PT1556412E - Promotor para il-18bp, sua preparação e utilização - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "PROMOTOR PARA IL-18BP, SUA PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com o promotor da proteína de ligação a interleuquina-18 (IL-18BP), com a sua preparação e utilização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As proteínas de ligação a citoquina (receptores de citoquina solúveis) são usualmente os domínios de ligação a ligando extracelular dos seus receptores de citoquina de superfície celular respectivos. São produzidos quer por excisão alternativa ou por quebra proteolítica do receptor de superfície celular. Estes receptores solúveis foram descritos no passado: por exemplo, os receptores solúveis para IL-6 e IFNy (Novick et al. 1989), TNF (Engelmann et al. 1989 e Engelmann et al. 1990), IL-1 e IL-4 (Maliszewski et al. 1990) e IFNa/β (Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). Uma proteína de ligação a citoquina, denominada osteoprotegerina (OPG, também conhecida como factor inibidor de osteoclasto - OCIF), um membro da família TNFR/Fas, parece ser o primeiro exemplo de um receptor solúvel que existe apenas como uma proteína segregada (Anderson et al. 1997, Simonet et al. 997, Yasuda et al. 1998).

Uma proteína de ligação a interleuquina-18 (IL-18BP) foi purificada por afinidade, numa coluna IL-18, a partir de urina (Novick et al. 1999). A IL-18BP suprime a indução de IFNy por IL-18, e a activação de NF-kB por IL-18 in vitro. 2

Em adição, a IL-18-BP inibe a indução de IFNy em murganhos injectados com LPS. 0 gene de IL-18BP foi localizado no cromossoma humano 11, e não se pôde encontrar um exão que codifique para um domínio da transmembrana na sequência genómica de 8,3 kb que compreende o gene de IL-18BP. Até agora foram descobertas quatro isoformas de IL-18BP qeradas por excisâo alternativa de ARNm em seres humanos. Foram designadas IL-18BP a, b, c, e d, todas partilhando a mesma extremidade N e diferindo na extremidade C (Novick et al. 1999) . Estas isoformas variam na sua capacidade de se ligar a IL-18 (Kim et al. 2000). Das quatro, as isoformas a e c de IL-18BP humano (hIL-18BP) são conhecidas por possuírem uma capacidade neutralizante para IL-18. A isoforma mais abundante de IL-18BP, a isoforma variante sujeita a excisão a, exibe uma elevada afinidade para IL-18 com uma activação rápida e uma inactivação lenta, e uma constante de dissociação (Kd) de aproximadamente 0,4 nM (Kim et al. 2000) . A IL-18BP é constitutivamente expressa no baço (Novick 1999), e circula a concentrações no plasma de 2,5 ng/mL (Novick et al. 2001). Os resíduos envolvidos na interacção da IL-18 com a IL-18BP foram descritos através da utilização de modelação computacional (Kim et al. 2000) e são baseados na interacção entre a proteína semelhante IL-Ιβ com a IL-1R tipo I (Vigers et al. 1997) . De acordo com o modelo de ligação da IL-18 à IL-18BP, foi proposto que o resíduo Glu na posição 42 e o resíduo Lys na posição 89 de IL-18 se liguem a Lys-130 e a Glu-114 em IL-18BP, respectivamente (Kim et al. 2000).

Como mencionado, a IL-18 induz IFNy que, por sua vez, foi recentemente reportado induzir a geração de ARNm da IL-18BPa in vitro (Muhl et al. 2000). Consequentemente, a IL- 3 18BPa poderia servir como um sinal de "inactivação", terminando a resposta inflamatória. A IL-18BP é significativamente homóloga a uma familia de proteínas codificada por vários Poxvírus (Novick et al. 1999, Xiang e Moss 1999). A inibição de IL-18 por esta IL-18BP virai putativa poderá atenuar a resposta inflamatória Th 1 antiviral. A IL-18BP do soro é significativamente elevada em sepsia, indicando o seu papel na regulação de respostas imunológicas in vivo (Novick et al. 2001). De facto, a IL-18BP é induzida por IFNy em várias células, sugerindo que serve como um inibidor de retroalimentação negativa da resposta imunológica mediada pela IL-18 (Mughl et al. 2000).

Resultados preliminares indicam que a IL-18BP ARNm é detectada em leucócitos, cólon, intestino delgado, próstata e particularmente em células do baço (Novick et al. 1999). As células componentes do baço consistem em macrófagos, linfócitos, e células do plasma com células adicionais derivadas a partir da circulação. A actividade de elementos que controlam a transcrição, o promotor e os intensificadores varia consideravelmente entre os diferentes tipos de células. Os promotores e intensificadores consistem em redes pequenas de sequências de ADN que interactuam especificamente com as proteínas celulares envolvidas na transcrição (revisto em Dynan e Tjian 1985, McKnight e Tjian 1986, Sassone-Corsi e Borreli 1986 e Maniatis et al. 1987). A combinação de diferentes sequências de reconhecimento e das quantidades dos factores 4 de transcrição aparentados determinam a eficiência com que um dado gene é transcrito num tipo particular de célula. Muitos promotores eucarióticos contêm dois tipos de sequências de reconhecimento: a caixa TATA e os elementos promotores a montante. Crê-se que a caixa TATA, localizada 25-30 bp a montante do sitio de inicio da transcrição, está envolvida na direcção da ARN polimerase II para iniciar a sintese de ARN no sitio correcto. Em contraste, os elementos promotores a montante determinam a taxa a que a transcrição é iniciada. Os elementos intensificadores podem estimular a transcrição até 1000 vezes a partir dos promotores homólogos ou heterólogos associados. No entanto, contrariamente aos elementos promotores a montante, os intensificadores são activos quando colocados a jusante do sitio do inicio da transcrição ou a uma distância considerável a partir do promotor. Muitos intensificadores de genes celulares trabalham exclusivamente num tecido particular ou num tipo celular (revisto por Voss et al. 1986, Maniatis et al. 1987). Em adição alguns intensificadores tornam-se activos apenas sob condições especificas que são geradas pela presença de um indutor, tal como uma hormona ou ião metálico (revisto por Sassone-Corsi e Borrelli 1986 e Maniatis 1987) . Devido a estas diferenças nas especificidades das células de intensificadores celulares, a escolha dos elementos promotor e intensificador a serem incorporados num vector de expressão eucariótico será determinada pelos tipos celulares em que o gene recombinante é para ser expresso. Contrariamente, a utilização de um vector pré-fabricado contendo um promotor especifico e intensificador celular poderá limitar severamente os tipos de célula em que a expressão pode ser obtida. 5

Muitos elementos intensificadores derivados de virus possuem uma gama de hospedeiro mais vasta e são activos numa variedade de tecidos, embora sejam observadas diferenças quantitativas significativas entre os diferentes tipos de células. Por exemplo, o intensificador precoce SV40 é promiscuamente activo em muitos tipos de célula derivados a partir de uma variedade de espécies de mamíferos, e consequentemente foram utilizados vectores que incorporam este intensificador (Dijkema et al. 1985). Duas outras combinações de intensificador/promotor que são activas numa vasta gama de células são derivadas a partir de uma repetição longa (LTR) do genoma do vírus de sarcoma Rous (Gorman et al. 1982) e a partir do citomegalovírus humano (Boshart et al. 1985).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção relaciona-se com uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana (SEQ ID 5 N0:1), ou uma fragmento tal como aquele na SEQ ID NOS 2 ou 3, ou um seu derivado funcional em que a terminação 3' da referida sequência de ADN ou do seu fragmento compreende um ou mais nucleótidos a partir da terminação 5'da SEQ ID NO: 5.

Mais especificamente, um derivado de acordo com a invenção pode ser o ADN da invenção mutado num ou mais sítios AP1 presentes num elemento silenciador presente na sequência, e a sequência de ADN poderá adicionalmente conter um gene operativamente ligado ao promotor da IL-18BP.

Num aspecto da invenção, o gene poderá codificar e.g. IL-18BP ou uma proteína heteróloga tal como luciferase, interferão-beta, TNF, eritropoietina, activador do plasminogénio de tecido, factor estimulante da colónia de 6 granulócitos, superóxido dismutase de manganês, uma imunoglobulina, ou seu fragmento, hormona de crescimento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR e proteínas de ligação ao receptor de tnf. A invenção providencia um vector compreendendo uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana, uma célula hospedeiro compreendendo o vector e.g. células CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, e Hakat U937, e um método para a produção de uma proteína recombinante compreendendo cultivar a célula hospedeiro e isolar a proteína recombinante produzida.

Em adição, a invenção providencia um vector virai recombinante que compreende uma porção do genoma do vírus, um fragmento de ADN que codifica um gene de interesse e um fragmento de ADN compreendendo uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana. Mais especificamente a porção de vírus pode ser e.g. um vírus adeno associado, e um retrovírus tal como HIV, HFV, MLV, FIV e VSV.

Também a presente invenção providencia um método para regular a expressão específica celular de um gene de interesse, compreendendo a transdução de uma célula de mamífero alvo com o vector virai da invenção numa célula alvo tal como uma célula mãe hematopoiética, e um monócito. 0 gene de interesse pode ser e.g. uma proteína que confere resistência à infecção por HIV. A regulação da expressão específica da célula de um gene de interesse pode ser utilizada no tratamento de e.g. infecção por HIV, no tratamento de patologias hematopoiéticas tais como SCID, doença granulomatosa crónica e talasemia. 7 A invenção providencia adicionalmente um método de terapia genética para o tratamento de uma doença num indivíduo que exibe elevado IFNy num tecido corporal, compreendendo a administração de uma quantidade efectiva do vector virai da invenção, opcionalmente compreendendo adicionalmente a administração de IL-6 e/ou TNF-α e ou factores IRF e ou C/ΕΒΡβ.

Noutro aspecto a invenção relaciona-se com murganhos transgénicos que contêm a sequência de ADN que codifica uma sequência de ADN da invenção.

Em adição a invenção ensina a utilização de uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana (SEQ ID N0:1), ou um seu fragmento ou um seu derivado funcional em que a terminação 3' da referida sequência de ADN ou seu fragmento compreende um ou mais nucleótidos a partir da terminação 5' da SEQ ID NO: 5, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença.

Também, a invenção providencia uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana (SEQ ID N0:1), ou um seu fragmento ou um seu derivado funcional em que a terminação 3' da referida sequência de ADN ou seu fragmento compreende um ou mais nucleótidos a partir da terminação 5'de SEQ ID NO: 5.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra uma representação esquemática da região do promotor do gene da IL-18BP, incluindo os 5 elementos reguladores. 8 A Figura 2 mostra as cinéticas da indução de IL-18BP e a sinergia com TNFa e IL-6. (A) 0 IFNy induz a IL-18BP de uma maneira dependente da dose e do tempo em células WISH humanas. As células foram incubadas com as concentrações indicadas de IFN-γ durante 24 e 48 h. (B) Efeitos sinergisticos de TNFa; IL-6 e sua combinação em IL-18BP induzida por IFNy. As células HepG2 foram incubadas com as combinações indicadas de IFNy (100 U/mL), TNFa (20 ng/mL) e IL-6 (300 U/mL) . A indução de IL-18BP por cada combinação foi significativamente superior (p < 0,05) que a indução por IFNy sozinho. Os dados são a média ± SD (n = 3, para A. n = 4, para B) . A Figura 3 mostra uma representação esquemática da organização conservada exão-intrão dos genes da IL-18BP humana e de murganho. O gene da IL-18BPa humana foi comparado com o gene da IL-18BPd de murganho. Os exãos são indicados. O sitio do inicio da transcrição, o sitio do inicio da translação (ATG), o codão de paragem (Stop) e o sinal de poliadenilação (PAS) são indicados para o gene da IL-18BPa humana. A Figura 4 mostra que a indução de IL-18BP por IFNy está no nível transcricional e depende da síntese de proteína de novo. (A) A RT-PCR semi-quantitativa de ARNm da IL-18BP a partir de células HepG2 que foram pré-incubadas com actinomicina D (1 pg/mL, 30 min), lavadas e incubadas com IFNy (100 U/mL) durante os tempos indicados. A RT-PCR do ARNm da actina R é exibida como um controlo (B) A RT-PCR semi-quantitativa de ARNm da IL-18BP a partir de células HepG2 que foram pré-incubadas com cicloheximida (20 pg/mL) e IFNy (100 U/mL) durante os tempos indicados. 9 A Figura 5 mostra a actividade basal e a actividade induzida por IFN-γ dos vectores repórteres de luciferase que transportam o promotor da IL-18BP humana. 0 tamanho da inserção, que se estende desde o sítio do início da transcrição (+1) é dado entre parênteses. Os números no interior de um circulo representam os vários elementos de resposta: 1. GAS. 2. IRF-E. 3. C/EBP-E (2 sítios). Silenciador 5. Intensificador distai. Os quadrados a cheio ilustram a mutação num elemento de resposta específico. As células HepG2 foram co-transfectadas com o vector repórter indicado e com pSV40 pGAL. Todos os valores de luciferase foram normalizados à actividade de β-galactosidase. (A) Actividade da luciferase em extractos de células não induzidas relativamente àquela de células transfectadas com o vector pGL3-Básico. (B) Actividade da luciferase em células transfectadas com vectores seleccionados e induzidos com IFNy. As vezes de indução estão sobre a actividade basal como dado em (A) . A Figura 6 mostra que IRF-1 é essencial para a expressão da IL-18BP em murganhos. A IL-18BP em soro de murganhos C57BI/6 IRF-1_/” e murganhos de controlo C57 BI/6 que foram injectados intraperitonealmente com IFNy de murino (53 000 u/murganho). Os murganhos foram sangrados antes da injecção e 24 h após a injecção. A IL-18BP no soro foi determinada por ELISA. Os dados são a média ± SE (n = 6 para cada grupo). As diferenças entre a IL-18BP no soro em murganhos de controlo e em murganhos deficientes em IRF, assim como na indução de IL-18BP em murganhos de controlo foram estatisticamente significativas (p < 0,05). 10 A Figura 7 mostra o papel de IRF-1 e de C/ΕΒΡβ na indução do gene da IL-18BP e sua associação. (A) Ensaio de variação da mobilidade electroforética (EMSA Exemplo 18) das sondas de ADNds correspondendo às bases -33 até -75 (IRF-E, painel esquerdo) e -8 até -55 (GAS, painel direito). As células HepG2 foram tratadas com IFNy durante os tempos indicados e os extractos nucleares foram deixados reagir com as sondas IRF-E ou GAS. As bandas desviadas são indicadas por pontas de setas a cheio. O complexo GAS foi também sujeito a um super-desvio com os anticorpos indicados. A banda super-desviada é indicada por uma ponta de seta por preencher. (B) RT-PCR semi-quantitativa de ARNm da IL-18BP a partir de células HepG2 que foram transfectadas com as combinações indicadas dos vectores de expressão de IRF-1 ou C/ΕΒΡβ. Quando indicado, foi adicionado IFNy e as células foram recolhidas 5 h mais tarde. Os valores foram normalizados relativamente ao ARNm de β actina. (C) Actividade luciferase em células transfectadas com o vector repórter de luciferase pGL3 (1272), que contém o promotor completo da IL-18BP, juntamente com a concentração indicada de pCADN3-IRF-l (círculos) e 1 yg/106 células de pCADN3-C/ΕΒΡβ. Alternativamente, as células foram transfectadas com a concentração indicada de pCADN3-C/EBPp (quadrados) e 0,1 yg/106 células de pCADN3-IRF-l. A actividade de luciferase foi normalizada através da actividade pGal. (D) imunotransferências de extractos nucleares e citoplásmicos (ver o Exemplo 17 para a preparação de extractos) de células tratadas com IFNy (100 U/mL, 2 h) . Os extractos foram sujeitos a imunoprecipitação (IP) e a imunotransferência (IB) com os anticorpos indicados. 11 A Figura 8 mostra os factores de ligação ao promotor de IL-18BP após a indução por IFNy (A) EMSA com a C/ΕΒΡβ E proximal e a totalidade dos extractos celulares após o tratamento com IFNy. Quando indicado, os extractos foram super-desviados com os anticorpos indicados. (B) EMSA com uma sonda correspondendo ao intensificador distai e a totalidade dos extractos celulares após o tratamento com IFNy. Quando indicado, os extractos foram super-desviados com os anticorpos indicados, com ou sem competição com ADNds correspondendo à metade proximal da sonda. As bandas desviadas estão indicadas por pontas de setas a cheio e a banda super-desviada está por pontas de setas por preencher.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com o promotor da IL-18BP humana. Este promotor dirige a expressão constitutiva da IL-18BP em células particulares, por exemplo em monócitos e a indução da expressão de IL-18BP mediada por IFNy em muitas células. 0 promotor da IL18BP humana é capaz de dirigir a expressão constitutiva e induzida por IFNy de uma proteína heteróloga. A invenção relaciona-se com uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana (SEQ ID N0:1), ou um seu fragmento ou um seu derivado funcional em que a terminação 3' da referida sequência de ADN ou seu fragmento compreende um ou mais nucleótidos a partir da terminação 5' da SEQ ID N: 5. 0 ARNm da IL-18BP é detectado em leucócitos, cólon, intestino delgado, próstata e principalmente em células do 12 baço (Novick et al. 1999). Num dos exemplos adiante é mostrado que a proteína IL-18 é expressa constitutivamente em monócitos.

Foi descoberto que a expressão da IL-18BP é induzida por IFNy, não apenas em monócitos mas também em muitas células diferentes e que esta indução poderia ser intensificada adicionalmente pela adição de IL-6 e TNFa.

Foi descoberto de novo que a síntese proteica é essencial para a activação do gene da IL-18BP por IFNy. 0 sítio do início da transcrição do ARNm da IL-18BPa humana foi determinado por 5' RACE.

Descobriu-se que a 3' terminação do ARNm da proteína do dedo de Zn localizada a montante do gene da IL-8BP limita assim a sequência reguladora potencial a montante da IL-18BPa até 1601 bases a montante da base 1.

Foram identificados seis elementos reguladores (Figura 1) nesta região (a partir da transcrição proximal até à transcrição distai): 1- Uma sequências activada por gama (GAS) nas bases -24 até -32, 2- Um elemento de resposta IRF-1,2 (IRF-E) nas bases de extensão —57 até —69, 3- e 4-dois elementos de resposta C/ΕΒΡβ nas bases -309 até -322 e —621 até — 634, 5- Um silenciador nos resíduos —625 até — 1106 e 6- Um elemento intensificador nas bases de extensão - 1106 até -1272. Uma série de vectores repórteres de luciferase com truncagens progressivas na terminação 5' do fragmento de 1601 bp foi testada em células HepG2 (uma linha de carcinoma hepatocelular humano). A região de 1272 kb estabelecida na SEQ ID NO: 1 dirige ambas, uma expressão 13 basal observada nalguns tecidos e tipos celulares, assim como uma indução por IFNy. A avaliação da actividade do promotor em fragmentos de ADN sucessivamente truncados nesta região demonstraram que um fragmento de ADN de 122 bp, proximal ao sitio do inicio da transcrição estabelecido na SEQ ID NO: 3 compreende o promotor minimo. Este promotor minimo é também indutivel. No entanto, outras sequências reguladoras a montante deste promotor minimo contribuem para a extensão da indução. Foi descoberto que um fragmento de ADN de 635 bp contendo em adição aos elementos IRF-1 e GAS dois elementos C/ΕΒΡβ, estabelecidos na SEQ ID NO: 2, confere indução máxima de expressão de luciferase por IFNy.

As experiências in vivo levadas a cabo com murganhos deficientes em IRF-1 confirmaram a importância de IRF-1 como um mediador de expressão basal de IL 18BP assim como de expressão de IL 18BP induzida por IFNy.

Foi descoberto que após indução por IFNy, a expressão do factor IRF-1 é induzida e o factor é complexado com C/ΕΒΡβ que está constitutivamente presente nas células. 0 complexo liga-se ao elemento promotor GAS proximal e ao seu elemento promotor IRF-E adjacente.

Foi descoberto que o intensificador presente no sitio de transcrição distai terminal interactua com o promotor basal através de IRF-1.

A presente invenção relaciona-se com o promotor da IL18BP da SEQ ID N0:1 ou com um seu fragmento e com métodos para regular a expressão do gene. Mais particularmente, a presente invenção relaciona-se com as sequências de ADN 14 isoladas da IL-18BP de 1272 bp (SEQ ID N0:1) ou com um seu fragmento tal como, 635 bp (SEQ ID NO: 2) e 122 bp (SEQ ID NO: 3) que são capazes de dirigir a expressão do gene.

Esta região promotora de IL-18BP foi clonada e sujeita a sequenciação e corresponde aos nucleótidos na região de 1272 bp a montante do sitio do inicio da transcrição da IL-18BP (SEQ. ID. NO: 1). A presente invenção compreende a totalidade do promotor de IL-18BP (SEQ ID NO:1), mas também sequências de ADN compreendendo um seu fragmento (SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3), capazes de dirigir a transcrição do gene, e consequentemente finalmente a expressão do gene, e podem ser utilizados com outras porções da região promotora da IL-18BP ou alternativamente com promotores heterólogos ou elementos promotores heterólogos para controlar a transcrição do gene. Este promotor ou seu fragmento é capaz de realizar a indução por IFNy. Tal indução pode ser intensificada adicionalmente através da sobre-expressão de IRF-1 e/ou C/ΕΒΡβ e/ou por tratamento com IL-6 e/ou TNFa.

Os derivados funcionais de promotor estabelecidos na SEQ ID N0:1, ou seus fragmentos tais como a SEQ ID NO:2 ou a SEQ ID NO: 3 são mutantes em que 1 a 10, preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente 1 nucleótido é substituído por outro, ou é suprimido e que são capazes de dirigir a expressão do gene e a indução por IFNy.

As sequências de ADN da presente invenção compreendendo um promotor de IL-18BP (SEQ ID NO: 1) ou um seu fragmento tais como aquelas na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, podem ser isoladas utilizando vários métodos conhecidos na técnica. 15

Poderão ser empregues pelo menos três métodos principais alternativos: (1) o isolamento da sequência de ADN a partir do ADN genómico que contém a sequência; (2) a síntese química da sequência de ADN; e (3) a síntese da sequência de ADN por reacção em cadeia da polimerase (PCR).

Na primeira abordagem, pode ser seleccionada uma biblioteca de ADN genómico humano de modo a identificar uma sequência de ADN que compreende um promotor da IL-18BP ou um elemento promotor da IL-18BP.

Na segunda abordagem, pode ser sintetizada quimicamente uma sequência de ADN compreendendo um promotor da IL-18BP ou um elemento promotor da IL-18BP. Por exemplo, pode ser sintetizada uma sequência de ADN compreendendo uma região promotora da IL-18BP ou um promotor da IL-18BP como uma série de 100 bases de oligonucleótidos que posteriormente se podem ligar sequencialmente (através de sítios de restrição terminal adequados) de modo a formar a sequência linear correcta de nucleótidos.

Na terceira abordagem, pode ser sintetizada uma sequência de ADN compreendendo uma região promotora da IL-18BP ou um promotor da IL18BP utilizando PCR. Resumidamente, podem ser utilizados pares de oligonucleótidos de ADN sintético de pelo menos 15 bases de comprimento (iniciadores de PCR) que sofrem hibridação com cadeias opostas da sequência de ADN alvo para amplificar enzimaticamente a região de ADN interveniente na sequência alvo. Os ciclos repetidos de desnaturação pelo calor do modelo, emparelhamento dos iniciadores e extensão das terminações 3' dos iniciadores 16 emparelhados com uma ADN polimerase resulta na amplificação do segmento definido pelas terminações 5' dos iniciadores de PCR. Ver, Pat. U.S. Nos. 4 683 195 e 4 683 202. O promotor da IL-18BP da invenção mostrou ser capaz de conferir expressão basal e também expressão induzida por IFNy de um gene heterólogo. Assim, o promotor de IL-18BP possui ambas a actividade basal e indutivel.

Enquanto que a sequência de nucleótidos do promotor é estabelecida na SEQ. ID. NO.l ou nos seus fragmentos possuindo actividades promotoras e se faz referência à referida sequência na especificação, é reconhecido que se podem elaborar derivados de nucleótidos que não afectam a função do promotor ou do elemento promotor. Estas sequências de nucleótidos modificadas poderão ser preparadas, por exemplo, através da mutação da sequência de nucleótidos de modo que a mutação resulte na supressão, substituição, inserção, inversão ou adição de um ou mais nucleótidos utilizando vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, poderão ser empregues os métodos de mutagénese de dirigida para o sitio descrito em Taylor, J. W. et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985) e Kunkel, J. A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 482-492 (1985). Em adição, poderão ser adquiridos kits (conjuntos) para mutagénese dirigida para o sitio a partir de vendedores comerciais. Por exemplo, poderá ser adquirido um kit (conjunto) para realizar mutagénese dirigida para o sitio a partir da Amersham Corp. (Arlington Heights, 111.). A presente invenção compreende ADN contendo sequências idênticas em pelo menos 50 % e preferencialmente idênticas em 75 % e mais preferencialmente idêntica em 90 % à SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3 respectivamente, na 17 condição de que a actividade do promotor seja retida e/ou intensificada. Um tal derivado e.g. na SEQ ID N0:1 é aquele que sofreu mutação num ou na totalidade dos três sitios AP1 presentes na região silenciadora. A sequência de nucleótidos compreendendo o promotor da IL-18BP, um seu fragmento e/ou um seu derivado poderá estar operativamente ligada à região de codificação de qualquer gene de interesse para expressar esse gene numa célula hospedeiro adequada. Por operativamente ligado entende-se operativamente ligado ao promotor e aos elementos. Para a expressão de um gene de interesse, é preferido que a totalidade do promotor de IL-18BP na SEQ. ID. N0.1: ou um seu fragmento tal como na SEQ ID 2 ou SEQ ID NO:3 ou um seu derivado esteja operativamente ligado ao gene de interesse. Como apresentado adiante na secção de exemplos, o promotor da IL-18BP, ou um seu fragmento tal como aquele na SEQ ID NO: 2 ou na SEQ ID NO: 3 é capaz de dirigir a expressão de genes heterólogos. É também contemplada a expressão de genes homólogos com o promotor da invenção. 0 promotor poderá conter adicionalmente um intrão, por exemplo o primeiro intrão da IL-18BP.

Um promotor ou elemento promotor da IL-18BP "operativamente ligado" irá dirigir a transcrição de uma molécula de ácido nucleico unida numa grelha de leitura adequada. Com respeito aos promotores heterólogos, os promotores e elementos da invenção estão operativamente ligados quando controlam a função de tais promotores heterólogos.

Como mencionado acima, o promotor da IL-18BP; um seu fragmento e uma sua sequência derivada da presente invenção 18 pode ser utilizado para expressar qualquer gene de interesse. Tipicamente, é utilizado um vector de expressão para este fim. Assim, a presente invenção diz respeito adicionalmente a vectores de expressão compreendendo uma sequência de ADN isolada capaz de dirigir a expressão do gene que compreende um promotor de IL-18BP ou um seu fragmento ou um seu derivado. Os vectores de expressão contêm preferencialmente um promotor da IL-18BP um seu fragmento ou seu derivado possuindo uma sequência de nucleótidos correspondendo à SEQ 1D N0:1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:3, respectivamente ou seus fragmentos e/ou derivados. Também preferidos são os vectores de expressão compreendendo adicionalmente um gene homólogo ou heterólogo operativamente ligado ao promotor de IL-18BP ou um seu fragmento e/ou um seu derivado modificado sua sequência de nucleótidos.

Os vectores de expressão de utilidade na presente invenção estão frequentemente na forma de "plasmídeos", que se referem a ADNs circulares de cadeia dupla que, na sua forma de vector, não estão ligados ao cromossoma. No entanto, a invenção pretende incluir tais outras formas de vectores de expressão que servem a funções equivalentes e que se tornam conhecias na técnica subsequentemente na presente invenção.

Os vectores de expressão úteis na presente invenção contêm tipicamente uma origem de replicação, um promotor da IL-18BP localizado em frente do (i.e., a montante do) gene de interesse, sequências de terminação da transcrição e o vector restante. Os vectores de expressão podem também incluir outras de sequências de ADN conhecidas na técnica, por exemplo, sequências lider para estabilidade que providenciam a estabilidade do produto de expressão, 19 sequências líder secretoras que providenciam a secreção do produto de expressão, sequências que permitem a expressão do gene estrutural a ser modulado (e.g., pela presença ou ausência de nutrientes ou outros indutores no meio de crescimento), sequências marcadoras que são capazes de providenciar a selecção fenotípica em células hospedeiro transformadas, e sequências que providenciam sítios para quebra por endonucleases de restrição. As características do vector de expressão actual utilizado devem ser compatíveis com a célula hospedeiro que é para ser empregue. Um vector de expressão como contemplado pela presente invenção é pelo menos capaz de dirigir a transcrição, e preferencialmente a expressão, do gene de interesse ditado pela região promotora da IL-18BP ou de promotor da IL18BP ou uma sua sequência de nucleótidos modificada. As origens de replicação adequadas incluem, por exemplo, aquela do vírus Simian 40 (SV40). As sequências de terminação adequadas incluem, por exemplo, aquelas do vírus Simian 40 (SV40). O promotor da invenção pode ser empregue para a expressão de virtualmente qualquer gene de interesse, por exemplo, aqueles que codificam produtos terapêuticos tais como interferão-beta, TNF, eritropoietina, activador de plasminogénio de tecido, factor estimulante da colónia de granulócitos, superóxido dismutase de manganês, uma imunoglobulina, ou seu fragmento, hormona de crescimento, hsLDLR, FSH, hCG, IL-18, proteínas de união ao receptor de TNF e proteínas de ligação a IL-18. A totalidade destes materiais são conhecidos na técnica e muitos estão disponíveis comercialmente.

Os vectores de expressão adequados que contêm as sequências de codificação e de controlo desejadas poderão ser 20 construídos utilizando técnicas de ADN recombinante comuns conhecidas na técnica, muitas das quais são descritas em Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). A presente invenção diz respeito adicionalmente a células hospedeiro contendo um vector de expressão compreendendo uma sequência de ADN isolada capaz de dirigir a expressão genética que compreende uma região promotora da IL-18BP ou de um promotor da IL-18BP ou suas sequências de nucleótidos modificadas. Preferencialmente, a região promotora da IL-18BP possui a sequência de nucleótidos correspondendo a 1272 bp a montante do sítio de início da transcrição da IL18BP estabelecida na SEQ ID NO:l , ou um seu fragmento tal como a sequência de nucleótidos correspondendo a 635 bp a montante do sítio de início da transcrição estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tal como a sequência de nucleótidos de 122 bp a montante do sítio de início da transcrição estabelecida na SEQ ID NO:3. Também preferidas são as células hospedeiro contendo um vector de expressão compreendendo adicionalmente um gene homólogo ou heterólogo operativamente ligado à região promotora da IL-18BP ou da IL-18BP estabelecida na SEQ ID NO:l ou um seu fragmento. As células hospedeiro adequadas incluem, por exemplo, células HeLa humanas ou células CV-1 e COS-1 de Macaco Verde Africano, células CHO, HepG2, células WISH, Hakat U937 etc. São preferidas as células hospedeiro contendo receptores para IFNy, que permitem a indução do promotor da IL-18BP e consequentemente intensificam a expressão do gene de interesse. 21

Os vectores de expressão poderão ser introduzidos nas células hospedeiro por vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a transfecção de células hospedeiro com vectores de expressão pode ser levada a cabo através do método de precipitação de fosfato de cálcio. No entanto, podem também ser empregues outros métodos para introduzir vectores de expressão em células hospedeiro, por exemplo, electroporação, fusão biolistica, fusão liposomal, injecção nuclear e infecção virai ou de fago.

Uma vez que um vector de expressão tenha sido introduzido numa célula hospedeiro adequada, a célula hospedeiro pode ser cultivada e o polipéptido codificado pelo gene de interesse pode ser isolado. Alternativamente uma vez que um vector de expressão tenha sido introduzido numa célula hospedeiro adequada, a célula pode ser cultivada e após se atingir uma densidade celular desejada, as células podem ser estimuladas com IFNy e o polipéptido codificado pelo gene de interesse pode ser isolado.

As células hospedeiro que contêm um vector de expressão as quais contêm uma sequência de ADN que codifica um gene de interesse poderão ser identificadas utilizando vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, pode ser empregue hibridação ADN-ADN, avaliação da presença ou ausência das funções do gene marcador, avaliação do nível de transcrição como medido através da produção de transcritos de ARNm do gene de interesse na célula hospedeiro, e detectando imunologicamente o produto génico.

As sequências de ADN de vectores de expressão, plasmídeos ou moléculas de ADN da presente invenção poderão ser determinadas por vários métodos conhecidos na técnica. Por 22 exemplo, poderá ser empregue o método de terminação de cadeia didesoxi como descrito em Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467 (1977), ou o método de Maxam-Gilbert como descrito em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560-564 (1977) .

Entender-se-á que os nucleótidos específicos ou regiões no promotor da IL-18BP poderão ser identificados como seja necessário para a regulação. Estas regiões ou nucleótidos poderão estar localizados por dissecção estrutural fina dos elementos, e podem ser estudados através de experiências que analisam a capacidade funcional de mutantes do promotor. Por exemplo, utilizando PCR, podem ser geradas mutações de um par de bases único de elementos de promotor ou delecções progressivas, tais como as empregues na secção de exemplos adiante. Deste modo, é amplificado um número de regiões promotoras mutadas ou construções de delecção, e em seguida novamente clonadas nas construções repórter e avaliadas com as técnicas de ensaio de transfecção e de luciferase (como estabelecido na secção de exemplos adiante). Estes fragmentos amplificados podem ser clonados novamente no contexto do promotor da IL-1813P e também nas construções de promotor heterólogas. Deste modo, são identificadas as sequências de nucleótidos exactas que são importantes na direcção da transcrição do gene.

Esta análise irá também identificar as variações no nucleótido que não afectam a função do promotor, ou que possam aumentar a função promotora. Assim, podem também ser construídos os promotores derivados funcionais e os elementos promotores. 23 A análise funcional da região promotora ou do promotor pode ser facilitada por estudos de caracterização e desvio em gel. 0 conhecimento dos pares de bases exactos importantes na mediação da ligação de proteínas providencia evidência de bases importantes na mediação da resposta transcricional.

Consequentemente a invenção compreende adicionalmente os pares de bases importantes na interacção ADN-proteína. Tais pares de bases podem ser elucidados. Os fragmentos genómicos contendo as áreas de interesse podem ser empregues em experiências de caracterização in vitro [Galas et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981)]. O fragmento de restrição isolado pode ser radiomarcado e subsequentemente incubado com extractos nucleares elaborados com técnicas estabelecidas a partir de células que se espera que contenham proteínas de ligação a ADN que se irão ligar ao fragmento [por exemplo, Dignam et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983)]. Os fragmentos de ADN marcados são incubados com os extractos nucleares, digeridos com ADNse I, e sujeitos a electroforese num gel de poliacrilamida desnaturante. As proteínas de ligação ao ADN no extracto celular ligam-se à sua sequência de reconhecimento contida no fragmento de restrição marcado, e protegem o ADN da digestão pela ADNse. As regiões de protecção delineiam o sítio de ligação. Podem ser utilizadas as reacções de sequenciação do fragmento de Maxam e Gilbert como um marcador para definir os nucleótidos protegidos da digestão por ADNse. A invenção é adicionalmente concebida para a identificação e caracterização de factores trans-activadores que interactuam com o promotor ou com os elementos promotores. 24

As sequências reguladoras actuam em Cis servem como sítios de ligação para proteínas que são denominadas factores trans-activadores (TAF) [Dynan W. S., Tjian T. Nature 316, 774-778 (1985); Maniatis, T. et al., Science 236, 1237-1245 (1987) ] . Se presume que cada gene se liga a uma ou mais proteínas em cada uma das suas sequências reguladoras, e que estas proteínas interactuam com uma outra e a ARN polimerase II de um modo que controla a transcrição.

Foram identificados TAFs em extractos nucleares devido à sua capacidade de se ligar a e retardar a mobilidade electroforética dos fragmentos de ADN da sequência que actua em cis [Dignam, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983); Dynan, W., Cell 58, 1-4 (1989); Fletcher, C. et al., Cell 773-781 (1987); Scheidereit, C. et al., Cell 51, 783-793 (1987)].

As sequências que actuam em cis são úteis em ensaios de retardação em gel para determinar a actividade de ligação em extractos nucleares. A tecnologia para ensaios de desvio em gel é descrita na literatura e inclui muitos dos mesmos reagentes utilizados nas experiências de caracterização [Fried, M. et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981); Revzin, A., Biotechniques 7, 346-355 (1989); Strauss, F. A. et al., Cell 37, 889-901 (1984)]. Quer os fragmentos de restrição marcados com 32P ou os pares emparelhados de oligos complementares são incubados com extractos nucleares e poli d(I-C) num tampão de ligação, e os produtos desta reacção são sujeitos a electroforese num gel de poliacrilamida não desnaturante. A localização do fragmento de ADN no gel como determinado com auto-radiografia é retardado nos casos em que a proteína estava ligada ao ADN. 25 0 grau de retardação é uma função relativa do tamanho da proteína.

As proteínas de ligação assim identificadas podem em seguida ser purificadas e finalmente clonadas utilizando técnicas conhecidas. 0 promotor da IL-18BP também encontra utilização em estudos transgénicos. Os murganhos transgénicos providenciam um modelo genético poderoso para o estudo de um número de doenças humanas incluindo o cancro. Eles também providenciaram um importante método in vivo para estudos de regulação genética que confirmaram e estenderam as observações efectuadas com experiências de transfecção do gene repórter (e.g. luciferase) (Palmiter, F. L. et al., Ann. Rev. Genet. 20, 465-499 (1986)]. Os estudos pretendidos para a dissecção dos sinais que permitem o desenvolvimento da relação da expressão genética podem raramente ser realizados em modelos de cultura celular e é provavelmente melhor estudada com um modelo transgénico. Este tipo de experiência é possível devido à notável conservação entre espécies de sequências reguladoras, tais como aqueles sinais reguladores humanos são interpretados com precisão pela maquinaria de transcrição do murganho.

As construções expressas em murganhos transgénicos poderiam consequentemente providenciar muita informação acerca da regulação do gene da IL-18BP.

Os murganhos transgénicos podem ser preparados através de métodos conhecidos na técnica. O método mais vastamente utilizado através do qual foram produzidos animais transgénicos envolve a injecção de uma molécula de ADN no 26 pronúcleo masculino de um ovo fertilizado [Brinster et al., Cell 27, 223 (1981); Costantini et al., Nature 294, 982 (1981); Harpers et al., Nature 293, 540 (1981); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 5016 (1981); Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 1260 (1976)].

Uma vez que a molécula de ADN tenha sido injectada na célula de ovo fertilizada, a célula é implantada no útero da fêmea recipiente e deixado desenvolver-se num animal. Assim, a totalidade das células do animal resultante deveriam conter a sequência de gene introduzida.

Os murganhos transgénicos resultantes ou progenitores podem ser cruzados e os descendentes analisados para se estabelecer linhas a partir dos progenitores que expressam o transgene. Nos animais transgénicos, podem ser seleccionados tecidos múltiplos para observar a expressão genética. Os estudos de ARN nas diversas linhas de murganhos irão permitir a avaliação da independência do sitio de integração para os niveis de expressão do transgene. Ver, Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1986). O promotor da IL-18BP e os elementos promotores poderão também providenciar meios úteis para levar a cabo a terapia genética. "Terapia genética" é a administração de material genético para modificar ou manipular a expressão de um produto genético para alterar propriedades biológicas de células vivas para utilização terapêutica. 27

As células podem ser alogeneicas ou autólogas. As células poderão ser modificadas ex-vivo para administração subsequente ao sujeito ou alteradas in vivo por produtos de terapia genética administrados directamente ao sujeito.

Para a maior parte, as construções compreendendo o promotor da 1L-18BP ou seu fragmento e/ou um seu derivado serão utilizadas para expressão genética alvo naquelas células em que o gene da IL-18BP é expresso normalmente, por exemplo células mononucleares. Podem ser utilizados quaisquer meios disponíveis na técnica para a transferência das construções para o interior dos animais, incluindo seres humanos. Isto inclui vectores virais, particularmente vectores retrovirais (ver, por exemplo, Zweibel et al.r Science 243, 220 (1989), e as referências aí citadas), assim como outros métodos.

Os vectores AAV recombinantes demonstraram ser bastante promissores para a administração de genes terapêuticos no fígado e no músculo esquelético (Snyder et al. 1997, Murphy et al. 1997, Song et al. 1998, Snyder et al. 1999, Herzog et al. 1997). Os murganhos gerados por disrupção do gene do factor de coagulação IX exibem patologia com hemorragia grave e parecem-se muito com o fenotipo observado em pacientes com hemofilia B. Foi relatado (Wang et al. 1999) que uma única injecção intraportal de um vector virai recombinante adeno-associado (AAV) que codifica o ADNc do factor IX canino sob o controlo de um intensificador/promotor específico de fígado conduz a uma correcção a longo prazo e completa da patologia de hemorragia. 28

Os vectores retrovirais, derivados a partir de oncoretrovirus tal como o virus de leucemia murina (MVL), foram os vectores mais vastamente utilizados para a transferência de gene devido ao genoma do vector se integrar nos cromossomas de células alvo, resultando numa expressão estável dos transgenes (I.M. Verma e N. Somia. Nature 389, 239 (1997). No entanto, estes vectores provaram ser especialmente bons para células em divisão. Os vectores de letivirus tais como os vectores de HIV são correntemente utilizados para células que não se encontram em divisão Mioshi et al. Science 1999 283: 682-686. A capacidade de letivirus para infectar células que não se encontram em divisão tais como macrófagos torna-os bons candidatos para utilização como ferramentas de transferência de genes. Os vectores de HIV facilitam a transdução de células mãe hematopoiéticas quiescentes humanas (HSCs).

As células mãe hematopoiéticas humanas (HSC) são um alvo atractivo para a terapia genética de patologias hematopoiéticas hereditárias assim como outras patologias adquiridas devido a estas células possuírem a capacidade para regenerar todo o sistema hematopoiético. Por exemplo as células mãe hematopoiéticas podem regenerar células monocíticas que se sabe que estão envolvidas na patogénese do vírus de imunodeficiência humano-1 (HIV-1).

Apesar de mais de 15 anos de investigação no campo da terapia genética utilizando células mãe hematopoiéticas, o principal obstáculo permanece sendo a incapacidade de inserir eficientemente e de modo estável os genes nestas células. Os vectores retrovirais baseados no vírus da leucemia murina Moloney (MLV) foram utilizados mais extensivamente, mas produzem uma transferência genética 29 relativamente baixa nas HSC pluripotenciais humanas e uma expressão genética que é frequentemente insatisfatória.

Recentemente, são pretendidas tentativas para realizar a modificação genética de células mãe hematopoiéticas com genes que inibem a replicação do HIV-1, para o desenvolvimento de monócitos resistentes à infecção por HIV-1 (Kohn et al. 1999).

Teoricamente, a inserção de um gene capaz de conferir resistência ao HIV-1 em células mãe hematopoiéticas poderia resultar em que esse gene estando presente nos monócitos maduros descendentes e noutras células susceptiveis ao HIV-1. Assim, é vantajosa a utilização de um promotor que está activo em células monócito tal como o promotor da IL-18BP ou um seu fragmento, para a terapia genética de HIV-1. A terapia genética da maioria das patologias genéticas sanguíneas (e.g. SCID doença granulomatosa crónica, talasemia etc.) requer a transferência do gene ex vivo no interior das HSCs transplantáveis, auto-renovadoras e regulação da expressão do transgene numa ou mais linhagens celulares A correcção de patologias que afectam uma progenia específica das HSCs (e, . g. hemoglobinopatias ou talasemias, infecção por HIV-1) requer a restrição da expressão de gene terapêutico de modo específico da linhagem celular (lotti et al. 2002). Nestes casos, r é obrigatório a direcção transcricional do gene transferido. A expressão genética em diferentes tipos de células é dependente da força relativa do promotor utilizado. No entanto, a maioria dos estudos pré-clínicos levados a cabo até agora dependem da utilização de promotores virais, constitutivos para dirigir a expressão do transgene. Por 30 exemplo no vector de HIV-1 utiliza-se um promotor de CMV interno e o promotor de CMV de murino do vector retroviral LTR de murino. A regulação adequada do transgene no quadro de um vector retroviral é uma tarefa difícil, devido à interferência transcricional entre a repetição terminal longa virai (LTR) e os promotores intensificadores internos e a instabilidade genético das sequências reguladoras complexas. Na presente invenção o promotor da IL-18BP que se sabe que dirige a transcrição em células mononucleares é utilizado para dirigir a expressão do transgene em HSCs, o precursor de tais células mononucleares. A modificação genética das células mãe hematopoiéticas com "genes anti H1V" poderia conduzir ao desenvolvimento de linfócitos e monócitos resistentes à infecçâo por HIV após o transplante. As HSC de pacientes infectados com o HIV-1 podem ser recuperadas, células CD34+ isoladas, sujeitas a transdução in vitro com um vector retroviral que transporta uma proteína inibidora de HIV-1 sob o controlo do promotor da IL-18BP (em vez do promotor retroviral) e re-injectando estas células nestes pacientes (Kohn et al. 1999). A fonte de HSC mais comummente utilizada é a das células mãe hematopoiéticas de sangue periférico (PBSC), que foram vastamente substituídas pela medula óssea em ambiente de transplantes autólogos (Gale et al. 1992 e Kessinger et al. 1991) . As PBSC são mobilizadas a partir da medula óssea para a circulação periférica por administração de factores tais como G-CSF ou GM-CSF durante 3-5 dias e podem em seguida ser recolhidas por leucaferese. Vários estudos demonstraram que o enxerto ocorre mais rapidamente quando se transplantam células mãe de sangue periférico em vez de medula óssea (Henon et al. 1992 e Chao et al. 1993) . As 31 células progenitoras clonogénicas contidas em PBSC mobilizadas por G-CSF são bastante susceptiveis de realizar transferência genética mediada por retroviral, enquanto que a velocidade de transdução das células mãe de reconstituição a longo prazo em PBSC não é melhor que a medula óssea (Breni et al. 1992, Cassei et al. 1993, Dunbar et al. 1995). Foi demonstrado que os sujeitos infectados por HIV-1 podem possuir com êxito uma mobilização e colecção de G-CSF das PBSC mobilizadas sem qualquer aumento nos niveis endógenos do HIV-1, pelo menos durante os estágios iniciais da doença (Junker et al. 1997 e Slobod et al. 1996).

Outra fonte de células mãe hematopoiéticas é o sangue do cordão umbilical (UCB) que demonstrou ser susceptivel a transdução retroviral, potencialmente ainda mais que células de medula óssea (Moritz et al. 1993 e Hao et al. 1995). A utilização de células UCB HSC poderia ser particularmente benéfica para recém-nascidos infectados por HIV-1. Uma vez que a transmissão é principalmente perinatal, o sangue do cordão umbilical deverá conter números e funções normais das células mãe hematopoiéticas, que poderão estar diminuídos na medula óssea de crianças e adultos infectados por HIV-1 (Kearns et al. 1997).

Foi desenvolvido um grande número de genes sintéticos que podem suprimir a replicação de HIV-1 ("genes anti-HlV-1"), incluindo: anti-sentido, ribozimas, mutantes dominantes negativos (e.g. RevMIO), atractores de ARN, anticorpos intracelulares para prevenir a expressão de proteínas virais ou co-receptores celulares, etc. (Veres et al. 1996, Zhou et al. 1994, Couture et al. 1996, Malim et al. 1989, Bahner et al. 1993 e Sullenger et al. 1990, Lee et al. 32 1994, Marasco et al. 1997 e Chen et al. 1997). Em muitos casos, estes genes anti-HIV-1 demonstraram em sistemas modelo ser capazes de suprimir significativamente a replicação de HIV-1 e nalguns casos limitam mesmo a entrada do vírus nas células (36, 3944) . Se essencialmente 100% das HSC de um paciente e as células monocíticas resultantes poderiam ser incapazes de suportar a replicação de HIV-1, é provável que se produzissem cargas virais reduzidas. Teoricamente, seria requerida uma inibição activa da replicação de HIV-1 em 99,9% das células susceptíveis para produzir uma redução de log 3 na carga do vírus, um efeito muitas vezes produzido por terapia anti-retroviral altamente efectiva. No entanto, com as capacidades limitadas por a transdução efectiva de elevadas percentagens de células mãe hematopoiéticas humanas, não é correntemente possível proteger a maioria de células susceptíveis. Um mecanismo alternativo para a eficácia é baseado na possibilidade de que essas células concebidas para serem incapazes de suportar a replicação activa de HIV-1 poderão ser protegidas de citopaticidade induzida por o vírus e assim possuir uma vantagem de sobrevivência selectiva comparada com células não protegidas. Nesse caso, um número modesto de células protegidas poderá compreender uma percentagem aumentada de todos os monócitos, conduzindo a alguma preservação de função imunológica. A presente invenção também se relaciona com composições farmacêuticas compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um vírus compreendendo uma sequência da presente invenção correspondendo à região promotora da IL-18BP ou ao promotor operativamente ligado a um gene de interesse que codifica para um fármaco adequado. Estas composições poderão ser utilizadas preferencialmente para 33 direccionar um fármaco para tecidos nos quais os niveis de IFNy são elevados.

Tendo descrito agora a invenção, esta será mais prontamente compreendida com referência aos seguintes exemplos que são providenciados em termos de ilustração e não pretendem ser limitativos da presente invenção. EXEMPLOS Exemplo 1:

Expressão basal de IL-1ÕBP em monócitos. 0 ARNm da IL-18BP é detectado em leucócitos, cólon, intestino delgado, próstata e particularmente em células do baço (Novick et al. 1999). As células do baço consistem em macrófagos, linfócitos, e células do plasma com células adicionais derivadas a partir da circulação.

De modo a determinar expressão da proteína da IL-18BP em células, foi utilizado um teste de ELISA específico (Exemplo 12) . Foi descoberto que as células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) produzem constitutivamente a IL-18BP (0,7-1,5 ng/mL). As células U-937, uma linha celular derivada de células malignas obtidas a partir da efusão pleural de um paciente com linfoma histiocítico, não expressam qualquer IL-18BP. As células U- 937 podem ser induzidas até à diferenciação terminal monocítica por tratamento com ésteres de forbol. Uma expressão basal de IL-18BP de 0,07 ± 0,01 ng/mL foi detectada apenas após a diferenciação das células em células semelhantes a macrófagos por estimulação com TPA (10 ng/mL). Estes resultados mostram que a IL-18BP é produzida em monócitos e macrófagos. 34

Exemplo 2:

Indução da expressão de IL-18BP em várias células diferentes.

Foi reportado previamente que o ARNm da IL-18BP induzido por IFNy e proteína em várias linhas celulares tais como a linha celular de queratinócitos, uma linha celular de carcinoma do cólon e em células mesangiais renais primárias (Muhl et al. 2000) . Foi estudada a indução da IL-18BP em várias linhas celulares humanas e em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) por IFNy e outras citoquinas. A expressão de IL-18BP induzida por IFNy (ver Exemplo 11 para a monitorização de ARNm e Exemplo 12 para ELISA) de uma maneira dependente da dose, exibiu um EC50 a 50 U/mL em células WISH e HepG2 (Figura 2 A e B). A IL-18BP acumulada aparentemente em sobrenadantes de culturas de células WISH, como a sua concentração foi mais elevada a 48 h comparada com 24h (Figura 2 A).

As células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) produziram constitutivamente IL-18BP (0,7 -1,5 ng/mL), e o tratamento com IFNy (100 U/mL) aumentou o nivel de IL-18BP em 1,7 ± 0,1 e 2,1 ± 0,3 vezes a 24 e 48 h, respectivamente (p < 0,05, n=4). Não foi observado qualquer efeito sobre a produção de IL-18BP após o pré-tratamento das PBMC com TPA. A indução de IL-18BP por IFNy foi testada na linha celular U937. O IFNy não induziu a IL-18BP em células U937 não diferenciadas, no entanto, a seguir à diferenciação com éster de forbol (TPA, 10 ng/mL) em células semelhantes a macrófagos, foi obtido um nivel basal de IL-18BP (0,07 ± 0,01 ng/mL), e aumentou em 4,6 ± 0,05 vezes após indução 35 com IFNy (100 U/mL, 24 h), aumentando adicionalmente a 96 h (não mostrado).

Foi testado o efeito de outras citoquinas, tais como IFNa2, IFNp, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 e TNFa, na expressão de IL-1813P em células HepG2 (Figura 2B) . Os resultados obtidos depois da incubação das células com diferentes citoquinas na presença ou ausência de IFNy (Fig. 1 web PNAS) mostram que as IFNa2, ΙΡΝβ, IL-1, IL-6, IL-12, 11-18 e TNFa não induzem a IL-18BP sozinha. No entanto, em células HepG2 a IL-6 e TNFa actuaram sinergisticamente com IFNy, providenciando um aumento estatisticamente significativo da IL-18BP.

Esses resultados indicam que a IL-18BP pode ser induzida por IFNy, em monócitos e em muitas células diferentes. A indução de IL-18BP por IFNy é melhorada adicionalmente pela adição de IL-6 e TNFa.

Exemplo 3: O gene de IL-18BP é regulado transcricionalmente por IFNy, requerendo a síntese de novo da proteína.

De modo a verificar se a indução de ARNm da IL-18BP por IFNy é ao nível transcricional, foi medido o efeito do interferão sobre as células HepG2 e WISH na presença de um inibidor da tradução, a Actinomicina D (Fig. 3A). O aumento nos níveis de ARNm da IL-18BP foi detectável através de RT-PCR semi-quantitativo após 3 h de tratamento com IFNy em células HepG2 e só após 5 h em células Hakat e WISH. O pré-tratamento de células HepG2 e WISH com Actinomicina D antes 36 da estimulação com IFNy elimina a expressão do ARNm de IL-1813P em várias pontos de tempo, indicando que o IFNy estimula a síntese de novo do ARNm. A acumulação de IL-18BP foi evidente a 24 h e posteriormente seguindo o tratamento com IFNy, apoiando uma dependência da expressão de IL-18BP sobre a indução precedente de proteínas, e.g. factores de transcrição, por IFNy. Consequentemente de modo a confirmar tal hipótese, foi empregue adicionalmente um inibidor de proteína, a cicloheximida, para avaliar se a indução de ARNm da IL-18BP por IFNy requer a síntese de novo de proteínas. Os resultados resumidos na Figura 3B mostram que o pré-tratamento das células com cicloheximida elimina a indução de ARNm de IL-18BP. Este resultado indica que a síntese de novo da proteína é essencial para a activação do gene de IL-18BP por IFNy.

Exemplo 4:

Definição do sitio de início da transcrição de IL-18BPa e sua região promotora, de modo a mapear o promotor de IL-18BP.

De modo a estudar a região promotora de IL-18BP, é requerido inicialmente a localização específica do sítio de início da transcrição. 0 sítio de início da transcrição de ARNm da IL-18BPa humana foi determinado por 5' RACE (RACE Exemplo 14). Só um produto de PCR, correspondendo a IL-18BPa, a variante de ligação mais abundante, foi obtido pelo 5' RACE. A análise da sequência de ADN deste produto revelou o sítio de início 37 da transcrição e um exão adicional de 50 bp seguindo o sitio de inicio da transcrição na terminação 5' de ARNm da IL-18BPa humana, correspondendo às posições 785 - 835 do ADN de IL-18BP genómico (pode ser encontrado na base de dados Entrez pubmed nucleotide, No. de acesso AF110798) . Concordantemente, foi gerado um novo mapa exão-intrão por comparação do ADN genómico com o ARNm ao qual foi adicionado o exão 5'. (Ver Fig. 4).

Tendo o sitio do inicio da transcrição de IL-18BPa (base 1) , o ADN genómico humano a montante da base 1 (cromossoma llq clone:RP11-757C15, No de acesso AP000719.4 nucleótidos a montante da base 152 178) correspondendo à região promotora de IL-18BP poderia ser analisado adicionalmente. A comparação deste ADN com o da base de dados de sequências tag expressas (EST) em NCBI pelo programa BLAST revelou um gene a montante da cadeia +, que codifica para uma proteína de dedo de Zinco (No. de acesso AK001961) . A sequência de ARNm depositada desta proteína de Zn foi adicionalmente alongada pelo programa "Instant RACE" (www.LabOnWeb.com), que selecciona uma colecção extensa de ESTs humano. 0 programa colocou a terminação 3' de ARNm da proteína do dedo de Zn no nucleótido 150 517 do clone genómico RP11-757C15, limitando assim a sequência reguladora a montante potencial da IL-18BPa a 1661 bases a montante da base 1.

Exemplo 5:

Exploração do promotor mínimo, a montante do gene de IL-18BP, capaz de promover a expressão constitutiva de um gene heterólogo.

De modo a encontrar o fragmento de ADN mínimo, a montante do gene de IL-18BP, capaz de dirigir a expressão de um gene 38 hexógeno tal como o gene repórter de luciferase, um vector contendo até 1601 bp correspondendo à sequência de ADN a montante da base 1 e incluindo 50 bp a montante do sitio do inicio da transcrição (SEQ ID NO: 5) e foram gerados vectores possuindo formas truncadas deste ADN (Fig. 5A) fundido ao gene de luciferase (Exemplo 15) . A actividade luciferase em células HepG2 humanas (uma linha de carcinoma hepatocelular humano) transfectado com um vector (pGL3 (1601)) compreendendo o ADN a montante de 1601 bp foi 10,3 ± 0,9 vezes maior que aquele obtido com o vector pGL3 vazio. Tal actividade não foi observada quando o mesmo ADN foi inserido em orientação contrária (pGL3 (-1601). Este resultado demonstrou que o ADN de 1601 bp a montante da base 1 tem uma actividade promotora basal. O exame da sequência deste fragmento 1601 bp de ADN revelou que não inclui um elemento caixa de TATA, mas que tinha diversos domínios ricos em GC próximos do sítio de início da transcrição nas bases -3 a -9, -39 a -48 e -122 a -132. A análise da sequência de 1601 bp do ADN pelo programa TFSEARCH identificou uma sequência activada por gama (GAS) nas bases -24 a -32 (Fig. 1) . Adicionalmente a análise revelou um elemento de resposta IRF1,2 (IRF-E) bases expandidas -57 a -69 e dois elementos de resposta C/ΕΒΡβ (C/EBP-E) nas bases -309 a -322 e -621 a -634.

Foi testada uma série de vectores repórteres para luciferase com truncagens progressivas na terminação 5' do fragmento de 1601 bp. Os resultados resumidos na figura 5A mostram todas as construções, incluindo pGL3 (122), contendo só os elementos IRF e GAS, foram pelo menos tão eficazes como pGL3 (1601) no apoio da actividade promotora basal. 39

Estes resultados revelaram que o fragmento de 122 bp (SEQ ID NO: 3) compreendendo os elementos IRF e GAS são suficientes para promover a actividade basal de um gene heterólogo (Fig. 5A).

Exemplo 6:

Exploração do promotor mínimo, a montante do gene IL-18BP, capaz de promover a expressão indutível de um gene heterólogo.

De modo a identificar um fragmento de ADN mínimo, a montante da região do promotor de IL-18BP, capaz de promover a expressão de luciferase induzida por IFNy, os vectores de ADN truncados do exemplo precedente foram testados em células HepG2 transfectadas na presença de IFNy, (Figura 5B para transfectações ver exemplo 16).

Os resultados resumidos na figura 5B mostram que após 24 h o IFNy aumentou a actividade da luciferase em 33 vezes sobre o nível de expressão basal no vector incluindo só os elementos IRF-E e GAS (vector pGL3 (122)). Este resultado demonstrou que o par IRF-E-GAS só pode mediar a indução do gene heterólogo por IFNy. A inclusão dos elementos C/EBP-El e 2 (pGL3 (656)) aumentou significativamente a indução da actividade de luciferase pelo IFNy até 88 vezes sobre a actividade basal, demonstrando a importância destes elementos na indução por IFNy. Em contraste, a inclusão de um ADN adicional a montante a tal inserção (pGL3 (1106)) suprime a indução de actividade de luciferase acima do seu nível basal. Este resultado sugere que um elemento silenciador reside nas bases -656 a —1106 (a montante do segundo elemento C/EBP-El) . Foi demonstrado que os três 40 elementos de resposta AP1 estão presentes na região de silenciador e que c-Jun se liga a, e está envolvido no silenciamento do gene de IL-18BP através dos tais três elementos de resposta AP-1. A extensão adicional do promotor através das 88 bases a montante do silenciador (pGL3 (1272)) restabeleceu a resposta a IFNy, sugerindo que um elemento intensificador reside nas bases -1106 a -1272, e sua activação por IFNy suprime o efeito do silenciador vizinho. A extensão adicional da sequência não afecta a actividade basal ou induzida por IFNy, sugerindo que todas as sequências reguladoras a montante estavam localizadas nas bases -1 a -1272 (SEQ ID NO:l). A partir de todas as construções testadas a indução de pGL3 (656) é a maior, indicando que este fragmento de ADN contém o promotor indutivel óptimo da IL-18BP.

Os resultados mostram que o promotor indutivel mínimo está localizado a 122 bp a montante do sítio de início da transcrição (SEQ ID NO:3) contendo os elementos IRF-E e GAS, em que o pomotor indutivel máximo e óptimo está localizado a 656 bp a montante do sítio de início da transcrição (SEQ ID NO: 2) contendo em adição aos elementos IRF-E e GAS, dois elementos C/ΕΒΡβ.

Exemplo 7:

Envolvimento de IRF-1 na expressão de IL-18BP in vivo.

Para explorar o envolvimento de IFR-1, foi estudado o sítio de ligação que se descobriu estar no promotor de IL-18BP, 41 na expressão de IL-18BP da expressão de IL-18BP em murganhos deficientes em IRF-1.

Os níveis de IL-18BP foram medidos em murganhos deficientes em IRF-1 (Jackson laboratories, Bar Harbor ME) antes e após a administração de IFNy de murino e comparados com aqueles de murganhos de controlo C57B1/6 (Fig. 6). A IL-18BP do soro basal em murganhos C57B1/6 de controlo foi 9,1 ± 1,9 ng/mL e foi significativamente aumentado por IFNy para 22,4 ±2,2 ng/mL. Em contraste, a IL-18BP do soro em murganhos deficientes em IRF-1 esteve abaixo do limite de detecção e foi aumentada somente até 0,7 ± 1,15 ng/mL com IFNy. Este resultado confirmou a importância de IRF-1 como um mediador basal bem como a expressão induzida por IFNy de 18BP.

Exemplo 8:

Detecção dos factores de transcrição que se ligam ao promotor de IL-18BP sob condições indutivas.

Foram empregues ensaios do desvio de mobilidade electroforética (EMSA Exemplo 18) para identificar as interacções proteína - ADN entre os diversos elementos de resposta no promotor da IL-18BP. As sondas de ADNDs marcadas correspondendo as bases -33 a -75 (contendo o IRF-E) e -8 a -55 (contendo o GAS) foram deixadas ligar-se a extractos nucleares de células de controlo e tratadas com IFNy. Um complexo de sonda que contendo IRF-E e proteína (s) nuclear (es) foi evidente após incubação das células durante 1 h com IFNy e a resposta máxima foi observada a 3 h (Fig. 7 A, linhas 1 - 5). Como esperado, a adição de anticorpos a IRF-E ocasionou um "super-desvio", enquanto que os anticorpos de controlo anti-transdutor de sinal e anti- 42 activador de transcrição 1 (STAT1) não tiveram efeito (dados não mostrados). Em contraste com IRF-E, a sonda contendo GAS foi associada constitutivamente à proteína (Fig. 7 A, linha 6), e este complexo foi melhorado após a indução de células com IFNy durante 3 a 6 h (linhas 7,8). É esperado que GAS se ligue ao dímero STAT1 induzido por IFNy. Não obstante, o complexo não foi afectado pelos anticorpos para STAT1 (linha 10), sugerindo que o dímero STAT1 induzido por IFNy não estava associado com este GAS. 0 mesmo resultado negativo foi obtido com extractos nucleares de células tratadas com IFNy durante apenas 15 ou 30 min (dados não mostrados). Surpreendentemente, este complexo foi eliminado pelos anticorpos para C/EB113 (linha 9) e foi super-desviado com anticorpos para IRF-1 (linha 10) . Portanto a sonda de ADN contendo GAS parece ligar-se a C/ΕΒΡβ apesar da ausência de um C/ΕΒΡβ E de consenso.

Os resultados obtidos com EMSA indicam que após indução com IFNy, IRF-1 liga-se ao elemento IRF-E no promotor da IL-18BP. Em adição, é formado um complexo compreendendo IRF-1 e C/ΕΒΡβ e liga-se ao elemento GAS.

Exemplo 9:

Exploração do papel do complexo IRF-1-C/ΕΒΡβ na indução de IL-18BP.

Para estudar adicionalmente o papel de IRF-1 e C/ΕΒΡβ na indução do gene de IL-18BP, foi medido o ARNm da IL-18BPa por PT-PCR semi-quantitativa após a sobre-expressão de IRF- 1 e C/ΕΒΡβ empregando os vectores de expressão de transfecção (Exemplo 14, Fig. 7 B) . A sobre-expressão quer 43 do factor de transcrição ou de uma combinação de ambos os factores em células HepG2 não induz o ARNm da IL-18BP. Este resultado sugere que são requeridos factores adicionais induzidos por IFNy para a activação do gene de IL-18BP. A transfecção das células com qualquer um dos vectores de expressão seguido pela sua indução com IFNy reduz realmente o ARNm de IL-18BP comparado com IFNy sozinho. Em contraste, a co-expressão dos dois factores de transcrição incrementa a indução de ARNm de IL-18BP por IFNy. Este resultado sugere que IRF-1 e C/ΕΒΡβ têm que estar presentes numa certa razão, formando possivelmente um complexo dentro do complexo do inicio da transcrição. Para estudar adicionalmente a possível interacção entre IRF-1 e C/ΕΒΡβ foi realizada uma titulação da actividade de luciferase por co-transfecção de células com pGL3 (1272), uma quantidade fixa de um vector de expressão IRF-1 e quantidades variáveis do vector de expressão C/ΕΒΡβ. Semelhantemente, foi medida a actividade de luciferase quando o vector C/ΕΒΡβ foi mantido constante e com quantidades variáveis do vector IRF-1. Em ambos casos foi obtida uma curva dose -resposta em forma de campânula, sugerindo que a indução óptima de IL-18BP requer uma razão molar fixa entre estes dois factores de transcrição (Fig. 7 C) .

Foram levados a cabo estudos de imunoprecipitação de modo a confirmar a associação física entre IRF-1 e C/ΕΒΡβ (Exemplo 19, Fig. 1D) . A imunoprecipitação (ip) seguida por imunotransferência (ib) de proteínas nucleares e citoplásmicas (Exemplo 15) a partir de células tratadas com IFNy com anticorpos para C/ΕΒΡβ revelou que C/ΕΒΡβ se expressa constitutivamente em células HepG2 e se desloca 44 para o núcleo em resposta a IFNy (painel superior) . Em contraste a ΟΙΕΒΡβ que não é induzido por IFNy, ip e ib dos extractos celulares com anticorpos para IRF-1 revelou que IFNy induz a expressão de IRF-1. Mas semelhante a C/ΕΒΡβ, após a indução com IFNy, IRF-1 é deslocado para o núcleo (painel médio). Ip com anticorpos para C/ΕΒΡβ seguido por ib com anticorpos para IRF-1 revelou a presença de um complexo estável IRF-l-C/ΕΒΡβ na fracção nuclear (painel inferior). Estes resultados confirmam a formação do complexo IRF-l-C/ΕΒΡβ após indução com IFNy e é a primeira demonstração da existência de tal complexo entre estes dois factores de transcrição. Assim após indução por IFNy, a sequência contendo GAS proximal e o seu IRF adjacente liga-se ao complexo de C/ΕΒΡβ e IRF-1.

Exemplo 10:

Exploração do papel de C/EBP-Es na actividade do promotor de IL-18BP.

Os dois sitios C/ΕΒΡβ nas posições -309 a -322 e -621 a -634 não têm um IRF-E adjacente. De facto, os EMSA (Exemplo 18) de uma sonda correspondendo aos sitios C/ΕΒΡβ nas posições —309 a —322 revelou uma banda retardada (seta com a ponta a cheio) que foi super-desviada com anticorpos para C/ΕΒΡβ (seta com a ponta por preencher) mas não com anticorpos para IRF-1 (Fig. 8 A) . Daqui, foi concluído que este sítio se liga a C/ΕΒΡβ e não ao seu complexo com IRF-1. Adicionalmente, esta banda foi gerada com um extracto nuclear de células HepG2 não induzidas que expressam constitutivamente C/ΕΒΡβ mas carecem de IRF-1. De facto, IFNy, não aumentou a expressão de C/ΕΒΡβ nestas células 45 (Fig. 8D) e consequentemente não aumentarão a intensidade da banda retardada (Fig. 8 A) . Foram obtidos resultados semelhantes com o sitio C/ΕΒΡβ mais distai (dados não mostrados).

Os resultados mostram que o factor de transcrição C/EBP ao contrário de IRF-1, é expresso constitutivamente e não é induzido por IFNy, e que em além da ligação a IRF-1 e a GAS, se liga a ambos os elementos de C/EBP presentes no promotor de IL-18BP.

Exemplo 11:

Estudo do papel do intensificador na expressão de IL-18BP.

Foi estudado o papel regulador do intensificador distai por EMSA (Exemplo 18) com uma sonda de ADN de 192 bp, correspondendo aos nucleótidos -1081 a -1272. O extracto nuclear de células HepG2 de controlo formou um complexo com esta sonda (Fig. 8 B, seta com a ponta a cheio) . Após tratamento das células com IFNy, o complexo foi mais intenso e de alguma maneira mais retardado. Foi posteriormente realizado um super-desvio deste complexo com anticorpos dirigidos contra IRF-1, C/ΕΒΡβ e cFos. Destes, só anti-IRF-1 produziu um a super-desvio (Fig. 8 B, seta com a ponta por preencher) . Um ADNds não marcado correspondendo aos nucleótidos -1083 até -1174 não compete com a sonda radiomarcada, indicando que as proteínas nucleares foram ligadas a resíduos -1175 até -1272. Dado que o IRF-E foi identificado só na região proximal, este resultado sugere o intensificador distai foi associado provavelmente ao IRF-E proximal. 46

Estes resultados indicam que o intensificador distai interactua com o promotor basal através de IRF-1.

Exemplo 12: ELISA para IL-18BP. A IL-18BP humana foi medida através de um teste ELISA de anticorpo duplo como descrito (Novick et al. 2001). A IL-18BP de rato foi medida através de um teste ELISA de anticorpo duplo utilizando um anticorpo policlonal purificado através da afinidade com antigénio de coelho para a IL-18BP de murino e anticorpo biotinilado que foram obtidos da Cytolab, Israel.

Exemplo 13:

Isolamento de ARN e Transcrição Reversa (RT)-PCR.

Após o tratamento em meio isento de soro, as células HepG2, e WISH (106) foram colhidas aos tempos indicados e o ARN total foi extraído utilizando o reagente TRI. Foi preparado o ADNc utilizando hexâmeros aleatórios e SuperscriptII (Invitrogen™, Leek, The Netherlands) de acordo com as instruções do fabricante. Foi realizada a PCR com os seguintes iniciadores: IL-18BP humana, 5' CACGTCGTCACTCTCCTGG e 5' CGACGTGACGCTGGACAAC; IRF-1 humano 5' GACCCTGGCTAGAGATGCAG e 5' GAGCTGCTGAGTCCATCAG; β Actina humana 5' GTGGGGCGCCCCAGGCACCA e 5' CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC. Foram feitas amplificações por desnaturação inicial (92 °C, 2 min) , 28 ciclos de desnaturação (92 °C, 45 seg.), fixação (62 °C, 1 min) e extensão (72 °C, 1.5 min), e extensão final (72 °C, 10 min) . Os produtos resultantes da PCR foram resolvidos por electroforese em gel de agarose (1 %). 47

Exemplo 14:

Amplificação rápida de terminações 5' de ADNc (5' RACE).

Foi realizada uma 5' RACE com um sistema 5' RACE (GIBCO BRL) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o ARN total das células WISH tratadas com IFNy foi transcrito de maneira reversa (Exemplo 13) com um iniciador complementar para nucleótidos 89-70 do ARNm de IL-18BPa (GenBank No. de acesso AF110799) seguido por modificações das terminações sintetizadas recentemente com um ADN âncora. Foi seguidamente realizada a PCR com um iniciador de sentido directo complementar para o ADN âncora e um iniciador reverso interno complementar para os nucleótidos 31 - 11 de ARNm de IL-18BPa. Os produtos de PCR foram seguidamente sub-clonados e sujeitos a análise da sequência de ADN.

Exemplo 15:

Plasmideos e clonagem.

Toda a região promotora de IL-18BPa putativa de 1601 bp foi obtida por PCR do ADN genómico utilizando um iniciador de sentido (S4753.Pgi) contendo um sitio Kpn I (5' CTATATGGTACCCACCCTTCCTTITACTTTTTCC) e um iniciador reverso (RlexA) contendo o sitio NHe I (5' TATCGCTAGCCAGTCACACAGGGAGGCAGT). O produto de PCR foi clonado num vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI) e verificado por análise de sequência de ADN. Foi isolado um fragmento Kpn I-Nhe I a partir do clone pGEM-T Easy e ligado num vector pGL3-Básico (Promega) utilizando um kit de ligação rápida de ADN (Roche) para originar pGL3(1601). Uma série de repórteres 5'-truncados (pGL3(1454), pGL3(1274) , pGL3(1106) , pGL3(656), pGL3(280) e pGL3(122) 48 foi preparado semelhantemente com o mesmo iniciador reverso e com os seguintes iniciadores de sentido, respectivamente: S334 .pgi 5': CTATATGGTACCCATGAACTAGACACCTAGAG; S4i5.pgi 5': CTATATGGTACCCTACAAGAAGTTTGAGATCA;

Ssoi.pgi 5': CTATATGGTACCCAGCCGTTGCACCCTCCCAATCAC; lexD pgl 5' CTATATGGTACCGTCTTGGAGCTCCTAGAGG; S5e4.pgi 5' CTATATGGTACCCACCAAAGTCCTGACACTTG e Si39.pgi 5' TTGGTACCCACTGAACTTTGGCTAAAGC.

Todos os produtos de PCR também foram clonados num vector pGL3-Básico na orientação oposta para servir como controlos.

Exemplo 16:

Ensaios de transfecção transiente

Foram transfectadas células HepG2 ou WISH em placas de 6 poços (0,5 x 106 /poço) utilizando FuGENE 6 e o vector repórter indicado para luciferase (0,5 μg/poço) e pSV40 PGAL (0,2 pg/poço, Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Em alguns casos a co-transfecção foi feita com os seguintes vectores de expressão: pcADN3-IRF-l (0,07 -1,5 pg/poço, amavelmente fornecido pelo Dr. B. Levy, Technion, Israel); pcADN3-C/EBPP (0,5 - 2,5 pg/poço, amavelmente fornecido pelo Dr. D. Zipori, Weizmann Institute of Science). Após 16 h as células foram tratadas quer com IFNy (100 U/mL), IL-6 (150 U/mL), TNFa (10 ng/mL) ou a suas combinações indicadas em meio livre de soro durante 24 h. As células foram seguidamente recolhidas, sujeitas a lise e foi medida a actividade de luciferase. Todos os resultados foram normalizados relativamente à actividade para β-galactosidase: 49

Exemplo 17:

Preparação de extractos nucleares e citoplásmicos.

As células foram lavadas 3 vezes com solução salina de tampão fosfato (PBS) arrefecida em gelo e congeladas imediatamente em azoto liquido. Os concentrados de células foram re-suspensos em quatro volumes celulares embalados de tampão citoplásmico (Hepes 10 mM, pH 7,9, NaCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, 5% (em volume) glicerol, MgCl2 1,5 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM, PMSF 0,5 mM, NaF 50 mM, Na3V04 0,1 mM, EGTA 2 mM, EDTA 10 mM, Na2Mo04 10 mM, 2 μρ/ΐΐΛ de cada leupeptina, pepstatina e aprotinina). O lisado foi centrifugado (3000 x g, 10 min.) e foi recolhido o sobrenadante contendo as proteínas citoplásmicas. O concentrado foi re-suspenso em 2,5 volumes de célula embaladas de tampão nuclear (idêntico ao tampão citoplásmico excepto que o NaCl foi aumentado até 0,42 M) . O resíduo nuclear foi removido por centrifugação (15, 000xg, 20 min. 4 °C) , alíquotas de sobrenadante foram congeladas em azoto líquido e guardados a -80 °C. Foi determinada a concentração de proteína através de um kit de reagente apara teste da proteína BCA (Pierce, Rockford USA) utilizando albumina de soro de bovino como um padrão.

Exemplo 18:

Ensaios de desvios da mobilidade electroforética

Os oligonucleótidos ds que correspondem a elementos de resposta seleccionados (10 pmol) foram marcados com [32P]3 ATP através de polinucleótido quinase (New England Biolabs). Foram pré-incubados extractos nucleares (5 μg de proteína) (15 min., 0 °C) juntamente com poli(dl-dC) (Amersham Pharmacia biotechnology) em 20 μ]4 de tampão IEMSA 50 (20 mM Hepes pH 7,5; 5 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 5 mM DTT e 5% (em vol.) de glicerol). Foi adicionada seguidamente uma sonda marcada (3 x 104 cpm) e continuada a incubação durante 30 min. adicionais à temperatura ambiente. Para os ensaios de super-desvio as amostras foram incubadas com os anticorpos indicados (4 yg, 1 h a 0 °C) antes da adição da sonda. Foi adicionado um excesso de 200 vezes de competidores de tipo selvagem e competidores mutados juntamente com a sonda relevante. As misturas reaccionais foram seguidamente sujeitas a electroforese em géis de poliacrilamida não desnaturantes a 5 %. Os géis foram secos em vácuo e auto-radiografados durante a noite a -80 °C.

Exemplo 19:

Análise de Imunoprecipitação (ip) e imumotransferência (ib) .

Foram incubados extractos de proteínas nucleares ou citoplásmicas (80 yg) com 6 yg dos anticorpos policlonais indicados durante a noite a 4 °C. e imunoprecipitados com glóbulos de proteína G Sepharose (Pharmacia) durante 1 h à temperatura ambiente. Os glóbulos foram em seguida sujeitos a ebulição em tampão para amostra SDS-PAGE contendo DTT a 10% e o sobrenadante foi resolvido através de SDS-PAGE (10 % de acrilamida) sob condições redutoras. O gel foi seguidamente transferido para uma membrana de nitrocelulose e as proteínas foram detectadas com os anticorpos indicados. Foram identificados complexos imunes através de um kit de detecção Super Signal™ (Pierce).

Exemplo 20: 51

Preparação de CHO r-hsLDLR utilizando o promotor de IL-18BP.

As células CHO recombinantes estáveis que expressam LDLR solúvel humana são geradas por co-transfecção de células CHO-DUKX que carecem do gene de dihidrofolato redutase (DHFR) (Urlaub, G. et al., 1980) com dois vectores de expressão: um contendo o domínio da ligação ao ligando terminal N de LDLR, começando no resíduo de aminoácido Asp (+ 4) até Glu 291 (+291), e pDHFR, contendo o gene de murino para DHFR, DBFR controlada pelo promotor inicial de SV40 e o gene sLDLR pelo promotor de IL-18BP (SEQ ID NO:2) e elementos para a terminação da transcrição da região inicial de SV40. A transfecção é realizada por liposomas catiónicos utilizando LipofectAmine (Gibco BRL), de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. Setenta e duas horas após a transfecção as células são transferidas para um meio selectivo que carece de desoxi e ribonucleósidos e complementado com 10 % de FCS dialisado. As células que expressam actividade de DHFR são capazes de formar colónias, que são isoladas por remoção das células com discos de papel embebidos em tripsina. As células são cultivadas e seleccionadas relativamente à actividade de r-hsLDLR. As células transfectadas são seguidamente sujeitas a amplificação de gene por MTX, seguido por sub-clonagem e selecção dos clones produtores estáveis.

REFERÊNCIAS

Bahner 1993 J. Virol 67:3199.

Breni et al. 1992 Blood 80:1418.

Boshart et al. 1985 Cell 41:521.

Brinster et al. (1981) Cell 27:233.

Cassei 1993 Exp. Hematol. 21:585.

Chao 1993 Blood 81:2031. 52

Chen 1997 Nat. Med. 3:1110 Costantini et al. (1981) Nature 294:982 Couture 1996 Trends Genet. 12:510.

Dignam et al. 1983 Nucleic. Acid. Res. 11: 1475 Dijkema et al. 1985 EMBO J 4:761.

Dunbar 1995Blood 85 : 3048.

Dynan and Tjian 1985 Nature 316:774.

Dynan W. 1989 Cell 58:1-4.

Fletcher et al. 1987 Cell 51:773-781.

Fried et al. 1981 Nucleic Acids Res. 9, 6505 Gale et al. 1992 Transplant 9 :151.

Gordon et al. (1976) PNAS 73 : 1260.

Gorman et al. 1982b PNAS 79 :6777 Henon et al. 1992 Transplant 9: 285.

Herzog, R. W., Hagstrom, J. N., Kung, S. H., Tai, S. J., Wilson, J. M., Fisher, K. J. & High, K. A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 5804-5809 Harpers et al. (1981) Nature 293:540.

Hao et al. 1995 Blood 86:3745.

Junker 1997 Blood 89:4299.

Kearns 1997 Human Gene Ther 8: 310.

Kohn et al. (1999) Blood 94:368.

Lee 1994 J. Virol 68:8254

Lili Wang*, Kazuaki Takabeteft, Scott M. Bidlingmaier*, Charles R. ΙΙΙΦ, and Inder M. Verma* Vol. 96, Issue 7, 3906-3910, Março 30, 1999 Sustained correction of bleeding disorder in hemophilia B mice by gene therapy Lotti et al. 2002 J. of Virol. 76:3996.

Malim 1989 Cell 58:205.

Maniatis et al. 1987 Science 236:1237.

Marasco 1997 Gene Ther. 4:11. 53

Muhl, H., Kampfer, H., Bosmann, M., Frank, S., Radeke, H. & Pfeilschifter, J. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 960-963.

Murphy, J. E., Zhou, S., Giese, K., Williams, L. T., Escobedo, J. A. & Dwarki, V. J. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 13921-13926

Neighbors, M., Xu, X. Barrat, F. J., Ruuls, S. R., Churakova, T., Debets, R., Bazan, J. F., Kastelein, R. A., Abrams, J. S. & 0'Garra, A. (2001) J. Exp. Med. 194, 343-354.

Novick, D., Schwartsburd, B., Pinkus, R., Suissa, D., Belzer, I., Sthoeger, Z., Keane, W. F., Chvatchko, Y., Kim, S. H., Fantuzzi, G., Dinarello, C. A. & Rubinstein, M. (2001) Cytokine 14, 334-342.

Novick D, Kim SH, Fantuzzi G, Reznikov LL, Dinarello CA,

Rubinstein M. Immunity 1999 Jan; 10(1):127-36

Novick D, Schwartsburd B, Pinkus R, Suissa D, Belzer I,

Sthoeger Z, Keane WF, Chvatchko Y, Kim SH, Fantuzzi G,

Dinarello CA, Rubinstein M. Cytokine 2001 Jun 21;14 (6) :334- 42

McKnight and Tjian 1986 Cell 46:795.

Mioshi et al. 1999 Science 283:682.

Moritz 1993 J. Exp. Med. 178:529.

Palmiter et al. 1986 Ann. Rev. Genet. 20:465.

Revzin 1989 Biotechniques 7:346

Sassone-Corsi and Borreli 1986 Trend. Genet. 2:215 Scheidereit et al. 1987 Cell 51:783-793.

Slobod 1996 Blood 88, 3329

Snyder, R. O., Miao, C. H., Patijn, G. A., Spratt, S. K., Danos, O., Nagy, D., Gown, A. M., Winther, B., Meuse, L., Cohen, L. K., et al. (1997) Nat. Genet. 16, 270-276 54

Snyder, R. 0., Miao, C., Meuse, L., Tubb, J., Donahue, B. A., Lin, H. F., Stafford, D. W., Patel, S., Thompson, A. R., Nichols, T., et al. (1999) Nat. Med. 5, 64-70 Song, S., Morgan, M., Ellis, T., Poirier, A., Chesnut, K., Wang, J., Brantly, M., Muzyczka, N., Byrne, B. J., Atkinson, M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 14384-14388

Sullenger 1990 Cell 63:601.

Veres et al. 1996 J. Virol. 70 : 8792 Verma et al. 1997 Nature 389 :239.

Voss et al. 1986 Trends Biochem. Sei. 11 :287.

Wagner et al. (1981) PNAS 78:5016

Xiao, W., Berta, S. C., Lu, Μ. M., Moscioni, A. D., Tazelaar, J. & Wilson, J. M. (1998) J. Virol. 72, 10222- 10226

Zecchina G, Novick D, Rubinstein M, Barak V, Dinarello C, Nagler A. J Hematother Stem Cell Res. 2001 Dec;10(6):769- 76.

Zhou 1994 Gene 149:33.

Zweibel et al. 1989 Science 243 : 220.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Yeda Research and Development Co. Ltd Rubinstein, Menachem Novick, Daniela Hurgin, Vladimir

<120> PROMOTOR PARA IL-18BP, SUA PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO

<130> 596PCT <150> 152232 <151> 2002-10-10 55 < 16 Ο > 5 <17Ο> Patentln version 3.1 <210 > 1 <211> 1272

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 catgaactag acacctagag aagaaggatg tgacttgtag tatcctatgt ctaaattagg 60 aatatgaatc tggtttttct acaagaagtt tgagatcaca gctgactgtg ttcctgatgc 120 atccaccaaa cccagttcca tctgtgggec tccctggctc tgtcaccagc cgttgcaccc 180 tcccaatcac aggagtcaca aacctcagac atgcagctcc tgtccacact taatatatgc 240 atgcattgga tcacccagcc ctggtctttc tgcctccatg gataactgca tgaccctgag 300 agaaaacctc cttagattta gcatcctagg ttcctcacac gcctcaccct gaatcctggc 360 cctcccgcag ccccagcgcc atttgtccca tcagtgacaa gattcatatt ctgatgtaga 420 ctctgttgcc agagccagtg ttgagccagt ccgcctcttc cccgggaagt gcctgccctt 480 ccctcctgtt agggttggct ctcgagcttg tgtgccagtt cctgggttgg ccgtgagagt 540 tctacagaca aggaggaagt gctctcggtg tatttcctgt ggtgggttca cacgcagcta 600 gacacagcta acttgagtct tggagctcct agagggaagc ttctggaaag gaaggptctt 660 caggacctct taggagccag gtaggagtct gggactacta gtgaacctag acctgtggct 720 ctggccagag gggctaggat gagagacaga gggtgtgatg gtgggtgctg ggagatgtag 780 ccgaccttgg ggctggtggc tgggggagtg ggtagcctgg gaaaggccag gatgtggacg 840 gactggtatg gcattgagcc tgaagtggtc caacttgggg ttccccagtg cctaggaaag 900 ttgtcccctt gaatgtcagt gtgaaggtga aggaggaagc agatgcctgt tcatatggaa 960 acaaagacct ggctgtgaag aggggaggcg gacaccaaag tcctgacact tgggcgggac 1020 agaattgatc tgtgagagac tcatctagtt cataccctag gtgaccctgg gggtggcatg 1080 ggggtagatt agagatccca gtctggtatc ctctggagag taggagtccc aggagctgaa 1140 ggtttctggc cactgaactt tggctaaagc agaggtgtca cagctgctca agattccctg 1200 gttaaaaagt gaaagtgaaa tagagggtcg gggcagtgct ttcccagaag gattgctcgg 1260 catcctgccc tt 1272 <210> 2 56 <211> 634 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 gcttctggaa aggaaggctc ttcaggacct cttaggagcc aggtaggagt ctgggactac 60 tagtgaacct agacctgtgg ctctggccag aggggctagg atgagagaca gagggtgtga 120 tggtgggtgc tgggagatgt agccgacctt ggggctggtg gctgggggag tgggtagcct 180 gggaaaggcc aggatgtgga cggactggta tggcattgag cctgaagtgg tccaacttgg 240 ggttccccag tgcctaggaa agttgtcccc ttgaatgtca gtgtgaaggt gaaggaggaa 300 gcagatgcct gttcatatgg aaacaaagac ctggctgtga agaggggagg cggacaccaa 360 agtcctgaca cttgggcggg acagaattga tctgtgagag actcatctag ttcataccct 42Ó aggtgaccct gggggtggca tgggggtaga ttagagatcc cagtctggta tcctctggag 480 agtaggagtc ccaggagctg aaggtttctg gccactgaac tttggctaaa gcagaggtgt 540 cacagctgct caagattccc tggttaaaaa gtgaaagtga aatagagggt cggggcagtg 600 ctttcccaqa aqqattqctc qqcatcctqc cctt 634 <210> 3 <211> 122

<212> ADN <213> Homo sapiens <4 00> 3 cactgaactt tggctaaagc agaggtgtca cagctgctca agattccctg gttaaaaagt 60 gaaagtgaaa tagagggtcg gggcagtgct ttcccagaag gattgctcgg catcctgccc 120 tt 122 <210> 4 <211> 1061 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 57 tgcagctcct gtccacactt aatatatgca tgcattggat cacccagccc tggtctttct 60 gcctccatgg ataactgcat gaccctgaga gaaaacctcc ttagatttag,catcctaggt 120 tcctcacacg cctcaccctg aatcctggcc ctcccgcagc cccagcgcca tttgtcccat 180 cagtgacaag attcatattc tgatgtagac tctgttgcca gagccagtgt tgagccagtc 240 cgcctcttcc ccgggaagtg cctgcccttc cctcctgtta gggttggctc tcgagcttgt 300 gtgccagttc ctgggttggc cgtgagagtt ctacagacaa ggaggaagtg ctctcggtgt 360 atttcctgtg gtgggttcac acgcagctag acacagctaa cttgagtctt ggagctccta 420 gagggaagct tctggaaagg aaggctcttc aggacctctt aggagccagg taggagtctg 480 ggactactag tgaacctaga cctgtggctc tggccagagg ggctaggatg agagacagag 540 ggtgtgatgg tgggtgctgg gagatgtagc cgaccttggg gctggtggct gggggagtgg 600 gtagcctggg aaaggccagg atgtggacgg actggtatgg cattgagcct gaagtggtcc 660 aacttggggt tccccagtgc ctaggaaagt tgtccccttg aatgtcagtg tgaaggtgaa 720 ggaggaagca gatgcctgtt catatggaaa caaagacctg gctgtgaaga ggggaggcgg 780 acaccaaagt cctgacactt gggcgggaca gaattgatct gtgagagact catctagttc 840 ataccctagg tgaccctggg ggtggcatgg gggtagatta gagatcccag tctggtatcc 900 tctggagagt aggagtccca ggagctgaag gtttctggcc actgaacttt ggctaaagca 960 gaggtgtcac agctgctcaa gattccctgg ttaaaaagtg aaagtgaaat agagggtcgg 1020 ggcagtgctt tcccagaagg attgctcggc atcctgccct t 1061 <210> 5 <211> 51

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 cccaqaagca gctctggtgc tgaagagagc actgcctccc tgtgtgactg g 51

Lisboa, 26 de Janeiro de 2010

Claims (31)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana (SEQ ID N0:1), ou um seu fragmento funcional ou um seu derivado funcional em que a terminação 3' da referida sequência de ADN ou seu fragmento compreende a SEQ ID NO:5.

2. A sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1, em que o derivado é mutado num ou mais sitios AP 1 presentes num elemento silenciador presente na sequência.

3. A sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1, em que o fragmento compreende a SEQ ID NO:2.

4. A sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1, em que o fragmento compreende a SEQ ID NO:3.

5. A sequência de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo adicionalmente um intrão.

6. A sequência de ADN de acordo com a reivindicação 5, em que o intrão consiste no primeiro intrão de L-18BP.

7. A sequência de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, contendo adicionalmente um gene ligado operativamente ao promotor de IL-18BP.

8. A sequência de ADN de acordo com a reivindicação 7, em que o gene codifica IL-18BP. 2

9. A sequência de ADN de acordo com a reivindicação 7, em que o gene codifica uma proteína heteróloga.

10. A sequência de ADN de acordo com a reivindicação 9, em que o gene heterólogo codifica o gene de luciferase.

11. A sequência de ADN de acordo com a reivindicação 9, em que o gene heterólogo codifica uma proteína seleccionada a partir do interferão-beta, TNF, eritropoietina, activador de tecido plasminogénio, factor estimulante de colónia de granulócitos, superóxido dismutase de manganês, uma imunoglobulina, ou seu fragmento, hormona do crescimento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR e proteínas de ligação ao receptor de TNF.

12. Um vector compreendendo uma sequência de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.

13. Uma célula hospedeiro compreendendo um vector de acordo com a reivindicação 12.

14 . Uma célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 13, sendo uma célula mamífera.

15. Uma célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 14, seleccionada a partir de células CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, e Hakat U937.

16. Um método para a produção de uma proteína recombinante compreendendo cultivar uma célula hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15 e isolar a proteína recombinante produzida. 3

17. Um vector virai recombinante que compreende uma porção do genoma do vírus, um fragmento de ADN que codifica um gene de interesse e um fragmento de ADN compreendendo uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ligado operativamente ao gene de interesse.

18. Um vector virai recombinante de acordo com a reivindicação 17, em que o gene de interesse é seleccionado a partir de interferão-beta, TNF, eritropoietina, activador de tecido plasminogénio, factor estimulante da colónia de granulócitos, superóxido dismutase de manganês, uma imunoglobulina, ou seu fragmento, hormona do crescimento, FSH; hCG, IL-18, hsLDLR e proteínas de ligação ao receptor de TNF.

19. Um vector virai recombinante de acordo com a reivindicação 17, em que a porção do genoma do vírus pertence a um vírus adeno-associado.

20. Um vector virai recombinante de acordo com a reivindicação 17, em que a porção do genoma do vírus pertence a um retrovírus.

21. Um vector virai recombinante de acordo com a reivindicação 20, em que o retrovírus é seleccionado a partir de HIV, HFV, MLV, FIV e VSV.

22. Um método in vitro de regular a expressão específica celular de um gene de interesse, compreendendo a transdução de uma célula alvo mamífera com um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21. 4

23. Um método de acordo com a reivindicação 22, em que a célula alvo é uma célula mãe hematopoiética.

24. Um método de acordo com a reivindicação 22, em que a célula alvo é um monócito.

25. Um método de acordo com a reivindicação 24, em que a célula alvo é um macrófago.

26. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, em que o gene de interesse codifica uma proteína conferindo resistência à infecção por HIV.

27. Utilização do vector virai recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de infecção por HIV, patologias hematopoiéticas tais como SCID, doença granulomatosa crónica e talasemia e/ou de uma doença num indivíduo exibindo elevado INFy num tecido corporal.

28. Utilização de acordo com a reivindicação 27, em que o medicamento é para o tratamento de uma doença num indivíduo que exibe elevado INFy num tecido corporal e compreende adicionalmente factores IL-6 e/ou TNFa e/ou IRF e/ou C/ΕΒΡβ.

29. Murganhos transgénicos que contêm a sequência de ADN que codifica uma ADN sequência de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

30. A utilização de uma sequência de ADN que codifica o promotor da IL-18BP humana (SEQ ID NO:l), ou um seu fragmento ou um seu derivado funcional em que a terminação 5 3' da referida sequência de ADN ou seu fragmento compreende um ou mais nucleótidos a partir da terminação 5' da SEQ ID NO: 5, no fabrico de um medicamento para o tratamento de infecção por HIV, patologias hematopoiéticas tais como SCID, doença granulomatosa crónica e talasemia e/ou de uma doença num indivíduo exibindo elevado IFNy num tecido corporal.

31. Uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efectiva de uma sequência de ADN que codifica o promotor de IL-18BP humana (SEQ ID N0:1), ou um seu fragmento ou um seu derivado funcional, em que a terminação 3' da referida de sequência de ADN ou seu fragmento compreende a SEQ ID NO: 5. Lisboa, 26 de Janeiro de 2010