NO332931B1 - Anvendelse av kompleks av thorium-227 og komplekseringsmiddel i fremstilling av et medikament, farmasoytisk sammensetning omfattende mykvevsmalrettingskompleks, mykvevsmalrettingskompleks, fremgangsmate for a danne et kompleks samt sett for bruk i anvendelsen. - Google Patents

Abstract

Denne oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for behandling av mykvevssykdommer i pattedyrsubjektet (et humant eller hundesubjekt), hvor fremgangsmåten omfatter å administrere til subjektet en terapeutisk effektiv mengde av et mykvevsmålrettet kompleks fra thorium-227 og et komplekseringsmiddel, hvor mengden er slik at den aksepterbare ikke-myelotoksiske mengde av radium-223 genereres in vivo ved kjernenedbrytning av det administrerte thorium-227.

Description

Denne oppfinnelsen gjelder en anvendelse for radioterapi, mer bestemt en slik anvendelse av thorium-227 for fremstilling av et medikament for behandling av mykvevssykdommer.

Oppfinnelsens bakgrunn

Spesifikk celledreping kan være vesentlig for en vellykket behandling av et flertall sykdommer i pattedyr. Typiske eksempler på dette er ondartede sykdommer slik som sarkom og karsinom. Men den selektive elimineringen av visse celletyper kan også spille en nøkkelrolle i behandlingen av andre sykdommer, spesielt hyperplasi og neoplasi sykdommer.

De mest vanlige fremgangsmåter for selektiv behandling i dag er kirurgi, kjemoterapi, og ekstern stråleeksponering. Målrettet radionuklideterapi er imidlertid et lovende og utviklende område med potensiale for å levere høyt cytotoksiske stråleeksponeringer til uønskede celletyper. De mest vanlige formene for radiofarmasøytiske midler i dag som er autorisert for bruk i mennesker anvender betaemitterende og/eller gammaemitterende radionuklider. Det har imidlertid vært litt interesse for bruken av alfaemitterende radionuklider i terapien på grunn av deres potensiale for mer spesifikk celledreping.

Bestrålingsrekkevidden for en typisk alfaemitter i fysiologiske omgivelser er generelt mindre enn 100 mikrometer, noe som tilsvarer kun noen få cellediametere. Dette gjør disse kildene godt egnet for behandlingen av tumorer, inkluderende mikrometastaser fordi lite bestrålt energi vil passere forbi målcellene slik at skaden på det omgivende friske vevet blir minimalisert (se Feinendegen et al., Radiat Res 148:195-201 (1997)). Til kontrast har en betapartikkel en rekkevidde på 1 mm i vann (se Wilbur, Antibody Immunocon Radiopharm 4: 85-96 (1991)).

Energien til alfapartikkelstråler er høy sammenlignet med betapartikler, gamma-stråler og røntgenstråler, og er typisk rundt 5-8 MeV som tilsvarer 5-10 ganger energien til en betapartikkel og 20 eller flere ganger energien til en gammastråle. Denne deponering av en stor mengde energi på en svært kort avstand gir a-stråling en eksepsjonelt høy lineær energioverføring (LET), høy relativ biologisk effisiens (RBE) og lavt oksygenøkende forhold (OER) sammenlignet med gamma- og betastråling (se Hall, "Radiobiology for the radiologist", femte utgave, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA, USA, 2000). Dette forklarer den eksepsjonelle cytotoksisiteten til alfaemitterende radionuklider og gir også strenge krav til kontrollnivåer og studier av alfaemitterende radionuklidfordelinger som er nødvendig for å unngå uakseptable bieffekter.

Svært få alfaemitterende radionuklider er i dag antatt å være anvendbare for målrettet molekylærterapi (se f.eks. Feinendegen Supra and Wilbur supra). For å avgjøre om en bestemt nuklide er egnet må kandidatene nøye evalueres på basis av deres fysiske karakteristikker, kjemiske egenskaper og egenskapene til deres nedbrytningsprodukt(er) (dvs. deres datternuklider). Det er ofte tilfelle at datternuklidene som dannes ved nedbrytning av de potensielle terapeutiske alfaemitterende radionuklidene også er alfaemittere og/eller leder til ytterligere alfaemitterende isotoper når de på sin side nedbrytes. Det er derfor vesentlig å betrakte egenskaper for potensielle datternuklider når man vurderer den terapeutiske egnetheten til en alfaemitter.

Tabell 1 nedenfor viser de fysiske nedbrytningsegenskapene til alfaemittere slik de fremstilles i litteraturen og som muligens har terapeutiske evner.

Så langt har hovedfokuset vært på211 At og<2I3>Bi, og disse to nuklidene har blitt undersøkt i kliniske immunoterapiforsøk.

Flere av radionuklidene som er foreslått er kortlivede, dvs. har halveringstider på mindre enn tolv timer. Slike korte halveringstider gjør det vanskelig å produsere og fordele radiofarmasøytiske midler basert på disse radionuklidene på kommersielt vis. Administrering av kortlivede nuklider vil også øke andelen av bestrålingsdoseringen som vil emitteres i kroppen før målområdet blir nådd.

To langlivede nuklider<223>Ra og<225>Ac har mer gunstige halveringstider. Begge disse radionuklider har kortlivede datterprodukter (mor og datter emitterer en kombinert total på fire alfapartikler), og vil danne en sterk alfakaskade hvis nedbrytning av mor og datter finner sted på samme plass. Men hvis datternukliden ikke er inneholdt i målområdet, vil disse nuklider ha et potensial for å frigjøre store mengder av skadelig stråling inn i friskt vev. Det er også vesentlig og et fundamentalt problem at rekylen til datternukliden etterfølgende alfanedbrytning er høyenergetisk.

(Frigjøring av heliumkjernen ved ca. 2 % av lyshastigheten gir en svært betydelig mengde moment til den gjenværende datterkjernen).

Rekylenergien til en alfaemisjon vil i mange tilfeller forårsake frigjøring av datternuklider fra nedbrytningsposisjonen til forelderen. Denne rekylenergien er tilstrekkelig til å bryte mange datternuklider ut av det kjemiske miljøet som har holdt på foreldrene, dvs. hvor foreldrene var kompleksert ved en ligand slik som chelatchelaterende middel. Dette vil inntreffe selv hvor datteren er kjemisk kompatibel med, dvs. kompleksert med den samme liganden. Tilsvarende når datternukliden er en gass, spesielt en edelgass slik som radon eller kjemisk inkopatibel med liganden, vil denne frigjøringseffekten være enda større. Når datternukliden har halveringstider på mer enn noen få sekunder, kan de diffusere unna i blodsystemet uhindret av komplekseringsmidler som holdt på forelderen. Disse frie radioaktive døtrene kan forårsake uønskede systemisk toksisiteter.

Nylig har aktinium-225 tiltrukket seg noe oppmerksomhet, men forskning på denne nukliden har blitt hindret av lav tilgjengelighet på kildemateriale. Det har blitt vist at<225>Ac kan kobles til monoklonale antistoffer og brukt for målretting mot antigeninneholdende vev. Studier opptil nå indikerer at<225>Ac-merkede antistoffer er høyt toksiske i dyreeksperimenter.

Andre nuklider som har blitt nevnt som kandidater for medisinsk alfaemitterterapi terapi inkluderer j Ra og a a grRa (T1/2= 1600 år) og ble mye brukt i den tidligere delen av forrige århundre men ble senere forlatt fordi de negative langtidseffektene inkluderer beinkreft. Disse to radiumnuklider har radondøtre som er gassholdige og diffuserer hurtig bort fra plassen hvor mornukliden sitter. Det er også en generell mangel på egnede koblinger for feste av radium til et molekylært målrettningsmiddel. I tillegg er den ekstremt lange halveringstiden til<226>Ra veldig problematisk når det gjelder strålingssikkerhet og forurensningsfare.

De fleste alfaemitterende radionuklider er dermed antatt å være uegnede på grunn av deres uegnede halveringstider eller på grunn av deres nedbrytningsprodukter som er antatt å være ikke-kompatible for medisinsk bruk, dvs. fordi datternuklidene er beinsøkende (se Mausner, Med Phys 20, 503-509 (1993)). Dermed vil f.eks. radium som er en kalsiumanalog, være en spesielt sterk beinmålretter og hvis den frigjøres fra<227>Th in vivo er datternukliden<223>Ra kjent (se Muller, Int J Radiat Biol 20: 233-243 (1971)) for å akkumuleres uønskelig i skjelettet hvor en vesentlig myelotoksisitet kan forventes.

I henhold til Feinendegen et al. ("Alpha-emitters for medical therapy" Second Bi-Annual Workshop, Toronto, juni 1998, US Dept. of Energy Report nr. DOE/NE-0116), er det to terapeutiske radionuklidkandidater som nedbryter via minst tre alfaemitterende progener (eng: progenies). Disse er<225>Ac og 223Ra. Terapeutiske studier i dyremodeller med radioimmunokonjugater av aktinum-225 (T1/2= 10,0 dager) har indikert at injiserte doser på 6,3 kBq (ca. 250 kBq/kg, antatt 25 g som gjennomsnittelig vekt på dyret) vil sterkt forbedre overlevelsen i mus som bærer disseminerte lumfomaxenografter. Aktinum-225-serien frigir fire alfapartikler, de første tre alfaemitterne i serien har levetider på mindre enn 5 min., mens den siste alfaemitteren i denne serien vismut-213, har en halveringstid på 46 minutter.

In vivo data som demonstrerer antitumoreffekter til<223>Ra har så langt ikke blitt presentert i litteraturen. Fordelen ved denne nukliden er den korte levetiden til døtrene, dvs. døtre fra<2I9>Rn (Ti/2= 3,96 sek.) som frigir to eller flere alfa innenfor sekunder, mens den siste alfaemitteren i serien<2II>Bi, ved siden av å være forutgått av Pb (<T>1/2= 36,1 min.), har en halveringstid på 2,17 min. og kan diffusere bort fra<223>Ra. Men tre av de fire alfaemitterne vil nedbrytes i nærvær av mornukliden med<223>Ra så vel som<225>Ac. Dette er i sterk kontrast til227Th som har avkom som emitterer fire alfaer, alle foregått av datteren<223>Ra med 11,4 dagers halveringstid. Denne lange halveringstiden til<223>Ra datteren vil sannsynligvis forårsake en nesten fullstendig translokasjon av avkommet sammenlignet med mor22<3>Th-nukliden og gir dermed betydelige vanskeligheter med å kontrollere stedene til disse fire alfautstrålinger og vil dermed med høy sannsynlighet gi uønskede bieffekter.

Men thorium-227 ( Tm = 18,7 dager) har nylig blitt foreslått (se WO 01/60417 og WO 02/05859) som terapeutiske radionuklider så lenge det anvendes et bæresystem som tillater at datternuklidene blir gjenholdt i et lukket miljø. I ett tilfelle er radionukliden anbrakt inne i et liposom og den vesentlige størrelsen til liposomet (sammenlignet med rekylavstanden) hjelper å holde igjen datternuklidene inne i liposomet. I det andre tilfellet anvendes bensøkende komplekser til radionukliden som innlemmer det i bengrunnmassen og dermed gjenholder frigjøringen av datternuklidene. Dette er potensielt høyt fordelaktige fremgangsmåter, men administreringen av liposomer er ikke ønskelig i noen tilfeller, og det er mange sykdommer i mykt vev hvor radionuklidene ikke kan omgis av en mineralisert grunnmasse for å gjenholde datterisotopene.

I fravær av slike spesifikke midler for å gjenholde radiumdøtre av thorium-227, har den offentlig tilgjengelige informasjon når det gjelder radiumtoksisitet gjort det klart at det ikke er mulig å anvende thorium-227 som et terapeutisk middel fordi dosene som er nødvendig for å oppnå en terapeutisk effekt fra thorium-227-nedbrytning vil resultere i en høy toksisitet og muligens dødelig strålingsdosering fra nedbrytning av radiumdøtre, dvs. det er ikke noe terapeutisk vindu.

Det er derfor et betydelig behov for forbedringer av ytterligere radionuklidbehandlinger av mykvev som tillater terapeutisk behandling av ondartede og ikke-ondartede sykdommer med alfaemittere uten å forårsake uakseptable bieffekter, spesielt myelotoksisitet.

Oppfinnerne har uventet funnet at et terapeutisk behandlingsvindu eksisterer hvor en terapeutisk effektiv mengde av en målsatt thorium-227-radionukleid kan administreres til et subjekt (typisk et pattedyr) uten å generere en tilstrekkelig mengde radium-223 til å forårsake uakseptabel myelotoksisitet.

Sammendrag av oppfinnelsen

I et aspekt fremskaffer denne oppfinnelse en anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av et mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel for fremstilling av et medikament for behandling av mykvevssykdommer i pattedyrsubjekter (fortrinnsvis et menneske eller hundesubjekt), der nevnte effektiv mengde er slik at i bruk blir en aksepterbar ikke-myelotoksisk mengde av radium-223 generert in vivo ved en kjernenedbrytning av administrert thorium-227 og der thorium-227 er konjugert til en målrettingsdel med bioaffinitet, unntatt beinsøkere, liposomer og folatkonjugerte antistoffer eller antistoffragmenter og hvor den terapeutisk effektive mengden thorium-227 et minst 25 kBq/kg.

I et andre aspekt fremskaffer denne oppfinnelse bruk av thorium-227 for produksjon av et medikament omfattende et mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel for bruk i en fremgangsmåte for å behandle mykvevssykdommer.

I et tredje aspekt fremskaffer denne oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning omfattende en mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel, sammen med minst én farmasøytisk bærer eller eksipiens.

I et ytterligere aspekt fremskaffer denne oppfinnelse et mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel.

For å skille seg fra ikke-radioaktive thoriumkomplekser skal det forstås at thoriumkomplekser og sammensetninger av disse som kreves herunder inkluderer thorium-227 ved større enn naturlig mengde, dvs. minst 20 % større. Dette påvirker ikke definisjonen av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen hvor den terapeutisk effektive mengde av thorium-227 er påkrevd.

I et ytterligere aspekt fremskaffer oppfinnelsen et kitt for bruk i en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen, hvor kittet omfatter en løsning av et mykvevsmålsatt kompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel sammen med instruksjoner for bruk av løsningen i en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen.

I et ytterligere aspekt fremskaffer oppfinnelsen et sett for bruk i en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen hvor settet omfatter et komplekseringsmiddel i stand til å kompleksere thoriumioner, og hvor komplekseringsmidlet ikke er et mykvevsmålrettet komplekseringsmiddel, og en mykvevsmålrettet forbindelse eventuelt sammen med en koblingsforbindelse (eng: linker compound) konjugerbar til komplekseringsmidlet for å fremskaffe et mykvevsmålrettet komplekseringsmiddel. Videre inneholder settet instruksjoner for preparering av mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel, og eventuelt også for bruk av komplekset i en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er en graf som viser fallet i radioaktivitet som funksjon av tid av på grunn av thorium-227-nedbrytning og de resulterende økninger med tid av radioaktiviteten på grunn av radium-223-nedbrytning etterfulgt ved administrering av en thorium-227 kompleks i henhold til oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Med "mykvevsmålrettet" menes herunder at substansen, når den er i form av et thoriumkompleks, tjener til å bringe thorium til et mykvevssted hvor dens radioaktive nedbrytning er ønsket. Dette kan være i form av en komponent i komplekseringsmidlet som binder til celleoverflatemarkører (f.eks. reseptorer) tilstede på sykdomspåvirkede celler eller celler i nærvær av sykdomspåvirkede celler (f.eks. proteiner som er mer tyngre uttrykt på sykdomscelleoverflater enn friske celleoverflater eller mer tyngre uttrykt på celleoverflater under vekstperioder eller replikasjon enn under dormante faser), eller ved hjelp av forbindelser som bindes til ytterligere mykvevsbindemiddel (i tilfelle ytterligere middel vil administreres først som en "stifinner" for thoriumkomplekset). Alternativt kan målrettingen være mot et antigen som er forbundet med målcellene men ikke festet direkte til disse. Slike antigener vil typisk være i grunnmassen mellom målcellene og vil dermed være omgitt av sykdomsvevet. Eksempler på dette er grunnmasseantigener slik som tenaskin, som er forbundet med hjernetumorer men som er uttrykt i grunnmassen mellom cellene. Slike grunnmasseantigener kan målrettes direkte eller ved et preliminært bindemiddel som diskutert ovenfor.

Begrepet "mykvev" som brukt herunder indikerer vev som ikke har en "hard" mineralisert grunnmasse. Mykvev som brukt herunder kan være et hvilket som helst vev som ikke er skjelettvev. Tilsvarende vil begrepet "mykvevssykdommer" som brukt herunder indikere sykdommer som inntreffer i mykvev som brukt herunder. Oppfinnelsen er spesielt egnet for behandling av kreft og "mykvevssykdommer" som omfatter karsinom, sarkom, myelom, leukemi, lymfom og blandede typer kreft som inntreffer i en hvilken som helst "myk" (dvs. ikke-mineralisert) vev, så vel som andre ikke-kreftlignende sykdommer i slike vev. Kreftlignende mykvevssykdommer inkluderer faste tumorer som inntreffer i myke vev så vel som metastatiske og mikrometastatiske tumorer. Mykvevssykdommer kan omfatte primært fast tumorer av mykvev og minst én metastatisk tumor av mykvev i samme pasient. Alternativt kan mykvevssykdommer bestå av kun en fast tumor eller metastaser med den primære tumoren i form av en skjelettsykdom.

Som brukt herunder vil begrepet "aksepterbar ikke-myelotoksisk" anvendes for å indikere at mengden radium som genereres generelt ikke er tilstrekkelig for å være direkte dødelig for subjektet.

Det er åpenbart for en fagperson på feltet at mengden margskade (og sannsynligheten for en dødelig reaksjon) som kan være en aksepterbar sideeffekt av en slik behandling vil variere sterkt med typen sykdom som blir behandlet, målsetningen med behandlingsregimet og prognosene for subjektet. Selv om foretrukne subjekter for denne oppfinnelsen er mennesker, vil andre pattedyr og spesielt hunder også dra fordel av bruken av oppfinnelsen og nivået av aksepterbar margskade kan også resultere spesiet til subjektet. Nivået på aksepterbar margskade vil generelt være større i behandlingen av ondsinnede sykdommer enn for godartede sykdommer. Et godt kjent mål på nivået av myelotoksisitet er neutrofilcelletallet og, i denne oppfinnelse, en aksepterbar ikke-myelotoksisk mengde på<223>Ra vil typisk være en mengde kontrollert slik at neutrofilfraksjonen er ved dens laveste punkt (nadir) på ikke noe mindre enn 10 % av tellingen før behandlingen. Fortrinnsvis vil aksepterbare ikke-myelotoksisk mengde av<223>Ra være en mengde slik at neutrofilcellefraksjonen er minst 20 % ved nadir og mer fortrinnsvis minst 30 %. En nadir neutrofilcellefraksjon på minst 40 % er mest foretrukket.

I tillegg kan det anvendes<227>Th-inneholdende forbindelser med høye doseregimer hvor myelotoksisiteten til det genererte<223>Ra vil normalt være utolererbar når stamcellestøtten eller en sammenlignbar gjenvinningsfremgangsmåte er inkludert. I slike tilfeller vil neutrofilcelletallet reduseres til under 10 % ved nadir og i eksepsjonelle tilfeller reduseres til 5 % eller hvis nødvendig under 5 %, så fremt egnede forholdsregler er tatt og etterfølgende stamcelleunderstøttelse er gitt. Slike teknikker er godt kjent innenfor fagområdet.

Thorium-227 er relativt lett å produsere og kan prepareres indirekte ved nøytronbestrålt<226>Ra, som vil inneholde mornukliden til<227>Th, dvs.<227>Ac (T1/2 = 22 år). Aktinium-227 kan lett separeres fra<226>Ra-målet og anvendes som en generator for<227>Th. Denne prosessen kan skaleres til industriskala hvis nødvendig, og dermed kan man unngå forsyningsproblemene som er tilfelle for de fleste andre alfaemittere antatt å være kandidater for molekulær målrettet radioterapi.

Thorium-227 nedbrytes via radium-223.1 dette tilfellet vil den primære datter ha en halveringstid på 11,4 dager. Fra en ren 227Th-kilde, vil kun moderate mengder

radium produseres under de første dagene. Men den potensielle toksisiteten til<223>Ra er høyere enn<227>Th fordi utstrålingen av en alfapartikkel fra<223>Ra etterfølges i løpet av minutter av tre ytterligere alfapartikler fra kortlevede døtre (se tabell 2 nedenfor som viser nedbrytningsserien for thorium-227).

Delvis på grunn av at den genererer potensielt skadelige nedbrytningsprodukter, har ikke thorium-227 (T1/2= 18,7 dager) blitt betraktet for alfapartikkelterapi.

Oppfinnerne bak denne oppfinnelse har etablert for første gang at thorium-227 kan administreres i mengder tilstrekkelig for å fremskaffe ønskede terapeutiske effekter uten å generere så mye radium-223 at det forårsakes utolererbar beinmargsundertrykkelse.

Ved å anta at drapseffektiviteten på tumorceller vil hovedsakelig komme fra thorium-227 og ikke fra dens døtre, kan den antatte terapeutiske doseringen av denne isotopen etableres ved sammenligning med andre alfaemittere. F.eks. har terapeutiske doser i dyr for astatin-211 typisk vært 2-10 MBq/kg. Ved å korrigere for halveringstiden og energiene blir den tilsvarende doseringen for thorium-227 minst 36-200 kBq/kg kroppsvekt. Dette vil sette en nedre grense på mengden 227Th som kan administreres med forventning om en terapeutisk effekt. Denne beregningen antar sammenlignbar retensjon av astatin og thorium. Det er imidlertid klart at 18,7 dagers halveringstid til thorium vil mest sannsynlig resultere i større eliminasjon av denne isotop før dens nedbrytning. Denne beregnede dosering bør derfor normalt antas å være minimal effektiv mengde. De terapeutiske dosene uttrykt i begrepet fullt gjenholdt2<27>Th (dvs.<227>Th som ikke er eliminert fra kroppen) vil typisk være minst 18 eller 25 kBq/kg, fortrinnsvis minst 36 kBq/kg og mer fortrinnsvis minst 75 kBq/kg, f.eks. 100 kBq/kg eller mer. Større mengder thorium vil forventes å ha større terapeutiske effekter men kan ikke administreres hvis utolererbare bieffekter inntreffer. Tilsvarende, hvis thorium administreres i en form som har en kort biologisk halveringstid (dvs. en halveringstid før eliminasjon fra kroppen som fortsatt bærer thoriumet), vil større mengder av radioisotopen være nødvendig for en terapeutisk effekt på grunn av at mye av thoriumen vil elimineres før den nedbrytes. Det vil imidlertid være en tilsvarende nedgang i mengden av radium-223 som genereres. De ovenfor nevnte mengder av thorium-227 som skal administreres når isotopen er fullstendig gjenholdt, kan lett relateres til ekvivalente doser ved korte biologiske halveringstider. Slike beregninger er gitt i eksempler 1 og 2 nedenfor.

Som et eksempel kan beregning av mengden<001>Th som er ekvivalent til en bestemt gjenholdt dose beregnes ved å anta neglisjerbar gjenholding i målområdet, i dette tilfellet:

hvor

Dadder administrert dose;

Dret er ekvivalent, fullstendig gjenholdt dose;

TTher den fysiske halveringstiden til<227>Th (18,7 dager); og

TBi0 er den biologiske halveringstiden til det administrerte thoriumkomplekset.

Minimumseffektiv dose av thoriumkomplekset kan dermed lett estimeres. Biologiske halveringstider kan bestemmes uten å bruke radioaktiv form av thoriumkomplekset.

Hvis en radiomerket forbindelse frigjør datternuklider er det, hvis mulig viktig å vite skjebnen, til de radioaktive datternuklid(er). For<227>Th er hoveddatterproduktet<223>Ra, som er under klinisk evaluering på grunn av bensøkende egenskaper. Radium-223 forlater blod svært raskt og konsentreres enten i skjelettet eller ekskreteres via intestinale eller renale ruter (se Larsen, J Nucl Med 43 (5, Supplement): 160P (2002)). Radium-223 frigjort in vivo fra<227>Th kan derfor ikke påvirke helsen til mykvev i en stor grad. I en studie ved Muller i Int. J. Radiat. Biol. 20:233-243 (1971) av distribueringen av<227>Th som et løst sitratsalt, ble det funnet at<223>Ra generert fra<227>Th i mykvev var i stor grad omdistribuert til bein eller ble ekskretert. Den kjente toksisiteten til<223>Ra, spesielt for beinmarg, er dermed antatt å være en begrensende faktor når<227>Th blir anvendt in vivo.

Oppfinnerne har etablert at<227>Th-komplekest (dvs. chelatchelatkomplekser) frigjør<223>Ra etter nedbrytning av<227>Th (se eksempel 6 nedenfor). Dette kan være resultatet av nukleær rekyl, eller inkompatibel chelatchelatering, eller en kombinasjon av faktorne. Dette er mot hva som forventes av en ønskelig egenskap til en alfaemitter (se f.eks. Feinendegen et al. 1998, ovenfor) ved at alfaemitterforbindelsen bør gjenholde hvilke som helst radioaktive datternuklider av foreldrechelatchelatet som en viktig sikkerhetskarakteristikk.

I henhold til data nylig tilgjengelig i fagfeltet er den maksimale toleransedoseringen radium-223 forventet å være i området 39-113 kBq/kg (se eksempel 7 nedenfor). Det er akseptert innen fagfeltet at et realistisk og konservativt estimat av toksiske bieffekter av datterisotoper må tilpasses (se f.eks. Finendagen (1998) ovenfor) og dermed at en maksimal dose på 39 kBq/kg radium-223 vil være antatt aksepterbar. Ved en hvilken som helst dose større enn dette, kan radiumen forventes å bli dødelig for subjektet, noe som selvsagt er uaksepterbart.

Genereringen av<223>Ra in vivo vil variere med residenstiden til<227>Th. I tilfelle med 100 % retensjon vil 1 kBq227Th generere et antall<223>Ra-atomer tilsvarende en injeksjonsdose på 1,6 kBq223Ra, fullstendig gjenholdt. Dermed vil en maksimalt tolererbar dose av radium-223 på 39 kBq/kg være ekvivalent til en administrering av 24,4 kBq/kg fullstendig gjenholdt<227>Th. Dette er betydelig under minimal forventet treapeutisk dose på 36 kBq/kg, som også ble estimert på basis av fullstendig retensjon (se diskusjon ovenfor). Hvis retensjonen av thorium avtar vil mindre radium genereres pr. enhet thorium administrert, men effektiviteten til thoriumen vil tilsvarende reduseres slik at dosen må økes. Dermed var forventningen fra tilgjengelig lære i fagfeltet at minimum mengde<227>Th tilstrekkelig for å fremskaffe en terapeutisk fordel må være større enn mengden forventet å forårsake dødelig myelotoksisitet. Derfor kunne ikke terapeutisk vindu for administreringen av22<7>Th eksistere.

Oppfinnerne har nå etablert at en dose på minst 200 kBq/kg<223>Ra kan administreres og tolereres i humane subjekter. Disse data er presentert nedenfor i eksempel 8. Derfor kan det nå ses, svært uventet, at terapeutisk vindu eksisterer hvor en terapeutisk effektiv mengde på<227>Th (slik som større enn 36 kBq/kg) kan administreres til et pattedyrsubjekt uten forventning om at subjektet vil risikere en uakseptabel risiko for alvorlig eller til og med dødelig myelotoksisitet.

Mengden 00% Ra generert fra farmasøytisk001Th vil avhenge av den biologiske halveringstiden til den radiomerkede forbindelsen. Den ideelle situasjon vil være å anvende et kompleks med et raskt opptak i tumoren, inkluderende internalisering til tumorcellen, sterk tumorgjenholding og en kort biologisk halveringstid i normalvev. Komplekset med mindre enn ideell biologisk halveringstid kan imidlertid være anvendbare så lenge doseringen av<223>Ra opprettholdes innenfor tolererbare nivåer. Mengden radium-223 generert in vivo vil være en faktor av mengden thorium administrert og den biologiske gjenholdingstiden til thoriumkomplekset. Mengden radium-223 generert i et hvilket som helst spesialtilfelle kan lett beregnes av én med vanlige kunnskaper og eksempelberegninger gitt i eksempel 1 og 2 nedenfor. Maksimal administrerbar mengde<227>Th vil være avhengig av mengden radium generert in vivo og må være mindre enn mengden som produserer et utolererbart nivå av bieffekter, spesielt myelotoksisitet. Denne mengde vil generelt være mindre enn 300 kBq/kg, spesielt mindre enn 200 kBq/kg og mer fortrinnsvis mindre enn 170 kBq/kg (f.eks. mindre enn 130 kBq/kg).

Dermed, i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, blir thoriumkomplekset fortrinnsvis administrert som en thorium-227-dosering på 18-400 kBq/kg kroppsvekt, fortrinnsvis 36-200 kBq/kg (slik som 50-200 kBq/kg), mer fortrinnsvis 75-170 kBq/kg, spesielt 100-130 kBq/kg. Thoriumdoseringen, komplekseringsmidlet og administreringsruten vil med fordel være slik at radium-223-dosering generert in vivo er mindre enn 300 kBq/kg, mer fortrinnsvis mindre enn 200 kBq/kg, enda mer fortrinnsvis mindre enn 150 kBq/kg, spesielt mindre enn 100 kBq/kg. De ovenfor dosenivåer er fortrinnsvis fullstendig i henhold til doseringen av<001>Th men kan være administrerte doser som tar hensyn til at noe<227>Th vil fjernet ("cleared") fra kroppen før den nedbrytes.

Når den biologiske halveringstiden til<227>Th-kompleket er kort (f.eks. mindre enn 7 dager, spesielt mindre enn 3 dager), kan vesentlig større administreringsdoser være nødvendig for å fremskaffe ekvivalent gjenholdt dose. Dermed vil f.eks. en fullt gjenholdt dosering på 150 kBq/kg tilsvare kompleks med en 5 dagers administreringstid administrert som en dose på 711 kBq/kg, i henhold til ligningen gitt ovenfor. Ved bruk av denne ligning, vil ekvivalente administrerte doser for hvilke som helst av de gjenholdte doser beregnes fra biologiske fjerningshastigheter ("clearence rate") til komplekset.

Siden nedbrytningen av én<227>Th-kjerne fremskaffer ett<223>Ra-atom, kan gjenholdingen og terapeutisk aktivitet til<227>Th være direkte knyttet til 223Ra-dosen som pasienten utsettes for.

I en forenklet beregning kan in vivo genereringen av<223>Ra knyttes til mengden<227>Th administrert ved å anta ingen vesentlig retensjon i målvevet. Maksimal tolererbar dose22<7>Th kan dermed uttrykkes som:

hvor:

TBi0 er biologisk halveringstid til<227>Th-komplekset;

TTh er fysisk halveringstid til<227>Th (18,7 dager);

Dadd er aktiviteten til administrert<227>Th-kompleks (kBq/kg); og

Max Ra er aksepterbar ikke-myelotoksisk mengde<00%>Ra (kBq/kg) som diskutert herunder.

I en foretrukket utførelse fremskaffer denne oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av mykvevssykdommer i pattedyrsubjekter, hvor fremgangsmåten omfatter å administrere til subjektet en terapeutisk effektiv mengde av et mykvevsmålrettet kompleks av Thorium-227 og et komplekseringsmiddel, hvor mengden Dadd beregnes fra formel I nedenfor slik at en aksepterbar ikke-myelotoksisk mengde DRa radium-223 genereres in vivo ved nukleær nedbrytning av inistrert thorium-227:

hvor:

TBi0er biologisk halveringstid i det mykvevsmålrettede komplekset av thorium-227 og et komplekseringsmiddel;

TTher fysisk halveringstid til<227>Th (18,7 dager);

Dadder aktiviteten til administrert<227>Th-kompleks (kBq/kg); og

DRa er aksepterbar ikke-myelotoksisk mengde av22<3>Ra, f.eks. 75-200 kBq/kg.

Biologisk halveringstid til hvilke som helst mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og komplekseringsmiddel kan måles ved kjente teknikker ved å anvende ikke-radioaktive thorium eller ved målinger av f.eks. karakteristisk gammautstrålinger ved svært lave nivåer av thorium-227 i kombinasjon med ikke radioaktivt thorium. Fra denne formel, kan det f.eks. ses at ikke-myelotoksisk dose på 100 kBq/kg<00%>Ra genereres fra et mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og komplekseringsmiddel som har en biologisk halveringstid på 10 dager med en administrert dose på [100 x 18,7 x (10"<1>+ 18,7-<1>)]/1,65 = 173 kBq/kg.

Det er åpenbart ønskelig å minimalisere eksponeringen til et subjekt for<00%>Ra-datterisotoper, med mindre egenskapene til disse blir fordelaktig utnyttet. For å tillate at tilstrekkelig<227>Th administreres vil det imidlertid være nødvendig at en viss mengde radium genereres. Denne mengde vil være én av hvilke som er nødvendig for å tillate en terapeutisk effektiv administrering av<227>Th og vil generelt være større enn mengden som tidligere har vært tatt som maksimalt aksepterbar i lys av forventet<223>Ra-myelotoksisitet (se eksempler 7 og 8 nedenfor og diskusjonen ovenfor). Mengden radium-223 generert in vivo vil typisk være større enn 40 kBq/kg, dvs. større enn 60 kBq/kg. I noen tilfeller vil det være nødvendig for<223>Ra generert in vivo til å være mer enn 80 kBq/kg, dvs. større enn 100-115 kBq/kg.

Thorium-227-merkede komplekser i egnede bæreløsninger kan administreres intravenøst, intrakavitært (f.eks. intraperitonealt), subkutant, oralt eller topisk, som en enkelt applikasjon eller et fraksjonert applikasjonsregime. Kompleksene vil fortrinnsivs administreres som løsninger med en parental rute, spesielt intravenøst eller ved en intrakavitær rute. Sammensetningen i henhold til oppfinnelsen vil fortrinnsvis være formulert i sterile løsninger for parental administrering.

Thorium-227 i fremgangsmåtene og produktene i henhold til denne oppfinnelse kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre behandlingsmodaliteter inkluderende kirurgi, ekstern bestrålingsterapi, kjemoterapi, andre radionuklider, vevstemperaturjusteringer osv. Dette danner et ytterligere foretrukket utførelseseksempel av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. I én bestemt foretrukket utførelse er subjektet også utsatt for stamcellebehandling for å redusere effekten av radium-223-indusert myelotoksisitet.

I henhold til denne oppfinnelsen kan<227>Th komplekseres ved målrettede komplekseringsmidler. Disse vil typisk ha en molekylvekt fra 100 g/mol til flere millioner g/mol, og vil fortrinnsvis ha en affinitet for sykdomsrelaterte reseptorer og/eller en egnet preadministrert reseptor (f.eks. biotin eller avidin) bundet til et molekyl som har blitt målrettet mot sykdommen før administrering av<227>Th. Egnede målrettede deler inkluderer poly- og oligo-peptider, proteiner, DNA- og RNA-fragmenter, aptamerer osv., fortrinnsvis et protein, f.eks. avidin, streptavidin, et polyklonalt eller monoklonalt antistoff (inkludert IgG- og IgM-type antistoffer), eller en blanding av proteiner eller fragmenter eller konstrukter av proteiner. Antistoffet, antistoffkonstrukter, fragmenter av antistoffer (f.eks. FAB-fragmenter), konstrukter av fragmenter (f.eks. enkeltkjedeantistoffer) eller en blanding av disse er spesielt foretrukket.

Også egnet for bruk i denne oppfinnelse er terapeutiske konjugater av<227>Th med et peptid, aminosyre, steroidalt eller ikke-steroidalt hormon, folat, østrogen, testosteron, biotin, eller andre spesifikt bundne forbindelser med en molekylvekt typisk under 10000 g/mol.

Det skal forstås at mykvevsmålrettede komplekseringsmidler er et bifunksjonelt middel: én del må tjene for å kompleksere thoriumionet, fortrinnsvis i et chelatchelatkompleks, dvs. ett i hvilket thorium blir multikompleksert, og en ytterligere del må tjene som en vektor for å målrette komplekset til mykvevet som skal behandles. Komplekseringsdelen kan bestå av én eller flere funksjonelle grupper tilstede på den målrettede delen eller som kan introduseres til den målrettede delen ved kjemisk behandling. Mer generelt vil imidlertid komplekseringsdelen konjugeres direkte eller indirekte (f.eks. via en koblingsdel) til den målrettede delen. Slike konstrukter av aktive (dvs. terapeutisk eller diagnostisk aktive) metall -komplekseringsdeler - optiske koblingsdeler - målrettede deler er godt kjent innen fagområdet målrettede radiofarmasøytiske midler og målrettede bildemidler og kan velges og konstrueres for thorium på en analog måte. I denne sammenheng kan det refereres til f.eks. "Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents", red. Torchilin, CRC Press, 1995.

Thorium-227 i denne oppfinnelse vil fortrinnsvis være konjugert med et målrettet molekyl ved å anvende bifunksjonelle chelatchelatorer. Disse kan være sykliske, lineære eller grenede chelatchelatorer. Spesiell referanse kan gjøres til polyaminopolysyrechelatchelatorer som omfatter en lineær, syklisk eller grenet polyazaalkanryggrad med en syre (f.eks. karboksylalkyl) gruppe festet til ryggradnitrogener. Eksempler på egnede chelatchelatorer inkluderer DOTA-derivater slik som p-isotiocyanatobenzyl-l,4,7,10-tetraazasyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre (p-SCN-Bz-DOTA) og DTPA-derivater slik som p-isotiocyanatobenzyl-dietylentriaminpentaeddiksyre (p-SCN-Bz-DTPA), de første sykliske chelatchelatorer, de siste er lineære chelatchelatorer.

Derivater av l,4,7,10-tetraazasyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre er spesielt foretrukne chelatchelatorer for thorium i denne oppfinnelsen, men er ikke kjent for deres evne til å koordinere til tetravalente metaller slik som thorium. Oppfinnerne har overraskende funnet at selv om standardfremgangsmåter ikke lett kan anvendes for å chelatchelatere thorium med DOTA-derivater, vil oppvarmingen av DOTA-derivatet med metallet effektivt fremskaffe chelatchelateringen som indikert i eksempler nedenfor. I et ytterligere aspekt gjelder denne oppfinnelsen en fremgangsmåte for å danne et kompleks av oppfinnelsen eller egnet for bruk i fremgangsmåtene til oppfinnelsen omfattende å varme thorium-227 med et derivat av l,4,7,10-tetraazasyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre for å danne et chelatchelatert thorium-227 og deretter feste det chelatchelaterte thorium-227 til en målrettingsdel. Enhver egnet målrettingsdel, slik som de indikert herunder (se f.eks. nedenfor) kan anvendes.

Metallisering av den komplekserende delen kan utføres før eller etter konjugering av den komplekserende delen med målrettingsdelen. Når

oppvarmingsfremgangsmåten indikert ovenfor blir anvendt er det imidlertid ønsket at metallet skal koordineres før festing til målrettingsdelen.

ChelatChelatorene vil fortrinnsvis være ikke-fosfonatmolekyler, og i denne oppfinnelse vil<227>Th fortrinnsvis ikke festes til fosfonat eller annen beinmålrettende gruppe.

Typer målrettingsforbindelser som kan kobles til thorium-227 via en chelatchelator inkluderer monoklonale eller polyklonale antistoffer, vekstfaktorer, peptider, hormoner og hormonanaloger, folat og folatderivater, botin, avidin og streptavidin eller analoger av disse. Andre mulige bærere kan være RNA, DNA, eller fragmenter av disse, oligonukleotider, karbohydrater, lipider eller forbindelser lagd ved å kombinere slike grupper med eller uten proteiner, osv.

Thorium-227 er konjugert med en målrettingsdel med bioaffinitet, fortrinnsvis ekskluderende beinsøkere, liposomer og folatkonjugerte antistoffer eller antistoffragmenter for å bestråle mykvevet i terapeutiske hensikter.

Thorium-227-merkede molekyler i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for behandling av canserogene eller ikke canserogene sykdommer ved å målrette sykdomsrelaterte reseptorer. En slik medisinal bruk av<227>Th vil typisk være radioimmunoterapi basert på å koble<227>Th med en chelatchelator til et antistoff, et antistofffragment eller en konstruksjon av antilegemer eller antistofffragmenter for behandling av cancerogene eller ikke-canerogene sykdommer. Bruken av<227>Th i fremgangsmåtene og farmasøytiske midler i henhold til denne oppfinnelse er spesielt anvendbare for hvilken som helst form for kraft og reumatologiske sykdommer, spesielt kreft i hud, prostata, cervix, eller bryst, eller betennelsessykdommer slik som artritt eller fibrositt.

Eksperimenter med thoriummerkede monoklonale antistoffer in vitro presentert herunder har demonstrert at thorium-227 kan bindes via en bifunksjonell chelatchelator til et bærermolekyl. Det er også demonstrert at slike<227>Th-immunokonjugater viser spesifikk bindingsevne mot CD20-antigenuttrykkende human lymfomacellelinje DAUDI og at et relevant antall<227>Th-atomer kan bindes pr. celle. Det er derfor for første gang vist at reseptormålretting med et<227>Th-merket molekyl er oppnåelig.

En interessant egenskap ved bruken av thorium-227 er at bestrålingsintensiteten vil øke med tiden på grunn av veksten av datterradionuklider, dvs. dosen levert til normale organer kan holdes lav under opptak og eliminasjonsfasene. Dette er illustrert i fig. 1. Hvis retensjonen er høy i tumoren, kan doseringsraten der øke med tiden, på grunn av indre vekst av datternuklider, avhengig av tumorgjenholdingen av datternukliden. På grunn av vanskeligheter med rekylenergier, krever effektiv gjenholding av døtre ved målstedet imidlertid svært spesifikke leveringsmåter, slik som i liposomer eller slik at radionukliden innlemmes i mineralisert bein.

Mengden frigjort<223>Ra kan minkes hvis molekylet som bærer<227>Th har en kort gjenholdingshalveringstid in vivo på grunn av at radionukliden vil mest sannsynlig elimineres før en høy andel av2<27>Th har blitt nedbrutt til<223>Ra. Mengden<227>Th vil imidlertid måtte økes for å opprettholde terapeutisk effektivitet i henhold til denne oppfinnelse. Foretrukne biologiske halveringstider in vivo er mindre enn 7 dager, fortrinnsvis mindre enn 4 dager og spesielt mindre enn 2 dager. Hvis komplekseringsmidlet er valgt slik at det leverer<227>Th direkte til det indre av de målcellene, vil dette ytterligere øke den spesifikke cytotoksisiteten og redusere systemisk toksiske effekter til den radioaktive datteren på grunn av minst delvis gjenholding av datterisotoper ved tumorstedet. Begge disse egenskaper gjør det terapeutiske vinduet til<227>Th bredere og danner dermed en foretrukket utførelse av denne oppfinnelse.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen kan pasienter med både mykvevssykdommer og skjelettsykdommer behandles med både 997 Th og med<00%>Ra generert in vivo ved administrert thorium. I dette spesielt fordelaktige aspekt blir en ekstra terapeutisk komponent til behandlingen avledet fra den aksepterbare ikke-myelotoksiske mengden av<223>Ra ved målretting av skjelettsykdommen. I denne terapeutiske fremgangsmåte blir<227>Th typisk utnyttet for å behandle primære og/eller metastatiske kreftsorter i mykvev ved egnet målretting av disse og<223>Ra generert fra<227>Th-nedbrytning blir anvendt for å behandle relaterte skjelettsykdommer i samme subjekt. Disse skjelettsykdommer kan være metastaser til skjelettet resulterende fra de primære mykvevskreftsortene, eller kan være primære sykdommer hvor mykvevsbehandlingen er for å motvirke metastatiske kreftsorter. Av og til kan mykvevssykdommer og skjelettsykdommene være ikke-relaterte (f.eks. ytterligere behandling av skjelettsykdommer i en pasient med reumatologiske mykvevssykdommer).

Oppfinnelsen vil nå illustreres ved de følgende ikke-begrensende eksempler.

EKSEMPLER

Bakgrunnsantagelse

Generelt vil vekten av tumorvevet i et subjekt være lav sammenlignet med kroppsvekten og selv hvis signifikant konsentrasjon og gjenholding av thoriumkomplekset i tumor er oppnådd, vil typisk 1 % eller mindre av thoriumet nå tumorvevet i mennesker. Mykvevseksponeringen bør derfor estimeres basert på hele kroppsklargjøringen ("dearing") av thoriumkomplekset. De effektive tumormålsettinger vil dermed neglisjeres i eksemplene 1 og 2, noe som viser innflytelsen til biologisk halveringstid på mengden 223Ra som genereres in vivo relativt til mengden<227>Th som administreres.

Materialer

Ammoniumacetat (AmAc), L-askorbinsyre (AscA), dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA), etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), natriumkarbonat (Na2C03), natriumhydrogenkarbonat (NaHCOa), tetrametylammoniumacetat (TMAA, 90 % renhet), ble oppnådd fra Aldrich (Milwaukee, WI, USA), og overskred 99 % renhet såfremt ikke annet er angitt. 2-(p-isotiocyanatobenzyl)-l,4,710-tetraacasyklodekan (NCS-DOTA) ble oppnådd fra Macrocyclics, Dallas, TX, USA. Bovin serumalbumin (BSA) og albumin bovin fraksjon V ble oppnådd fra Sigma, St. Louis, MO, USA. Fosfatbufret salt (PBS), føtalt bovint serim (FBS) og RPMI 1640 medium med glutamaks ble oppnådd fra Gibco, Paisley, Scotland, UK. Det RPMI 1640 mediet ble forsynt med 15 % FBS, penicillin og streptomycin. Anionvekslingsmaterialet ble oppnådd fra Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA. Mabthere (rituximab) ble oppnådd fra F. Hoffman-La Roche AG, Basel, Sveits. Cellelinjen som ble anvendt var CD20 positiv lymfoma DAUDI kjøpt fra European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, UK.

Eksempel 1. Estimat av in vivo generering av<223>Ra etterfulgt av administrering av en thoriummerket forbindelse med en hellegeme retensjonshalveringstid på 12 timer Den effektive halveringstiden for<227>Th (antar neglisjerbar fraksjon av<227>Th gjenholdt i tumoren) vil være l/Ti/2effektiv=l/Ti/2fyS+ l/Ti/2bioi=> Ti/2effektiv = 0,487 dager. Fraksjonen2<27>Th som nedbrytes i legemet vil være ekvivalent med Ti/2effektiv/Ti/2fysiSk = 0,0262 som vil tilsvare genereringen av 6,1 x IO<9>atomer<223>Ra pr. 100kBq22<7>Th som ble injisert. Den toksiske komponenten fra datternuklidene bør omtrent være ekvivalent med radium-223-doseringen til 4,3 kBq<223>Ra pr. 100 kBq (initiell) av<227>Th. Nedbrytningen v 0,0262 av den administrerte thoriumen er ekvivalent til 2,6 kBq av fullt gjenholdt<227>Th for hver 100 kBq som er administrert.

Eksempel 2. Estimat av in vivo generering av Ra etterfulgt av administrering av en thoriummerket forbindelse med en hellegemeretensjonshalveringstid på 4 dager Beregnet som i eksempel 1, er Ti/2effektiv = 3,3 dager for kroppsklareringen. Dette er ekvivalent til en fraksjon på 0,176 av Th-atomer som nedbrytes i legemet. Dette tilsvarer 4,1 x 10<10>atomer<223>Ra generert pr. 100 kBq<227>Th. Den toksiske komponenten fra datternuklidene bør ca. være ekvivalent til en injisert dose på 29 kBq<223>Ra pr. 100 kBq22<7>Th injisert. Med denne biologiske halveringstiden, er administrert 100 kBq22<7>Th lik 17,6 kBq fullt gjenholdt.

Eksempel 3. Preparering av 22 7 Th.

Thorium-227 blir selektivt isolert fra en 227Ac-blanding, som har grodd i døtre i to uker ved å tilsette 0,25 ml 7 M HNO3til Ac-blandingen (som har blitt fordampet til tørrhet) og eluere løsningen gjennom en anionutvekslingskolonne. Kolonnen hadde en indre diameter på 2 mm og en lengde på 30 mm inneholdende ca. 70 mg AG-1 X 8 anionutvekslingsharpiks (Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA) (nitratform). Kolonnen ble vasket med 2-4 ml 7 M HNO3for å fjerne22<7>Ac,<223>Ra og Ra-døtre men gjenholde 00* 7 Th. Deretter ble 00* 7Th strippet fra kolonnen med noen få ml 12 M HC1. Deretter ble HC1 fordampet til tørrhet og<227>Th gjenløst i 0,2 M HC1.

Eksempel 4. Thorium- 227- merking av bifunksjonell chelatchelator NCS- DOTA. Såfremt ikke annet er angitt er kjemikaliene fra Aldrich (Milwaukee, WI, USA) og hadde en renhet på 99 % eller bedre. Til 100 ul<227>Th i 0,2 M HCl-løsning i en halv gram vial ble det tilsatt en løsning inneholdende 25 ul p-SCN-benzyl-DOTA (10 mg/ml) (Macrocyclics Inc., Dallas, TX, USA), 20 ul L-askorbinsyre (150 mg/ml) og 50 ul tetrametylammoniumacetat (300 mg/ml) (90 % renhet) til en pH på ca. 5,5. Reaksjonsblandingen ble reagert i en rister/inkubator (Thermomixer Comfort, Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland) ved 55°C i 1 time. (Dette vil typisk forårsake en kvantitativ eluering av<227>Th gjennom en 0,5 ml Sephadex C-25-kolonne ved å anvende 2,5 ml 0,9 % NaCl-løsning, mens<223>Ra (ukompleksert) vil bli omtrent kvantitativt gjenholdt i kolonnen. Det ble også verifisert i et kontrolleksperiment med2<27>Th i en "reaksjons" løsning uten chelatchelator, at både<227>Th og 223Ra var over 90 % gjenholdt i kolonnen). Det ureagerte reaksjonsproduktet<227>Th-p-SCN-benzyl-DOTA ble brukt for å merke rituximab.

Eksempel 5. Preparering av et 227Th- basert radioimmunokonjugat ( RIC). Merkingen ble utført i en totrinnsprosedyre, det første trinnet var kombinering av<227>Th og chelatchelatoren (beskrevet i eksempel 4). Det andre trinnet er kobling av den radioaktive chelatchelatoren til antistoffet. Reaksjonsløsningen (eksempel 4) ble tilsatt til 200 ul rituximab (10 mg/ml, Mabthera<®>, F. Hoffmann-La Roche AG, Basel, Sveits) og reaksjonsløsningen blir justert til pH~9 og tilsettes ca. 100 ul 1 M Na2C03/NaHCC«3. Reaksjonsløsningen ble blandet forsiktig i en mikser (Thermomixer Comfort, Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland) ved 35°C i 1 time. Deretter ble 50 ul av 10 mM dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA, Fluka Chemie AG, Buchs, Neu-Ulm, Tyskland), og 200 ul 0,2 M glysin i mettet borat (natriumtetraboratdekahydrat fra Fluka) og inkubasjon ble utført i 5 min. Deretter ble reaksjonsblandingen overført til en Sephadex G-25 PD 10 kolonne og eluert med 1 % BSA (albumin, bovin fraksjon V, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) i PBS (Gibco, Paisley, Skottland, UK). Eluatet ble oppsamlet i fraksjoner på~0,6 ml som deretter ble tellet i en dosekalibrator (CRC-127R, Capintec, Ramsey, NJ, USA) og fraksjonene tilsvarende proteineluatet ble analysert ved gammaspektroskopi (GEM15-P-detektor og Gammavision 5,20 programvare, begge fra EG&G Ortec, Oak Ridge, TN USA) for å bestemme22<7>Th gamma versus<223>Ra gamma, i hver fraksjon før eventuell ytterligere bruk. De følgende gammatopper ble anvendt:227Th, 236,0 keV (11,6 % mengde), 256,3 keV (7,4 %), 329,9 keV (2,8 %).223Ra henholdsvis 154,2 keV (6,0 %), 269,4 keV (13,6 %), 323,9 keV (3,7 %). Fraksjonene 6 og 7 tilsvarer ca. 50 % av proteineluatet (som verifisert ved eluering<I25>I-merkede rituximab gjennom PD-10-kolonner) ble anvendt fordi de var hovedsakelig fri fra<223>Ra. Fraksjoner 8 og 9 inneholdt større mengder<223>Ra, noe som indikerer en signifikant overlapp eller protein og mindre molekyler i disse fraksjoner (når re-renset på en PD-10-kolonne ga disse to fraksjoner ca. 50 % av<227>Th i de sjette og sjuende fraksjonene fra nye eluater, noe som verifiserer nærvær av 00* 7Th-rituximab). Basert på målingen av PD-10-eluatfraksjoner på Ge-detektoren er det estimert at det overordnede merkingsutbyttet var ca. 12 %. Det ble også vist med ca. 5 dagers gammel preparering lagret ved 8°C, at<227>Th-antistoffkonjugat kan lett renses på en PD-10-kolonne for å fjerne223Ra generert fra nedbrytning av<227>Th. Det ble dermed vist at<227>Th kan bindes til et målretningsmolekyl via en bifunksjonell chelator renses fra datterproduktet. Under lagring vil genererte datterprodukter<223>Ra frigjøres fra chelatoren og ved å anvende en gelfiltrering/størrelsesekskluderingsrensing, er det mulig å regenerer et rent<227>Th-antistoffkonjugat.

Eksempel 6. Bindning av 22 7 Th- merkede antistoffer til DA UDI humane lymfomceller.

DAUDI-celler ble kjøpt fra European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, UK og dyrket i henhold til leverandørens instruksjoner ved å anvende et kulturmedium og supplement fra Gibco (Paisley, Skottland, UK) og ved å anvende 500 ml kulturflasker (Cell Star, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Tyskland). DAUDI-celler (2 x IO<7>celler i 0,7 ml PBS) ble anvendt for å studere bindingen av<227>Th-merkede rituximab in vitro. Som kontroll på ikke-spesifikk binding ble det anvendt DAUDI-celler premettet (blokkert) med 40 ug umerkede rituximab i 15 min. Testrørene (polystyrenkulturtestrør, 12 x 75 mm, Elkay, Shrewsbury, MA, USA) ble tilsatt<227>Th-merkede rituximab tilsvarende til henholdsvis 1,3, 5,3 eller 26 ug/ml. Eksperimentet ble utført i duplikat ved ethvert konsentrasjonsnivå ved å anvende ublokkerte og blokkerte celler. Inkuberingen ble utført i minst 2 timer ved 8°C. Etter inkubering ble cellesuspensjonene tellet for radioaktivitet (Crystal II Multidetector, Packard Instrument Company Inc., Downers Grove, IL, USA) og cellene vasket med 2 ml 1 % BSA (Albumin, Bovine Fraction V, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) i PBS (Gibco, Paisley, Skottland, UK) og sentrifugert (sentrifuge 58 R, Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland) ved 200 rpm i 5 min. Vaskingen/sentrifugeringen ble gjentatt to ganger. Deretter ble cellepelletene tellet for radioaktivitet. Resultatene (hvert middel av et duplikat) er vist i tabell 3 nedenfor.

Resultatene viste at<227>Th-merkede rituximab ble spesifikt bundet til DAUDI-celler. I gjennomsnitt ble ca. 12 ganger så mye RIC bundet til ublokkerte som blokkerte celler. Videre ble et terapeutisk relevant antall<227>Th-atomer bundet pr. celle.

Dermed ved å anvende en bifunksjonell chelator anvendbar for festing av antistoffer, peptider og vitaminer osv., er det mulig å preparere en2<27>Th-merket RIC med evnen til å binde til terapeutisk relevant antall<227>Th-atomer spesifikt til tumorceller.

Eksempel 7. Estimater av<223>Ra- toksisitet fra kjent teknikk.

På grunn av mangel på humane data på toksisiteten til radium-223 og radium-224, kan en antatt radiotoksisitet for<223>Ra deriveres som følgende ved å anvende publiserte data for radium-224 i hunder. Nedbrytningsseriene (inkluderer

004. O O "X

nedbrytning av datternuklider) til både Ra og Ra forårsaker emisjon av fire alfapartikler pr. radiumatom. Den totale dosen alfapartikler fra f\ f\ r+ Ra og004Ra i likevekt med døtrene er ca. 26,3 og 27,1 MeV henholdsvis pr. transformering og er

0 04 OO "X

derfor nesten likeverdige. Halveringstidene til Ra er 3,62 dager og for Ra er den 11,43 dager. Dette betyr at pr. aktivitetsenhet injisert, vil den skelettale dosen fra<223>Ra være ca. 3,1 ganger fra<224>Ra, når man tar i betraktning alfaenergien og

halveringslevetidsforskjellene, og ved å anta langlivede biologiske gjenholdinger for radionuklidene (dvs. klareringen styres av den fysiske halveringstiden til radionuklidene). Dette er en gyldig antagelse fordi Ra er en Ca-analog og vil lett inkorporeres i skjelettet.

004. 003 Blodcelletypene som blir sterkest påvirket etter behandlingen med Ra eller Ra virker å være nøytrofiler. Data fra publiserte studier på biologiske effekter på<2>24Ra i voksne hunder (se Muggenburg, Radiat Res 146: 171-186 (1996)), administrert som en enkelt intravenøs injisering, viser nøytrofilcelletap sterkt redusert ved 120 og enda mer ved 350 kBq/kg kroppsvekt (kBq/kg) som indikert i tabell 4 nedenfor.

Ved 350 kBq/kg inntraff død i noen av subjektene forårsaket av hematologisk dyskrasi resulterende fra beinmargdestruering (3 hunder av 8). Det kan derfor antas at maksimal tolererbar dose av<224>Ra er mellom 120 og 350 kBq/kg i hunder. Overført til<223>Ra, som beskrevet ovenfor, vil dette tilsvare til 39-113 kBq/kg<223>Ra. Ved å anta tilsvarende hematologisk toksisitet i hunder og mennesker, vil man forvente å nå maksimal tolererbar dose innen området 39-113 kBq/kg<223>Ra i mennesker. Generelt må man være forsiktig når man sammenligner data fra to forskjellige spesier. Men hunder og mennesker er svært like når det gjelder beinmargtoksisitet fra bestråling (se Hall, "Radiobilogy for the radiologist", Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, 2000) og det vil derfor forventes at denne beregningen vil gi et effektivt estimat på maksimal tolererbar dose<223>Ra i mennesker.

Eksempel 8. Laboratoriestudier av Ra i mennesker

I en fase I studie pasienter med bryst- eller prostatakreft, ble dosenivået på 37, 74, 130, 170 og 200 kBq/kg<223>Ra gitt som enkeltdose. Nøytrofilcellefraksjoner ble overvåket som et følsomt mål på hematologisk toksisitet. Resultatene er vist i tabell 5 nedenfor.

Det ble overraskende funnet at høye dosenivåer var tolererbare i mennesker og dette indikerer at det er mulig å levere signifikante høyere radioaktive doser til beinoverflater med<00%>Ra enn tidligere antatt uten å forårsake skade i hematologisk toksisitet.

Eksempel 9. Ytterligere laboratoriestudier av Ra i mennesker

Eksperimentet i eksempel 8 ble utført med dosemetere kalibrert til en høy nøyaktighet. Dosenivåer målt ved 46, 93, 163, 213 og 250 kBq/kg223Ra ble gitt som enkeltdoser og et multidoseskjema ble også introdusert.

Pasienter og studiekriterier

31 pasienter med metastaser til skjelettet, 10 fra bryst- og 21 fra prostatakreft, ble innrullert som fase IA og fase IB forsøk. Prostatakreftpasientene var var fra 60-85 år gamle og hadde kroppsvekter varierende fra 50-120 kg. Alle av dem hadde

utviklende sykdommer antatt hormonrefraktorier. Brystkreftpasientene var fra 40-70 år med kroppsvekt fra 50-95 kg. Alle av dem gjennomgikk andre hormonell og/eller kjemoterapi. Primærmålsetningen var å evaluere sikkerheten og toleransen til<223>Ra.

Oppfølging

Oppfølgingsperioden var 8 uker.

Dosenivåer og behandlingsskjemaer

I enkeltinjiseringsforsøk ble de følgende gjennomsnittelige dosenivåene anvendt: 46, 93, 163, 213 og 250 kBq/kg kroppsvekt (b.w.). Fem pasienter ble inkludert i hvert dosenivå. 15 prostata- og 10 brystkreftpasienter ble inkludert.

I gjentatte injeksjonsskjemaer, ble 6 pasienter, alle med prostatakreft, inkludert. 3 pasienter ble satt opp til å motta 5 doser hver på 50 kBq/kg"<1>b.w. ved tre ukers intervaller og 3 pasienter skulle motta to doser hver på 125 kBq/kg"<1>b.w. ved seks ukers intervaller.

Blodklarering

Ca. 1 ml blod ble tatt ved forskjellige tidspunkter etter injisering og anvendt for radioaktivitetsmålinger for å bestemme blodklareringsprofilene til 25 pasienter inkludert i enkeltinjeksjonsskjemaet. Vekten til hver blodprøve ble bestemt og tellehastigheten pr. ml blod ble beregnet (ved å anta 1 ml blod tilsvarer 1 g). Radioaktiviteten ble målt i en Nal brønntype teller. Aktivitetsnivået umiddelbart etter injisering ble beregnet ved å anta at 100 % av aktiviteten var initielt i blodet og at den totale blodvekten representerte 7 % av kroppsvekten. Dataene presentert som biologiske data, dvs. justert for radioaktiv nedbrytning mellom injisering og måletidspunkt.

Radionuklidproduksjon

Radium-223 ble produsert fra 00* 7 Ac/ 00* 7Th og renset ved å anvende Ac-harpiks for å immobilisere<227>Ac og 227Th som beskrevet i WO 0040275. Produktkonsentratet, dvs. oppløst<223>RaCi2ble testet for radionuklidrenhet ved gammaspektroskopi før ytterligere bruk. Et konsentrat av<223>Ra i NaCl og Na-sitrat ble sendt steril produksjon. Isotonisitet, pH og aktivitetskonsentrasjon ble justert, en prøve ble holdt tilside for patogen og pyrogen testing og det endelige produktet ble fylt i sterile vialer som deretter ble lukket med forseglet gummimembran penetrerbar for nåler. Vialene ble puttet i blycontainere og sendt til sykehusene.

Sideeffekter

Dosebegrensende toksisitet ble ikke observert i den doseeskallerende delen av studien. Reversibel myeloundertrykkelse inntraff, med nadier 2-3 uker etter injisering og gjenvinning under den følgende perioden. Nøytropeni på maksimum grad 3 inntraff i to av de 25 pasientene. Trombocyttene avslørte kun grad 1 toksisitet, selv etter de to høyeste dosenivåeene. Generelt var det en liten tendens mot høyere myeloundertrykkelse med økning i dosenivået, men effekten var ikke sterk. Få skadelige hendelser ble observert, kvalme var den mest vanlige og inntraff i 4 av 5 pasienter med de høyeste dosenivåene. Reversibel diarrhorrea, grad 1 og 2, som responderte godt til medisinering ble observert i alle dosegruppene og for en total på ca. 50 % av pasientene. I den høyeste dosegruppen inntraff oppkast i 4 av 5 pasienter. Dette ble ikke observert i de andre dosegruppene.

Gjentatte injeksjons skjemaer

De tre pasientene i 50 x 5 skjemaet erfarte ikke noen ytterligere toksisitet relatert til gjentagelsen av behandlingen. Det virker som de hematologiske profilene ble glattet ut på grunn av at fraksjoneringsskjemaet sammenlignet med en enkeldose ga samme total som de fire fraksjonene sammen.

Skadelige hendelser ikke relatert til Ra

I det gjentatte doseringsskjemaet fikk kun én av pasientene i 125 x 2 skjemaet fikk en andre dose. Av de to pasientene som ikke ble gitt en oppfølgingsdose, døde én på grunn av progresjon i levermetastaser, og den andre ble dømt uegnet for ytterligere behandling på grunn av tilbakekomst av en tidligere hjertesykdom.

My el otoksisitet

Effekten av radium-223 på nøytrofilcellefraksjoner, blodplater, hvite blodcelletellinger og hemoglobin ble overvåket for å gi et bredt mål på hematologisk toksisitet. Effekten på nøytrofiler og hvite blodceller var det største, noe som indikerer at disse er følsomme markører for myelotoksisitet. Resultatene ble uttrykt som antall pasienter i studien som viser et bestemt nivå av toksisitet på CTC toksisitetsgradskalaen og er vist i tabell 6 nedenfor.

Claims (18)

1. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av et mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel, i fremstillingen av et medikament for behandling av mykvevssykdommer i pattedyrsubjekter, der nevnte effektiv mengde er slik at i bruk blir en aksepterbar ikke-myelotoksisk mengde av radium-223 generert in vivo ved en kjernenedbrytning av administrert thorium-227 og der thorium-227 er konjugert til en målrettingsdel med bioaffinitet, unntatt beinsøkere, liposomer og folatkonjugerte antistoffer eller antistoffragmenter og hvor den terapeutisk effektive mengden thorium-227 et minst 25 kBq/kg.

2. Anvendelse i henhold til krav 1 der subjektet er et menneske eller hund.

3. Anvendelse i henhold til krav 1 eller 2, der nevnte terapeutisk effektive mengde er minst 75 kBq thorium-227 pr. kg kroppsvekt.

4. Anvendelse i henhold til ethvert av kravene 1 til 3,der den aksepterbare ikke-myelotoksiske mengde er mindre enn 300 kBq radium-223 pr. kg kroppsvekt.

5. Anvendelse i henhold til krav 4, der nevnte aksepterbare ikke-myelotoksike mengde er mindre enn 150 kBq radium-223 pr. kg kroppsvekt.

6. Anvendelse i henhold til ethvert av kravene 1 til 5, der nevnte kompleks omfatter chelatert thorium-227 koblet til en ligand valgt fra gruppen av antistoffer, antistoffkonstrukter, antistoffragmenter, konstrukter av antistoffragmenter og blandinger av disse.

7. Anvendelse i henhold til ethvert av kravene 1 til 6, der nevnte mykvevssykdom er en ondartet sykdom.

8. Anvendelse i henhold til krav 7, der nevnte ondartede sykdom er en sykdom valgt fra gruppen av karsinom, sarkom, myelom, leukemi, lymfom og blandede typer kreft.

9. Anvendelse i henhold til ethvert av kravene 1 til 8, der nevnte medikament blir brukt i en metode der subjektet også behandles for å bekjempe myelotoksisitet fra radium-223 generert deri.

10. Anvendelse i henhold til krav 9, der subjektet er utsatt for stame ellebehandling.

11. Anvendelse av en terapeutisk aktiv mengde av et mykvevsmålrettet kompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel, i fremstillingen av et medikament for behandling av mykvevssykdommer i pattedyrsubjekter, der nevnte effektiv mengde er Daddsom beregnet fra formel I nedenfor, slik at en aksepterbar ikke-myelotoksisk mengde DRa av radium-223 genereres in vivo ved kjernenedbrytning av det administrerte thorium-227;

hvor: TBi0er biologisk halveringstid til nevnte mykvevsmålrettede komplekset av thorium-227 og et komplekseringsmiddel; TTher fysisk halveringstid til<227>Th (18,7 dager); Dadder aktiviteten til administrert<227>Th-kompleks (kBq/kg) og er minst 25 kBq/kg; og DRa er aksepterbar ikke-myelotoksisk mengde av<223>Ra; og videre der thorium-227 er konjugert til en målrettingsdel med bioaffinitet, unntatt beinsøkere, liposomer og folatkonjugerte antistoffer eller antistoffragmenter.

12. Anvendelse i henhold til krav 11, der DRa er 200 kBq/kg.

13. Anvendelse i henhold til ethvert av kravene 1 til 10, der nevnte medikament er for anvendelse i kombinasjon med minst én ytterligere behandlingsmodalitet valgt fra kirurgi, ekstern strålingsterapi, kjemoterapi, endoradionukleidterapi med radionuklider andre enn<227>Th, o<g/>eller vevstemperaturjusteringer.

14. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert vedat den omfatter mykvevsmålretted kompleks på thorium-227 og et komplekseringsmiddel, sammen med minst én farmasøytisk bærer eller eksipient der thorium-227 er konjugert til en målrettingsdel med bioaffinitet, unntatt beinsøkere, liposomer og folatkonjugerte antistoffer eller antistoffragmenter og der thorium-227 er tilstede i en terapeutisk effektiv mengde på minst 25 kBq/kg.

15. Mykvevsmålrettingskompleks av thorium-227 og et komplekseringsmiddel,karakterisert vedat thorium-227 er konjugert til en målrettingsdel med bioaffinitet, unntatt beinsøkere, liposomer og folatkonjugerte antistoffer eller antistoffragmenter.

16. Kompleks i henhold til krav 15, karakterisert vedat thorium-227 er chelatert til et derivat av 1,4,7,10-tetraazasyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre.

17. Fremgangsmåt for å danne et kompleks i henhold til krav 16,karakterisert vedat det omfatter å varme nevnte thorium-227 med nevnte derivat av l,4,7,10-tetraazasyklododekan-l,4,7,10-tetraeddiksyre for å danne et chelatert thorium-227 og deretter feste chelaterte thorium-227 til en målrettingsdel.

18. Sett for bruk i en anvendelse henhold til ethvert av kravene 1 til 13,karakterisert vedat nevnte sett omfatter en løsning av mykvevsmålretted kompleks fra thorium-227 og et komplekseringsmiddel sammen med instruksjoner for bruk av løsningen i nevnte anvendelse der thorium-227 er konjugert til en målrettingsdel med bioaffinitet, unntatt beinsøkere, liposomer og folatkonjugerte antistoffer eller antistoffragmenter.