCA-Flash 4.0 浜松ホトニクス)でも行う事が可能であった。
Claims (7)
- 蛍光カルシウムプローブであるCaMPの1または複数が咽頭筋の筋肉細胞内で発現しているか、または発現可能な状態である線虫。
- 前記CaMPが下記の(a)、(b)または(c)に示される蛍光カルシウムプローブからなるグループから選択される蛍光カルシウムプローブであることを特徴とする請求項1に記載の線虫。
(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12および配列番号14で表されるアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ、
(b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12および配列番号14で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ、
(c)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12および配列番号14で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる蛍光カルシウムプローブ - 前記線虫が、C. elegans、C. briggsaeまたはC. remaneiであることを特徴とする請求項1または2に記載の線虫。
- 下記の(a)および(b)の工程を含む、試験物質の生理活性を評価する方法。
(a)請求項1ないし3のいずれかに記載の線虫と試験物質を接触させる工程、
(b)前記線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程 - 下記の(c)および(d)の工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
(c)請求項1ないし3のいずれかに記載の線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程、
(d)前記工程(c)のカウント数と請求項4の工程(b)のカウント数を比較する工程 - 下記の(a)および(b)の工程を含む、生体への放射線の影響を調べる方法。
(a)請求項1ないし3のいずれかに記載の線虫に放射線を照射する工程、
(b)前記線虫の咽頭筋で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程 - 下記の(c)および(d)の工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
(c)請求項1ないし3のいずれかに記載の線虫内で発現しているCaMPからの蛍光強度変化数をカウントする工程、
(d)前記工程(c)のカウント数と請求項4の工程(b)のカウント数を比較する工程
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017026712A JP7045680B2 (ja) | 2017-02-16 | 2017-02-16 | 線虫を用いた物質の生理活性評価法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017026712A JP7045680B2 (ja) | 2017-02-16 | 2017-02-16 | 線虫を用いた物質の生理活性評価法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018130076A true JP2018130076A (ja) | 2018-08-23 |
JP7045680B2 JP7045680B2 (ja) | 2022-04-01 |
Family
ID=63247154
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017026712A Active JP7045680B2 (ja) | 2017-02-16 | 2017-02-16 | 線虫を用いた物質の生理活性評価法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7045680B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117204398A (zh) * | 2023-08-29 | 2023-12-12 | 华南农业大学 | 一种基于秀丽线虫模型评价蛋清蛋白多肽抗氧化、抗衰老的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002531115A (ja) * | 1998-12-07 | 2002-09-24 | デフヘン・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 表現型プロフィールのライブラリーを構築する方法 |
JP2011125318A (ja) * | 2009-12-21 | 2011-06-30 | Saitama Univ | 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質またはそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質 |
JP2012085542A (ja) * | 2010-10-15 | 2012-05-10 | Saitama Univ | 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質又はそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質 |
WO2015088039A1 (ja) * | 2013-12-10 | 2015-06-18 | 国立大学法人九州大学 | 線虫の嗅覚を用いた癌検出法 |
-
2017
- 2017-02-16 JP JP2017026712A patent/JP7045680B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002531115A (ja) * | 1998-12-07 | 2002-09-24 | デフヘン・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 表現型プロフィールのライブラリーを構築する方法 |
JP2011125318A (ja) * | 2009-12-21 | 2011-06-30 | Saitama Univ | 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質またはそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質 |
JP2012085542A (ja) * | 2010-10-15 | 2012-05-10 | Saitama Univ | 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質又はそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質 |
WO2015088039A1 (ja) * | 2013-12-10 | 2015-06-18 | 国立大学法人九州大学 | 線虫の嗅覚を用いた癌検出法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
NEURON, vol. 26(3), JPN6020050575, 2000, pages 583 - 94, ISSN: 0004671242 * |
PLOS ONE, vol. Volume 7,Issue 12, JPN6020050576, 2012, pages 51286, ISSN: 0004671243 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117204398A (zh) * | 2023-08-29 | 2023-12-12 | 华南农业大学 | 一种基于秀丽线虫模型评价蛋清蛋白多肽抗氧化、抗衰老的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7045680B2 (ja) | 2022-04-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7111791B2 (ja) | 線虫の嗅覚を用いた癌検出法 | |
Dewan et al. | Single olfactory receptors set odor detection thresholds | |
Chen et al. | Heritable expansion of the genetic code in mouse and zebrafish | |
Calixto et al. | Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1 | |
Zhang et al. | SUMO modification is required for in vivo Hox gene regulation by the Caenorhabditis elegans Polycomb group protein SOP-2 | |
Rieckher et al. | Maintenance of proteostasis by P body-mediated regulation of eIF4E availability during aging in Caenorhabditis elegans | |
Adikes et al. | Visualizing the metazoan proliferation-quiescence decision in vivo | |
Langenau et al. | Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish | |
Mendenhall et al. | Single cell quantification of reporter gene expression in live adult Caenorhabditis elegans reveals reproducible cell-specific expression patterns and underlying biological variation | |
Roberts et al. | Defining components of the ßcatenin destruction complex and exploring its regulation and mechanisms of action during development | |
Li et al. | P5A ATPase controls ER translocation of Wnt in neuronal migration | |
Shaffer et al. | SALSA, a genetically encoded biosensor for spatiotemporal quantification of Notch signal transduction in vivo | |
JP7045680B2 (ja) | 線虫を用いた物質の生理活性評価法 | |
Wu et al. | Development of a heat shock inducible gfp transgenic zebrafish line by using the zebrafish hsp27 promoter | |
Askjaer et al. | Modern tools to study nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in Caenorhabditis elegans | |
Haeussler et al. | Methods to Study the Mitochondrial Unfolded Protein Response (UPR mt) in Caenorhabditis elegans | |
D’Souza et al. | The MADD-3 LAMMER kinase interacts with a p38 MAP kinase pathway to regulate the display of the EVA-1 guidance receptor in Caenorhabditis elegans | |
ES2368328T3 (es) | Modelo de roedor para la rápida identificación de compuestos activos farmacéuticos in vivo. | |
Lant et al. | Induction of germline apoptosis in Caenorhabditis elegans | |
Fischer et al. | Optogenetic applications in the nematode Caenorhabditis elegans | |
Palmisano et al. | RNAi-mediated inactivation of autophagy genes in Caenorhabditis elegans | |
JP6124442B2 (ja) | Dnaカセット、ベクター、形質転換細胞、形質転換動物、機能性遺伝子発現動物及び解析装置 | |
Lee et al. | C. elegans REMO-1, a glial GPCR, regulates stress-induced nervous system remodeling and behavior | |
CN108495928A (zh) | 用于从细胞获得指示剂信号的方法 | |
Martinez et al. | A water-soluble, synthetic auxin analog for rapid degradation of target proteins during C. elegans development |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200205 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20200311 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20200311 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210104 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20201225 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210302 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210503 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210525 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210823 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20210823 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20210823 |
|
C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20210927 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20211101 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20211102 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220208 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220308 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220314 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7045680 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |