NO334018B1 - Promoter til IL-18BP, dens fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår promoteren til interleukin-18-bindende protein (IL-18BP), til dens fremstilling og anvendelse.

Cytokinbindende proteiner (oppløselige cytokinreseptorer) er vanligvis de ekstracellulære ligandbindende domenene til de respektive

overflatecytokinreseptorene. De blir fremstilt enten ved alternativ spleising eller ved proteolytisk avspaltning fra celleoverflatereseptoren. Disse oppløselige reseptorene er beskrevet tidligere: For eksempel den oppløselige reseptoren for IL-6 og IFNy (Novick et al. 1989), TNF (Engelmann et al. 1989 og Engelmann et al. 1990), IL-1 og IL-4 (Maliszewski et al. 1990) og IFNa/p (Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). Et cytokinbindende protein, kalt osteoprotegerin (OPG, også kjent som osteoklastinhibitorisk faktor - OCIF), et medlem av TNFR/Fas-familien, synes å være det første eksempelet på en oppløselig reseptor som bare eksisterer som et sekrert protein (Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998).

Et interleukin-18-bindende protein (IL-18BP) ble affinitetsrenset på en IL-18-kolonne fra urin (Novick et al. 1999). IL-18BP opphever IL-18-induksjon av IFNy og IL-18-aktivering av NF-kB in vitro. I tillegg inhiberer IL-18BP induksjon av IFNy i mus injisert med LPS. IL-18BP-genet var lokalisert til det humane kromosom 11, og intet ekson som koder for et transmembrant domene kunne finnes i den 8,3 kb genomiske sekvensen som omfatter IL-18BP-genet. Fire isoformer av IL-18BP generert ved alternativ mRNA-spleising er blitt funnet hos mennesker til nå. De ble betegnet IL-18BP a, b, c og d, hvor alle deler det samme N-terminus og er forskjellig i C-terminus (Novick et al. 1999).

Disse isoformene varierer i sin evne til å binde IL-18 (Kim et al. 2000). Av de fire humane IL-18BP (hIL-18BP) -isoformene er a og c kjent for å ha en nøytraliserende kapasitet for IL-18. Den mest vanlige IL-18BP-isoformen, den spleisede variantisoformen a, utviser en høy affinitet for IL-18 med en hurtig på-hastighet og en langsom av-hastighet, og en dissosiasjonskonstant (Kd) på omtrent 0,4 nM (Kim et al. 2000). IL-18BP er konstitutivt uttrykt i milten (Novick 1999) og sirkulerer med plasmakonsentrasjoner på 2,5 ng/ml (Novick et al. 2001). Restene involvert i interaksjonen til IL-18 med IL-18BP er blitt beskrevet gjennom anvendelsen av datamaskinmodellering (Kim et al. 2000) og basert på interaksjonen mellom det lignende proteinet IL-1J3 med IL-1R type I (Vigers et al. 1997). I henhold til modellen for IL-18-binding til IL-18BP, har Glu-resten i stilling 42 og Lys-resten i stilling 89 på IL-18 blitt foreslått i binde seg til henholdsvis Lys-130 og Glu-114 i IL-18BP (Kim et al. 2000).

Som nevnt induserer IL-18 IFNy som i sin tur nylig ble rapportert å indusere IL-18BPa mRNA-dannelse in vitro (Muhl et al. 2000). Derfor kunne IL-18BPa tjene som et "avslåings"-signal som avslutter den inflammatoriske responsen. IL-18BP er signifikant homologt til en familie av proteiner som er kodet av flere Poxvira (Novick et al. 1999, Xiang og Moss 1999). Inhibering av IL-18 ved dette formodede virale IL-18BP kan svekke den inflammatoriske antivirale Thl-responsen.

Serum IL-18BP er signifikant hevet ved sepsis, noe som angir dets rolle ved regulering av immunresponser in vivo (Novick et al. 2001). IL-18BP er virkelig indusert av IFNy i forskjellige celler, noe som antyder at det tjener som en negativ feedbackinhibitor til IL-18-mediert immunrespons (Mughl et al. 2000).

Foreløpige resultater indikerer at IL-18BP mRNA blir detektert i leukocytter, kolon, tynntarmen, prostata og spesielt i leverceller (Novick et al. 1999). Komponentcellene i milten består av makrofager, lymfocytter og plasmaceller med ytterligere celler avledet fra sirkulasjonen.

Aktiviteten til elementer som kontrollerer transkripsjon, promoter og forsterkere (enhancers) varierer betydelig blant forskjellige celletyper. Promotere og forsterkere består av korte oppstillinger av DNA-sekvenser som interagerer spesifikt med cellulære proteiner involvert i transkripsjon (gjennomgått i Dynan og Tjian 1985, McKnight og Tjian 1986, Sassone-Corsi og Borelli 1986 og Maniatis et al. 1987). Kombinasjonen av forskjellige gjenkjennelsessekvenser og mengden av de kognate transkripsjonsfaktorene bestemmer effektiviteten med hvilken et gitt gen blir transkribert i en spesiell celletype. Mange eukaryote promotere inneholder to typer av gjenkjennelsessekvenser: TATA-boks og oppstrøms promoterelementer. TATA-boksen, lokalisert 25-30 bp oppstrøms for transkripsjonsinitieringssetet er ment å være involvert i å styre RNA-polymerase II til å begynne RNA-syntese på korrekt sete. I kontrast til dette bestemmer de oppstrøms promoterelementene hastigheten med hvilken transkripsjon blir initiert. Forsterkerelementer kan stimulere transkripsjon opptil 1000 ganger fra koblede homologe eller heterologe promotere. I motsetning til oppstrøms promoterelementer, er imidlertid forsterkere aktive når de plasseres nedstrøms fra transkripsjonsinitieringssetet eller i en betydelig avstand fra promoteren. Mange forsterkere til cellulære gener arbeider eksklusivt i et spesielt vev eller celletype (gjennomgått av Voss et al. 1986, Maniatis et al. 1987). I tillegg blir noen forsterkere aktive bare under spesielle betingelser som blir dannet ved nærværet av en induser, så som et hormon eller metallion (gjennomgått av Sassone-Corsi og Borelli 1986 og Maniatis 1987). På grunn av disse forskjellene i cellespesifisitetene for cellulære forsterkere, vil valget av promoter- og forsterkerelementer som skal inkorporeres i en eukaryot ekspresjonsvektor bli bestemt av celletypene hvori det rekombinante genet skal uttrykkes. I motsatt fall kan anvendelsen av en prefabrikkert vektor som inneholder en spesifikk promoter og cellulær forsterker alvorlig begrense celletypene i hvilke ekspresjon kan oppnås. Mange forsterkerelementer avledet fra virus har et bredere vertsområde og blir aktive i en rekke forskjellige vev, skjønt signifikante kvantitative forskjeller er observert blant de forskjellige celletypene. For eksempel er SV40 tidlig forsterker promiskuøst aktivt i mange celletyper avledet fra en rekke forskjellige pattedyrarter og vektorer som inkorporerer denne forsterkeren har følgelig blitt anvendt (Dijkema et al. 1985). To andre forsterker/promoterkombinasjoner som er aktive i et stort område av celler er avledet fra den lange repetisjonen (LTR) av Rous sarkom virusgenom (Gorman et al. 1982b) og fra humant cytomegalovirus (Boshart et al. 1985).

WO 9909063 beskriver cDNA-sekvenser som koder for IL-18BP.

Oppfinnelsen angår en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 1) eller et funksjonelt fragment, så som det i SEKV.ID. NR. 2 eller 3, eller et funksjonelt derivat derav hvori 3'-enden av nevnte DNA-sekvens eller fragment derav omfatter SEKV.ID. NR. 5.

Mer spesifikt kan et derivat i henhold til oppfinnelsen være DNA i henhold til oppfinnelsen mutert på ett eller flere API-seter som er tilstede i en ekspresjonsavbryter (silencer element) som er tilstede i sekvensen, og DNA-sekvensen kan ytterligere inneholde et gen som er operativt koblet til IL-18BP-promoteren.

I ett aspekt ved oppfinnelsen kan genet kode for eksempel IL-18BP eller et heterologt protein så som luciferase, interferon-beta, TNF, erytropoietin, vevsplasminogenaktivator, granulocyttkolonistimulerende faktor, mangansuperoksiddisputase, et immunoglobulin eller fragment derav, veksthormon, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR og TNF-reseptorbindende proteiner.

Oppfinnelsen tilveiebringer en vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren, en vertscelle som omfatter vektoren som for eksempel CHO-, WISH-, HepG2-, Cos-, CV-1-, HeLa- og Hakat U937-celler og en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein som omfatter å dyrke vertscellen og isolere det produserte rekombinante proteinet.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen en rekombinant virusvektor som omfatter en del av virusgenomet, et DNA-fragment som koder et gen av interesse og et DNA-fragment som omfatter en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren. Mer spesifikt kan virusdelen for eksempel være et adenoassosiert virus og et retrovirus så som HIV, HFV, MLV, FIV og VSV.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å regulere cellespesifikk ekspresjon av et gen av interesse, som omfatter å omforme en målpattedyrcelle med virusvektoren i henhold til oppfinnelsen i en målcelle så som hematopoietisk stamcelle og en monocytt. Genet av interesse kan for eksempel være et protein som gir resistens mot HIV-infeksjon. Regulering av cellespesifikk ekspresjon av et gen av interesse kan anvendes til behandlingen av for eksempel HIV-infeksjon, behandlingen av hematopoietiske lidelser så som SCID, kronisk granulomatøs sykdom og talassemi.

Det beskrives videre en fremgangsmåte, som ikke er en del av oppfinnelsen, for genterapi til behandlingen av en sykdom hos et individ som utviser hevede IFNy i et kroppsvev, som omfatter administrering av en effektiv mengde av virusvektoren i henhold til oppfinnelsen, eventuelt ytterligere å omfatte administrering av IL-6 og/eller TNF-a og/eller IRF og/eller C/EBPp-faktorer.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår transgene mus som har DNA-sekvensen som koder en DNA-sekvens i henhold til oppfinnelsen.

I tillegg lærer oppfinnelsen anvendelsen av en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 1) eller et fragment eller et funksjonelt derivat derav hvori 3'-enden av nevnte DNA-sekvens eller fragment derav omfatter SEKV.ID. NR. 5, til fremstilling av et legemiddel for behandlingen av en sykdom.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en farmasøytisk sammensetning som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 1) eller et fragment eller funksjonelt derivat derav, hvori 3'-enden av nevnte DNA-sekvens eller fragment derav omfatter SEKV.ID. NR. 5.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser en skjematisk representasjon av promoterregionen til IL-18BP-genet, inkludert de 5 regulatoriske elementene. Figur 2 viser kinetikkene til IL-18BP-induksjon og synergi med TNFa og IL-6. ( A) IFNy induserer IL-18BP på en dose- og tidsavhengig måte i humane WISH-celler. Cellene ble innkubert med de angitte konsentrasjonene av IFNy i 24 og 48 timer. ( B) Synergistiske virkninger av TNFa, IL-6 og deres kombinasjon på IFNy-indusert IL-18BP. HepG2-celler ble innkubert med de angitte kombinasjonene av IFNy (100 U/ml), TNFa (20 ng/ml) og IL-6 (300 U/ml). Induksjon av IL-18BP med hver kombinasjon var signifikant høyere (p < 0,05) enn induksjon av IFNy alene. Dataene er gjennomsnitt ± SD (n = 3 for A. n = 4 for B). Figur 3 viser en skjematisk representasjon av den konserverte ekson-intron-organiseringen av de humane og muse IL-18BP-genene. Det humane IL-18BPa-genet ble sammenlignet med IL-18BPd-genet fra mus. Eksoner er angitt.

Transkripsjonsstartsetet, translasjonsstartsetet (ATG), stoppkodon (Stopp) og polyadenyleringssignalet (PAS) er angitt for det humane IL-18BPa-genet. Figur 4 viser at induksjonen av IL-18BP med IFNy er på det transkripsjonene nivået og avhenger av de novo proteinsyntese. (4) Semikvantitativ RT-PCR av IL-18BP mRNA fra HepG2-celler som ble preinnkubert med aktinomycin D (1^g/ml, 30 min), vasket og inkubert med IFNy (100 U/ml) for de angitte tidene. RT-PCR av p-aktin mRNA er vist som en kontroll. ( B) Semikvantitativ RT-PCR av IL-18BP mRNA fra HepG2-celler som ble preinkubert med sykloheksimid (20^g/ml) og IFNy (100 U/ml) i de angitte tidsrom. Figur 5 viser den basale og IFNy-induserte aktiviteten til luciferase reportervektorer som bærer den humane IL-18BP-promoteren. Innskuddsstørrelse som strekker seg fra transkripsjonsstartsetet (+1) er gitt i parentesene. Innsirklede tall representerer de forskjellige responselementene: 1. GAS. 2. IRF-E. 3. C/EBP-E (2 seter). Transkripsjonsavbryter 5. Distal forsterker. Fylte firkanter viser mutasjon i et spesifikt responselement. HepG2-celler ble samtransfektert med den angitte reportervektoren og pSV40 PGAL. Alle luciferaseverdier ble normalisert til P-galaktosidaseaktivitet. ( A) Luciferaseaktivitet i ekstrakter fra uinduserte celler relativ til de cellene som er transfektert med pGL3 - basisvektor. ( B) Luciferaseaktivitet i celler transfektert med utvalgte vektorer og indusert med IFNy. Foldeinduksjon er over basalaktivitet som gitt i ( A). Figur 6 viser at IRF-1 er essensielt for IL-18BP-ekspresjon hos mus. Serum IL-18BP til C57B1/6 IRF-1"<7>" og kontroll C57Bl/6-mus som ble injisert intraperitonealt med murint IFNy (53000 u/mus). Musene ble blødd før injeksjon og 24 timer etter injeksjon. Serum IL-18BP ble bestemt ved ELISA. Data er gjennomsnitt ± SE (n = 6 for hver gruppe). Forskjellene mellom serum IL-18BP i kontroll og IRF-defekte mus, så vel som induksjonen av IL-18BP hos kontrollmus var statistisk signifikant (P<<>0,05). Figur 7 viser rollen til IRF-1 og C/EBPp i IL-18BP-geninduksjon og deres assosiasjoner. ( A) Elektroforetisk mobilitetsforskyvningsassay (EMSA eksempel 18) av dsDNA-prober som tilsvarer basene -33 til -75 (IRF-E, venstre panel) og -8 til -55 (GAS, høyre panel). HepG2-celler ble behandlet med IFNy i de angitte tidsrom og nukleære ekstrakter ble tillatt å reagere med IRF-E- eller GAS-probene. Forskjøvne bånd er angitt ved fylte pilhoder. GAS-komplekset ble også utsatt for superforskyvning med de angitte antistoffene. De superforskjøvne båndene er angitt med et åpent pilhode. ( B) Semikvantitativ RT-PCR av IL-18BP mRNA fra HepG2-celler som ble transfektert med de angitte kombinasjonene av IRF-1- eller C/EBPp-ekspresjonsvektorer. Der hvor det er angitt, ble IFNy tilsatt og cellene ble høstet 5 timer senere. Verdier ble normalisert til P-aktin mRNA. (Q Luciferaseaktivitet i

celler transfektert med luciferase reportervektor pGL3(1272) som inneholder den fullstendige IL-18BP-promoteren sammen med den angitte konsentrasjonen av pCDNA3-IRF-l (sirkler) og 1 ug/106 celler av pCDNA3-C/EBPp. Alternativt ble cellene transfektert med den angitte konsentrasjonen av pCDNA3-C/EBPp (firkanter) og 0,1^g/10<6>celler av pCDNA3-IRF-l. Luciferaseaktivitet ble normalisert ved pGal-aktiviteten. (£>) Immunoblot av nukleære og cytoplasmatiske ekstrakter (se eksempel 17 for fremstilling av ekstraktene) av celler behandlet med IFNy (100 U/ml, 2 timer). Ekstraktene ble immunoutfelt (IP) og immunoblottet (IB) med de angitte antistoffene.

Figur 8 viser faktorene som bindes til promoteren til IL-18BP etter IFNy-induksjon.

( A) EMSA med den proksimale C/EBPp E og hele celleekstrakter etter behandling med IFNy. Der hvor det er angitt, ble ekstraktene superforskjøvet med de angitte antistoffene. ( B) EMSA med en probe som tilsvarer den distale forsterkeren og hele celleekstrakter etter behandling med IFNy. Der hvor det er angitt, ble ekstraktene superforskjøvet med de angitte antistoffene, med eller uten konkurranse med dsDNA som tilsvarer den proksimale halvparten av proben. Forskjøvne bånd er angitt ved fylte pilhoder og superforskjøvne bånd er angitt ved åpne pilhoder.

Den foreliggende oppfinnelsen angår promoteren til humant IL-18BP. Denne promoteren driver den konstitutive ekspresjonen av IL-18BP i spesielle celler, for eksempel i monocytter og IFNy-mediert induksjon av IL-18BP-ekspresjon i mange celler. Promoteren til humant IL-18BP er i stand til å styre den konstitutive og IFNy-induserte ekspresjonen til et heterologt protein.

Oppfinnelsen angår en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 1) eller et fragment eller et funksjonelt derivat derav hvori 3'-enden av nevnte DNA-sekvens eller fragment derav omfatter SEKV.ID. NR. 5. IL-18BP mRNA er påvist i leukocytter, kolon, tynntarmen, prostata og hovedsakelig i miltceller (Novick et al. 1999). I ett av eksemplene nedenfor ble det vist at IL-18-protein er konstitutivt uttrykt i monocytter. IL-18BP-ekspresjon ble funnet å være indusert av IFNy, ikke bare i monocytter, men også i mange forskjellige celler og at denne induksjonen ytterligere kunne bli forsterket ved tilsetning av IL-6 og TNFa.

De novo proteinsyntese ble funnet å være essensiell for IL-18BP-genaktivering med INFy.

Transkripsjonsstartstedet til humant IL-18BPa mRNA ble bestemt med 5' RACE.

3'-enden mRNA til Zn-fingerprotein lokalisert oppstrøms for IL-18BP-genet ble funnet derved å begrense den potensielle oppstrøms regulatoriske sekvensen til IL-18BPa til 1601 baser oppstrøms for base 1.

Seks regulatoriske elementer (figur 1) ble identifisert innenfor denne regionen (fra transkripsjonen proksimalt til transkripsjonen distalt): 1- En gammaaktivert sekvens (GAS) på basene -24 til -32, 2- et IRF-1,2 responselement (IRF-E) som spenner over basene -57 til -69, 3- og 4- to C/EBPJ3 responselementer på basene -309 til -322 og -621 til -634, 5- en ekspresjonsavbryter på restene -625 til -1106 og 6- et forsterkerelement som omfatter basene -1106 til -1272. En serie av luciferase reportervektorer med progressive trunkeringer på 5'-enden til 1601 bp-fragmentet ble testet i HepG2-celler (en human hepatocellulær karsinomlinje). Den 1272 kb regionen fremsatt i SEKV.ID. NR. 1 styrer både en basal ekspresjon sett i enkelte vev og celletyper så vel som induksjon av IFNy. Testing av promoteraktivitet på påfølgende trunkerte DNA-fragmenter i denne regionen viste at 122 bp DNA-fragment, proksimalt til transkripsjonsstartsetet fremsatt i SEKV.ID. NR. 3 omfatter den minimale promoteren. Denne minimale promoteren er også induserbar. Andre regulatoriske sekvenser oppstrøms for denne minimale promoteren bidro imidlertid til utstrekningen av induksjonen. Et DNA-fragment på 635 bp som inneholder i tillegg til IRF-1- og GAS-elementene to C/EBPp-elementer, fremsatt i SEKV.ID. NR. 2, ble funnet å gi maksimal induksjon av luciferaseekspresjon med IFNy.

In vivo eksperimenter utført med IRF-1-defekte mus bekreftet viktigheten av IRF-1 som en mediator av basal så vel som IFNy-indusert ekspresjon av IL-18BP.

Det ble funnet at etter IFNy-induksjon er ekspresjonen av IRF-1-faktoren indusert og faktoren blir kompleksert til C/EBPp som er konstitutivt tilstede i cellene. Dette komplekset bindes til det proksimale GAS-promoterelementet og dets tilstøtende IRF-E-promoterelement.

Forsterkeren som er tilstede på transkripsjonssetets distale ende ble funnet å interagere med den basale promoteren gjennom IRF-1.

Den foreliggende oppfinnelsen angår IL-18BP-promoteren i SEKV.ID. NR. 1 eller et fragment derav og fremgangsmåter for å regulere genekspresjon. Mer spesielt angår den foreliggende oppfinnelsen de isolerte DNA-sekvensene til IL-18BP 1272 bp (SEKV.ID. NR. 1) eller et fragment derav så som 635 bp (SEKV.ID. NR. 2) og 122 bp (SEKV.ID. NR. 3) som er i stand til å styre genekspresjon.

Denne IL-18BP-promoterregionen er blitt klonet og sekvensert og tilsvarer nukleotidene i 1272 bp oppstrøms for transkripsjonsstartsetet til IL-18BP

(SEKV.ID. NR. 1).

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 1), men også DNA-sekvenser som omfatter et fragment derav (SEKV.ID. NR. 2, SEKV.ID. NR. 3) som er i stand til å styre gentranskripsjon og derfor den endelige genekspresjonen, og kan anvendes med andre deler av IL-18BP-promoterregionen eller alternativt med heterologe promotere eller heterologe promoterelementer for å kontrollere gentranskripsjon. Denne promoteren eller fragment derav er i stand til induksjon ved IFNy. Slik induksjon kan ytterligere forsterkes ved overekspresjon av IRF-1 og/eller C/EBPp og/eller ved behandling med IL-6 og/eller TNFa.

Funksjonelle derivater av promoteren fremsatt i SEKV.ID. NR. 1 eller fragment derav så som SEKV.ID. NR. 2 eller SEKV.ID. NR. 3, er mutanter hvori 1 til 10, fortrinnsvis 1 til 5, mer fortrinnsvis 1 nukleotid blir erstattet med et annet, eller er strøket og som er i stand til å styre genekspresjon og IFNy-induksjon.

DNA-sekvensene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen som omfatter en IL-18BP-promoter (SEKV.ID. NR. 1) eller et fragment derav så som det i SEKV.ID. NR. 2 eller SEKV.ID. NR. 3, kan isoleres ved å bruke forskjellige fremgangsmåter kjent på området. Minst tre alternative hovedmetoder kan anvendes: (1) isolering av DNA-sekvensen fra genomisk DNA som inneholder sekvensen;

(2) kjemisk syntese av DNA-sekvensen; og

(3) syntese av DNA-sekvensen ved polymerase kjedereaksjon (PCR).

I en første tilnærming kan et humant genomisk DNA-bibliotek screenes for å identifisere en DNA-sekvens som omfatter en IL-18BP-promoter eller IL-18BP-promotere lement.

I en andre tilnærming kan en DNA-sekvens som omfatter en IL-18BP-promoter eller et IL-18BP-promoterelement syntetiseres kjemisk. For eksempel kan en DNA-sekvens som omfatter en IL-18BP-promoterregion eller en IL-18BP-promoter syntetiseres som en serie på 100 baseoligonukleotider som deretter sekvensielt kan ligeres (via egnede terminale restriksjonsseter) slik at det danner den korrekte lineære sekvensen til nukleotidene.

I en tredje tilnærming kan en DNA-sekvens som omfatter en IL-18BP-promoterregion eller en IL-18BP-promoter syntetiseres ved å bruke PCR. Kort fortalt kan par av syntetiske DNA-oligonukleotider på minst 15 baser i lengde (PCR-primere) som hybridiseres til motsatte tråder i mål-DNA-sekvensen anvendes for enzymatisk å amplifisere den mellomliggende regionen av DNA på målsekvensen. Gjentatte sykluser av varmedenaturering av templatet, sammenføyning av primerne og forlengelse av 3'-termini til de sammenføyde primerne med en DNA-polymerase resulterer i amplifisering av segmentet definert ved 5'-endene til PCR-primerne. Se U.S. patent nr. 4,683,195 og 4,683,202. IL-18BP-promoteren i henhold til oppfinnelsen ble vist å være i stand til å gi basal ekspresjon og også indusert ekspresjon med IFNy til et heterologt gen. Således har promoteren til IL-18BP både basal og induserbar aktivitet.

Mens nukleotidsekvensen til promoteren er fremsatt i SEKV.ID. NR. 1 eller til fragmenter derav som har promoteraktiviteter og referanse er gjort til slik sekvens i beskrivelsen, er det anerkjent at nukleotidderivater kan fremstilles som ikke påvirker promoteren eller promoterelementfunksjon. Disse modifiserte nukleotidsekvensene kan for eksempel fremstilles ved mutasjon av nukleotidsekvensen slik at mutasjonen resulterer i delesjon, substitusjon, innskudd, inversjon eller tilsetning av ett eller flere nukleotider ved å bruke forskjellige fremgangsmåter kjent på området. For eksempel kan fremgangsmåtene for setestyrt mutagenese beskrevet i Taylor, J.W. et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985) og Kunkel, J.A., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, 482-492 (1985) anvendes. I tillegg kan sett for setestyrt mutagenese kjøpes fra kommersielle forhandlere. For eksempel kan et sett for å utføre setestyrt mutagenese kjøpes fra Amersham Corp. (Arlington Heights, IL). Den foreliggende oppfinnelsen omfatter DNA som inneholder sekvenser som er minst 50% identiske og fortrinnsvis 75% identiske og mer fortrinnsvis 90% identiske til henholdsvis SEKV.ID. NR. 1, SEKV.ID. NR. 2 og SEKV.ID. NR. 3, forutsatt at promoteraktiviteten er bibeholdt og/eller forsterket. Et slikt derivat, for eksempel i SEKV.ID. NR. 1, er det som er mutert i ett eller alle av de tre API-setene tilstede i ekspresjonsavbruddsregionen.

Nukleotidsekvensen som omfatter promoteren til IL-18BP, et fragment derav og/eller et derivat derav, kan være operativt koblet til den kodende regionen til ethvert gen av interesse for å uttrykke det genet i en egnet vertscelle. Med operativt koblet, er det ment operativ kobling for promoter og elementer. For å uttrykke et gen av interesse er det foretrukket at hele IL-18BP-promoteren i SEKV.ID. NR. 1 eller et fragment derav så som i SEKV.ID. NR. 2 eller SEKV.ID. NR. 3 eller et derivat derav, er operativt koblet til genet av interesse. Som vist nedenfor i eksempelavsnittet, er IL-18BP-promoteren eller et fragment derav så som det i SEKV.ID. NR. 2 eller i SEKV.ID. NR. 3 i stand til å styre ekspresjonen av heterologe gener. Ekspresjonen av homologe gener med promoteren i henhold til oppfinnelsen, er også vurdert.

Promoteren kan videre inneholde et intron, for eksempel det første intronet til IL-18BP.

En "operativt koblet" IL-18BP-promoter eller -promoterelement vil styre transkripsjonen av et nukleinsyremolekyl sammenføyd i den riktige leserammen. Med hensyn til heterologe promotere, er promoterene og elementene i henhold til oppfinnelsen operativt koblet når de kontrollerer funksjonen til slike heterologe promoterer.

Som bemerket ovenfor, kan IL-18BP-promoteren, et fragment derav og en derivatsekvens derav i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, utnyttes for å uttrykke ethvert gen av interesse. Typisk blir en ekspresjonsvektor anvendt i denne hensikt. Således angår den foreliggende oppfinnelsen videre ekspresjonsvektorer som omfatter en isolert DNA-sekvens som er i stand til å styre genekspresjonen som omfatter en IL-18BP-promoter eller et fragment derav eller et derivat derav. Ekspresjonsvektorene inneholder fortrinnsvis en IL-18BP-promoter, et fragment derav eller derivat derav som har en nukleotidsekvens som tilsvarer henholdsvis SEKV.ID. NR. 1, SEKV.ID. NR. 2 eller SEKV.ID. NR. 3 eller fragmenter derav og/eller derivater. Også foretrukket er ekspresjonsvektorer som ytterligere omfatter et homologt eller heterologt gen som er operativt koblet til IL-18BP-promoteren eller et fragment derav og/eller et derivat derav eller modifisert nukleotidsekvens derav.

Ekspresjonsvektorer som er nyttige i den foreliggende oppfinnelsen er ofte i form av "plasmider" som betegner sirkulært dobbelttrådet DNA som i sin vektorform ikke er bundet til kromosomet. Oppfinnelsen er imidlertid ment å inkludere slik andre former for ekspresjonsvektorer som tjener ekvivalente funksjoner og som blir kjent på området i det påfølgende.

Ekspresjonsvektorer som er nyttige i den foreliggende oppfinnelsen inneholder typisk et replikasjonsorigo, en IL-18BP-promoter lokalisert foran (det vil si oppstrøms for) genet av interesse, transkripsjonstermineringssekvenser og den gjenværende vektoren. Ekspresjonsvektorene kan også inkludere andre DNA-sekvenser kjent på området, for eksempel stabilitetsledersekvenser som tilveiebringer stabilitet i ekspresjonsproduktet, sekretoriske ledersekvenser som tilveiebringer sekresjon av ekspresjonsproduktet, sekvenser som tillater ekspresjon av det strukturelle genet å moduleres (for eksempel ved nærværet eller fraværet av næringsmidler eller andre induseringsmidler i vekstmediet), markeringssekvenser som er i stand til å tilveiebringe fenotypisk seleksjon i transformerte vertsceller og sekvenser som tilveiebringer seter for spalting ved restriksjonsendonukleaser. Egenskapene til den aktuelle ekspresjonsvektoren anvendt må være kompatible med vertscellen som skal anvendes. En ekspresjonsvektor vurdert i den foreliggende oppfinnelsen er minst i stand til å styre transkripsjonen, og fortrinnsvis ekspresjonen, av genet av interesse styrt av IL-18BP-promoterregionen eller IL-18BP-promoteren eller en modifisert nukleotidsekvens derav. Egnede replikasjonsorigo inkluderer for eksempel det til Simianvirus 40 (SV40). Egnede termineringssekvenser inkluderer for eksempel den til Simianvirus 40 (SV40). Promoterene i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for ekspresjonen av så å si ethvert gen av interesse, for eksempel de som koder terapeutiske produkter så som interferon-beta, TNF, erytropoietin, vevsplasminogenaktivator, granulocyttkolonistimulerende faktor, magansuperoksiddismutase, et immunoglobulin eller fragment derav, veksthormon, hsLDLR, FSH, hCG, IL-18, TNF-reseptorbindende proteiner og IL-18-bindende proteiner. Alle disse materialene er kjent på området og mange er kommersielt tilgjengelige.

Egnede ekspresjonsvektorer som inneholder de ønskede kodende og kontrollsekvensene kan konstrueres ved å bruke standard rekombinante DNA-teknikker kjent på området, hvor mange er beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Den foreliggende oppfinnelsen angår i tillegg vertsceller som inneholder en ekspresjonsvektor som omfatter en isolert DNA-sekvens som er i stand til å styre genekspresjon som omfatter en IL-18BP-promoterregion eller en IL-18BP-promoter eller modifiserte nukleotidsekvenser derav. Fortrinnsvis har IL-18BP-promoterregionen nukleotidsekvensen som tilsvarer 1272 bp oppstrøms for transkripsjonsstartsetet til IL-18BP fremsatt i SEKV.ID. NR. 1 eller et fragment derav så som nukleotidsekvensen som tilsvarer 635 bp oppstrøms for transkripsjonsstartsetet fremsatt i SEKV.ID. NR. 2 eller et fragment derav så som nukleotidsekvensen til 122 bp oppstrøms for transkripsjonsstartsetet fremsatt i SEKV.ID. NR. 3. Også foretrukket er vertsceller som inneholder en ekspresjonsvektor som ytterligere omfatter et homologt eller heterologt gen operativt koblet til IL-18BP-promoterregionen eller IL-18 fremsatt i SEKV.ID. NR. 1 eller et fragment derav. Egnede vertsceller inkluderer for eksempel humane HeLa-celler eller afrikansk grønnapeceller CV-1 og COS-1, CHO-celler HepG2, WISH-celler, Hakat U937 osv.

Foretrukket er vertsceller som inneholder reseptorer for IFNy som tillater induksjon av IL-18BP-promoteren og derfor forsterket ekspresjon av genet av interesse.

Ekspresjonsvektorer kan innføres i vertscellene ved forskjellige metoder kjent på området. For eksempel kan transfeksjon av vertsceller med ekspresjonsvektorer utføres ved kalsiumfosfatutfellingsmetoden. Andre metoder for å introdusere ekspresjonsvektorer inn i vertsceller, for eksempel elektroporering, biolistisk fusjonering, liposomal fusjonering, nukleær injeksjon og viral eller faginfeksjon, kan imidlertid også anvendes.

Så snart ekspresjonsvektoren er blitt introdusert i en egnet vertscelle, kan vertscellen dyrkes og polypeptidet som er kodet av genet av interesse kan isoleres. Alternativt, når en ekspresjonsvektor har blitt introdusert i en egnet vertscelle, kan cellen dyrkes og etter å ha oppnådd en ønsket celletetthet kan cellene stimuleres med IFNy og polypeptidet som er kodet av genet av interesse kan isoleres.

Vertsceller som inneholder en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for et gen av interesse, kan identifiseres ved å bruke forskjellige fremgangsmåter kjent på området. For eksempel kan DNA-DNA-hybridisering som vurderer nærværet eller fraværet av markørgenfunksjoner, som vurderer nivået av transkripsjon målt ved produksjonen av mRNA-transkripter av genet av interesse i vertscellen og deteksjon av genproduktet immunologisk, bli anvendt.

DNA-sekvensene til ekspresjonsvektorene, plasmider eller DNA-molekyler i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, kan bestemmes ved hjelp av forskjellige metoder kjent på området. For eksempel kan dideoksy kjedetermineringsmetoden som beskrevet i Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467 (1977) eller Maxam-Gilbert-metoden som beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 560-563 (1977) anvendes.

Det skal forstås at spesifikke nukleotider eller regioner innenfor IL-18BP-promoteren kan identifiseres som nødvendig for regulering. Disse regionene eller nukleotidene kan være lokalisert ved fin strukturell disseksjon av elementene og kan undersøkes ved eksperimenter som analyserer den funksjonelle kapasiteten til promotermutanter. For eksempel kan enkelte baseparmutasjoner av promoterelementer eller progressive delesjoner, som sådan anvendt i eksempelseksjonen nedenfor, bli generert ved å benytte PCR. På denne måten blir et antall muterte promoterregioner eller delesjonskonstrukter amplifisert og deretter klonet tilbake inn i reporterkonstruktene og evaluert med transfeksjon og luciferaseassayteknikker (som fremsatt i eksempelseksjonen nedenfor). Disse amplifiserte fragmentene kan klones tilbake til sammenhengen med IL-18BP-promoteren og også inn i de heterologe promoterkonstruktene. På denne måten blir de nøyaktige nukleotidsekvensene som er viktige ved styring av gentranskripsjon identifisert.

Denne analysen vil også identifisere nukleotidforandringer som ikke påvirker promoterfunksjon eller som kan øke promoterfunksjon. Således kan funksjonelle derivatpromoterer og promoterelementer også bli konstruert.

Funksjonelle analyser av promoterregionen eller promoteren kan gjøres lettere ved fotavtrykks- og gelforskyvningsundersøkelser. Kjennskap til de nøyaktige baseparene som er viktige for å mediere binding av proteinene, tilveiebringer bevismateriale for baser som er viktige for å mediere den transkripsjonene responsen.

Oppfinnelsen omfatter derfor videre baseparene som er viktige for DNA-proteininteraksjon. Slike basepar kan tydeliggjøres. Genomiske fragmenter som inneholder områdene av interesse kan anvendes i in vitro fotavtrykkseksperimenter [Galas et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981)]. Isolert restriksjons fragment kan radiomerkes og i det påfølgende innkuberes med kjerneekstrakter fremstilt med etablerte teknikker fra celler som er forventet å inneholde DNA-bindende proteiner som vil binde seg til fragmentet [for eksempel Dignam et al., Nucleic Acids Res.

11, 1475-1489 (1983)]. Merkede DNA-fragmenter blir innkubert med kjerneekstraktene, fordøyd med DNAse I og elektroforert på en denaturerende polyakrylamidgel. DNA-bindende proteiner i celleekstraktet bindes til deres gjenkjennelsessekvens inneholdt i det merkede restriksjonsfragmentet og beskytter DNA fra fordøyelse med DNAse. Regioner for beskyttelse skisserer bindingssetet. Maxam og Gilbert sekvenseringsreaksjoner for fragmentet kan anvendes som en markør for å definere nukleotidene som er beskyttet mot DNAse-fordøyelse.

Oppfinnelsen angår videre identifikasjon og karakterisering av transaksjonsfaktorer som interagerer med promoteren eller promoterelementene. Cis-virkende regulatoriske sekvenser tjener som bindingsseter for proteiner som blir kalt transaksjonsfaktorer (TAF) [Dynan W.S., Tjian T. Nature 316, 774-778 (1985); Maniatis T. et al., Science 236, 1237-1245 (1987)]. Hvert gen er antatt å binde ett eller flere proteiner på hver av dets regulatoriske sekvenser og disse proteinene interagerer med hverandre og RNA-polymerase II på en måte som kontrollerer transkripsjon.

TAF er blitt identifisert i nukleære ekstrakter ved sin evne til å binde seg til og retardere elektroforetisk bevegelighet av cis-virkende sekvens-DNA-fragmenter [Dignam, J.D. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983); Dynan, W., Cell 58, 1-4 (1989); Fletcher, C. et al., Cell 773-781 (1987); Scheidereit, C. et al., Cell 51, 783-793 (1987)].

De cis-virkende sekvensene er nyttige i gelretarderingsassayer for å bestemme bindingsaktivitet i nukleære ekstrakter. Teknologien for gelforflytningsassayer er beskrevet i litteraturen og inkluderer mange av de samme reagensene som de brukt i fotavtrykkseksperimenter [Fried, M. et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981); Revzin, A., Biotechniques 7, 346-355 (1989); Strauss, F.A. et al., Cell 37, 889-901

(1984)]. Enten 32 P-merkede restriksjons fragmenter eller sammenføyde par av komplementære oligoer blir innkubert med nukleære ekstrakter og poly d(I-C) i en bindingsbuffer og produktene i denne reaksjonen elektroforert på en ikke-denaturerende polyakrylamidgel. Lokaliseringen av DNA-fragmentet på gelen som bestemt ved autoradiografi blir retardert i tilfeller hvor protein har bundet seg til DNA. Ustrekningen av retardasjonen er en relativ funksjon av proteinets størrelse.

Bindingsproteinene identifisert på denne måten kan deretter renses og eventuelt klones ved bruk av kjente teknikker.

Promoteren til IL-18BP finner også anvendelse i transgene undersøkelser. Transgene mus tilveiebringer en kraftig genetisk modell for undersøkelsen av et antall humane sykdommer, inkludert kreft. De har også tilveiebrakt en viktig in vivo fremgangsmåte for undersøkelse av genregulering som har bekreftet og utvidet observasjoner gjort med transfeksjonsreportergen (for eksempel luciferase) -eksperimenter [Palmiter, F.L. et al., Ann. Rev. Genet. 20, 465-499 (1986)]. Undersøkelser rettet mot å dissekere signalene som tillater utviklingsslektskap med genekspresjon kan sjelden bli utført i cellekulturmodeller og er muligens best undersøkt med en transgen modell. Denne type av eksperiment er mulig fordi den bemerkelsesverdige konserveringen mellom arter av regulatoriske sekvenser så som at humane regulatoriske signaler blir nøyaktig tolket av

musetranskripsjonsmaskineriet.

Konstrukter uttrykt i transgene mus kunne derfor tilveiebringe mye informasjon om reguleringen av IL-18BP-genet.

Transgene mus kan fremstilles ved fremgangsmåter kjent på området. Den mest utstrakt brukte fremgangsmåten gjennom hvilken transgene dyr er blitt produsert, involverer å injisere et DNA-molekyl inn i den hannlige pronukleus i et befruktet egg [Brinster et al., Cell 27, 223 (1981); Costantini et al., Nature 294, 982 (1981); Harpers et al., Nature 293, 540 (1981); Wagner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78, 5016 (1981); Gordon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 73, 1260 (1976)].

Så snart DNA-molekylet er blitt injisert inn i den befruktede eggcellen, blir cellen implantert i livmoren til en mottakerhunn og tillatt å utvikles til et dyr. Således skulle alle cellene i det resulterende dyret inneholde den introduserte gensekvensen.

Den resulterende transgene musen eller grunnleggere kan avles og avkommet analyseres for å etablere linjer fra grunnleggerne som uttrykker transgenet. I transgene dyr kan et flertall vev screenes for å observere genekspresjon. RNA-undersøkelser i forskjellige muselinjer vil tillate evaluering av uavhengigheten av integreringssetet til ekspresjonsnivåer av transgenet. Se Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1986). IL-18BP-promoteren og -promoterelementene kan også tilveiebringe nyttige midler for å utføre genterapi.

"Genterapi" er administreringen av genetisk materiale for å modifisere eller manipulere ekspresjonen av et genprodukt for å forandre biologiske egenskaper til levende celler for terapeutisk anvendelse.

Cellene kan være allogene eller autologe. Cellene kan modifiseres ex vivo for påfølgende administrering til individet eller forandres in vivo ved genterapiprodukter gitt direkte til individet.

For det meste vil konstrukter som omfatter IL-18BP-promoteren eller fragmenter derav og/eller et derivat derav, utnyttes til målgenekspresjon i de celler når IL-18BP-genet er normalt uttrykt, for eksempel mononukleære celler. Ethvert middel tilgjengelig på området for overføring av konstruktene inn i dyrene, inkludert mennesker, kan anvendes. Dette inkluderer virale vektorer, særlig retrovirale vektorer (se for eksempel Zweibel et al., Science 243, 220 (1989) og referansene sitert deri) så vel som andre fremgangsmåter.

Rekombinante AAV-vektorer er blitt vist å være ganske lovende for terapeutisk genlevering i lever og skjelettmuskel (Snyder et al. 1997, Murphy et al. 1997, Song et al. 1998, Snyder et al 1999, Herzog et al. 1997). Mus dannet ved å ødelegge koaguleringsfaktor IX-genet utviser alvorlige blødningslidelser og ligner svært fenotypen sett i hemofili B-pasienter. Det er blitt rapportert (Wang et al. 1999) at en enkelt intraportal injeksjon av et rekombinant adenoassosiert virus (AAV) -vektor som koder hundefaktor IX cDNA under kontroll av en leverspesifikk forsterker/promoter, fører til en langtids og fullstendig korreksjon av blødningslidelsen.

Retrovirale vektorer avledet fra onkoretrovirus så som det murine leukemiviruset (MVL), har vært de mest utstrakt anvendte vektorene for genoverføring fordi vektorgenomet integreres i kromosomene til målcellene og resulterer i stabil ekspresjon av transgener (I.M. Verma og N. Somia. Nature 389, 239 (1997)). Disse vektorene ble imidlertid bevist å være gode, spesielt for delende celler. Lentivirusvektorer så som HIV-vektorer er for tiden blitt brukt for ikke-delende celler, Mioshi et al. Science 1999 283: 682-686. Evnen til lentivirus til å infisere ikke-delende celler så som makrofager, gjør dem til gode kandidater for anvendelse som genoverføringsverktøy. HIV-vektorer letteregjør transduksjon av hvilende humane hematopoietiske stamceller (HSC).

Humane hematopoietiske stamceller (HSC) er et attraktivt mål for genterapi ved nedarvede hematopoietiske lidelser så vel som andre ervervede lidelser fordi disse cellene har evnen til å regenerere hele det hematopoietiske systemet. For eksempel kan hematopoietiske stamceller regenerere monocyttiske celler som er kjent for å være involvert i human immunsviktvirus-1 (HIV-1) -patogenese.

Til tross for mer enn 15 års forskning på området med genterapi ved å bruke hematopoietiske stamceller, forblir den viktigste hindringen den manglende evnen til effektivt og stabilt å innføre gener inn i disse cellene. Retrovirale vektorer basert på Moloney murint leukemivirus (MLV) er blitt mest brukt, men gir relativt lav genoverføring inn i pluripotent humant HSC og genekspresjon som ofte er utilfredsstillende.

Nylig er forsøk blitt gjort på genetisk modifikasjon av hematopoietiske stamceller med gener som inhiberer replikasjon av HIV-1 rettet mot utviklingen av monocytter som er motstandsdyktige mot HIV-1-infeksjon (Kohn et al. 1999).

Teoretisk ville innføring av et gen som er i stand til å gi motstandsdyktighet mot HIV-1 i hematopoietiske stamceller resultere i at genet vil være tilstede i de nedadstigende modne monocyttene og andre HIV-1-utsatte celler.

Således er anvendelsen av en promoter som er aktiv i monocyttiske celler så som promoteren til IL-18BP eller et fragment derav, for delaktig for HIV-1-genterapi.

Genterapi av de fleste genetiske blodlidelser (for eksempel SCID kronisk granulomatøs sykdom, talassemi osv) krever ex vivo genoverføring inn i transplanterbart, selvfornyende HSC og regulering av transgen ekspresjon i en eller flere celleliner. Korreksjon av lidelser som påvirker et spesifikt avkom av HSC (for eksempel hemoglobinopatier eller talassemier, HIV-1-infeksjon) krever restriksjonsekspresjon av terapeutisk gen på cellelinjespesifikk måte (Iotti et al. 2002). I disse tilfellene er transkripsjonen målretting av det overførte genet nødvendig. Genekspresjon i forskjellige celletyper er avhengig av den relative styrken til promoteren som anvendes. De fleste prekliniske studier utført så langt har imidlertid vært basert på anvendelsen av virale, konstitutive promoterer for å drive transgen ekspresjon fremover. For eksempel i HIV-l-vektor anvendes en indre CMV-promoter og det murine CMV-promoteren, murin retroviral vektor LTR. Egnet transgen regulering innenfor rammen av en retroviral vektor, er en vanskelig oppgave på grunn av transkripsjonen interferens mellom de virale lange terminale repetisjonene (LTR) og indre forsterkerpromoterer og genetisk ustabilitet av komplekse regulatoriske sekvenser. I den foreliggende oppfinnelsen blir promoteren til IL-18BP som er kjent for å drive frem transkripsjon i mononukleære celler brukt til å drive frem transgen ekspresjon i HSC som er forløperen for slike mononukleære celler.

Genetisk modifikasjon av hematopoietisk stamceller med "anti-HIV-gener" kunne føre til utvikling av lymfocytter og monocytter som er resistente mot HIV-infeksjon etter transplantasjon. HSC av HIV-1-infiserte pasienter kan gjenvinnes, CD34+-celler isolert, overført in vitro med en retroviral vektor som bærer et HIV-1-inhibitorisk protein under kontroll av IL-18BP-promoteren (i stedet for den retrovirale promoteren) og reinfusjon av disse cellene i disse pasientene (Kohn et al. 1999).

Den mest vanlig brukte kilden til HSC er hematopoietiske stamceller fra perifert blod (PBSC) som i stor grad har erstattet beinmarg på området autolog transplantasjon (Gale et al. 1992 og Kessinger et al. 1991). PBSC blir mobilisert fra beinmargen inn i den perifere sirkulasjonen ved administrering av faktorer så som G-CSF eller GM-CSF i 3-5 dager og kan deretter innsamles ved leukaferese. Flere undersøkelser har vist at innpoding skjer hurtigere når perifere blodstamceller transplanteres i stedet for beinmarg (Henon et al. 1992 og Chao et al. 1993). De klonogene forløpercellene inneholdt i G-CSF-mobilisert PBSC er svært utsatt for retroviralt mediert genoverføring, mens transduksjonshastigheten til langtids rekonstituerende stamceller i PBSC ikke er bedre enn beinmarg (Breni et al. 1992, Cassel et al. 1993, Dunbar et al. 1995). Det er blitt vist at HIV-1-infiserte individer kan ha vellykket mobilisering og oppsamling av G-CSF-mobilisert PBSC uten noen økning i endogene HIV-1-nivåer, i det minste under tidlige utviklingstrinn av sykdommen (Junker et al. 1997 og Slobod et al. 1996).

En annen kilde for hematopoietiske stamceller er navlestrengblod (UCB) som er blitt vist å være utsatt for retroviral transduksjon, potensielt enda mer enn beinmargceller (Moritz et al. 1993 og Hao et al. 1995). Anvendelse av UCB-celler HSC kunne være spesielt gunstig for HIV-1-infiserte nyfødte. Siden transmisjon for det meste er perinatal, skulle navlestrengblodet inneholde normale antall og funksjon av hematopoietiske stamceller som kan være redusert i beinmargen til HIV-1-infiserte barn og voksne (Kearns et al. 1997).

Et stort antall syntetiske gener er blitt utviklet som kan undertrykke HIV-1-replikasjon ("anti-HIV-1-gener") inkludert: Antisens, ribozymer, dominant-negative mutanter (for eksempel RevMlO), RNA-lokkemidler, intracellulære antistoffer for å forhindre ekspresjon av virale proteiner eller cellulære samreseptorer, osv (Veres et al. 1996, Zhou et al. 1994, Couture et al. 1996, Malim et al. 1989, Bahner et al. 1993 og Sullenger et al. 1990, Lee et al. 1994, Marasco et al. 1997 og Chen et al. 1997). I mange tilfeller har disse anti-HIV-1-genene i modellsystemer vist seg å være i stand til signifikant å undertrykke replikasjonen av HIV-1 og i enkelte tilfeller til og med begrense virusinntrenging i cellene (36, 39-44). Hvis essensielt 100% av en pasients HSC og de resulterende monocyttiske cellene kunne gjøres ute av stand til å understøtte HIV-1-replikasjon, er det rimelig at redusert virale belastninger ville være resultatet. Teoretisk ville aktiv inhibisjon av HIV-1-replikasjon i 99,9% av de utsatte cellene være nødvendig for å produsere en 3-log-reduksjon i virusbelastning, en effekt som ofte produseres med svært effektiv anti-retroviral terapi. Med de begrensede kapasitetene til effektivt å overføre høye prosentandeler av humane hematopoietiske stamceller, er det imidlertid ikke for tiden mulig å beskytte hovedparten av de utsatte cellene. En alternativ mekanisme for effektivitet er basert på muligheten av at cellene som er konstruert for å være ute av stand til å understøtte aktiv HIV-1-replikasjon kan være beskyttet fra viralindusert cytopatisitet og således ha en selektiv overlevelsesfordel sammenlignet med ubeskyttede celler. I det tilfellet kan et beskjedent antall beskyttede celler omfatte en økt prosentandel av alle monocytter og føre til noe bevaring av immunfunksjonen.

Den foreliggende oppfinnelsen angår også farmasøytiske sammensetninger som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og et virus som omfatter en sekvens i henhold til den foreliggende oppfinnelsen som tilsvarer IL-18BP-promoterregionen eller promoter operativt koblet til et gen av interesse som koder for et egnet legemiddel. Disse sammensetningene kan anvendes fortrinnvis for å målrette et legemiddel til vev hvori nivåene av IFNy er forhøyet.

Idet oppfinnelsen nå er beskrevet, vil den lettere forstås med referanse til de følgende eksemplene som er tilveiebrakt for å illustrere, og er ikke ment å være begrensende for den foreliggende oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Eksempel 1:

Basal ekspresjon av IL-18BP i monocytter.

IL-18BP mRNA blir påvist i leukocytter, kolon, tynntarmen, prostata og særlig i miltceller (Novick et al. 1999). Miltceller består av makrofager, lymfocytter og plasmaceller med ytterligere celler avledet fra sirkulasjonen.

For å bestemme ekspresjon av IL-18BP-protein i celler, ble en spesifikk ELISA-test anvendt (eksempel 12). Humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ble funnet konstitutivt å produsere IL-18BP (0,7-1,5 ng/ml). U-937-celler, en cellelinje avledet fra ondartede celler oppnådd fra pleural effusjon hos en pasient med histiocyttisk lymfom, uttrykte ikke noe IL-18BP. U-937-celler kan induseres til terminal monocyttisk differensiering ved behandling med forbolestere. En basal IL-18BP-ekspresjon på 0,07 ± 0,01 ng/ml ble påvist bare etter differensiering av cellene til makrofaglignende celler ved stimulering med TPA (10 ng/ml). Disse resultatene viser til IL-18BP blir konstitutivt produsert i monocytter og makrofager.

Eksempel 2:

Induksjon av IL-18BP-ekspresjon i forskjellige celler.

Det er tidligere blitt rapportert at IFNy-indusert IL-18BP mRNA og protein i forskjellige cellelinjer så som en keratinocyttcellelinje, en kolonkarsinomcellelinje og i primære renale mesangiale celler (Muhl et al. 2000). Induksjonen av IL-18BP i forskjellige humane cellelinjer og i mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ved IFNy og andre cytokiner, ble undersøkt. IFNy-indusert IL-18BP-ekspresjon (se eksempel 11 for overvåkning av mRNA og eksempel 12 for ELISA) på en doseavhengig måte, viser en EC5oved 50 U/ml i WISH- og HepG2-celler (figurene 2 A og B). IL-18BP ble tilsynelatende akkumulert i kultursupernatantene fra WISH-celler, idet dens konsentrasjon var høyere ved 48 timer sammenlignet med 24 timer (figur 2 A).

Mononukleære celler fra humant perifert blod (PBMC) produserte konstitutivt IL-18BP (0,7-1,5 ng/ml) og behandling med IFNy (100 U/ml) økte nivået av IL-18BP med 1,7 + 0,1 og 2,1 + 0,3 ganger ved henholdsvis 24 og 48 timer (p < 0,05, n = 4). Ingen virkning på IL-18BP-produksjonen ble sett ved forbehandling av PBMC med

TPA.

IL-18BP-induksjon ved IFNy ble testet i U937-cellelinjen. IFNy induserte ikke IL-18BP i udifferensierte U937-celler, men fulgte imidlertid differensiering med forbolester (TPA, 10 ng/ml) i makrofaglignende celler, idet et basalnivå på IL-18BP (0,07 + 0,01 ng/ml) ble oppnådd, og økt ved 4,6 + 0,05 ganger ved induksjon med IFNy (100 U/ml, 24 timer), ytterligere økning ble observert ved 96 timer (ikke vist).

Effekten av andre cytokiner så som IFNa2, IFNp, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 og TFNa på IL-18BP-ekspresjon ble testet i HepG2-celler (figur 2B). De oppnådde resultatene etter innkubering av cellene med forskjellige cytokiner i nærværet eller fraværet av IFNy (figur 1 PNAS-nett) viser at IFNa2, IFNp, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 og TNFa ikke induserte IL-18BP alene. I HepG2-celler virket imidlertid IL-6 og TNFa synergistisk med IFNy og tilveiebrakte en statistisk signifikant økning av IL-18BP.

Disse resultatene angir at IL-18BP kan induseres av IFNy i monocytter og i mange forskjellige celler. Induksjon av IL-18BP ved IFNy blir ytterligere forsterket ved tilsetning av IL-6 og TNFa.

Eksempel 3:

IL-18BP-genet blir transkripsjonelt regulert av IFNy, noe som krever de novo proteinsyntese.

For å undersøke hvorvidt induksjonen av IL-18BP mRNA ved IFNy er på det transkripsjonelle nivået, ble virkningen av interferon på HepG2- og WISH-celler målt i nærværet av en translasjonsinhibitor, aktinomycin D (figur 3A). Økning i IL-18BP mRNA-nivåer var påvisbare ved semikvantitativ RT-PCR etter 3 timers behandling med IFNy i HepG2-celler og bare etter 5 timer i Hakat- og WISH-celler. Forbehandling av HepG2- og WISH-celler med aktinomycin D før IFNy-stimulering utslettet ekspresjonen av IL-18BP mRNA på forskjellige tidspunkter, noe som angir at IFNy stimulerer de novo mRNA-syntese.

Akkumulering av IL-18BP var klart 24 timer og senere etter IFNy-behandling, noe som understøtter en avhengighet av IL-18BP-ekspresjon på den foregående induksjonen av proteiner, for eksempel transkripsjonsfaktorer, ved IFNy. For å bekrefte en slik hypotese, ble derfor en proteininhibitor, sykloheksimid, ytterligere anvendt for å undersøke hvorvidt induksjon av IL-18BP mRNA ved IFNy krever de novo syntese av proteiner. Resultatene er oppsummert i figur 3B og viser at forbehandling av cellene med sykloheksimid opphevet induksjonen av IL-18BP mRNA. Dette resultatet angir at de novo proteinsyntese er essensiell for IL-18BP-genaktivering ved IFNy.

Eksempel 4:

Definering av transkripsjonsstartsetet til IL-18BPa dens promoter region for å kartlegge IL-18BP-promoteren.

For å kartlegge IL-18BP-promoterregionen er det først nødvendig å spesifikt lokalisere transkripsjonsstartsetet.

Transkripsjonsstartsetet til humant IL-18BPa mRNA ble bestemt med 5' RACE (RACE eksempel 14). Bare ett PCR-produkt som tilsvarer IL-18BPa, den mest hyppige spleisevarianten, ble oppnådd ved 5' RACE. DNA-sekvensanalyse av dette produktet viste at transkripsjonsstartsetet og et ytterligere ekson på 50 bp etter transkripsjonsstartsetet i 5'-enden av humant IL-18BPa mRNA som tilsvarer posisjonene 785-835 i det genomiske IL-18BP DNA (kan bli funnet på Entrez pubmed nukleotiddatabase, tilgangsnummer AF110798). Følgelig ble et nytt ekson-intron-kart dannet ved å sammenligne det genomiske DNA med mRNA til hvilke det nye 5'-eksonet var tilsatt. (Se figur 4).

Idet man har transkripsjonsstartsetet til IL-18BPa (base 1), kunne det humane genomiske DNA oppstrøms for base 1 (kromosom llq klon: RP11-757C15, tilgangsnummer AP000719.4 nukleotider oppstrøms for base 152,178) som tilsvarer IL-18BP-promoterregionen bli ytterligere analysert. Sammenligning av dette DNA til det uttrykte sekvensmerket (EST) database ved NCBI med BLAST-programmet viste et oppstrøms gen på +-tråden som kodet for et sinkfingerprotein (tilgangsnummer AK001961). Den deponerte mRNA-sekvensen til dette Zn-fingerproteinet ble ytterligere forlenget ved "Instant RACE "-programmet (www.LabOnWeb.com), som skannet en utstrakt samling av humane EST'er. Programmet plasserte 3'-enden mRNA til Zn-fingerproteinet på nukleotid 150,517 til den genomiske klonen RP11-757C15, for derved å begrense den potensielle oppstrøms regulatoriske sekvensen til IL-18BPa til 1661 baser oppstrøms for base 1.

Eksempel 5:

Undersøkelse av den minimale promoteren, oppstrøms for IL-18BP-genet, som er i stand til å fremme konstitutiv ekspresjon av et heterologt gen.

For å finne det minimale DNA-fragmentet, oppstrøms for IL-18BP-genet, som er i stand til å styre ekspresjon av et heksogent gen så som luciferase reportergenet, ble en vektor som inneholder opptil 1601 bp, som tilsvarer DNA-sekvensen oppstrøms for base 1 og som inkluderer 50 bp nedstrøms for transkripsjonsstartsetet (SEKV.ID. NR. 5), og vektorer som har trunkerte former av dette DNA (figur 5A) fusjonert til luciferasegenet, dannet (eksempel 15). Luciferaseaktivitet i humane HepG2-celler (en human hepatocellulær karsinomlinje) transfektert med en vektor (pGL3(1601)) som omfatter 1601 bp oppstrøms DNA var 10,3 ± 0,9 ganger høyere enn det oppnådd med den tomme pGL3-vektoren. Slik aktivitet ble ikke observert når det samme DNA ble innskutt i den motsatte orienteringen (pGL3(-1601)). Dette resultatet viste at det 1601 bp DNA oppstrøms for base 1 har basal promoteraktivitet. Sekvensundersøkelse av dette 1601 bp DNA-fragmentet viste at det ikke inkluderer et TATA-bokselement, men hadde flere GC-rike domener nær transkripsjonsstartsetet ved basene -3 til -9, -39 til -48 og -122 til -132. Analyse av den 1601 bp DNA-sekvensen med programmet TFSEARCH identifiserte en gammaaktivert sekvens (GAS) ved basene -24 til -32 (figur 1). Ytterligere analyse viste et IRF1,2 responselement (IRF-E) som spenner over basene -57 til -69 og to C/EBPp-responselementer (C/EBP-E) ved basene -309 til -322 og -621 til -634.

En serie av luciferase reportervektorer med progressive trunkeringer i 5'-enden av det 1601 bp fragmentet ble testet. Resultatene oppsummert i figur 5A viser at alle konstruktene, inkludert pGL3 (122), som inneholder bare IRF- og GAS-elementer, var i det minste så effektive som pGL3(1601) til å understøtte basal promoteraktivitet.

Disse resultatene viste at det 122 bp fragmentet (SEKV.ID. NR. 3) som omfatter IRF- og GAS-elementer er tilstrekkelig til å fremme basal aktivitet av et heterologt gen (figur 5A).

Eksempel 6:

Utforskning av den minimale promoteren, oppstrøms for IL-18BP-genet, som er i stand til å fremme induserbar ekspresjon av et heterologt gen.

For å identifisere det minimale DNA-fragmentet, oppstrømsregionen til IL-18BP-promoteren, som er i stand til å fremme IFNy-indusert luciferaseekspresjon, ble de trunkerte DNA-vektorene fra det foregående eksempelet testet i transfekterte HepG2-celler i nærværet av IFNy (figur 5B for trans feksj oner, se eksempel 16).

Resultatene oppsummert i figur 5B viser at etter 24 timer økte IFNy luciferaseaktiviteten 33 ganger over det basale ekspresjonsnivået i vektoren som bare inkluderer IRF-E- og GAS-elementer (pGL3(122) vektor). Dette resultatet viser at IRF-E-GAS-paret alene kan mediere heterolog geninduksjon ved IFNy. Inklusjon av C/EBP-E 1- og -2-elementer (pGL3(656)) øker signifikant induksjonen av luciferaseaktivitet ved IFNy til 88 ganger over basal aktivitet, noe som viser viktigheten av disse elementene i induktivitet ved IFNy. I kontrast til dette utslettet inklusjon av et ytterligere oppstrøms DNA til slike innskudd (pGL3(1106)) induksjon av luciferaseaktivitet over dets basale nivå. Dette resultatet foreslo at et støydemperelement er lokalisert innenfor basene -656 til -1106 (oppstrøms for det andre C/EBP-El-elementet). Det ble demonstrert at tre APl-responselementer er tilstede innenfor støydemperregionen og at c-Jun binder seg til og er involvert i støydemping av IL-18BP-genet gjennom alle av slike tre AP-l-responselementer. Ytterligere utvidelse av promoteren med 88 baser oppstrøms for støydemperen (pGL3(1272)) gjenopprettet responsen til IFNy, noe som antyder at et forsterkerelement er lokalisert i basene -1106 til -1272, og dets aktivering ved IFNy undertrykker virkningen av nabostøydemperen. Ytterligere utvidelse av sekvensen påvirket ikke basal eller IFNy-indusert aktivitet, noe som antyder at alle oppstrøms regulatoriske sekvenser var lokalisert innenfor basene -1 til -1272 (SEKV.ID. NR. 1).

Fra alle konstruktene som ble testet, er induktiviteten til pGL3(656) den høyeste, noe som angir at dette DNA-fragmentet inneholder en optimalt induserbare promoteren til IL-18BP.

Resultater viser at den minimale induserbare promoteren er lokalisert 122 bp oppstrøms for transkripsjonsstartsetet (SEKV.ID. NR. 3) som inneholder IRF-E- og GAS-elementer, hvori den maksimale og optimalt induserbare promoteren er lokalisert 656 bp oppstrøms fra transkripsjonsstartsetet (SEKV.ID. NR. 2) som i tillegg til IRF-E- og GAS-elementene inneholder to C/EBPp-elementer.

Eksempel 7:

Involvering av IRF-1 i IL-18BP-ekspresjon in vivo.

For å undersøke involveringen av IFR-1, hvis bindingssete var funnet å være i promoteren til IL-18BP i IL-18BP-ekspresjon, ble ekspresjonen av IL-18BP i IRF-1-sviktende mus undersøkt.

Nivåene av IL-18BP ble målt i IRF-1-sviktende mus (Jackson laboratories, Bar Harbor, ME) før og etter administrering av murint IFNy og sammenlignet med de i kontroll C57Bl/6-mus (figur 6). Basalt serum IL-18BP i kontroll C57Bl/6-mus var 9,1 ± 1,9 ng/ml og var signifikant økt ved IFNy til 22,4 ± 2,2 ng/ml. I kontrast til dette, var serum-IL-18BP i IRF-1-sviktende mus under deteksjonsgrensen og økte til bare 0,7 + 1,15 ng/ml med IFNy. Dette resultatet bekreftet viktigheten av IRF-1 som en mediator for basal så vel som IFNy-indusert ekspresjon av IL-18BP.

Eksempel 8:

Deteksjon av transkripsjonsfaktorer som bindes til IL-18BP-promoteren under induktive betingelser.

Elektroforetiske mobilitetsforskyvningsassayer (EMSA eksempel 18) ble anvendt for å identifisere protein-DNA-interaksjoner blant de forskjellige responselementene i IL-18BP-promoteren. Merkede dsDNA-prober som tilsvarer basene -33 til -75 (som inneholder IRF-E) og -8 til -55 (som inneholder GAS) ble tillatt å bindes med nukleære ekstrakter fra kontroll- og IFNy-behandlede celler. Et kompleks av IRF-E-holdig probe og nukleært protein(er) var klart etter innkubering av celler i 1 time med IFNy og maksimal respons ble sett ved 3 timer (figur 7 A, sporene 1-5). Som forventet forårsaket tilsetning av antistoffer til IRF-E en "superforskyvning", mens kontroll anti-signalomformer og aktivator av transkripsjon 1 (STAT1) antistoffer ikke hadde noen virkning (data ikke vist). I kontrast til dette, med IRF-E, var den GAS-holdige proben konstitutivt assosiert med et protein (figur 7 A, spor g) og dette komplekset ble forsterket ved induksjon av celler med IFNy i fra 3 til 6 timer (sporene 7,8). GAS er forventet å binde den IFNy-induserte STATl-dimeren. Ikke desto mindre ble komplekset ikke påvirket av antistoffer til STAT1 (spor 10), noe som antyder at IFNy-indusert STATl-dimer ikke var assosiert med denne GAS. Det samme negative resultatet ble oppnådd med nukleære ekstrakter av celler behandlet med IFNy i bare 15 eller 30 minutter (data ikke vist). Overraskende ble dette komplekset opphevet av antistoffer til C/EBPp (spor 9) og ble superforskjøvet med antistoffer til IRF-1 (spor 10). Følgelig synes den GAS-holdige DNA-proben å binde C/EBPp til tross for mangel på en konsensus C/EBPpE.

Resultatene oppnådd med EMSA angir at ved induksjon med IFNy, binder IRF-1 seg til IRF-E-elementet i IL-18BP-promoteren. I tillegg er det dannet et kompleks som omfatter IRF-1 og C/EBPp og bundet til GAS-elementet.

Eksempel 9:

Undersøkelse av rollen til IRF-1-C/EBPp-komplekset i IL-18BP-induksjon.

For ytterligere å undersøke rollen til IRF-1 og C/EBPp i IL-18BP-geninduksjon, ble IL-18BPa mRNA målt ved semikvantitativ RT-PCR etterfulgt av overekspresjon av IRF-1 og C/EBPp ved å anvende transfeksjon av ekspresjonsvektorer (eksempel 14, figur 7 B). Overekspresjon av enten transkripsjonsfaktor eller en kombinasjon av begge faktorene i HepG2-celler, induserte ikke IL-18BP mRNA. Dette resultatet antyder at ytterligere IFNy-induserte faktorer ikke er nødvendig for aktivering av IL-18BP-genet. Transfeksjon av cellene med enten en av ekspresjonsvektorene etterfulgt av deres induksjon med IFNy, reduserte i virkeligheten IL-18BP mRNA sammenlignet med IFNy alene. I kontrast til dette, økte samekspresjon av de to transkripsjonsfaktorene induksjonen av IL-18BP mRNA ved IFNy. Dette resultatet antydet at IRF-1 og C/EBPp må være tilstede i et visst forhold, muligens danne et kompleks inne i transkripsjonsinitieringskomplekset. For ytterligere å undersøke den mulige interaksjonen mellom IRF-1 og C/EBPp, ble en titrering av luciferaseaktivitet ved samtransfekterende celler med pGL3 (1271), en fiksert mengde av IRF-1-ekspresjonsvektor og forskjellige mengder av C/EBPp-ekspresjonsvektor utført. På samme måte ble luciferaseaktivitet målt når C/EBPp-vektoren ble holdt konstant og med forskjellige mengder av IRF-1-vektoren. I begge tilfeller ble en klokkeformet doseresponskurve oppnådd, noe som antyder at optimal IL-18BP-induksjon krever et fiksert molart forhold mellom disse to transkripsjonsfaktorene (figur 7 C).

Immunutfellingsundersøkelser ble utført for å bekrefte den fysikalske assosieringen mellom IRF-1 og C/EBPp (eksempel 19, figur 7 D). Immunutfelling (ip) etterfulgt av immunoblotting (ib) av nukleære og cytoplasmatiske proteiner (eksempel 15) fra IFNy-behandlede celler med antistoffer til C/EBPp, viste at C/EBPp er konstitutivt uttrykt i HepG2-celler og translokeres til kjernen i respons til IFNy (øvre panel). I kontrast til C/EBPp som ikke er indusert med IFNy, viste ip og ib av celleekstrakter med antistoffer til IRF-1 at IFNy induserer ekspresjonen av IRF-1. Men på samme måte som C/EBPp, er IRF-1 translokert til kjernen (midtre panel) ved IFNy-induksjon. Ip med antistoffer til C/EBPp etterfulgt av ib med antistoffer til IRF-1 viste nærværet av et stabilt IRF-l-C/EBPp-kompleks i den nukleære fraksjonen (nedre panel). Disse resultatene bekrefter dannelsen av IRF-l-C/EBPp-komplekset ved IFNy-induksjon og er den første demonstrasjonen av eksistensen av et slikt kompleks mellom disse to transkripsjonsfaktorene. Etter IFNy-induksjon under den proksimale GAS-holdige sekvensen og dens tilstøtende IRF-E binder således komplekset til C/EBPp og IRF-1.

Eksempel 10:

Utforskning av rollen til C/EBP-Es i IL-18BP-promoteraktiviteten.

De to C/EBPp-setene i posisjonene -309 til -322 og -621 til -634 har ikke en tilstøtende IRF-E. EMSA (eksempel 18) av en probe som tilsvarer C/EBPp-setene i stillingene -309 til -322, viste i virkeligheten et retardert bånd (fylte pilhoder) som ble superforskjøvet med antistoffer til C/EBPp (åpne pilhoder), men ikke med antistoffer til IRF-1 (figur 8 A). Følgelig ble det konkludert med at dette setet binder C/EBPp og ikke dets kompleks med IRF-1. Videre ble dette båndet dannet med et kjerneekstrakt av uinduserte HepG2-celler som konstitutivt uttrykker C/EBPw men som mangler IRF-1. Faktum er at IFNy ikke økte ekspresjonen av C/EBPp i disse cellene (figur 8 D) og følgelig økte den ikke intensiteten av de retarderte båndene (figur 8 A). Lignende resultater ble oppnådd med det mer distale C/EBPp-setet (data ikke vist).

Resultatene viser at C/EBP-transkripsjonsfaktoren i motsetning til IRF-1 blir konstitutivt uttrykt og ikke indusert av IFNy og at i tillegg til å bindes til IRF-1 og til GAS, binder den seg til begge C/EBP-elementene som er tilstede i IL-18BP-promoteren.

Eksempel 11:

Undersøkelse av rollen til forsterkeren i ekspresjonen av IL-18BP.

Den regulatoriske rollen til den distale forsterkeren ble undersøkt ved EMSA (eksempel 18) med en 192 bp DNA-probe som korresponderer til nukleotidene -1081 til -1272. Kjerneekstrakt fra kontroll-HepG2-celler dannet et kompleks med denne proben (figur 8 B, fylte pilhoder). Ved behandling av cellene med IFNy, ble komplekset mer intenst og noe mer retardert. En superforskyvning av dette komplekset med antistoffer rettet mot IRF-1, C/EBPp og cFos ble deretter utført. Av disse utløste bare anti-IRF-1 en superforskyvning (figur 8 B, tomme pilhoder). Et umerket dsDNA som tilsvarer nukleotidene -1083 til -1174 konkurrerte ikke med den radiomerkede proben, noe som angir at de nukleære proteinene var bundet til restene -1175 til -1272. Ettersom IRF-E ble identifisert bare i den proksimale regionen, antyder dette resultatet at den distale forsterkeren muligens var assosiert med det proksimale IRF-E.

Disse resultatene indikerer at den distale forsterkeren interagerer med den basale promoteren gjennom IRF-1.

Eksempel 12:

ELISA for IL-18BP.

Humant IL-18BP ble målt med en dobbelt antistoff-ELISA som beskrevet (Novick et al. 2001). IL-18BP fra mus ble målt med en dobbelt antistoff-ELISA ved å bruke kaninantigen affinitetsrenset polyklonalt antistoff til IL-18BP fra mus og biotinylert antistoff som ble oppnådd fra Cytolab, Israel.

Eksempel 13:

RNA-isolering og revers transkripsjon (RT)-PCR.

Etter behandling i serumfritt medium, ble HepG2- og WISH-celler (IO<6>) høstet på de angitte tidspunkter og totalt RNA ble ekstrahert ved å bruke TRI-reagens. cDNA ble fremstilt ved å bruke tilfeldige heksamerer og Superscriptll (Invitrogen™, Leek, Nederland) i henhold til produsentens instruksjoner. PCR ble utført med følgende primere: Humant IL-18BP, 5' CACGTCGTCACTCTCCTGG og 5' CGACGTGACGCTGGACAAC; humant IRF-1 5' GACCCTGGCTAGAGATGCAG og 5' GAGCTGCTGAGTCCATCAG; humant p-aktin 5'

GTGGGGCGCCCCAGGCACCA og 5' CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC.

Amplifiseringer ble utført ved initiell denaturering (92°C, 2 min), 28 denatureringssykluser (92°C, 45 sek), sammenføyning (62°C, 1 min) og utvidelse (72°C, 1,5 min), og avsluttende utvidelse (72°C, 10 min). De resulterende PCR-produktene ble oppløst med agarose (1%) gelelektroforese.

Eksempel 14:

Hurtig amplifisering av 5f cDNA-ender (5f RACE).

5' RACE ble utført med et 5' RACE-system (GIBCO BRL) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble totalt RNA fra IFNy-behandlede WISH-celler revers transkribert (eksempel 13) med en primer komplementær til nukleotidene 89-70 fra IL-18BPa mRNA (GenBank tilgangsnummer AF110799) etterfulgt av forankring av de nylig syntetiserte endene med et anker-DNA. PCR ble deretter utført med en foroverprimer komplementær til anker-DNA og en "nested" revers primer komplementær til nukleotidene 31-11 i IL-18BPa mRNA. PCR-produktene ble deretter subklonet og utsatt for DNA-sekvensanalyse.

Eksempel 15:

Plasmider og kloning.

Hele den antatte IL-18BPa-promoterregionen på 1601 bp ble oppnådd ved PCR av genomisk DNA ved å bruke en sensprimer (S4753.pgl) som inneholder et Kpn I-sete (5' CTATATGGTACCCACCCTTCCTTTTACTTTTTCC) og revers primer (RlexA) som inneholder Nhe I-setet (5' TATCGCTAGCCAGTCACACAGGGAGGCAGT). PCR-produktet ble klonet inn i pGEM-T Easy vektor (Promega, Madison, WI) og verifisert ved DNA-sekvensanalyse. Et Kpn I-Nhe I-fragment ble isolert fra pGEM-T Easy klon og ligert inn i pGL3-Basic vektor (Promega) ved å bruke Rapid DNA ligeringssett (Roche) for å gi pGL3(1601). En serie på 5'-trunkerte reportere (pGL3(1454), pGL3(1274), pGL3(l 106), pGL3(656), pGL3(280) og pGL3(122)) ble på samme måten fremstilt med samme reverse primer og med henholdsvis de følgende sensprimerne:

Alle PCR-produktene ble også klonet inn i pGL3-Basic vektor i den motsatte orienteringen for tjene som kontroller.

Eksempel 16:

Transiente transfeksjonsassayer.

HepG2- eller WISH-celler i 6 brønners plater (0,5 x 10<6>/brønn) ble transfektert ved å bruke FuGENE 6 og den angitte luciferase reportervektoren (0,5^g/brønn) og pSV40 PGAL (0,2^g/brønn, Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. I noen tilfeller ble samtransfeksjon utført med følgende ekspresjonsvektorer: pcDNA3-IRF-l (0,07-1,5^g/brønn, vennligst tilveiebrakt av Dr. B. Levy, Technion, Israel); pcDNA3-C/EBPp (0,5-2,5^g/brønn, vennligst tilveiebrakt av Dr. D. Zipori, Weizmann Institute of Science). Etter 16 timer ble cellene behandlet med enten IFNy (100 U/ml), IL-6 (150 U/ml), TNFa (10 ng/ml) eller deres angitte kombinasjoner i serumfritt medium i 24 timer. Cellene ble deretter innsamlet, lysert og luciferaseaktiviteten ble målt. Alle resultatene ble normalisert mot P-galaktosidaseaktivitet.

Eksempel 17:

Fremstilling av kjerne- og cytoplasmatiske ekstrakter.

Celler ble vasket 3 ganger med iskald fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og øyeblikkelig frosset i flytende nitrogen. Cellepellets ble resuspendert i fire pakkede cellevolumer av cytoplasmatisk buffer (10 mM Hepes, pH 7,9, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 5% (volum) glyserol, 1,5 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,5 mM PMSF, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3V04, 2 mM EGTA, 10 mM EDTA, 10 mM Na2MOC«4, 2 ng/ml hver av leupeptin, pipstatin og aprotinin). Lysatet ble sentrifugert (3000xg, 10 min) og supernatanten som inneholder de cytoplasmatiske proteinene ble oppsamlet. Pelleten ble resuspendert i 2,5 pakkede cellevolumer av kjernebuffer (identisk med cytoplasmatisk buffer med unntak av at NaCl ble økt til 0,42 M). Kjerneavfall ble fjernet ved sentrifugering (15000xg, 20 min, 4°C), porsjoner av supernatanten ble frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80°C. Proteinkonsentrasjon ble bestemt ved et BCA proteinassayreagenssett (Pierce, Rockford, USA) ved å bruke storfe serumalbumin som en standard.

Eksempel 18:

Elektroforetiske mobilitetsforskyvningsassayer.

Ds-oligonukleotider som tilsvarer selekterte responselementer (10 pmol) ble merket med [<32>P]3 ATP med polynukleotidkinase (New England Biolabs). Kjerne ekstrakter (5 \ ig protein) ble preinnkubert (15 min, 0°C) sammen med poly(dl-dC) (Amersham Pharmacia biotechnology) i 20^1 EMSA-buffer (20 mM Hepes, pH 7,5; 5 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 5 mM DTT og 5% (volum) glyserol). En merket probe (3 x IO4 cpm) ble deretter tilsatt og inkubasjonen fortsatte i ytterligere 30 minutter ved romtemperatur. For superforskyvningsassayer ble prøver innkubert med de angitte antistoffene (4^g, 1 time ved 0°C) før tilsetning av proben. Et 200 gangers overskudd av villtype og muterte konkurrenter ble tilsatt sammen med den relevante proben. Reaksjonsblandingene ble deretter elektroforert i 5% ikke-denaturerende polyakrylamidgeler. Geler ble vakuumtørket og autoradiografert natten over ved -80°C.

Eksempel 19:

Immunoutfelling (ip) og immunoblott (ib) analyser.

Kjerne- eller cytoplasmatiske proteinekstrakter (80^g) ble innkubert med 6^g av de angitte polyklonale antistoffene natten over ved 4°C og immunoutfelt med Protein G sefarosekuler (Pharmacia) i 1 time ved romtemperatur. Kulene ble deretter kokt i SDS-PAGE prøvebuffer som inneholder 10% DTT og supernatanten oppløst med SDS-PAGE (10% akrylamid) under reduserende betingelser. Gelen ble deretter blottet på en nitrocellulosemembran og proteinene detektert med de angitte antistoffene. Immunkomplekser ble identifisert med Super Signal™ (Pierce) deteksjonssett.

Eksempel 20:

Fremstilling av CHO r-hsLDLR ved å bruke IL-18BP-promoteren.

Stabile rekombinante CHO-celler som uttrykker humant oppløselig LDLR blir dannet ved samtransfeksjon av CHO-DUKX-celler som mangler dihydrofolatreduktase (DHFR) -genet (Urlaub, G. et al., 1980) med to ekspresjonsvektorer: En som inneholder det N-terminale ligandbindende domenet til LDLR som begynner ved aminosyrerest Asp (+4) opp til Glu 291 (+291) og pDHFR som inneholder det murine genet for DHFR, DHFR kontrollert med tidlig SV40-promoter og sLDLR-genet med IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 2) og transkripsjonstermineringselementer for SV40 tidlig region. Transfeksjon blir utført med kationiske liposomer ved å bruke LipofectAmine (Gibco BRL) i henhold til protokollen beskrevet av produsenten. Syttito timer etter transfeksjon blir cellene overført til et selektivt medium som mangler deoksy- og ribonukleosider og supplert med 10% dialysert FCS. Cellene som uttrykker DHFR-aktivitet er i stand til å danne kolonier som er isolert ved å løfte cellene med papirskiver gjennombløtt med trypsin. Cellene er dyrket og screenet for r-hsLDLR-aktivitet. De transfekterte cellene blir deretter utsatt for genamplifisering med MTX etterfulgt av subkloning og seleksjon av de stabile produksjonsklonene.

REFERANSER

Bahner 1993 J Virol 67: 3199.

Breni et al. 1992 Blood 80: 1418.

Boshart et al. 1985 Cell 41: 521.

Brinster et al. (1981) Cell 27: 233.

Cassel 1993 Exp Hematol. 21: 585.

Chao 1993 Blood 81: 2031.

Chen 1997 Nat Med 3: 1110.

Constantini et al. (1981) Nature 294: 982.

Couture 1996 Trends Genet 12: 510.

Dignam et al. 1983 Nucleic Acid Res. 11: 1475.

Dijkema et al. 1985 EMBO J 4: 761.

Dunbar 1995 Blood 85: 3048.

Dynan and Tjian 1985 Nature 316: 774.

Dynan W 1989 Cell 58: 1-4.

Fletcher et al. 1987 Cell 51: 773-781.

Fried et al. 1981 Nucleic Acids Res. 9, 6505.

Gale et al. 1992 Transplant 9: 151.

Gordon et al. (1976) PNAS 73: 1260.

Gorman et al 1982b PNAS 79: 6777.

Henon et al. 1992 Transplant 9: 285.

Herzog, R.W., Hagstrom, J.N., Kung, S.H., Tai, S.J., Wilson, J.M., Fisher, K.J. & High, K.A. (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94, 5804-5809.

Harpers et al. (1981) Nature 293: 540.

Hao et al. 1995 Blood 86: 3745.

Junker 1997 Blood 89: 4299.

Kearns 1997 Human Gene Ther 8: 310.

Kohn et al. (1999) Blood 94: 368.

Lee 1994 J. Virol 68: 8254.

Lili Wang<*>, Kazuaki Takabe^, Scott M. Bidlingmaier<*>, Charles R. Ill<*>, and Inder M. Verma Vol. 96, Issue 7, 3906-3910, 30. mars 1999 Sustained correction of bleeding disorder in hemophilia B mice by gene therapy.

Lotti et al. 2002 J of Virol. 76: 3996.

Malim 1989 Cell 58: 205.

Maniatis et al. 1987 Science 236: 1237.

Marasco 1997 Gene Ther 4: 11.

Muhl, H., Kampfer, H., Bosmann, M., Frank, S., Radeke, H. & Pfeilschifter, J.

(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 960-963.

Murphy, J.E., Zhou, S., Giese, K., Willams, L.T., Escobedo, J.A. & Dwarki, V.J.

(1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94, 13921-13926.

Neighbors, M., Xu, X., Barrat, F.J., Ruuls, S.R., Churakova, R., Debets, R., Bazan, J.F., Kastelein, R.A., Abrams, J.S. & 0'Garra, A. (2001) J. Exp. Med. 194, 343-354.

Novick, D., Schwartsburd, B., Pinkus, R., Suissa, D., Belzer, I., Sthoeger, Z., Keane, W.F., Chvatchko, Y., Kim, S.H., Fantuzzi, G., Dinarello, CA. & Rubinstein, M. (2001) Cytokine 14, 334-342.

Novick D, Kim SH, Fantuzzi G, Reznikov LL, Dinarello CA, Rubinstein M. Immunity 1999 Jan; 10(1): 127-36.

Novick D, Schwartsburd B, Pinkus R, Suissa D, Belzer I, Sthoeger Z, Keane WF, Chvatchko Y, Kim SH, Fantuzzi G, Dinarello CA, Rubinstein M. Cytokine 2001 21. juni; 14(6): 334-42.

McKnight and Tjian 1986 Cell 46: 795.

Mioshi et al. 1999 Science 283: 682.

Moritz 1993 J Exp Med 178: 529.

Palmiter et al. 1986 Ann Rev. Genet. 20: 465.

Revzin 1989 Biotechniques 7: 346.

Sassone-Corsi and Borreli 1986 Trends Genet 2:215.

Scheidereit et al. 1987 Cell 51: 783-793.

Slobod 1996 Blood 88, 3329.

Snyder, R.O., Miao, C.H., Patijn, G.A., Spratt, S.K., Danos, O., Nagy, D., Gown, A.M., Winther, B., Meuse, L., Cohen, L.K., et al. (1997) Nat. Genet. 16, 270-276.

Snyder, R.O., Miao, C, Meuse, L., Tubb, J., Donahue, B.A., Lin, H.F., Stafford, D.W., Patel, S., Thompson, A.R., Nichols, T., et al. (1999) Nat. Med. 5, 64-70.

Song, S., Morgan, M., Ellis, T., Poirier, A., Chesnut, K., Wang, J., Brantly, M., Muzyczka, N., Byrne, B.J., Atkinson, M., et al. (1998) Proe. Nati. Acad. Sei. USA95, 14384-14388.

Sullenger 1990 Cell 63: 601.

Veres et al. 1996 J Virol 70: 8792.

Verma et al. 1997 Nature 389: 239.

Voss et al. 1986 Trends Biochem Sei. 11: 287.

Wagner et al. (1981) PNAS 78: 5016.

Xiao, W., Berta, S.C., Lu, M.M., Moscioni, A.D., Tazelaar, J. & Wilson, J.M.

(1998)7. Virol. 72, 10333-10226.

Zecchina G, Novick D, Rubinstein M, Barak V, Dinarello C, Nagler A. J Hematother Stem Cell Res. 2001 desember; 10(6): 769-76.

Zhou 1994 Gene 149: 33.

Zweibel et al. 1989 Science 243: 220.

Claims (1)

1. DNA-sekvens koder den humane IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 1) eller et funksjonelt fragment eller et funksjonelt derivat derav, karakterisert vedat 3'-enden av nevnte DNA-sekvens eller fragment derav omfatter SEKV.ID. NR. 5.

2. DNA-sekvens som angitt i krav 1, karakterisert vedat derivatet er mutert i ett eller flere API-seter som er tilstede i et ekspresjonshemmende (silencer element) tilstede i sekvensen.

3. DNA-sekvens som angitt i krav 1, karakterisert vedat fragmentet omfatter SEKV.ID. NR. 2.

4. DNA-sekvens som angitt i krav 1, karakterisert vedat fragmentet omfatter SEKV.ID. NR. 3.

5. DNA-sekvens som angitt i ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert vedat den ytterligere omfatter et intron.

6. DNA-sekvens som angitt i krav 5, karakterisert vedat intronet består av det første intronet til IL-18BP.

7. DNA-sekvens som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere inneholder et gen som er operativt koblet til IL-18BP-promoteren.

8. DNA-sekvens som angitt i krav 7, karakterisert vedat genet koder IL-18BP.

9. DNA-sekvens som angitt i krav 7, karakterisert vedat genet koder et heterologt protein.

10. DNA-sekvens som angitt i krav 9, karakterisert vedat det heterologe genet koder luciferasegenet.

11. DNA-sekvens som angitt i krav 9, karakterisert vedat det heterologe genet koder et protein valgt fra interferon-beta, TNF, erytropoietin, vevsplasminogenaktivator, granulocyttkolonistimulerende faktor, mangansuperoksiddismutase, et immunoglobulin eller et fragment derav, veksthormon, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR og TNF-reseptorbindende proteiner.

12. Vektor, karakterisert vedat den omfatter en DNA-sekvens som angitt i ethvert av de foregående krav.

13. Vertscelle, karakterisert vedat den omfatter en vektor som angitt i krav 12.

14. Vertscelle som angitt i krav 13, karakterisert vedat den er en pattedyrcelle.

15. Vertscelle som angitt i krav 14, karakterisert vedat den er valgt fra CHO-, WISH-, HepG2-, Cos-, CV-1-, HeLa- og Hakat U937-celler.

16. Fremgangsmåte til fremstilling av et rekombinant protein,karakterisert vedat den omfatter å dyrke en vertscelle som angitt i ethvert av kravene 13 til 15 og isolere det produserte rekombinante proteinet.

17. Rekombinant virusvektor, karakterisert vedat den omfatter en del av virusgenomet, et DNA-fragment som koder et gen av interesse og et DNA-fragment som omfatter en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren i henhold til ethvert av kravene 1 til 6, operativt koblet til genet av interesse.

18. Rekombinant virusvektor som angitt i krav 17, karakterisert vedat genet av interesse er valgt fra interferon-beta, TNF, erytropoietin, vevsplasminogenaktivator, granulocyttkolonistimulerende faktor, mangansuperoksiddismutase, et immunoglobulin eller et fragment derav, veksthormon, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR og TNF-reseptorbindende proteiner.

19. Rekombinant virusvektor som angitt i krav 17, karakterisert vedat delen av virusgenomet tilhører et adenoassosiert virus.

20. Rekombinant virusvektor som angitt i krav 17, karakterisert vedat delen av virusgenomet til hører et retrovirus.

21. Rekombinant virusvektor som angitt i krav 20, karakterisert vedat retroviruset er valgt fra HIV, HFV, MLV, FIV og VSV.

22. In vitro-fremgangsmåte for å regulere cellespesifikk ekspresjon av et gen av interesse, karakterisert vedat den omfatter å innføre i en målpattedyrcelle en vektor i henhold til ethvert av kravene 17 til 21.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 22, karakterisert vedat målcellen er en hematopoietisk stamcelle.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 22, karakterisert vedat målcellen er en monocytt.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 24, karakterisert vedat målcellen er en makrofag.

26. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 22 til 25,karakterisert vedat genet av interesse koder et protein som gir resistens mot HIV-infeksjon.

27. Anvendelse av rekombinant virusvektor i følge ethvert av kravene 17-21 for fremstilling av et medikament for behandling av HIV-infeksjon, hematopoietiske lidelser slik som SCID, kronisk granulomatøs sykdom og talassemi, og/eller en sykdom i et individ som utviser forhøyet IFNy i kroppsvev.

28. Anvendelse i følge krav 27, hvori medikamentet er for behandling av en sykdom i et individ som utviser forhøyet IFNy i kroppsvev og ytterligere omfatter IL-6 og/eller TNFa og/eller IRF og/eller C/EBPp-faktorer.

29. Transgene mus, karakterisert vedat de har DNA-sekvensen som koder en DNA-sekvens i henhold til ethvert av kravene 1 til 11.

30. Anvendelse av en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 1) eller et fragment eller funksjonelt derivat derav,karakterisert vedat 3'-enden av nevnte DNA-sekvens eller fragment derav omfatter SEKV.ID. NR. 5, for fremstillingen av et legemiddel for behandling av en HIV-infeksjon, hematopoietiske lidelser slik som SCID, kronisk granulomatøs sykdom og talassemi, og/eller en sykdom i et individ som utviser forhøyet IFNy i kroppsvev.

34. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert vedat den omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en DNA-sekvens som koder den humane IL-18BP-promoteren (SEKV.ID. NR. 1) eller et funksjonelt fragment eller et funksjonelt derivat derav, hvori 3'-enden av nevnte DNA-sekvens eller fragment derav omfatter SEKV.ID. NR. 5.