NO332305B1

NO332305B1 - IL-7 -legemiddelsubstans, preparat, samt fremstilling og anvendelse derav

Info

Publication number: NO332305B1
Application number: NO20050355A
Authority: NO
Inventors: Michel Christian Morre; Brigitte Assouline; Pierre Cortez; Anne Gregoire
Original assignee: Cytheris
Priority date: 2002-08-08
Filing date: 2005-01-25
Publication date: 2012-08-20
Also published as: ATE482273T1; ZA200501914B; CA2494974A1; IL166543A0; JP2005534339A; JP2010115203A; US20050249701A1; HK1075465A1; US7585947B2; EP1527179B1; AU2003250216A1; AU2003250216B2; WO2004018681A2; NO20050355L; ES2353006T3; EP1527179A2; WO2004018681A3; CA2494974C; JP2014147396A; DK1527179T3

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt områdene immunologi og molekylær biologi. Ifølge oppfinnelsen beskrives nærmere bestemt interieukin-7-legemiddelsubstanser, korresponderende, spesifikke immunreaktive antistoffer samt preparater som inneholder samme, samt fremstilling og anvendelser derav. Ifølge oppfinnelsen beskrives også fremgangsmåter til å karakterisere forurensningsprofilen i en r-hiL-7-legemiddelsubstans anvendt for terapeutiske formål, samt optimaliserte nukleotidsekvenser som koder for pattedyr-IL-7, rekombinante ekspresjonsvektorer samt fremgangsmåter til fremstilling og rensing av polypeptidene. Oppfinnelsen er basert på den uventede iakttakelse at langtidsaktiviteten til rekombinant IL-7 for det meste uttrykkes av en spesifikk conformer og at andre conformere, potensielle produktrelaterte substanser, produktrelaterte forurensninger og prosessrelaterte forurensninger, som normalt ville være inkludert i legemiddelsubstansen og/eller legemiddelproduktet bør, selv om de er bioaktive minimaliseres strengt pga. at de er i stand til å utløse en immunreaksjon mot det ønskede IL-7-molekyl.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk sammensetning omfattende IL-7 og én eller flere farmasøytisk kompatible eller akseptable bærere, eksipienter eller fortynningsmidler, samt en fremgangsmåte for fremstilling derav.

Bakgrunn for oppfinnelsen

B- og T-lymfocytter er de primære effektorceller i immunresponsene. Begge celleklasser betraktes å bli avledet i siste instans av hematopoietiske stamceller i beinmargen hos pattedyr via progenitor- eller forstadiumceller som representerer stadier som kan skjelnes i differensieringen av hver klasse. Modne T-celler utvikles hovedsakelig i tymus, sann-synligvis av en forstadiumcelle som migrerer fra beinmargen til tymusen på et tidlig stadium av T-lymfocyttutvikling. Tallrike faktorer er aktive ved modning av perifere B- og T-celler, inklusive IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, gamma-interferon, BSF-2, neuroleukin, trans-formerende betavekstfaktor samt IL-7 (EP0314415).

«lnterleukin-7-» eller «IL-7» henviser til et endogent pattedyrsekresjonsglykoprotein som er i stand til å forårsake proliferasjon av beinmargsavledede lymfocyttprogenitorer og forstadier, inklusive de spesialiserte forstadier som er kjent som pre-B-celler. Opprinnelig avledet av støtteelementet i en beinmargcellelinje skilles IL-7 også ut av thymusceller, tarmepitelceller, keratinocytter og generelt alt lymfoidvev. I EP03314415 beskrives interleukin-7-proteinerfra pattedyr og DNAersom koder for disse proteiner. Det modne humane IL-7 (r-hlL-7), som er eksklusivt ved glykosylering, produsert i Escherichia coli, som er beskrevet i EP0314415, oppviser en molekylvekt på 17.387 Dalton, og oppviser en høy aktivitet in vitro i spesifikke biologiske prøver basert på proliferasjonen av forskjellige lymfocyttpopulasjoner. Alternative betegnelser på dette molekyl er «pre-B-cellevekstfaktor» og «lymfopoietin-1». Faktisk ble IL-7 opprinnelig beskrevet som et cytokin hvis hovedaktivitet var forårsaking avforstadium-B-celleproliferasjon (A.E. Nåmen et al., Journal of Experimental medicine, Vol 167,1988, p 988-1002). IL-7 er senere blitt

beskrevet som at det er involvert i overlevelsen og proliferasjonen av thymocytter (T-celler) på tidlig stadium av T-celleutvikling (K.S. Schluns et al., «Nature Immunology», Vol 1(5), 2000, p 426-432). Videre identifiserte Fry og medarbeidere IL-7 som en kraftig modulator av thymusuavhengig T-celleregenerering i en flerfaktorfunksjon (T.J. Fry et al., «Blood», Vol 97(6), 2001, p 1525-1533). IL-7 har således en stor potensiell terapeutisk anvendelse i stimuleringen av proliferasjonen av T-celleforstadier, av antistoffutskillende B-celler, i stimuleringen av antigen-drevet perifer T-celleekspansjon og i fremstillingen av naive T-celler samt andre hematopoietiske celletyper. En spesielt interessant terapeutisk anvendelse av aktive IL-7-molekyler er for immunrekonstitusjon av lymfopeniske pasienter, pasienter behandlet for kreft, pasienter som har mottatt en beinmargs- eller stamcelleoverføring, pasienter som oppviser en ervervet eller genetisk immunitetsmangel, eldre pasienter eller pasienter som har lavt CD4-tall. Andre interesserende ligger i evnen til IL-7 til å produsere nye naive CD4 T-celler eller utvide spesifikke forråd for å produsere eller øke spesifikke immunresponser (vaksineforsterkning).

I betraktning av dets terapeutiske potensiale er det en betydelig interesse i å utvikle teknologier til fremstilling av biologisk aktive IL-7-polypeptider og tilsvarende legemiddelsubstanser. Det er mye interesse i å fremstille IL-7-legemiddelsubstanser eller farma-søytiske preparater som oppfyller reguleringsmyndighetenes krav og som er egnet til effektive terapeutiske anvendelser.

En legemiddelsubstans eller et farmasøytisk preparat som streber etter å stimulere en global eller spesifikk immunrekonstitusjon bør være effektiv i lang tid, noe som innebærer at den ikke bør utløse en spesifikk immunreaksjon mot sitt eget aktive prinsipp.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse vises det nå uventet at langtidsaktiviteten til et rekombinant, humant IL-7 for det meste uttrykkes ved hjelp av en spesifikk 1-4-, 2-5-, 3-6-konformer. Den foreliggende oppfinnelse viser dessuten at effektive legemiddelsubstanser ikke bør inneholde den ovennevnte konformer som hovedbestanddelen, men bør også være stort sett fri for andre konformere eller IL-7-molekylærvarianter, som tidligere ble betraktet som aktive produkter.

Selv om eksistensen av Cys-konformerne 1-4-, 2-5-, 3-6 ble fremstilt hypotetisk ved hjelp av datamaskinmodeller basert på hypotetisk GM-CSF- eller IL-4konformasjonsanalogi er opp til den foreliggende oppfinnelse bare IL-7-konformeren som oppviser disulfidbroer Cys: 1-6, 2,5, 3,4 blittkarakterisert vedhjelp av tryptisk spalting og massespektrometri. Denne form ble ansett for å utgjøre hovedformen av IL-7.1 skarp kontrast til dette foreslås det nå nye polypeptidprodukter og farmasøytiske preparater som er stort sett fri for slik konformer. Ifølge oppfinnelsen beskrives også fordelaktige fremstillings- og rensemetoder til fremstilling av slike polypeptider og preparater, som oppviser en høy biologisk aktivitet med nedsatt risiko for uønsket respons, så som anti-IL-7-immunresponser.

Ifølge oppfinnelsen beskrives således forbedrede fremgangsmåter til fremstilling og anvendelser av den rensede konformer av humant IL-7 fri for de ovennevnte produktrelaterte substanser eller forurensninger, som oppviser en særlig fordelaktig langtidsaktivitet in vivo og som er i stand til å favorisere universelle eller spesifikke immunresponser.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk sammensetning omfattende IL-7 og én eller flere farmasøytisk kompatible eller akseptable bærere, eksipienter eller fortynningsmidler, hvor minst 98 vekt% av den totale mengde av IL-7 i sammensetningen består av en IL-7 konformer som omfatter følgende tre disulfidbroer: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) og 3-6 (Cys47-Cys141).

Ytterligere foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse er angitt i underkravene 2-29.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for å produsere en farma-søytisk sammensetning som definert over, kjennetegnet ved at den omfatter:

a) å tilveiebringe en prøve som omfatter IL-7 polypeptider,

b) rense en IL-7 konformer som omfatter følgende tre disulfidbroer: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) og 3-6 (Cys47-Cys141) for å

produsere en IL-7 medikamentsubstans, og

c) valgfritt, måle eller kvantifisere, i medikamentsubstansen, nevnte bestemte IL-7 konformer.

Ytterligere foretrukne utførelser av fremgangsmåten er angitt i underkravene 31-40.

Det beskrives således en renset IL-7-konformer som omfatter følgende tre disulfidbroer: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92), 2-5 (Cys34- Cys 129), 3-6 (Cys47- Cys 141). Som beskrevet videre nedenfor er IL-7-konformeren fortrinnsvis en human rekombinant IL7-konformer og kan være glykosylert eller ikke-glykosylert.

Videre beskrives en legemiddelsubstans som omfatter en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor og stort sett fri for produktrelaterte forurensninger og produktrelaterte substanser, særlig andre konformere eller dimerer av IL-7.

Videre beskrives anvendelse av en legemiddelsubstans som beskrevet ovenfor i fremstillingen av et medikament («legemiddelprodukt») eller farmasøytisk preparat.

Videre beskrives et farmasøytisk preparat som inneholder en effektiv mengde av en legemiddelsubstans som beskrevet ovenfor og én eller flere farmasøytisk forenlige farmasøytiske bærere eller eksipienter.

Det beskrives også nukleinsyremolekyler som koder for et IL-7-polypeptid. Nukleinsyremolekylene inneholder en sekvens som koder for et IL-7-polypeptid, hvorved sekvensen er optimalisert for ekspresjonen, i en rekombinant vert, av biologisk aktivt IL-7, særlig en IL-7-konformer ifølge oppfinnelsen. Nærmere bestemt sørger nukleinsyremolekylene for en begrenset ekspresjon av trunkerte IL-7-polypeptider og økning av utbyttene ved fremstilling av biologisk aktiv, human IL-7-konformer. Spesielle sekvenser omfatter en mutert eller inaktivert Shine-Dalgarno-lignende sekvens (for eksempel SEQ. ID NO:1). Andre spesielle sekvenser omfatter et peptidsignal som forårsaker effektiv sekresjon av polypeptidet (f.eks. SEQ ID NOR: 3, 16, 18, 20 eller 22). For første gang beskrives nukleinsyresekvensen til IL-7 fra ape (f.eks. SEQ ID NO: 12, 20 eller 22).

Det beskrives dessuten vektorer som omfatter en nukleinsyre som nevnt ovenfor og rekombinante vertsceller som omfatter nevnte nukleinsyre eller nevnte vektor. Nukleinsyren og vektorene kan anvendes til fremstilling av rekombinante pattedyr-IL-7-polypeptider i forskjellige kompetente vertsceller, samt for genterapiformål.

Det beskrives også et antistoff som er spesifikt immunreaktivt med en human IL-7-konformer ifølge oppfinnelsen, hybridomcellelinjer som produserer det monoklonale antistoff samt preparater som er egnet for diagnose, prøving eller terapi og som inneholder antistoffet.

Det beskrives også en fremgangsmåte til fremstilling av en (rekombinant) IL-7-konformer som beskrevet ovenfor av prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller, samt en frem gangsmåte til detektering eller måling av nærværet av en IL-7-konformer i en prøve eller til å karakterisere en prøve.

Ifølge et spesielt aspekt omfatter fremgangsmåten til fremstilling av en IL-7konformer eller en legemiddelsubstans som definert ovenfor:

a) tilveiebringelse av en prøve som inneholder IL-7-polypeptider, og

b) rensing av en IL-7-konformer slik som beskrevet ovenfor.

Det beskrives også en fremgangsmåte til karakterisering eller kvalitativ analysering av en

prøve, hvor fremgangsmåten omfatter detektering eller måling, i prøven, nærvær av en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor. En slik fremgangsmåte er særlig egnet og viktig for validering av kliniske mengder eller satser, hvorved prøver som inneholder overdrevne IL-7-molekylære varianter og/eller produktrelaterte forurensninger kastes eller videre-behandles.

Det beskrives også en IL-7-konformer oppnådd ved en fremgangsmåte som beskrevet ovenfor til fremstilling av et farmasøytisk preparat for å forårsake eller modulere en immunrespons i et individ, særlig å forårsake en forlenget lymfopoiesestimulering og/eller forsterke en immunrespons.

Det beskrives også anvendelse av en IL-7-konformer oppnådd ved en fremgangsmåte som beskrevet ovenfor til fremstilling av et farmasøytisk preparat for å forebygge eller behandle en sykdom forbundet med en immundefekt.

Videre beskrives anvendelse av en IL-7-konformer ifølge oppfinnelsen som et verktøy for eksperimentell og farmakologisk anvendelse i aper.

Forklaring av figurene

Fig. 1: Fremstilling av strukturen av E. co//-ekspresjonsvektor ptac-hlL-7, som inneholder

SEQ ID NO:1.

Fig. 2: Fremstilling av strukturen av E. co//-ekspresjonsvektor ptac-sll_7opt, som inneholder en sekvens som koder for ape-IL-7 (svarer til SEQ ID NO:12 som er fri for nukleotider nr.: 4-75 som koder for signalpeptidet). Fig. 3: Fremstilling av strukturen av pattedyrekspresjonsvektor pcDNA-hPSIL-7 som inneholdte SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 eller SEQ ID NO:18 (konstitutiv ekspresjon).

Fig. 4: Oppstilte nukleotidsekvenser av cDNA fra menneske og ape.

Fig. 5: Oppstilte aminosyresekvenser for protein fra mennesket og ape.

Fig. 6: Elektroforeseanalyse av IL-7-PCR-produkt fra ape.

Fig. 7: Elektroforeseanalyse av optimalisert IL-7-PCR-produktfra ape.

Fig. 8: Elektroforeseanalyse av PS-IL-7-PCR-produktfra menneske.

Fig. 9: SDS-PAGE-analyse av renset, deglykosylert, rekombinant, human IL-7konformer: coomassie-blåfarget og sølvflekket. Fig. 10: Analyse av biologisk prøve av IL-7-proteiner fra pattedyr (mennesker og aper) på pre-B-cellelinje.

Fig. 11: Perifer CD4 T-blodcelletall behandlet med forskjellig rekombinant IL-7.

Fig. 12: Western Blot-analyse av IL-7-behandlet apeserum for detektering av anti-IL-7-antistoffer. Fig. 13: Perifer CD4 T-blodcelletall hos bestrålt ape behandlet med forskjellig rekombinant IL-7. Fig. 14: Fremstilling av strukturen av pattedyrekspresjonsvektor phT-PSIL-7h inneholdende SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 16 eller SEQ ID NO: 18 (Tetracyklininduserbar ekspresjon). Fig. 15: Fremstilling av strukturen av pattedyrekspresjonsvektor pAVc-PSIL-7h inneholdende SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 16 eller SEQ ID NO: 18 (Adenovirus-transistorisk ekspresjon).

Fig. 16: Spesifikke markørforandringer fra 100% forbehandlingsverdier.

Fig. 17: Fremstilling av strukturen av pattedyrekspresjonsvektor pBud-hPSIL-7BvlXL inneholdende en human IL-7-sekvens (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:16 eller SEQ ID NO:18) og en sekvens som koder for en human Bcl-XL antiapoptotisk faktor (koekspresjon IL-7/BclXL).

Fig. 18: hlL-7-ekspresjon i HEK293-celler ved transient transfeksjon.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det beskrives en renset IL7-konformer, hvor IL-7konformeren inneholder følgende tre disulfidbroer: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92), 2-5 (Cys 34-Cys129), 3-6 (Cys47-Cys141), legemiddelsubstanser, samt farmasøytiske preparater som inneholder IL-7-konformeren, fremgangsmåter til fremstilling derav, samt terapeutiske anvendelser derav. Slik det vil bli beskrevet videre nedenfor, er IL-7-konformeren fortrinnsvis en human, rekombinant IL-7-konformer, og kan være glykosylert eller glykosylert. Den humane, rekombinante IL-7-konformer er fortrinnsvis glykosylert.

Oppfinnelsen er basert på den uventede iakttakelse at mellom- og langvarig biologisk aktivitet in vivo av IL-7 i det vesentlige skyldes en spesiell struktur av molekylet som så langt ikke var mistenkt, og at sterkt forbedret terapeutisk effektivitet oppnås ved fremstilling av farmasøytiske preparater som inneholder IL-7-konformere i en stort sett ren form.

IL- 7- konformer

Det beskrives en renset eller isolert IL-7-konformer hvor IL-7-konformeren inneholder følgende tre disulfidbroer: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92), 2-5 (Cys34-Cys129), 3-6 (Cys47-Cys141). IL-7 primærsekvens (menneske og ape) inneholder 6 godt bevarte cysteinrester som er involvert i 3 intramolekylære disulfidbroer. Slik som opprinnelig beskrevet av Goodwin, er disse disulfidbroer nødvendige for bioaktivitet idet betamerkaptoetanolbehandling av IL-7-molekylet opphever fullstendig dets aktivitet (R.G. Goodwin, et al. «Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA», Vol 86, 1989, p 302-306). Fra dette synspunkt er ifølge rangeringen av posisjonene til cyste in restene forskjellige konformere mulige, blant andre: 1-6, 2-5, 3-4 eller 1-4; 3-4 eller 1-4; 2-6, 3-5 eller 1-5, 2-4, 3-6, pluss forskjellige andre konformere, inklusive tilgrensende broer.

Forskjellige forskningsgrupper anvendte datamaskinkjemi for å foreslå en strukturmodell for proteinet. Utfra sekundære strukturforutsigelsesprogrammerforeslo Srinivansan og medarbeidere de skruelinjeformede områder av IL-7, og ved hjelp av analogi med GM-CSF og IL-4 tredimensjonale strukturer en proteinstruktur som omfattet følgende tildeling forde 3 broer: 1-4, 2-5, 3-6 (S. Srinivansan et al., «Protein Engineering (supplement), Vol 6,1993, p 107)). Ved hjelp av homologimodellstudier forutså Kroemnerog medarbeidere en tredimensjonal modell av hlL-7 basert på homologi med strukturene til humane IL-2, IL-4, GM-CSF og GH, som funksjonerer som templater og som bindes sammen i en opp-opp-ned-ned-topologi. I sammenheng med denne vanlige topologi favoriserte den 3-dimensjonale modell av humant IL-7 hypotesen om et unikt disulfidmønster: 1-4-, 2-5-, 3,6-disulfiddesignet (R.T. Kroemer et al., «Protein Engineering», Vol 9(6), 1996, p 493-498)). Men i 1997 etablerte Cosenza og kolleger ut fra MALDI massespektroskopianalyse av humant IL-7 produsert ved rekombinant teknologi og ut fra CT-dirigert mutagenese hvor serin ble erstattet med cystein tildelingen av de 3 disulfidbroer til posisjonene 1-6, 2-5, 3-4 på en måte som var helt analog med intramolekylære disulfidbroer som ble bestemt eksperimentelt for IL-4 (L. Cosenza et al., «Protein Science», Vol 9, 2000, p 916-926 - M.R. Walter et al., «Journal of Biological Chemistry, Vol 267,1992, p 20371-20376). I dette arbeidet viste massespektrometrianalysen av peptidspaltingen av det rekombinante, native molekyl klart eksistensen av Cys2-Cys141 (1-6) disulfidbroen og at den setedirigerte mutagenese spilte den kritiske rolle for bioaktiviteten til Cys2-Cys141 (1-6)-og Cys47-Cys92 (3-4)broene. De 2 Cys/Ser-IL-7-mutanter som muliggjør disse 2 enkeltbroer var i stand til å vise en god bioaktivitet (EC50 på 4x10"<9>og 2x10"<9>) i den biologiske prøve sammenlignet med EC50 på 2x10"<10>for de 3 disulfidbromolekyler 1-6, 2-5, 3-4. Basert på disse forsøksresultater ble disse 3 disulfidbroer 1-6, 2-5, 3-4 henført til det humane interleukin-7 og innført i den Internasjonale Proteindatabank (Sveitsisk Prot P13232, PDB-kode 1IL7).

Det vises nå at den ovennevnte 3-dimensjonale struktur som inntil nå er presentert, vist og akseptert i databanken er feil og at langtidsaktiviteten til rekombinant, humant IL-7 for det meste uttrykkes av en spesifikk 1-4-, 2-5-, 3-6-konformer. De oppnådde forsøks-resultater avviker fra de tidligere rapporterte disulfidbindinger i humant IL-7 (hlL-7) (L. Cosenza et al., «Journal of Biological Chemistry», Vol 272, 1997, p 32995-33000) og viser for første gang at langtidsaktive IL-7-preparater krever nærvær av en stort sett ren, spesiell IL-7-konformer, som er i samsvar med andre modeller som er utformet ved hjelp av homologimodeller med GM-CSF og IL4-strukturer.

I konteksten av den foreliggende oppfinnelse angir et «IL-7-polypeptid» et IL-7-polypeptid fra pattedyr (f.eks. menneske eller ape) og fortrinnsvis et humant IL-7-polypeptid, særlig for anvendelser som terapeutikum eller vaksine, eller et ape-IL7-polypeptid, særlig for anvendelse i ikke-humane primatforsøk. Foretrukne IL-7-polypeptider ifølge oppfinnelsen omfatter en slik aminosyresekvens som er beskrevet i EP 314 415 samt vilkårlige naturlige varianter og homologer derav. Sekvensen i humant IL-7 er tilgjengelig i genbanker. Det typiske villtypeprotein inneholder 152 aminosyrer og eventuelt en ytterligere N-ende-metioninrest (SEQ ID NO: 2,4,17 og 19). Varianter derav omfatter mer foretrukket naturlige alleliske varianter som fremkommer ved naturlig polymorfisme, som omfatter SNP'er, spleisevarianter etc. I en spesifikk utførelsesform er termen IL-7-polypeptid ment å angi et polypeptid som har sekvensen SEQ ID NO: 2,13 [SEQ ID NO: 13 er med eller uten signalpeptidet (aminosyrer nr.: 2-25)], 17,19, 21 eller 23 samt naturlige varianter derav. Det spesifikke IL-7polypeptid som anvendes i den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis et rekombinant IL-7, mer foretrukket en rekombinant, human IL-7-konformer som inneholder aminosyresekvensen SEQ ID NO: 2, 4, 17 eller 19.

En spesifikk «konformer» av IL-7 angir et IL-7-polypeptid som har en spesiell 3-dimensjonal struktur.

Betegnelsen «rekombinant» betyr slik den benyttes her at polypeptidet er oppnådd eller avledet fra et rekombinant ekspresjonssystem, dvs. fra en kultur av vertsceller (f.eks. mikrobielle eller fra pattedyr), som er konstruert for å inneholde et nukleinsyremolekyl som koder for et IL-7-polypeptid. «Mikrobiell» henviser til rekombinante proteiner fremstilt i bakte rieekspresjonssyste mer.

For medisinsk anvendelse (omfattende terapeutisk, profylaktisk, etc.) er IL-7konformeren fortrinnsvis en rekombinant, human IL-7-konformer. I dette henseendet har i en spesiell utførelsesform den spesifikke IL-7-konformer aminosyresekvensen SEQ ID NO: 4, 17 eller 19 og inneholder disulfidbroene Cys2Cys92, Cys34-Cys129 og Cys47-Cys141.1 en annen spesifikk utførelsesform har den spesifikke IL-7-konformer aminosyresekvensen SEQ ID NO: 4, 17 eller 19 og inneholder i tillegg metionin i N-terminalstillingen (dvs. SEQ ID NO: 2).

For ytterligere anvendelser, så som forsøksanvendelser, kan IL-7-konformeren være en rekombinant IL-7-konformerfra ape. Den rekombinante IL-7-apekonformer inneholder fortrinnsvis aminosyresekvensene SEQ ID NO: 13 [SEQ ID NO: 13 er med eller uten signalpeptidet (aminosyrene nr 2-25)], SEQ ID NO: 21 eller 23. IL-7-konformeren ifølge denne oppfinnelse kan være glykosilert eller uglykosilert. Mange avsondrede proteiner skaffer seg kovalent bundne karbohydratenheter posttranslasjonelt. Glykosilering er ofte i form av oligosakkaridenheter som er bundet til proteiner via en asparaginrest (plassert i consensusfrekvensen: -Ans-X-Ser/Thr-, hvor X er en vilkårlig aminosyre unntatt prolin) eller via serin/treoninaminosyresidekjeder, som gir hhv. N-glykosid- eller O-glykosidbindinger. Både strukturen og antallet oligosakkaridenheter som er bundet til et spesielt utsondret protein kan være meget variable, noe som resulterer i et stort område av tilsynelatende molekylvekter som kan tilskrives et eneste glykoprotein. Murin IL-7 (mlL-7), ape IL-7 (slL-7) og humant IL-7 (hlL-7) er avsondrede glykoproteiner, og i en første variant er IL-7-konformeren ifølge oppfinnelse glykosilert. Konformeren kan inneholde forskjellige typer oligosakkaridenheter, avhengig avfremstillingssystemet og -betingelsene. Disse kan f.eks. være N-acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin, mannose, galaktose, glukose, fukose, xylose, glukuronsyre, iduronsyre og/eller sialsyrer.

I en spesiell utførelsesform er IL-7-konformeren ifølge oppfinnelsen moderat glykosilert. Fortrinnsvis er glykosileringen av CHO-type, enda mer foretrukket dannet ved hjelp av en CHO-glykosileringsmutant som stabilt uttrykker a2,6sialyltransferase og oppviser en mangel på CMP-Neu5Ac hydrolaseaktivitet. Slik glykosilering omfatter typisk N-acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin, mannose, galaktose, glukose, fukose, xylose, glukuronsyre, iduronsyre og/eller sialsyrer.

I en foretrukket utførelsesform omfatter IL-7-konformeren en glykosylering av human type. For å fremstille en slik glykosylert form fremstilles IL-7konformeren typisk ved rekombinant teknologi i en human vertscelle som kan velges blant humane stromale cellelinjer eller epitelcellelinjer, HE-293 (human embryonyre), HER (human embryoretina), HEK (humane epidermale keratinocytter) humane kortikale epitelcellelinjer, human beinmarg eller humane, stromale beinmargscellelinjer, eller human tymus. I en annen variant er IL-7-konformeren ikke glykosilert.

En rekombinant, human IL-7-konformer som har et humant karbohydrat-mønster er meget foretrukket for terapeutisk anvendelse.

Det beskrives en spesifikk IL-7-konformer hvor IL-7-konformeren har aminosyresekvensen SEQ ID NO:4,17 eller 19, inneholder disulfidbroene Cys2-Cys92, Cys34-Cys129 og Cys47-Cys141, og er humant glykosilert, moderat glykosilert eller uglykosylert, mer foretrukket (human type) glykosilert. Konformersekvensen kan omfatte en ytterligere metioninrest i N-terminalenden (SEQ ID NO:2) og er glykosilert eller uglykosylert.

Den rensede konformer kan være i form av en monomer eller bundet til eller danner kompleks med en spesiell valgt forbindelse. I dette henseendet er i en spesiell utførelses-form IL-7-konformeren bundet til hepatocyttvekstfaktoren («HGF») som en heterodimer. Heterodimeren kan oppnås kjemisk, ved kompleksdannelse eller ved rekombinant teknologi (dvs. ved genetisk fusjon). IL-7-konformeren kan være funksjonelt bundet til en Fc- del av en IgG tung kjede, typisk via en peptidhengelsregion. Slike fusjonsmolekyler har potensielt økt stabilitet og halveringstid in vivo. IgG-delen er mest foretrukket humant lgG1 eller lgG4. IL-7-konformeren kan være funksjonelt bundet til et humant serumalbumin («HSA») eller en del av et HSA, som et fusjonsprotein. Slike fusjonsmolekyler har potensielt økt stabilitet og forlenget halveringstid in vivo.

Legemiddelsubstans og farmasøytiske preparater

Det beskrives også en legemiddelsubstans som inneholder, som det ønskede produkt, en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor, hvor legemiddelsubstansen er stort sett fri for IL-7-produktbeslektede substanser og produktbeslektede forurensninger. En foretrukket legemiddelsubstans er dessuten stort sett fri for prosessrelaterte forurensninger.

I konteksten av foreliggende oppfinnelse henviser termen «legemiddelsubstans» til et produkt som er egnet som det aktive prinsipp i et medikament. «Legemiddelsubstansen» ifølge denne oppfinnelse er av natur et komplekst produkt, dvs. som er resultat av fremstillingsmetoden for det (f.eks. rekombinant DNA-teknologi).

Ifølge den foreliggende oppfinnelse beskrives det nå at for å frembringe effektive terapeutiske- og vaksineforsterkningseffekter bør en IL-7-legemiddelsubstans eller farma-søytisk preparat inneholde som hovedmolekylenheter konformeren som er refoldet i samsvar med 1-4-, 2-5-, 3-6-disulfidbroene. Selv om andre bioaktive konformere, r-hlL-7-molekylvarianter, så som 1-6-, 2-5-, 3-4, eksisterer og er beskrevet i litteraturen for langtidsanvendelse og/eller gjentatte administreringer, viser resultatene som er oppnådd i følge den foreliggende oppfinnelse for første gang at disse produkter vil oppføre seg som produktrelaterte forurensninger, oppvise nye epitoper og være utsatt for å forårsake en nøytraliserende immunrespons mot den foretrukne struktur av IL-7.

Ifølge oppfinnelsen beskrives også det faktum at i spesialtilfellet med farmasøytiske preparater som inneholder rekombinant IL-7, oppfører andre potensielle produktrelaterte substanser og produktrelaterte forurensninger, som normalt vil være innbefattet i beskriv-elsen av legemiddelsubstansen og/eller legemiddelproduktet, selv om de er bioaktive, seg som nye epitoper pga. den sterke vaksineforsterkende egenskap til IL-7. Disse produkter skal minimaliseres sterkt pga. at de er i stand til å utløse en immunreaksjon mot det ønskede IL-7-molekylet.

Bioaktivitet i en spesifikk biologisk prøve er et kritisk nøkkelresultat for å kvalifisere et rekombinant proteins aktivitet for terapeutisk anvendelse (se ICH Q6B, Harmonized Tripartite Guideline, som vedrører spesifikasjoner, testprosedyrer og aksepterbarhets-kriterierfor bioteknologiske legemiddelsubstanser og produkter. Publisert i Det Statlige Register 18. august 1999 og utgitt som opptatt i Europa av Committee for Proprietary Medicinal Product i mars 1999, utgitt som CPMP/ICH/365/96). Bioaktivitet er faktisk den eneste test for aktivitet som vanligvis holder som en beskrivelse av aktivitet for fremstilling av satsfrigivelse. Samsvar med bioaktivitetspesifikasjoner betinger vanligvis av den rekombinante proteinlegemiddelsubstans/-legemiddelprodukt er aktiv i mennesker. Selv om forskjellige andre dyremodeller utføres in vivo for å teste aktiviteten til rekombinante proteiner hindres evalueringen av langtidsaktiviteten i dyr pga. at de heterologe, humane, rekombinante proteiner avviker fra det homologe protein i de testede dyrearter.

Den tidligere erfaring med langtidsanvendelse av rekombinante proteiner i mennesker viser at administreringen av en umodifisert proteinsekvens, som er fri for meget immun reaktive «prosessrelaterte» forurensninger, så som DNA, endotoksiner og vertscelle-proteiner, muliggjør en langtidsaktivitet og -fordel uten å nøytralisere immunreaksjoner. Produktrelaterte substanser, som er molekylære varianter av det ønskede produkt, (som definert i ICH Q6B-retningslinjene) og produktrelaterte forurensninger, tolereres så lenge de har en betydelig bioaktivitet i en relativt høy prosentandel av legemiddelsubstansen/- legemiddelproduktpreparatet. ICH Internasjonal Retningslinje Q6B stipulerer at «produktrelaterte substanser er molekylære varianter av det ønskede produkt dannet under fremstilling og/eller lagring, som er aktive og som ikke har noen skadelig effekt på sikkerheten og effektiviteten til legemiddelproduktet. Disse varianter har egenskaper som er forenlige med det ønskede produkt og anses ikke som forurensninger». I dette lys vil forskjellige produktrelaterte substanser og/eller produktrelaterte forurensninger, molekylære varianter av IL-7, dersom de er bioaktive autorisere en satsfrigivelse basert på den biologiske prøve. Ifølge den foreliggende oppfinnelse beskrives det nå at i motsetning til disse retningslinjer og vanlig praksis vil i det spesielle tilfellet IL-7 disse molekylære varianter hva enn deres bioaktivitet er, forårsake en immunrespons mot det ønskede produkt r-hlL-7 og/eller endogent, humant IL-7 og nøytralisere det rekombinante proteins terapeutiske langtidsnytte. Dette skyldes hovedsakelig disse molekylære varianters, som oppfører seg som nye epitoper, tilknytning til den sterke vaksineforsterkende kapasitet av IL-7. Blant disse molekylære varianter beskrives det ifølge den foreliggende oppfinnelse nå at en spesiell oppmerksomhet bør rettes mot konformere som fremkommer ved en uegnet refolding av molekylet, mot deamiderte former, mot dimerer og mot hyperglykosylerte former f.eks. og mer generelt mot molekylære bioaktive varianter som mistenkes for å forårsake immunreaksjon pga. at de avviker fra de foretrukne, spesifikt identifiserte, molekylære arter.

Spesielt har man ifølge oppfinnelsen, ved å utføre in wVo-forsøk i aper, som rapportert i eksemplene, vært i stand til å vise at effektive legemiddelsubstanser vil kreve, som en hovedbestanddel en IL-7-konformer, som er beskrevet ovenfor og som også bør være stort sett fri for andre konformere eller produktrelaterte forurensninger. Slike resultater ville ikke oppnås i biologiske prøver in vitro hvor alle forbindelser er bioaktive, eller in vivo-prøver i gnagere, hvor IL-7 har en meget sterk lymfopoietisk effekt på B-celler. Ved kloning av ape-IL-7 og utføre forsøk in vivo i aper under anvendelse av enten legemiddelsubstanser ifølge denne oppfinnelse eller komplekse produkter som er beskrevet i kjent teknikk har det ifølge oppfinnelsen uventet vist seg at en spesifikk konformer var aktiv og at det var nødvendig å anvende den i renset form.

Det beskrives en legemiddelsubstans som inneholder som det ønskede produkt en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor og som er stort sett fri for IL-7-produktrelaterte substanser og produktrelaterte forurensninger.

Termen «stort sett fri» indikerer slik den benyttes her at legemiddelsubstansen ikke inneholder noen betydelig eller skadelig mengde av produktrelaterte substanser, produktrelaterte forurensninger og prosessrelaterte forurensninger. Nærmere bestemt bør substansen inneholde mindre enn 5%, mer foretrukket mindre enn 3% og enda mer foretrukket mindre enn 2% produktrelaterte substanser, produktrelaterte forurensninger og prosessrelaterte forurensninger. Mest foretrukket inneholder legemiddelsubstansene mindre enn ca. 1% produktrelaterte substanser og/eller produktrelaterte forurensninger og bare spormengder av prosessrelaterte forurensninger. IL-7-produktrelaterte substanser angir IL-7-molekylære varianter som f.eks. inneholder annen IL-7-konformer og/eller et aktivt eller inaktivt peptid eller polypeptidfragmenter av IL-7. IL-7-relaterte forurensninger omfatter f.eks. humane IL-7-polypeptider som inneholder mono- eller bi-disulfidbroer, tilgrensende disulfidbroer og en vilkårlig disulfidbro, så som følgende: Cys: 1-6, 2-5, 3-4 og tilgrensende disulfidbroer: Cys: 1-2, 3-4, 5-6. Andre IL-7-relaterte forurensninger omfatter avvikende glykosilert form som omfatter hyperglykosilert IL-7, gjærglykosylert IL-7, trunkert IL-7, deamidert, rekombinant IL-7, dimert eller multimert protein som inneholder IL-7, oksidert metioninform eller en kombinasjon derav.

Hva enn deres biologiske aktivitet er skal disse IL-7-molekylære varianter og IL-7-relaterte forurensninger minimaliseres sterkt eller kastes. Prosessrelaterte forurensninger omfatter DNA, endotoksiner, celledebris etc.

Slike forurensninger som de som er nevnt ovenfor dannes ofte ved rekombinant DNA-prosesser. Men deres innvirkning på den endelige produktaktivitet er ikke alltid blitt vurdert, og effektive metoder for fjerning av dem er ikke alltid tilgjengelige. Ifølge den foreliggende oppfinnelse vises det nå at konvensjonelle rekombinante metoder til fremstilling av IL-7 også genererer forskjellige forurensninger slik som beskrevet ovenfor. Nærmere bestemt viser oppfinnelsen at forskjellige IL-7-molekylære varianter er til stede og hvor forskjellige aminosyresekvenser er til stede. Videre er det i forbindelse med oppfinnelsen iaktatt at den kraftigste midlere eller langvarige biologiske aktivitet in vivo av r-IL-7 bæres av en spesifikk konformer som har 3 spesielle disulfidbroer. Cys: 1-4 (Cys2-Cys92), 2-5 (Cys34-Cys129), 3-6 (Cys47-Cys141). Manglende eller uegnede disulfidbroer vil kunne nedsette IL-7-aktiviteten vesentlig. Videre danner slike forurensninger molekyler som er immunreaktive ved administrering til humane eller ikke-humane primater og derved svekke den terapeutiske nytte av IL-7-konformeren ifølge oppfinnelsen.

En foretrukket legemiddelsubstans er således en legemiddelsubstans hvor den totale vektmengde IL-7 utgjør minst 95 vekt%, fortrinnsvis minst 98 vekt%, mer foretrukket minst 99 vekt% av en IL-7-konformer ifølge oppfinnelsen.

Det beskrives også et farmasøytisk preparat som inneholder en effektiv mengde av en legemiddelsubstans som beskrevet ovenfor, og én av flere farmasøytisk forenlige eller akseptable bærere, eksipienter eller tynnere.

Ifølge oppfinnelsen vises at farmasøytiske preparater som inneholder en stort sett ren IL-7- konformer slik som beskrevet ovenfor klart øker vaksineegenskapene til IL-7 og dets kapasitet til å stimulere antigenspesifikke immunresponser. Oppfinnelsen viser således at meget effektive biologiske preparater oppnås når IL-7-relaterte forurensninger fjernes og det anvendes en spesifikk konformer slik som beskrevet ovenfor.

Den farmasøytisk forenlige eller fysiologisk akseptable bærer, eksipient eller tynner kan velges blant svakt sure, isotoniske, bufrede saltløsninger eller suspensjoner og mer foretrukket blant sukrose, trehalose og aminosyre. Den farmasøytisk forenlige bærer inneholdes fortrinnsvis en passende buffer for å danne en isotonisk løsning. Tallrike molekylære varianter av IL-7, så som hyperglykosilerte, rekombinante proteiner fremstilt av rekombinante gjærstammer, IL-7-dimerer fremstilt med lav ionisk styrke, samt deamiderte former, selv om bioaktivitet bør minimaliseres sterkt. Under fremstilling eller lagring utløser eksponering av molekylet for høye eller moderat høye pHer: 8- 10, dannelsen av deamiderte former. Lagring ved pH 8,5-9 i noen få dager ved romtemperatur forårsaker tilsynekomst av disse deamiderte molekylære arter. Trinn som omfatter høye ph<i>er holdes fortrinnsvis på et minimum under prosessen, og det rekombinerte proteins stabilitet bedres dersom det lagres i en svakt sur buffer med pH fra 5-7. Den passende buffer har fortrinnsvis et pH-område på mellom 5 og 7,5, fortrinnsvis 6 og 7, enda mer foretrukket ca. 6,5 og er fortrinnsvis et organisk salt valgt blant en natriumsitratbuffer eller en ammoniumacetatbuffer. Det farmasøytiske preparat kan være i form av en suspensjon, løsning, gel, pulver, faststoff etc. Preparatet er fortrinnsvis i en lyofilisert form. Faktisk kan produktet formuleres som er lyofilisat under anvendelse av egnede eksipiensløsninger (f. eks. sukrose og/eller trehalose i et område mellom sukker og legemiddelsubstansmasse på f.eks. fra 1/1-10/1, fortrinnsvis fra 2/1-6/1) som tynnere og lyobeskyttere.

Preparatet kan inneholde stabiliseringsmidler, så som sukker, aminosyrer, proteiner, overflateaktive stoffer etc. Preparatet kan inneholde enhver saltløsning, så som fosfater, klorid etc. Egnede doser kan bestemmes i forsøk.

Et spesielt farmasøytisk preparat kan omfatte, i tillegg til den aktive legemiddelsubstans, et protein og/eller et overflateaktivt stoff. Nærværet av et protein eller et vilkårlig annet høymolekylært molekyl av naturlig opprinnelse, nedsetter eksponeringen av IL-7 mot vertens immunsystem hvorved sekundære effekter unngås. Mer foretrukket er proteinet ikke-immunogent i individet, slik som ethvert protein av human opprinnelse. Et mest foretrukket eksempel protein er humant serumalbumin. Det overflateaktive stoff kan velges blant kjente overflateaktive stoffer, så som «Tween»-produkter, fortrinnsvis «Tween 80». Et spesifikt preparat ifølge oppfinnelsen inneholder humant serumalbumin, fortrinnsvis 2-5 mg/ml) eller «Tween 80» (typisk 0,005%) eller en vilkårlig annen substans, så som en overflateaktiv substans som er i stand til å forebygge IL-7-immunogenisitet pga. lokal standhaftighet av legemiddelproduktet etter administrering av preparatet.

Aktuelle dosenivåer av aktive bestanddeler i preparatene ifølge oppfinnelsen kan tilpasses slik at det oppnås en mengde aktiv bestanddel som er effektiv for å oppnå en ønsket terapeutisk respons for et spesielt preparat og en spesiell administreringsmåte. Det valgte dosenivå avhenger derfor av den ønskede terapeutiske effekt, administreringsruten, den ønskede behandlingsvarighet og andre faktorer. Generelt kan doser på fra 3-300 ug/kg, fortrinnsvis fra 10-100 ug/kg administrert ved subkutan rute forventes å forårsake en biologisk effekt, fortrinnsvis når den administreres fra 1 gang daglig til 1 gang ukentlig, evnt. 2 ganger ukentlig, fortrinnsvis ikke oftere enn 1 gang hver 48. time.

Det skal imidlertid forstås at det spesifikke dosenivå for enhver spesiell pasient vil avhenge av forskjellige faktorer, så som kroppsvekt, generell helse, kjønn, kost, tid og administreringsrute, absorpsjonshastigheter og -utsondring, kombinasjon med andre legemidler og alvoret i den spesielle sykdom som behandles. I det spesifikke tilfellet med IL-7 bør det tas spesielt hensyn til pasientens immunstatus før justering av dosenivå. Jo mer pasienten er immunnedtrykt, bedømt ved f.eks. tellinger av perifere CD4 T-celler, desto mindre dose er nødvendig for å forårsake en relativ økning av lymfocytt-tall. I alvorlig immunnedtrykte primater frembringer subkutane doser på 60 ug/kg daglig en sterk økning i T-celletall (X3-X5 på en doseavhengig måte), men hos primater med normale lymfocytt-tall er høyere doser, så som 300 ug/kg, nødvendige for å øke lymfocytt-tallene fra 2 til 5-foldig. Etter subkutan administrering har rekombinat IL-7 en overraskende lang blodhalveringstid i primater. Dets effekt på cellesyklus varer fra 24-481, noe som muliggjør effektive behandlingsplaner med én eneste injeksjon daglig ned til 1 injeksjon ukentlig.

Farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen administreres fortrinnsvis fra 1 gang daglig ned til 1 gang ukentlig, eventuelt 2 ganger ukentlig, fortrinnsvis ikke hyppigere enn 1 gang pr. 48 timer, bare for å oppnå og/eller stimulere pasientimmungenerering.

Foretrukne administreringsruter er parenterale ruter. Den parenterale rute er fortrinnsvis intratumoral, mer foretrukket en intravenøs eller subkutan administrering. Den omfatter også intraarterielle, intraperitoneale eller intramuskulære injeksjoner. Det skal imidlertid forstås at enhver annen egnet administrasjonsrute kan overveies avhengig av pasientens helsestatus og reaktivitet.

Det farmasøytiske preparat kan inneholde ytterligere aktive bestanddeler, så som immunstimulerende midler, fortrinnsvis valgt blant en hematopoietisk cellevekstfaktor, et cytokin, et antigenmolekyl (eller antigen) og en adjuvans, for kombinert anvendelse, separat- eller anvendelse i rekkefølge.

Slike ytterligere aktive bestanddeler kan formuleres i kombinasjon med IL-7 eller separat, for kombinert, separat eller anvendelse i rekkefølge. I en første variant formuleres de aktive bestanddeler sammen, i den samme resipient eller beholder. I en annen, foretrukket variant, kondisjoneres de separat, dvs. i atskilte beholdere eller resipienter. Ifølge denne utførelsesform kan bestanddelene administreres separat, f.eks. samtidig eller i rekkefølge (f.eks. på forskjellige injeksjonssteder eller på forskjellige tidspunkter) for å frembringe den mest effektive biologiske effekt. Som nevnt ovenfor kan det også utføres gjentatte administreringer av det ene eller de 2 aktive bestanddeler.

I dette henseendet beskrives et farmasøytisk preparat som inneholder en stort sett ren IL-7-konformer som beskrevet ovenfor og en aktiv bestanddel valgt blant et immunstimulerende og et antigent molekyl, for kombinert, separat eller anvendelse i rekkefølge. Adjuvanser formuleres fortrinnsvis separat.

Den hematopoietiske cellevekstfaktor velges fortrinnsvis fra stamcellefaktoren (SCF), særlig den løselige form av SCF, G-CSF, GM-CSF, Flt-3-ligand, IL-15 og IL-2. Typiske eksempler på cytokiner for vaksineforsterkning omfatter cytokiner som induserer og/eller stimulerer immunresponsen av Th1-type. Cytokinet velges fortrinnsvis blant y-interferon, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 og MIP-1a. Det skal forstås at andre faktorer, så som FGF7 eller FGF10, interleukiner og/eller hormoner kan anvendes i kombinasjon med IL-7 for å frembringe ytterligere terapeutisk nytte.

Et spesifikt preparat kan inneholde en stort sett ren IL-7konformer som beskrevet ovenfor, og stamcellefaktor, særlig den løselige form derav, IL-15 og/eller Flt-3-ligand og/eller FGF10.

Et annet spesifikt preparat kan inneholde en stort sett ren IL-7konformer som beskrevet ovenfor og et cytokin valgt blant y-interferon, IL-2, IL-12, FJANTES og MIP-1a.

Et annet spesifikt preparat kan inneholde en stort sett ren IL-7konformer som beskrevet ovenfor, en stamcellefaktor og et cytokin.

Som angitt ovenfor kan det farmasøytiske preparat videre inneholde ett eller atskillige antigener (eller antigeniske molekyler), for kombinert, separat eller anvendelse i rekke-følge. Antigenet kan være et vilkårlig syntetisk eller naturlig peptid, et rekombinant protein, et avlivet, inaktivert eller svekket patogenprodukt, en mikroorganisme, en parasitt, et lipid, etc, en del derav og en kombinasjon derav. Antigenet kan være et helt protein eller et epitopholdig fragment eller del derav, særlig peptider som presenteres for immunsystemet via molekylene MHC Klasse I eller MHC II. Antigenet kan være et vilkårlig virusantigen, bakterielt antigen, parasittantigen, tumorantigen etc. Spesifikke eksempler på antigener omfatter antigener avledet av HIV, Varicella Zoster virus, influensavirus, Epstein-Barr-virus, Herpes Simplex-virus av type 1 eller 2, humant cytomegalovirus, dengue-virus, hepatittvirus A, B, C eller E, Syncytium respiratorisk virus, humant papillomavirus, mycobacterium tuberculosis, tokoplasma og clamydia.

Spesielt beskrives et preparat som inneholder en stort sett ren IL-7-konformer som beskrevet ovenfor og et antigenmolekyl for kombinert, separat eller anvendelse i rekkefølge. Preparatet kan dessuten inneholde ett eller flere immunstimulerende midler som beskrevet ovenfor for kombinert separat eller anvendelse i rekkefølge.

Videre beskrives et farmasøytisk preparat som inneholder en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor, hvor det farmasøytiske preparat administreres samtidig med, noen få dager før eller i rekkefølge med atskillige antigeniske molekyler for å oppnå og/eller stimulere en antigenspesifikk immunrespons hos et individ.

Videre beskrives en fremgangsmåte til å forårsake eller øke en antigenspesifikk immunrespons hos et individ, hvorved fremgangsmåten kjennetegnes ved at den omfatter at antigenet (eller et epitopholdig fragment derav) og et farmasøytisk preparat som inneholder en IL-7konformer som beskrevet ovenfor administreres til et individ. Det farmasøytiske preparat kan administreres samtidig, noen få dager før eller i rekkefølge med antigenet for å oppnå og/eller stimulere en antigenspesifikk immunrespons hos et individ.

Preparatet kan inneholde en adjuvans. Adjuvansen kan velges blant enhver substans, blanding, løsning eller preparat som letter eller øker et antigens immuniseringsevne og som er i stand til å indusere en immunrespons av Th1-type immunrespons, så som CpG, QS21, ISCOM og monofosforyllipid A. Slike adjuvanser er særlig egnet til å danne og/eller forsterke en spesifikk immunrespons mot antigen(er) i pattedyrindivider. Adjuvansen kondisjoneres og administreres fortrinnsvis separat fra det IL-7-holdige preparat og/eller på et distinkt injeksjonssted, fortrinnsvis med det eller de ønskede antigener.

Det beskrives også et farmasøytisk preparat som inneholder en effektiv menge av en IL-7-konformer i blanding med en egnet tynner, eksipient eller bærer, for parenteral administrering til en menneskepasient for profylaktisk eller terapeutisk stimulering av B eller T-lymfocyttutvikling og proliferasjon eller for forsterkning av en immunrespons. De farma-søytiske preparater induserer en langvarig lymfopoiesestimulering og/eller forsterkede immunresponser.

Et farmasøytisk preparat kan også anvendes i en menneskepasient for profylaktisk eller terapeutisk stimulering av B- eller T-lymfocyttutvikling og proliferasjon, for økning av universell og/eller spesifikk immunrekonstitusjon eller for økning av humorale og/eller cellulære immunresponser.

Et spesielt farmasøytisk preparat er for anvendelse til å forebygge eller redusere opportunistiske infusjoner hos immunsvekkede pasienter.

Et annet spesielt farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen er for anvendelse til å forlenge lymfopoiesestimulering og/eller til å frembringe spesifikk immunrespons, ikke bare mot dominerende epitoper, men også mot subdominerende eller mindre immunogeniske epitoper, epitoper som har en lavere affinitet til T-cellereseptoren, som vil gjøre det mulig å gjøre repertoaret for en spesifikk immunrespons hos menneskepasienter bredere.

Oppfinnelsen er særlig egnet til å frembringe en forebyggende eller helbredende immunrespons i individer, så som immunsvekkede pasienter, kreftpasienter, pasienter som gjennomgår transplantasjoner, pasienter som er infisert med et virus eller en parasitt, eldre pasienter eller alle pasienter som har lave CD4-tall etc.

Fremstillingsmetoder og verktøy

Det beskrives også egnede konstrukter og fremgangsmåter til fremstilling av de ovennevnte preparater, særlig den ovennevnte IL-7-konformer og -legemiddelsubstanser, i tilstrekkelige mengder og kvalitet for farmasøytisk anvendelse derav.

I dette henseendet beskrives det nukleinsyremolekyler som inneholder en sekvens som koder for et IL-7-polypeptid, hvorved sekvensen er optimalisert for ekspresjonen, i en rekombinant vert, av biologisk aktivt IL-7, særlig av en IL-7-konformer slik som beskrevet ovenfor. Nærmere bestemt sørger nukleinsyremolekylene for en begrenset ekspresjon av trunkerte IL-7polypeptider og øker utbyttene av dannelse av biologisk aktiv, human IL-7-konformer.

Den humane og ape IL-7-kodende DNA-sekvens (genomisk eller cDNA) inneholder i posisjon 49 etter «ATG»-initieringskodonet, et andre formentlig «ATG» som skulle kunne oppføre seg som et andre initieringskodon i E. coli. Faktisk går en «pseudo Shine-Dalgarno»-sekvens foran dette andre «ATG» (ribosombindende sekvens). For å danne optimaliserte produkter er det ifølge den foreliggende oppfinnelse utført inaktivering av dette putative andre initieringskodon og derved vesentlig minskning av den mulige dannelse av en amino-terminal, trunkert form av r-hlL-7. For å fremstille slike optimaliserte sekvenser ble nukleotider i den kodende sekvens mutert for å inaktivere den «SD-lignende» sekvens uten å modifisere den resulterende, kodede r-IL-7-aminosyresekvens.

Det beskrives således nukleinsyremolekyler som koder for et humant IL-7-polypeptid, hvori nukleinsyren inneholder en modifisert sekvens som unngår dannelse av et aminoterminalt, trunkert polypeptid, nærmere bestemt ved inaktivering av den «SD-lignende» sekvens (dvs. det formentlige andre initieringskodon som befinner seg i posisjon 49 i sekvensen, som koder for metioninrest 18 i SEQ ID NO:2).

Inaktivering av det formentlige andre initieringskodon kan mer foretrukket oppnås ved modifisering av sekvensen i minst ett av de 5 kodoner som ligger foran ATG-kodonet som koder for metionin 18 i SEQ ID NO:1, dvs. i kodonene 13-17 som koder for aminosyresekvens TyrGluSerValLeu. I en spesifikk utførelsesform modifiseres sekvensen ved forandring av kodonet som koder for et serin i posisjon 15 i SEQ ID NO:1 eller 2. Nærmere bestemt modifiseres i en foretrukket sekvens dette kodon slik at det ikke inneholder en AG-dublett. Egnede kodoner kan f.eks. velges fra TCC, TCT, TCA og TCG. I SEQ ID NO: 1, 3,16 og 18 er TCC-kodonet blitt anvendt. Kodonetsom koder for Tyr i posisjon 13 (basert på nummereringen i SEQ ID NO: 1) kan velges fra TAC eller TAT. Kodonet som koder for Glu i posisjon 14 (basert på nummereringen i SEQ ID NO:1) kan velges fra GAG og GAA. Kodonet som koder for Val i posisjon 16 (basert på nummereringen i SEQ ID NO:1) kan velges fra GTT, GTC, GTA og GTG. Endelig kan kodonet som koder for Leu i posisjon 17 (basert på nummereringen i SEQ ID NO:1) velges fra CTG, CTA, CTT, CTC, TTA og TTG. Alle kombinasjoner av de ovenfor angitte kodoner er mulige. Et spesifikt eksempel på en forandret DS-lignende sekvens svarer til nukleotidene 37-51 i SEQ ID NO:1.

Et spesifikt, foretrukket nukleinsyremolekyl omfatter sekvensen SEQ ID NO:1 og koder for et rekombinant, humant IL-7-polypeptid.

Videre beskrives et nukleinsyremolekyl som beskrevet ovenfor som dessuten inneholder en signalsekvens som forårsaker avsondring av det fremstilte polypeptid. Signal-sekvensen kan velges fra den naturlige signalsekvens i humant IL-7-protein eller fra enhver heterolog signalsekvens. Slike sekvenser kan ha sin opprinnelse i andre avsondrede proteiner, så som det humane veksthormon, eller være kunstig eller syntetisk. Et foretrukket signalpeptid kan være et naturlig signalpeptid i en human vekstfaktor eller i et humant veksthormon, mer foretrukket et naturlig signalpeptid i det humane erytropoietin. Et enda mer foretrukket signalpeptid er et syntetisk signalpeptid, så som HMM38. Foretrukne sekvenser er de som er funksjonelle i kompetente pattedyrvertsceller. Et spesifikt eksempel på en slik forbedret sekvens omfatter SEQ ID NO:3,16 eller 18. Denne sekvens omfatter en ledersekvens og en inaktivert SD-lignende sekvens, for bedret ekspresjon.

Det beskrives også et polypeptid som kodes av en nukleinsyresekvens som beskrevet ovenfor, som kan være glykosilert eller uglykosylert.

Det beskrives således et polypeptid som beskrevet ovenfor hvor polypeptidets tertiære struktur inneholder følgende 3 disulfidbroer: Cys: 1-4, 2-5, 3-6.

Det beskrives også vektorer som omfatter en nukleinsyre som beskrevet ovenfor, samt rekombinante vertsceller som inneholder nukleinsyren eller vektorene. Nukleinsyrene og vektorene kan anvendes til fremstilling av rekombinante, humane IL-7-polypeptider i forskjellige kompetente vertsceller, og for genterapiformål.

Vektoren kan være et plasmid, et virus, en fag, et cosmid, et episom etc. Foretrukne vektorer er virale vektorer (f.eks. rekombinante adenoviruser) og plasmider, som kan fremstilles basert på kommersielt tilgjengelige ryggrader, så som pBR, pcDNA, pUC, pET, pVITRO etc. Vektoren inneholder typisk reguleringselementer eller sekvenser for å styre eller få i stand ekspresjon av et IL-7-polypeptid fra den optimaliserte, kodende nukleinsyre. De regulerende sekvenser kan velges blant promotere, enhancere, silencere, vevsspesifikke signaler, peptidsignaler, introns, terminatorer, polyA-sekvenser, GC-regioner etc, eller en kombinasjon derav. Slike regulerende elementer eller sekvenser kan avledes av pattedyr-, plante-, bakterie-, gjær-, bakteriefag- eller virusgener, eller av kunstige kilder. Anvendelige promotere for prokaryotekspresjon, så som E. coli, omfatter T7 RNA polymerasepromoter (pT7), TAC-promoter (pTAC), Tfp-promoter, Lac-promoter, Tre-promoter, PhoA-promoter f.eks. Egnede promotere for ekspresjon i pattedyrceller omfatter viruspromotere (f.eks. CMV, LTR, RSV, SV40, TK, pCAG, etc), husdyrgen-promotere (f.eks. E1fa, kylling-p-aktin, Ubiquitin, INSM1, etc), hybridpromotere (f.eks. aktin/globin etc.) etc. En vektor kan inneholde mer enn 1 promoter. Promoterne kan være induserbare eller regulerte. F.eks. muliggjør anvendelse av induserbare eller regulerte promotere en bedre kontroll med produksjon ved at kulturen holdes atskilt fra pro-duksjonsfaser. Induserbare eller regulerte promotere kan finnes i litteraturen, så som Tetracyklin-systemet, Geneswitch-systemet, Ecdysone-system, Oestradiolsystemet, RU486-systemet, Cumate-systemet, metallotioneinpromoteren etc. Andre systemer er basert på elektriske strømmer eller mikrobølger, så som ultralydfokalisatorer o.l. Disse systemer kan anvendes til å kontrollere ekspresjon av et IL-7-polypeptid ifølge oppfinnelsen. IL-7 kan ko-uttrykkes med en anti-apoptosefaktor (f.eks. iex, Bcll2, BcIXL, etc). cDNA'et (som koder for nevnte IL-7- og forden anti-apoptosefaktor) kan være anbrakt både nedstrøms for den samme promoter, men atskilt med en IRES-sekvens, eller hver av dem nedstrøms for sin eget promoter.

Vektoren kan videre omfatte et replikasjonsopphav og/eller et markørgen, som kan velges fra konvensjonelle sekvenser.

Vektoren kan videre omfatte forskjellige kombinasjoner av disse forskjellige elementer som kan organiseres på forskjellige måter.

Det beskrives også rekombinante vertsceller som omfatter en nukleinsyre eller en vektor slik som beskrevet ovenfor. Vertscellen kan velges fra vilkårlige eukaryotiske og prokaryotiske celler, (typisk fra en pattedyrcelle, særlig en celle fra mennesket, gnager eller kanin). En bakteriecelle (særlig E. coli, Bacillus brevis, Bacillus subtilis), en gjærcelle, en plantecelle og en insektcelle. Når gjær-, plante- eller insektceller anvendes til fremstillings-formål underkastes produktene som oppnås i cellene fortrinnsvis et behandlingstrinn for å fremstille uglykosylerte produkter. Disse vertsceller kan tilpasses til serumfrie medier. Fremstilling kan også utføres i et transgent dyr.

Foretrukne rekombinante vertsceller velges fra en pattedyrcelle, særlig en celle fra mennesket, og en bakteriecelle samt derivater eller mutanter derav. Spesifikke eksempler på egnede vertsceller omfatter bakterier som sørger for ikke-glykosilert fremstilling av proteiner. I bakterier (f.eks. Escherichia coli) uttrykkes IL-7 vanligvis som inklusjonslegemer. Denne vert er særlig fordelaktig og kan nærmere bestemt anvendes sammen med en vektor som inneholder en sekvens SEQ ID NO:1.

Andre eksempler på egnede vertsceller omfatter pattedyrceller som sørger for glykosilert fremstilling av proteiner. Man kan overføre celler fra ovarier fra kinesiske hamstere (CHO)-celler fra babyhamsternyre (BHK), celler fra embryonyrer fra mennesket (HEK-293), humane, epidermale keratinocytter (HEK), humane stromale eller epitelceller, PERC6, etc. I slike pattedyrceller kan IL-7 fremstilles som et avsondret protein ved anvendelse av funksjonelle signalpeptidsekvenser. Disse verter kan nærmere bestemt anvendes sammen med en vektor som omfatter en sekvens SEQ ID NO:3,16 eller 18.

Det beskrives en prokaryotisk vertscelle som omfatter et nukleinsyremolekyl som inneholder SEQ ID NO:1.

Det beskrives en eukaryotisk vertscelle som omfatter et nukleinsyremolekyl som inneholder SEQ ID NO:3,12,16, 18, 20 eller 22.

Det beskrives en eukaryotisk eller prokaryotisk vertscelle som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for et IL-7polypeptid som inneholder aminosyrene 26-152 i SEQ ID NO:13.

Det beskrives antistoffer som er immunreaktive sammen med en IL-7-omformer slik som beskrevet ovenfor. Slike antistoffer kan fremstilles ved konvensjonelle metoder, så som immunisering av dyr og innsamling av serumet (polyklonale) eller fremstilling av hybridomaer fra miltceller (monoklonale). Fragmenter (f.eks. Fab') eller derivater av antistoffer (f.eks. ScFv) kan fremstilles ved kjente biologiske og kjemiske metoder. Foretrukne antistoffer er spesifikt immunreaktive med en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor, dvs. kan binde IL-7-konformeren uten vesentlig binding av IL-7-polypeptider som ikke inneholder følgende 3 disulfidbroer: Cys2-Cys92, Cys34-Cys129 og Cys47-Cys141. Selv om ikke-spesifikk eller mindre effektiv binding til slike andre antigener kan iakttas, kan slik ikke-spesifikk binding skjelnes fra spesifikk binding til den spesielle konformer ifølge oppfinnelsen.

Antistoffet er fortrinnsvis av opprinnelse fra ape, mus eller mennesket, eller er blitt humanisert.

Det beskrives også en hybridomcellelinje som danner et monoklonalt antistoff som beskrevet ovenfor.

Slike antistoffer er nyttige til detektering av IL-7-konformer eller til nøytralisering av biologisk aktivitet av IL-7 i prøver eller eksperimenter som involverer flere lymfokiner. Det beskrives også et preparat for diagnose, prøve eller terapi inneholder slike monoklonale antistoffer.

Det beskrives også en fremgangsmåte til fremstilling eller mangfoldiggjøring av en optimalisert IL-7-nukleinsyre fra en prøve, hvor fremgangsmåten omfatter:

i) tilveiebringelse av en prøve som inneholder et IL-7-gen eller

- kodende sekvens,

ii) bringe prøven i kontakt med et par primere som danner en optimalisert sekvens, særlig en sekvens som er fri for et funksjonelt, andre initieringskodon i posisjon 49, og

iii) fremstilling eller mangfoldiggjøring av den optimaliserte IL-7-nukleinsyre.

Prøven kan omfatte genomisk DNA, cDNA eller RNA.

Mangfoldiggjøring av genet kan frembringes ved en vilkårlig kjent teknikk, så som PCR, RT-PCR eller andre mangfoldiggjøringsteknikker. Mangfoldiggjøring krever vanligvis anvendelse av et par primere som er kjennetegnet ved at forsekvensen hybridiserer med 5'-enden i DNA og at den omvendte sekvens hybridiserer med 3'-enden i den samme DNA. Spesifikke eksempler på primere er som følger:

Par 1: SEQ ID NO:5 og SEQ ID NO:6,

Par 2: SEQ ID NO:7 og SEQ ID NO:6, samt

Par 3: SEQ ID NO:8 og SEQ ID NO:6.

Det skal forstås at andre primere kan utformes av fagfolk, så som fragment av det optimaliserte IL-7-genet, for anvendelse i mangfoldiggjøringstrinnet og særlig et par primere som omfatter en forsekvens og en omvendt sekvens, og primerne i paret hybridiserer med en region i det muterte IL-7-genet og muliggjør mangfoldiggjøring av i det minste en del av IL-7-genet.

Det beskrives også fremgangsmåter som kan benyttes i industriell skala til fremstilling av en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor i farmasøytisk kvalitet og stort sett ren. Fremgangsmåten fører til høye utbytter av rekombinant IL-7-konformer som er egnet for terapeutisk anvendelse. Det beskrives også fremgangsmåter for kontrahering av IL-7— holdige preparater for å bestemme nærværet av mengden av en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor.

Det beskrives fremstilling av en IL-7-konformer eller en legemiddelsubstans som definert ovenfor, hvor fremgangsmåten omfatter:

a) tilveiebringelse av en prøve som inneholder IL-7-polypeptider, og

b) rensing av en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor.

Prøven som anvendes i trinn a) kan være en vilkårlig biologisk prøve som inneholder et IL-7-polypeptid. Denne omfatter f.eks. en cellesupernatant, en biologisk væske, en celleekstrakt, en vevsprøve etc. Foretrukne prøver er cellesupernatanter av rekombinante vertsceller som danner et rekombinant IL-7 polypeptid, mer foretrukket et IL-7-polypeptid fra mennesket eller ape, enda mer foretrukket et rekombinant, humant IL-7-polypeptid.

Mest foretrukne prøver er (oppnådd fra) cellesupernatanter av rekombinante vertsceller som inneholder et optimalisert IL-7-kodende nukleinsyremolekyl som beskrevet ovenfor, nærmere bestemt et polynukleotid som omfatter SEQ ID NO:1, 3, 12, 16, 18, 20 eller 22.

Prøven kan utsettes for forskjellige behandlinger eller betingelser for å øke renheten av IL-7, for å frigjøre IL-7 fra inklusjonslegemer, for å fjerne celledebris eller andre spesielle legemer, etc. Typiske eksempler på slike behandlinger omfatter sentrifugering, filtrering og/eller klaring. Prøven kan således anrikes med IL-7-polypeptid.

For å øke utbyttene eller effektiviteten ved fremgangsmåten er det meget ønskelig å fremstille en prøve som inneholder eller som er anriket med korrekt foldede IL-7-polypeptider.

I dette henseendet, når prøven er (eller er avledet av) en kultur av prokaryotiske vertsceller som koder for et IL-7-polypeptid er spesielle behandlinger av prøven nødvendige. Slike behandlinger omfatter: i) behandling av prøven for å frembringe en fullstendig denaturering av IL-7-polypeptidene,

ii) eventuelt rensing av det denaturerte polypeptid som ble oppnådd i trinn

i)> og

iii) refolding av polypeptidene.

Trinn i) omfatter behandlingen av prøven for å frembringe denaturering av IL-7polypeptidene. Denaturering angir en destruksjon eller reduksjon av alle tertiære strukturer i polypeptidet, så som disulfidbroer eller andre intramolekylære bindinger. Denaturerings-behandling omfatter oppløsning av inklusjonslegemer i en denaturerende buffer for å oppnå et helt denaturert, løseliggjort protein. Denaturering kan oppnås med en buffer som inneholder guanidinhydroklorid, urea, EDTA, p-merkaptoetanol eller ditiotreitol (DTT). Passende doser kan bestemmes av fagfolk på området og avhengig av denaturerings-nivået som er nødvendig. Andre denatureringsbetingelser, som er kjente på området, kan også benyttes, alene eller i kombinasjon. Et foretrukket denatureringsnivå svarer til destruksjonen av alle disulfidbroene i IL-7.1 en foretrukket full denatureringsprotokoll anvendes det 8 M guanidinhydrokloridbuffer. Høy guanidinhydrokloridmolaritet foretrekkes for å muliggjøre fullstendig denaturering av proteinet før riktig refolding av dette. Dette denatureringsstadium kan kontrolleres ved hjelp av analyseteknikker som er kjente på området, så som f.eks. elektroforese.

Rensetrinn ii) kan utføres ved forskjellige i og for seg kjente teknikker, men som ikke har vært benyttet så langt i den foreliggende kombinasjon til å fremstille en fullt aktiv IL-7-polypeptidkonformer. Disse teknikker velges fortrinnsvis fra hydrofob vekselvirknings-kromatografi, ionebytterkromatografi, affinitetskromatografi og gelfiltreringskromatografi, enten alene eller i forskjellige kombinasjoner. Slike metoder gjør det mulig å fjerne DNA og andre forurensninger (lipider etc), som vil ha senket gjenvinning i det etterfølgende refoldingstrinn. I en foretrukket utførelsesform omfatter trinn ii) et hydrofobt vekselsvirkningskromatografitrinn.

Slik kromatografi kan utføres under anvendelse av forskjellige bærere og formater, fortrinnsvis under anvendelse av HIC-butyl, fortrinnsvis under denaturerende betingelser. For å utføre dette trinn er et foretrukket pH-område mellom 6 og 9, fortrinnsvis mellom 7 og 8,5. Trinn ii) kan utføres på enhver bærer, fortrinnsvis på en sats eller i en søyle under anvendelse av passende gel.

Refoldingstrinnet iii) omfatter en renaturering og fortrinnsvis reoksidasjon av IL-7-polypeptidene og, typisk, et ytterligere avsaltingstrinn utført ved filtrering (f.eks. en gelfiltrering) eller ultrafiltrering. I en foretrukket utførelsesform omfatter refoldingen et ionebytter-kromatografitrinn for å skille den aktive, nye konformer fra de uønskede former. I en mest foretrukket utførelsesform omfatter refoldingen et trinn hvor de rensede polypeptider bringes i kontakt med en valgt affinitetskromatografibærer for å skille den aktive, nye konformer fra de uønskede former. Dette meget fordelaktige trinn er selektivt for elueringen av det korrekt refoldede IL-7.

Refoldingstrinnet omfatter; iii) føring av løsningen oppnådd i trinn ii) gjennom en søyle som inneholder polymerer av sulfaterte polysakkarider. Det sulfaterte polysakkarid er fortrinnsvis dekstransulfat eller heparin, og matriksene kan være sefarose, akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer som det er vanlig å anvende i protein-rensing. En foretrukket matriks er heparinsefarose. Fremgangsmåten kan dessuten omfatte et ytterligere trinn med eluering av den ønskede IL-7-con-former.

En affinitetskolonne kan anvendes både til å rense og refolde polypeptidene, dvs. å utføre trinnene ii) og iii) samtidig.

Når prøven er, (eller avledes av) en kultur av eukaryotiske vertsceller som koder for IL-7-polypeptider, kan det være nødvendig å utføre de ovenfor angitte behandlingstrinn ii)-iii). Faktisk kan i en slik situasjon prøven omfatte korrekt foldede IL-7-proteiner, om enn i kompleks blanding med andre produktrelaterte substanser og forurensninger. Dette er spesielt slik når den rekombinante, eukaryotiske vertscelle omfatter et nukleinsyremolekyl som forårsaker ekspresjon og avsondring av IL-7-polypeptidene i dyrkingsmediet.

I dette tilfellet kan prøven direkte underkastes rensetrinnet b).

Rensetrinnet b) kan omfatte ett eller flere rensetrinn, så som filtrerings- eller ultra-filtreringstrinn, ionebytterkromatografi, affinitetskromatografi, hydrofob vekselvirknings-kromatografi etc. for å fjerne legemiddelrelaterte substanser, så som andre konformere, deamiderte former, dimerer av proteinet, restforurensninger, inklusive DNA, endotoksiner etc. Kromatografitrinnet kan realiseres på en gjennomstrømningsmåte, i en oppfangings-måte eller i en strømlinjemåte.

Rensetrinnet kan omfatte b) lasting av prøven gjennom en kolonne pakket med en spesifikk gel som omfatter sulfaterte polysakkarider immobilisert på en harpiks (f.eks. dekstransulfat eller heparin).

Rensetrinnet kan omfatte lasting av prøven gjennom en kolonne pakket med en spesifikk gel som omfatter et monoklonalt anti-IL-7-antistoff immobilisert på en harpiks (f.eks. dekstransulfat eller heparin).

Disse fremgangsmåter muliggjør reproduserbar og effektiv fremstilling av en stort sett ren, fullt aktiv, human IL-7-konformer som beskrevet ovenfor. Fremgangsmåtene er særlig fordelaktige idet den rekombinante IL-7-konformer kan oppnås med en renhet på minst 95 vekt%, fortrinnsvis minst 98 vekt% og enda mer foretrukket 99 vekt% eller sågar 99,5 vekt% i forhold til den totale mengde IL-7. Videre kan den ovenfor beskrevne rense-metode anvendes på andre polypeptider enn humant IL-7, særlig på andre cytokiner som har én eller atskillige disulfidbroer, inklusive dyre-IL-7 (f.eks. ape-IL-7), IL-13, IL-15, etc.

Hvert trinn i den ovenfor beskrevne fremgangsmåte kan kontrolleres ved hjelp av ana-lytiske metoder, så som SDS-PAGE-analyse. Primærstrukturen til det optimaliserte IL-7 kan kontrolleres og karakteriseres ved bestemmelse av gen- og/eller aminosyresekvensen, ved peptidkartleggingsanalyse, etter tryptisk spaltning, ved bestemmelse av molekylvekt med SDS-PAGE, størrelsesekskluderende HPLC, MALDI TOF og/eller massespektrometri ved bestemmelse av hydrofobisitet ved revers fase HPLC f.eks. og/eller ved bestemmelse av den elektriske ladning med kationbytterkromatografi-HPLC eller isoelektrofokaliseringsanalyse f.eks.

I en spesifikk variant beskrives en fremgangsmåte til fremstilling av en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor, hvor fremgangsmåten omfatter minst følgende trinn: a) tilveiebringelse av en prøve som omfatter IL-7-polypeptider fremstilt ved hjelp av en rekombinant, prokaryotisk vertscelle, a') behandling av prøven for å

frembringe en fullstendig denaturering av IL-7-polypeptidene, a") eventuelt rensing av det denaturerte polypeptid som ble oppnådd i trinn a'), a'") refolding

av polypeptidene, og

b) rensing av polypeptidet for å fremstille en konformer som beskrevet ovenfor.

I en annen spesifikk variant beskrives en fremgangsmåte til fremstilling av en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor, hvor fremgangsmåten omfatter minst følgende trinn: a) tilveiebringelse av en prøve fremstilt ved hjelp av en rekombinant eukaryotisk vertscelle, hvor prøven inneholder et refoldet IL-7-polypeptid, og b) gjennomføring av ett eller atskillige rensetrinn for å fjerne produktrelaterte substanser eller forurensninger.

Videre beskrives fremgangsmåter til fremstilling av IL-7 slik som beskrevet ovenfor hvor IL-7-ekspresjonen ved hjelp av rekombinante vertsceller er induserbar, regulert eller forbigående, slik at cellekulturen og IL-7-ekspresjonsfasene kan holdes fra hverandre. Nærmere bestemt kan i en spesiell utførelsesform IL-7-ekspresjonen undertrykkes eller minimaliseres under rekombinant cellevekst, mangfoldiggjøring og/eller dyrking for å muliggjøre fremstilling av store mengder rekombinante vertsceller uten noen IL-7-forårsaket, mulig toksisk effekt. Deretter kan IL-7-ekspresjonen induseres i cellekulturen (eller en prøve derav), noe som muliggjør effektiv syntese og frigjøring av rekombinant IL-7.

Videre beskrives en fremgangsmåte til fremstilling av et rekombinant IL-7-polypeptid, som omfatter dyrking av en rekombinant vertscelle som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for IL-7-polypeptidet, og fjerning av det fremstilte, rekombinante IL-7-polypeptidet, hvorved nukleinsyremolekylet sørger for en regulert eller induserbar ekspresjon av IL-7-poly-peptidet, slik at ekspresjon av IL-7-polypeptidet kan undertrykkes eller minimaliseres under rekombinant cellevekst og induseres i vekstfase. Nukleinsyren omfatter typisk en promoter, som kan undertrykkes eller aktiveres i nærvær eller fravær av et spesifikt middel som befinner seg i- eller tilsettes til dyrkingsmediet. Fremgangsmåten er særlig egnet til fremstilling av en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor.

Forskjellige regulerte eller induserbare ekspresjonssystemer er beskrevet på området, som er funksjonelle i pattedyrvertsceller og som kan anvendes i den foreliggende oppfinnelse. Disse omfatter Tetracyklin TetOn/Off-systemet, Geneswitch-systemet (Invitrogen) med «Mifepristone» som induserbart middel og GAL4-E1b-promoter (Ecdysone-systemet) (induksjon med ponasterone A eller muristerone A, analoger av insektsteroidhormoner) (Invitrogen), metallotioninpromoter (induserbar ved hjelp av sink), Oestradiol-systemet, RU486systemet, Ultra sons fokalisere, Cumate-systemet (Q-mate; Qbiogen), Cre-Loxsystemet etc. Disse regulerte eller induserbare ekspresjonssystemer kan anvendes i forskjellige celler, så som f.eks. HEK293, HEK293 EBNA, HEK, «T-REX»-293, «T-REX»-HeLa, «T-REX»-CHO eller «T-REX»-Jurkat cellelinjer, transformert med en rekombinant vektor som er utformet for å uttrykke rekombinant IL-7 etter induksjon.

Alternativt kan transient transfeksjon benyttes for å holde celleekspesjon atskilt fra IL-7-produksjon. I dette henseendet anvendes det effektive genleveringsvektorer for å introdusere en IL-7-kodende sekvens i celler ved mangfoldiggjøring av disse. Mer foretrukket er vektorsystemet for transient transfeksjon en virusvektor, så som en rekombinant adenovirus- eller en episomal vektor [f.eks. pCEPH (Invitrogen), pTT (IRB: Y. Durocher et al., Nucl. Acids. Res., 2002, Vol 30(2)) eller anvendelse av MAR-sekvenser]. Adenoviruser (og andre virusvektorer, så som AAVer) kan fremstilles ifølge kjent teknikk. Typisk fremstilles E1-mangelfulle adenoviruser i en E1-kompletterende cellelinje, så som HEK293, PERC6-celler, etc. Slike transiente transfeksjonsprosesser kan utføres i forskjellige pattedyrceller i kultur, så som A549-, HeLa-, VERO-, BHK- eller CHO-transformerte celler (f.eks. beskrevet i A4). En alternativ fremgangsmåte med transient ekspresjon egnet for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse er f.eks. beskrevet i følgende artikkel: Y. Durocher et al., «Nucl. Acids. Res.», 2002, Vol 30(2), i HGK293-, EBNA- eller HEK293-celler.

Fortrinnsvis omfatter fremgangsmåtene et ytterligere trinn c) med karakterisering og måling eller kvantifisering av den spesielle 7-konformer som beskrevet ovenfor inneholdt i det resulterende produkt. Den fysikalske og biologiske karakterisering av den ønskede IL-7-konformer kan oppnås ved massespektrometri (MALDI TOF) infrarød spektroskopi, kjernemagnetisk resonans (NMR), ved bestemmelse av sirkulær dikroisme, ved vurdering av IL-7-konformerens biologiske aktivitet i en spesifikk biologisk prøve, ved måling av affiniteten mot et spesifikt monoklonalt antistoff rettet mot IL-7-konformeren, eller ved heparinaffinitets-HPLC. Etter karakterisering kan kvantifisering av konformeren utføres ved ELISA-biologisk prøve, IL-7-konformerens affinitet til IL-7-reseptor og enhver fremgangsmåte for proteinkvantifisering anvendt på den isolerte konformer.

I dette henseendet beskrives også en fremgangsmåte til å identifisere og/eller måle mengden av IL-7-konformeren og/eller relaterte forurensninger i en prøve, særlig i et farmasøytisk preparat. Slike karakteriseringsmetoder kan benyttes for innledningsvis å karakterisere og kvalifisere proteinet for en terapeutisk anvendelse, i kvalitetskontrollen av farmasøytiske satser. Faktisk viser oppfinnelsen nå at det eksisterer en helt biologisk aktiv IL-7-konformer, og at nærværet av forurensninger, så som andre konformere eller IL-7-peptidfragmenter, kan forårsake høyst uønskede bivirkninger. Ifølge oppfinnelsen foreslås det således, for første gang, en fremgangsmåte til karakterisering av IL-7-holdige preparater, for å bestemme nærværet og/eller den relative mengde av den spesifikke IL-7-konformer ifølge oppfinnelsen. Foretrukne metoder benytter Western Blotting, størrelses-ekskluderende HPLC, Escherichia cofrproteinprøve (ECP), bakteriell endotoksin-prøve, Limulus Ameobocyte lysatprøve (LHL-test), kvantitativ bestemmelse av DNA, SDS-PAGE, revers fase av HPLC, ionebytter-HPLC, heparinaffinitets-HPLC, bisinokoninsyreprøve (BCA), aminosyreprøve (AAA), ELISA, UV-absorpsjonsprøve og/eller en biologisk prøve. Disse metoder kan utføres alene eller i forskjellige kombinasjoner.

Det beskrives også en fremgangsmåte til fremstilling av en IL-7-legemiddelsubstans eller et IL-7-farmasøytisk preparat, hvor fremgangsmåten omfatter i) dyrking av en rekombinant vertscelle som koder for et IL-7-polypeptid (ii) isolering av det rekombinante polypeptid for å fremstille en IL-7-legemiddelsubstans, samt (iii) kondisjonering av IL-7-legemiddelsubstansen for å fremstille et farmasøytisk preparat som er egnet for anvendelse i terapi eller vaksine, hvorved fremgangsmåten videre omfatter et trinn med identifisering, karakterisering eller måling, i legemiddelsubstansen eller det farmasøytiske preparat, mengden og/eller kvaliteten av en IL-7-konformer som beskrevet ovenfor, og nærmere bestemt et trinn med utvelgelse av legemiddelsubstansen eller det farmasøytiske preparat som inneholder, som den aktive bestanddel, mer enn 95, fortrinnsvis 98% av IL-7-konformeren.

Karakteriseringstrinnet kan utføres ved forskjellige teknikker, fortrinnsvis ved masse-spektrometrirelaterte metoder, med eller uten tryptisk spaltning, sirkulær dikroisme, NMR, spesifikk antistoffanalyse for disulfidbroer og/eller konformasjonskarakterisering. Identifi-seringen av molekylvarianter og produktrelaterte forurensninger utføres fortrinnsvis ved anvendelse av én eller flere metoder valgt blant bi-dimensjonal elektroforese, isoelektrisk fokusering og ionebytterkromatografi for de-amiderte former, størrelseseksklusjons-kromatografi og SDS-PAGE-analyse for dimere eller multimere former, samt HPLC med omvendt fase med eller uten forhåndsspaltning for forskjellige former som omfatter trunkerte former og oksiderte metioninformer.

Trinnet er særlig egnet for kvalitetskontroll av kliniske eller farmasøytiske preparater, hvorved bare preparater som inneholder mer enn 95% av den ovennevnte IL-7-konformer bibeholdes, fortrinnsvis mer enn ca. 96%, 98%, eller 99,5%.

Det beskrives også isolerte IL-7 polypeptidkonformer eller en rekombinant IL-7-konformer oppnådd ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåter, til fremstilling av et farmasøytisk preparat til forebygging eller behandling av en sykdom forbundet med en immunitetsmangel, særlig til å indusere en langvarig lymfopoiesestimulering, til å forårsake og/eller forsterke en immunrespons, særlig en antigenspesifikk immunrespons.

Det beskrives også anvendelse av en IL-7-konformer som et verktøy for eksperimentell og/eller farmakologisk anvendelse i aper.

Det beskrives også kitt for utførelse av de ovenfor beskrevet fremgangsmåter, omfattende minst én primer som er spesifikk for det optimaliserte IL-7-genet, og valgfritt et par primere og/eller en probe og/eller reagenser for en nukleinsyremangfoldiggjøringsreaksjon og/eller -antistoffer, slik som beskrevet ovenfor. Kits kan alternativt inneholde reagenser til fremstilling av et IL-7-polypeptid som beskrevet ovenfor, så som en optimalisert nukleinsyre, en vektor, en rekombinant vertscelle og/eller protokoller eller reagenser for rensing eller kvalitetskontroll av slike preparater.

EKSEMPLER

Eksempel A. Konstruksjon og ekspresjon av optimaliserte humane (h) og ape (s) IL-7-kodende nukleotidsekvenser:

Al. E . co//- ekspresion ( E . coli r JM101):

1.1. Konstruksjon av human IL- 7- kodende nukleotidsekvens:

Den humane IL-7-kodende cDNA-sekvens ble mangfoldiggjort ved polymerasekjede-reaksjon (PCR) (Mullis et al., «Methods in Enzymology», Vol 155,1987, p 335-350) av human placenta-cDNA (BioChain Inc.) under anvendelse av følgende spesifikke oligonukleotidprimere, som inneholder restriksjonsendonukleasegjenkjenningssekvenser:

Den humane IL-7-kodende DNA-sekvens oppviser i posisjon 49 etter «ATG»initierings-kodonet, et andre, formentlig «ATG», som vil kunne reagere som et andre initieringskodon i E. coli, idet dette andre «ATG» ligger etter en «pseudo Shine-Dalgarno»-sekvens (ribosombindende sekvens). For å unngå eventuell dannelse av en amino-terminal-trunkertform av r-hlL-7, ble noen av nukleotidene i den «SDS-lignende» sekvens mutert (uten modifisering av den resulterende, kodede r-hlL-7-aminosyresekvens), hvorved det ble dannet en forbedret metionyl-IL-7-kodende-DNA-sekvens som inneholdt ett eller flere foretrukne kodoner for ekspresjon i E. co//-celler.

Undertrykkelsen av den SD-lignende sekvens i den IL-7-kodende DNA-sekvens ble utført ved setedirigert mutagenese PCR under anvendelse av følgende oligonukleotidprimere:

Mangfoldiggjøringen og undertrykkelsen av den SD-lignende sekvens kan realiseres i ett eneste trinn under anvendelse av de ovenfor angitte oligonukleotidprimere.

PCR-produktene ble prøvd ved polyakrylamid- eller agarosegelelektroforese i nærværet av etidiumbromid og visualisering ved fluorescens av DNA-bånd stimulert ved UV-stråling. Et eneste hovedproduktbånd av størrelse som svarte til IL-7-PCR-fragmentet ble isolert og insatt i plasmidvektoren pCR ll-TOPO (Invitrogen) under anvendelse av TA-kloningsmetoden. Ligeringsproduktene ble transformert inn i TOP10-kompetente celler (Invitrogen). For å velge positive kloner ble plasmid-DNA, fremstilt av dyrkede, individuelle kanamycinresistente bakteriekloner ved Plasmid Miniprep Isolation-teknikkene (Biorad), analysert ved restriksjonskartlegging og bekreftet ved dideoksy-sekvensering (Sanger et al., «Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA», Vol 74,1977, p 5463-5467) av et asymmetrisk PCR-produkt DNA under anvendelse av pCR II TOPO universelle primere (Invitrogen) som sekvenserende primere.

For å konstruere den endelige ekspresjonsvektor som koder for Met-human IL-7-polypeptidet, ble plasmid-DNA fra en positiv klon spaltet med restriksjonendonukleaser BamH\ og A/del, og det resulterende fragment, r-hlL-7-kodende DNA-sekvens, ble insatt mellom BamH\- og A/del-restriksjonssetene i en ptac-vektor.

Dette ekspresjonsplasmid ble konstruert ved å erstatte T7-promoteren med en tac-promoter i en klassisk pET-vektor avledet av pBR322. For dette formål ble tac-promoteren først mangfoldiggjort under anvendelse av pMAL-p2X (Biolabs) som en matrise og nukleotider:

Det oppnådde PCR-fragment ble lastet på en agarosegel for å kontrollere dets riktige størrelse. Det ble deretter spaltet med Bg/ll og Xba\ og insatt i pET9a (Novagen) hydrolysert med de samme enzymer. Det oppnådde ligeringsprodukt ble transformert inn i TOP10 (Invitrogen)-kompetente celler og selektert på deres kanamycinresistens. Den oppnådde ptac-vektor ble deretter kontrollert ved spalting med atskillige enzymer og ved sekvensanalyse under anvendelse av oligonukleotider ptad og ptac2 som sekvenseringsprimere.

Ligeringsproduktene, som inneholdt r-hll_-7-fragment, ble transformert inn i TOP10-kompetente celler. Valget av plasmidholdige celler var på basis av det antibiotika-(kana-mycin)-resistente markørgen båret på vektoren. Plasmid-DNA fra en positiv klon ble isolert fra dyrkede celler, valgt ved restriksjonskartlegging, og den korrekte DNA-sekvens ble bekreftet ved sekvensanalyse under anvendelse av pET universelle primere som sekvensprimere (Novagen) samt som en ptac-spesifikk primer:

SEQ ID NO:11:ptac-promoterprimer

Det endelige E. co/A-ekspresjonsplasmid som inneholdt SEQ ID NO:1, benevnt ptac-hlL-7 (se dessuten Fig. 1) ble subklonet i E. coli JM101-celler (ATCC).

1. 2 Konstruksjon av ape- IL- 7- kodende nukleotidsekvens

a) Mangfoldiggjøring og sekvensering av simian IL-7-cDNA som inneholder 5'region. Den simian IL-7-kodende cDNA sekvens (Macaca Mulatta Rhesus-ape) ble oppnådd fra

rhesus-apenyre cDNA (BioChain Inc.) under anvendelse av PCRmangfoldiggjøring (Mullis et al., «Methods in Enzymology», Vol 155,1987, p 335-350). Grunnstrategien var å mangfoldiggjøre ape-IL-7-cDNA ved PCR med spesifikke oligonukleotidprimere som ble anvendt til å mangfoldiggjøre human IL-7-cDNA (SEQ ID NO:5: IL75' og SEQ ID NO:6: IL73'). Et eneste bånd fremkom ved gelelektroforese (se Fig. 6). Asymmetriske PCR'er og sekvensering gjorde det mulig å oppnå ape-IL-7-sekvensen. Sekvenshomologianalyse

mellom IL-7-DNA fra mennesket og ape og aminosyresekvenser viste 98,1% og 96,6% homologi-identitet for hhv. DNA (se Fig. 4) og aminosyre (se Fig. 5sekvenser).

b) Konstruksjon av ape IL-7-kodende nukleotidsekvens.

Som den humane IL-7-sekvens oppviser den simian IL-7-kodende DNA-sekvens i

posisjon 49 etter «ATG»-initieringskodonet et andre, formentlig «ATG» som vil kunne virke som et andre initieringskodon i E. coli idet dette andre «ATG» gås foran av en «pseudo Shine-Dalgarno»-sekvens (ribosombindende sekvens). For å unngå evnt. dannelse av en aminoterminal trunkert form av r-slL-7, ble noen av nukleotidene i den «SD-lignende» sekvens mutert (uten modifisering av den resulterende, kodede r-slL-7-aminosyresekvens) hvorved det ble dannet en forbedret metionyl-IL-7-kodende DNA-sekvens som inneholdt ett eller flere foretrukne kodoner for ekspresjon i E. coli- ceWer.

Mangfoldiggjøringen av den ape-IL-7-kodende DNA-sekvens som manglet den SD-lignende sekvens ble utført ved setedirigert mutagenese PCR under anvendelse av oligonukleotidprimere: SEQ ID NO:7: mutlL75'og SEQ ID NO:6: IL73').

PCR-produktene ble analysert ved polyakrylamid- eller agarosegelelektroforese i nærværet av etidiumbromid og visualisering ved hjelp av fluorescens av DNAbånd stimulert ved UV-stråling. Et eneste hovedproduktbånd av størrelse som svarte til IL-7-PCR-fragmentet (se Fig. 7) ble isolert og insatt i plasmidvektoren pCR-ll-TOPO (Invitrogen) under anvendelse av TA-kloningsmetoden. Ligeringsproduktene ble transformert i TOP10-kompetente celler. For å velge positive kloner ble plasmid-DNA, fremstilt av dyrkede, individuelle, kanamycinresistente, bakteriekloner ved Plasmid Miniprep Isolation-teknikker, analysert ved restriksjonskartlegging og bekreftet ved dideoksysekvensering (Sanger et al., «Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA», Vol 74,1977, p 5463-5467) av en asymmetrisk PCR-produkt-DNA under anvendelse av pCR II TOPO universalprimere (Invitrogen) som sekvenseringsprimere, noe som ga slL-7-sekvenser inneholdende ca. 700 baser.

Plasmid-DNA fra en positiv klon ble spaltet med restriksjonsendonukleaser BamH\ og A/del, og det resulterende fragment, r-slL-7-kodende DNA-sekvens, ble insatt i ptac-vektor, slik som beskrevet i Eks. 1.1, som også ble spaltet med BamH\- og A/del-restriksjonsseter. Ligeringsproduktene ble transformert inn i TOP10-kompetente celler. Utvelgelsen av plasmidholdige celler var på basis av det antibiotika (kanamycin)-resistente markørgen som ble båret på vektoren. Plasmid-DNA fra en positiv klon ble isolert fra dyrkede celler, valgt ut ved restriksjonskartlegging og bekreftet ved sekvensanalyse under anvendelse av universell T7-terminatorprimer på den ene side og ptac-promoterprimer på den annen side som sekvenseringsprimere.

Det endelige E. co/A-ekspresjonsplasmid som inneholdt SEQ ID NO: 12, benevnt ptac-slL7opt (se Fig. 2), ble subklonet inn i E. coli JM101 -celler.

A2. Pattedvrekspresion ( BHK- celle- ekspresion, eller CHO- celle- ekspresion eller HEK293- celle- ekspresion): Den humane, IL-7-kodende cDNA-sekvens ble mangfoldiggjort ved poly-merase-kjedereaksjon (PCR) (Mullis et al., 1987 «Methods in Enzymology», Vol 155, pp 335-350) av human placenta-cDNA (BioChain Inc.) under anvendelse av oligonukleotider som primere i forsøk på å mangfoldiggjøre de aktuelle deler av cDNA: IL-7-cDNA-fragmentene som i 5'-enden var bundet til det naturlige IL-7-signalpeptid.

Det ble anvendt følgende oligonukleotider, som inneholder restriksjonsendonukleasegjenkjenningssekvenser og kozak-sekvens:

PCR-produktene ble testet ved polyakrylamid- eller agarosegelelektroforese i nærvær av etidiumbrom og visualisering ved hjelp av fluorescens av DNA-bånd stimulert med UV-stråling (se Fig. 8). Produktbåndet av den størrelse som svarte til IL-7-PCR-fragmentet, betegnet «hPSIL-cDNA», ble isolert og insatt i plasmidvektoren pCR ll-TOPO (Invitrogen) under anvendelse av TA-kloningsmetoden. Ligeringsproduktene ble transformert inn i TOP10-kompetente celler. For å velge positive kloner ble plasmid-DNA fremstilt av dyrkede, individuelle bakteriekloner som var ampicillinresistente med Plasmid Miniprep Isolationrteknikker (Biorad), analysert med restriksjonskartlegging og bekreftet ved dideoksysekvensering (Sanger et al., «Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA», Vol 74,1977, p 5463-5467) av et asymmetrisk PCR-produkt-DNA under anvendelse av pCR II TOPO universalprimere som sekvenseringsprimere. Plasmid-DNA fra en positiv klon ble spaltet med restriksjonsendonukleaser Hind\\\ og BamH\, og det resulterende fragment, «hPSIL-7 cDNA»-fragment, ble insatt inn i pcDNA3.1(+)-vektor polylinker (Invitrogen), som var blitt spaltet med BamH\- og Hindlll-restriksjonsseter. Denne vektor inneholdt et gen for utvelgelsen og mangfoldiggjøringen av kloner. Ligeringsproduktene ble transformert inn i TOP10-kompetente celler. Utvelgelsen av plasmidholdige celler var på basis av det antibiotika-(ampicillin)-resistente markørgen som ble båret på vektoren. Plasmid-DNA fra en positiv klon ble isolert fra dyrkede celler, valgt ut ved restriksjonskartlegging og bekreftet ved sekvensanalyse under anvendelse av pcDNA3.1(+) universelle primere som sekvenseringsprimere (Invitrogen). Ekspresjonssystemet var utformet til å uttrykke et IL-7-protein som var forutsagt av translasjonen av den naturlige, humane IL-7-gensekvens. Utvelgelse av rekombinante, vektorholdige celler ble utført på basis av markørgenet som var antibiotikaresistent (ampicillin for kloning i E. coli og Neomycin for ekspresjon i pattedyrceller) og som ble båret på vektoren.

Pattedyrekspresjonsvektoren (HEK-293, CHO eller BHK) som inneholdt SEQ ID NO:3, benevnes pcDNA-hPSIL-7 (se Fig. 3). Ekspresjon av humant IL-7 i HEK-293 eller CHO-transfekterte celler ble oppnådd ved anvendelse av ekspresjonsvektoren pcDNA-hPSIL-7. Etter linearisering ved hjelp av Bg/ll, ble ekspresjonsvektor, pcDNA-hPSIL-7, transfektert inn i pattedyrvertscellene under anvendelse av fremgangsmåter som er kjente for fagfolk på området. Den valgbare markør som ble anvendt til å etablere stabile transformanter var G418 (Invitrogen).

A3. Induserbar pattedvrekspresion ( HEK293, HEK «T- REX»- 293, «T- REX»- Hela. «T-REX»- CHO, «T- REX»- Jurkat- cellelinier>: Den humane IL-7-kodende cDNA-sekvens ble isolert fra pcDNA-hPSIL-7 ved spalting med restriksjonsendonukleaser Hind\\\ og SamHI. Det resulterende «hPSIL-7 cDNA»-fragment ble renset på agarosegel og insertert i pcDNA4/TO (Invitrogen) hydrolysert med de samme enzymer. Ligeringsproduktene ble transformert inn i TOP10F'-kompetente celler (Invitrogen). Utvelgelsen for plasmidholdige celler var på basis av det antibiotika-(ampicillin)-resistente markørgen som ble båret på vektoren. Plasmid-DNA fra positive kloner ble isolert fra dyrkede celler, kontrollert ved restriksjonskartlegging og bekreftet ved sekvensanalyse under anvendelse av universelle CMV-forover og BGH-reverse primere.

Ekspresjonssystemet ble utformet til å uttrykke, etter induksjon med tetracyklin eller analoger, et IL-7-protein som ble forutsagt ut fra translasjonen av den naturlige, humane IL-7-gensekvens.

Utvelgelsen for rekombinante vektorholdige celler ble utført på basis av markørgen, som var antibiotikaresistent (ampicillin for kloning i E. coli og zeocin for ekspresjon i pattedyrceller og som ble båret på vektoren).

Den induserbare pattedyrekspresjonsvektor benevnes ph T-PSIL7h (se Fig. 14). Ekspresjon av humant IL-7 i HEK-293-, HEK, «T-REX»-293-, «T-REX»-HeLa-, «T-REX»-CHO eller «T-REX»-Jurkat-transfekterte celler ble oppnådd under anvendelse av ekspresjonsvektoren phT-PSIL7h. Etter linearisering ved hjelp av Pvul, ekspresjonsvektor, phT-PSIL7h, transfektert inn i pattedyrvertsceller under anvendelse av fremgangsmåter som er kjente for fagfolk på området. Den valgbare markør som ble anvendt til å etablere stabile transformanter var zeocin (Invitrogen). Etter den første utvelgelse, for å øke PSIL7-sekvenskopitallet i cellene, ble stabile kloner retransfektert ved hjelp av det samme plasmid eller ved hjelp av den samme type plasmid (avvik ved utvelgelsesmarkøren): PSIL7 insertert i pcDNA5/T0 (Invitrogen).

A4. Transient pattedvrekspresion via et adenovirus i A549.HeLa. VERO, BHK eller CHO- celler: Den humane IL-7-kodende cDNA-sekvens ble mangfoldiggjort ved polymerase-kjedereaksjon (PCR) (Mullis et al., «Methods in Enzymology», Vol 155, 1987, p 335-350) fra pcDNA-hPSIL-7 under anvendelse av oligonukleotider som primere i forsøk på å mangfoldiggjøre det interesserende cDNA (IL-7cDNA koblet til dets naturlige signalpeptid) mellom EcoRV og Mlu\ restriksjonsseter.

Følgende oligonukleotider ble anvendt:

PCR-produkter ble prøvd ved agarosegelelektroforese i nærværet i etidiumbromid og visualisering ved hjelp av fluorescens av DNA-bånd stimulert med UV-stråling. Det oppnådde produktbånd, som svarte til den forventede størrelse av hPSIL-7-cDNA, ble isolert og insatt i plasmidvektoren pCRII-TOPO (Invitrogen) under anvendelse av TA-kloningsmetoden. Ligeringsproduktene ble transformert inn i TOP10F'-kompetente celler. For å velge positive kloner ble plasmid-DNA-minipreparater (Biorad), fremstilt fra dyrkede, individuelle bakteriekloner, analysert ved restriksjonskartlegging og bekreftet ved dideoksysekvensering (Sanger et al., «Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA», Vol 74, 1977, p 5463-5467) under anvendelse av pCRII-TOPO universalprimere.

Plasmid-DNA fra en positiv klon ble spaltet med restriksjonsendonukleaser EcoRV og Mlul. Det resulterende «hPSIL-7 cDNA»-f rag ment ble insertert i pAdenoVator-CMV5(CuO)

(Q Biogene) og hydrolysert med de samme enzymer. Ligeringsproduktene ble transformert inn i TOP10F'-kompetente celler (Invitrogen). Utvelgelsen for plasmidholdige celler var på basis av det antibiotika (kanamycin)-resistente markørgen som ble båret på vektoren. Plasmid-DNA fra positive kloner ble isolert fra dyrkede celler, kontrollert ved restriksjonskartlegging og bekreftet ved sekvensanalyse under anvendelse av følgende primere:

For konstruksjon av den rekombinante adenovirusvektor ble det oppnådde pAVc-PSIL7h (se Fig. 15) linearisert ved hjelp av Pmel, renset på agarosegel og kotransformert med pAdenoVatorAE1/E3 inn i BJ5183 kompetente celler (Q Biogene). Utvelgelsen for rekombinante plasmidholdige celler var på basis av det antibiotika (kanamycin)-resistente markørgen som ble båret på vektoren. Plasmid-DNA fra positive kloner ble isolert fra dyrkede celler, kontrollert ved restriksjonskartlegging. Den rekombinante adenovirusvektor ble deretter mangfoldiggjort ved transformasjon av DH5a-kompetente celler, utsådd på LB/kanamycin-plater, og midipreparering (Macherey Nagel) av DNA fra cellekulturer.

Den sterile Pad-lineariserte, rekombinante adenovirus DNA (AdVc-PSIL7h DNA) ble anvendt til å transfektere QBI-293A-celler, effektive celler til å utgjøre komplementet til det rekombinante adenovirus og danne rekombinante viruspartikler.

A5. Pattedvr- ko- ekspresion av IL- 7 og BcIXL ( BHK- celle- ekspresion, eller CHO- celle-ekspresion eller HEK- 293- celle- ekspresion): Den humane IL-7-kodende cDNA-sekvens ble isolert fra pcDNA-hPSIL-7 ved spalting med restriksjonsendonukleaser Hind\\\ og BamHU. Det resulterende «hPSIL-7-cDNA»-fragment ble renset på agarosegel og insertert, nedstrøms for pCMV-promoteren, i pBudCE4.1-vektoren (Invitrogen), som var blitt spaltet med Hind\\\ og SamHI-restriksjonsseter.

Den humane BcIXL-kodende cDNA-sekvens ble mangfoldiggjort ved polymerasekjede-reaksjon (PCR) (Mullis et al., «Methods in Enzymology», Vol 155, 1987, p 335-350) fra humane Raji-lymfeceller cDNA (Clontech) under anvendelse av følgende oligonukleotider som primere:

PCR-produktene ble prøvd ved polyakrylamid- eller agarosegelelektroforese i nærværet av etidiumbromid og visualisering ved fluorescens av DNA-bånd stimulert ved UV-stråling. Produktbåndet av størrelse som svarte til BcIXL-PCRfragmentet ble isolert og innsatt i plasmidvektoren pCR ll-TOPO (Invitrogen) under anvendelse av TA-kloningsmetoden. Ligeringsproduktene ble transformert inn i TOP10-kompetente celler. For å velge positive kloner ble plasmidDNA, fremstilt fra dyrkede, individuelle, ampicillinresistente bakteriekloner ved Plasmid Miniprep Isolation-teknikker (Biorad), analysert ved restriksjonskartlegging og bekreftet ved dideoksysekvensering (Sanger et al., «Proceedings of the National Academy og Science of the USA», Vol 74, 1977, p 5463-5467) av et asymmetrisk PCR-produkt-DNA under anvendelse av PCR II TOPO universalprimere som sekvenseringsprimere.

Plasmid DNA fra en positiv klon ble spaltet med restriksjonsendonukleaser Noti og BstBI, og det resulterende fragment ble insertert, nedstrøms for pEF1a-promoteren, inn i pBudCE4.1-hpSIL-7-vektor som var blitt spaltet med Noti og BstBI-restriksjonsseter.

Den resulterende pattedyrekspresjonsvektor (HEK-293, CHO eller BHK) som inneholdt SEQ ID NO:3, 16 eller 18, benevnes pBud-hPSIL-7-BclXL (se Fig. 17).

Eksempel B. Fermentering av E. coli- produserende rekombinant IL- 7

Fermenteringer for produksjon av rekombinant (humant eller ape) IL-7 ble utført i 80 I fermentor (New Brunswick) under anvendelse av en E. coli JM101 vertsstamme transformert med ekspresjonsplasmid ptac-hlL-7 eller ptac-slL7opt som beskrevet i Eks. A1. 1 I inokuleringskultur ble aseptisk overført til en fermentor som inneholdt 10 I satsmedium NRJ18 (pH7). Kulturen ble dyrket i en sats (t=37°C, omrøring: 100-500 omdr./min., D.02: 30%). Fermenteringens produksjonsfase ble utløst ved hjelp av IPTG (200 mg/l) etter at D.02hadde nådd 0% inntil OD-600 i kulturen var ca. 40. Fermentorinnholdet ble samlet og avkjølt i minst 30 min. for å nå en temperatur på under 20°C. Kulturmediet ble filtrert under anvendelse av et 70 nm filter (PALL R1F-700) for å fjerne bunnfallene, og celler ble høstet ved sentrifugering (Beckman J6) ved 5000 g i 30 min. ved 4°C.

For induserbare kloner vil under dyrkingen i 10 dager celler daglig tatt fra perfusjons-reaktoren og innført ved hjelp av tetracyklin i en satsreaktor.

Eksempel C. Fermentering av HEK- 293- celler som produserer rekombinant hlL- 7

Den mest stabile positive klon, som i Eks. H2, ble tilpasset til en serumfri suspensjons-kultur ved atskillige mediescreeninger for å produsere en klon som var optimalisert for produktet og vekst i en kultur med høy celletetthet. Celledyrking ble utført i en 3 I bio-reaktor med et perfusjonssystem. Cellene fikk vokse til en konsentrasjon på 10 millioner celler/ml. Reaktoren ble drevet med en kontinuerlig perfusjonshastighet på ca. 3 l/dag i 10 dager. Ca. 30 I serumfritt kultur-medium som inneholdt rekombinant protein ble dannet og anvendt som utgangsmateriale for rensingen av r-hlL-7.

Eksempel D. Rensing av rekombinant IL- 7- produkt uttrykt i E . coli

De høstede celler ble som i eksempel B suspendert i Tris 20 mM/EDTA 10 mM buffer (pH8) og sentrifugert ved 16900 g i 45 min. ved 4°C. Etter 2 suksessive/vaske/- sentrifugeringssykluser ble inklusjonslegefraksjoner utvunnet.

Denne inklusjonslegefraksjon ble tynnet for å oppnå en proteinkonsentrasjon på 5-6 mg/ml og gjort løselig i en løseliggjørende buffer (8 M guanidin hydroklorid -1 mM EDTA - 1% b-merkaptoetanol - 0,5% DMDAP - 10 mM natriumfosfat - pH8), noe som ga en fullstendig reduksjon, denaturering og løseliggjøring av proteinet. Løsningen ble tynnet 1,6-foldig i 6,25 mM natriumfosfatbuffer og justert med 1,5 M ammoniumsulfat, pH7. Sluttkonsentrasjonen av guanidin-hydroklorid nådde 5M.

De oppløste inklusjonslegemer ble forhåndsfiltrert og deretter lastet inn i en HIC butyl 650M (Toso Haas)-søyle ekvilibrert med en buffer (6,25 mM natriumfosfat - 5 M guanidin-hydroklorid - 1,7M ammoniumsulfat - pH7). Etter anbringelse av prøven og vasking av søylen med den samme buffer ble eluering utført i ett trinn med 100% elueringsbuffer (6,25 mM natriumfosfat, 5 M guanidin-hydroklorid, pH 7). Alle fraksjoner ble oppsamlet, slått sammen og justert til en optisk tetthet, 280 = 0,5 ved tynning i 6,25 mM natriumfosfat pH 7, 5 M guanidinhydrokloridbuffer. I dette trinn ble forskjellige forurensninger, bl.a. DNA, som ville ha senket utvinningen i det etterfølgende refoldingstrinn, fjernet. IL-7 fikk renaturere ved tynning i refoldingsbufferen: de sammenslåtte fraksjoner fra HIC ble tynnet 2,5 fold i 83,3 mM Tris-buffer, 0,16% «Tween» 80, 0,5 M L-arginin, 0,166 mM oksidert glutation og 1,6 mM redusert glutation pH 8,5. Tynningsprosessen ble utført lineært over et tidsrom på 21 under omrøring av den mottakende buffer. Renatureringstrinnet ville kunne utføres festet på en fast bærer.

Renaturert IL-7 ble lastet 2 ganger enten på membranfilter eller i en G25 «Sephadex»

(Pharmacia)-søyle som var likevektsinnstilt med elueringsbuffer (20 mM natriumfosfat, 0,2 M L-arginin, pH 7) og eluert for å muliggjøre skikkelig lasting av IL-7 på den etterfølgende affinitetsbærer.

Proteintoppen som ble oppnådd i G25-trinnet ble lastet på en Heparin Sepharose Fast Flow (Pharmacia)-søyle som var likevektsinnstilt med en buffer (20 mM natriumfosfat, 50 mM natriumklorid, pH 7). Etter anbringelse av prøven og vasking av søylen med bufferen ble eluering utført i 2 trinn. Først ble et fast forhold med 25% elueringsbuffer (20 mM natriumfosfat, 1 M natriumklorid, pH 7)/buffer anbrakt over 20 søylevolumer. Deretter ble refoldet IL-7 eluert i 1 trinn med 60% elueringsbuffer/lastebuffer. Den sterke selektivitet i dette trinn førte til eluering av den riktig refoldede r-IL-7-konformer.

For å eliminere det meste av restforurensningene, inklusive endotoksiner, ble fraksjonen justert til pH 5 og utsatt for en søyle av karboksymetyl og keramikk (BioSepra). Denne søyle ble likevektsinnstilt med lastebuffer (50 mM natriumacetat, pH 5). Etter anbringelse av prøven og vasking av søylen med vaskebuffer (50 mM natriumacetat, 0,2 M natriumklorid, pH 6) ble eluering utført i 1 trinn med buffer (50 mM natriumacetat, 0,8 M natriumklorid, pH 6). Avslutningstrinn kan også omfatte et rensetrinn i G25 «Sephadex» for avsalting etterfulgt av et Q Sepharose Fast Flow (QFF Pharmacia)-trinn som holdt tilbake de forskjellige restforurensninger. R-IL-7-legemiddelsubstans ble utvunnet ren i gjennomstrømningen slik som vist i Fig. 9, som representerere SDS-PAGEanalyse: coomassie-blåfarget og sølvflekket.

Eksempel E. Rensing av rekombinant, humant IL- 7- produkt uttrykt i HEK- 293celler

Rå cellekulturvæske, dannet ved vekst av ekspresjonssystem HEK-293-pcDNA-hpSIL-7 slik som rapportert i Eks. C, ble behandlet ved å benytte en tradisjonell tilnærming eller en «Streamline» ionebyttermodus.

I en «Streamline»-prosess ble rå cellekulturvæske overført direkte fra fermentoren til det utvidede sjikt av «Streamline»-ionebytter eller heparin, eller Sulfopropyl (SP) eller dietyl-aminoetyl (DEAE), etterfulgt av en kombinasjon av IEX og HIC. Avsluttende trinn kan omfatte filtrering og konsentrering. I en tradisjonell tilnærming ble rå cellekulturvæske klarnet ved anvendelse av en kombinasjon av filtrering/og konsentrerings [mikrofiltrering (0,45 nm) ultra/diafiltrering] trinn for å isolere produktet. Den oppnådde proteinløsning ble lastet på en ionebytterkombinasjon og Heparin Sepharose [Fast Flow (Pharmacia)-søyle] i forskjellige kombinasjoner for å rense produktet.

Avslutningstrinn kan også omfatte et rensetrinn med hydrofob vekselvirkningsutbytting (HIC) og f i I tre ri ng/u Itraf i Itre ri ng (UF) eller karboksymetyl/keramikk (BioSepra) for å fjerne restforurensninger, etterfulgt av et «Sephadex» G25 rensetrinn for avsalting, etterfulgt av Q Sepharose Fast Flow (QFF Pharmacia) som holdt tilbake forskjellige restforurensninger. R-IL-7-legemiddelsubstans ble utvunnet ren i strømmen gjennom det siste rensetrinnet.

Eksempel F. Produktkontroller og - spesifikasjoner

F1. Legemiddelsubstanskontroller og -spesifikasjoner:

F2. Eksempel Lot X r. hIL-7-satsresultater

Karakterisering og bevis for struktur av denne konformer omfattet en aminosyreanalyse, en peptidkartlegging etter tryptisk spalting, aminoterminaldelens sekvens, kontroll av molekylvekten ved massespektrometri (MALDI TOF), massespektrometrikontroll av disulfidbroene, samt proteinprofiler ved: SDS-PAGE sølvflekking, HPLC med revers fase, kationbytter HPLC, størrelses-ekskluderende HPLC.

F3. Peptidkartleqqinq

Peptidsekvenser var i overensstemmelse med forventede sekvenser etter en tryptisk spalting av r-hll_-7

F4. Massespektrometri. MALDI- TOF: Proteinmolekvlvekt

Gjennomsnittlig proteinmasse med én sats [M+H]<+>. Målingen ga en molekylmasse på 17517,6 Da mot en teoretisk verdi på 17518,4 Da.

F5. Massespektrometri. MALDI- TOF: Sulfhvdrvlqrupper Masse av monoisotopiske peptider satset 1 gang [M+H]<+>.

Eksempel G. Prøve på biologisk aktivitet av rekombinant IL- 7 in vitro:

IL-7 fra pattedyr (menneske og ape) uttrykt i E. coli (Eks. A1), renset ogkarakterisertsom

i Eks. D, ble prøvd og sammenlignet med IL-7 fra mus (R&D System) for deres evne til å stimulere proliferasjonen av IL-7-avhengige cellelinje betegnet pre-B-cellelinje PB1 (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Tyskland), en cellelinje som var avledet av beinmargceller fra CBA/C57BL-mus.

Også «urent» r-IL-7 fra mennesket og ape, dannet ved anvendelse av trinn med delvis denaturering eller ved kjemisk behandlet, renset r-IL-7 for å danne ca. 20% deamidert IL-7-form eller dimerform, ble prøvd.

PB-1-cellelinjen er absolutt avhengig av eksogent IL-7 forfortsatt vekst og levedyktighet. Tilsetningen av r-IL-7 til disse dyrkede cellelinjer stimulerer en doseavhengig proliferasjon, noe som muliggjør en kvantitativ bestemmelse av nærværende nivåer av r-IL-7. Mengden proliferasjon måles ved «pulsering» av hver mikrobrønn med tritiumbehandlet thymidin 3H-TdR i 41 ved 37°. Deling av pre-B-celler vil inkorporere 3H-Tdr i deres DNA. Cellene fra hver brønn høstes deretter på glassfiberfilterplater som fanger DNA. Mengden spesifikt bundet radioaktivitet måles deretter i en væskescintillasjonsteller. Antallet tellinger pr. min.

(cpm) for hver brønn er direkte proporsjonal med mengden proliferasjon av de aktiverte pre-B-celler i respons på IL-7.

Alle IL-7-proteiner var aktive på pre-B-cellelinjen fra mus som angitt i Fig. 10.

Eksempel H. Prøver for detektering av antistoffer mot rekombinant IL- 7 i serum;

Humant, rekombinant IL-7 er heterologt for apemodeller og kan indusere nøytraliserende antistoffer mot rekombinant, human IL-7-konformer (som beskrevet ovenfor). Disse antistoffer kan funksjoneres som inhibitorer in vivo og kan bidra til de immunsuppressive virkninger av legemiddelsubstansen. På denne basis ble anti-IL-7-antistoffer undersøkt i serum og plasma fra dyr behandlet med r-hlL-7 eller rent r-slL-7 (ifølge den foreliggende oppfinnelse) eller urent r-slL-7 som beskrevet i de etterfølgende eksempler.

Fremgangsmåtene som ble benyttet for detekteringen av antistoffer i kroppsvæsker kan omfatte cytokinbiologisk prøve, immunometrisk prøve, radioligandprøve og forskjellige blottingsteknikker. Plasmakvantifiseringen av anti-r-IL-7antistoffer ble oppnådd ved anvendelse av ELISA-teknikk, og den serologiske detektering av anti-r-IL-7-antistoffer ble realisert ved anvendelse av Western Blot-teknikk. Disse teknikker er kjent for fagfolk på området.

H1. ELISA- prosedvre:

ELISA-strimmelplate ble belagt med r-IL-7 (fra menneske eller ape) tynnet i blokkingsbuffer som inneholdt «Tween» med 0,75 ng/ml. Etter inkubering natten over ved 4°C ble metningen av platen utført med blokkingsbuffer i 1 t ved rt. Etter fjerning av all løsning og vasking av platen med vaskebuffer, var platen klar for anvendelse til prøven.

Serietynninger av preimmun og immunplasma ble utført og dispensert i brønner. Plate ble inkubert i 1 t ved 30°C. Positiv kontroll (biotinylert IL-7antistoff) og negativ kontroll (serum eller placebo-ape) ble testet og i spesifikke brønner. Plate ble deretter vasket med vaskebuffer og inkubert ved rt i 30 min. med IgG-ape-HRP tynnet i blokkeringsbuffer/- «Tween» for serum- og negativ kontroll. Positive kontrollbrønner ble inkubert med streptavidin-HRP i blokkeringsbuffer/«Tween». Etter fjerning av løsningen ble platen vasket med vaskebuffer og inkubert ved rt i opptil 15 min. med OPD-substratløsning etterfulgt av tilsetning av svovelsyre i hver brønn for å stoppe reaksjonen.

Absorbansen ble deretter avlest ved 492 nm.

H2. Western Blot- prosedvre

Rekombinant IL-7 (fra menneske eller ape) ble overført på nitrocellulose- eller PVDF-membran. Deretter ble membranen inkubert med sera fra behandlede dyr (tynning 1/100 eller 1/200) eller med anti-IL-7-antistoff (antihumant IL-7antistoff: AB 207 NA, R&D System) for den positive kontroll. Etter fjerning av løsningen ble membranen vasket og inkubert med det sekundære antistoff: anti-ape-lgG-alkalisk fosfatasekonjugat (SIGMA A1929) eller Anti-geit IgG alkalisk fosfatasekonjugat (SIGMA A4187) for den positive kontroll. Deretter ble avsløringen utført under anvendelse av BCIP/NBT (SIGMA).

Eksempel I. In wVo-effekter av r-IL-7 på CD4 T-celletall i normal, ikke-human primatmodell Rekombinant IL-7 (fra menneske og ape) uttrykt i E. coli (Eksempel A1), renset ogkarakterisertsom i Eksempel D, og «urent» r-slL-7 (som definert i Eksempel G) ble testet for in wVo-biologisk aktivitet i normale primater. Denne primatmodell var den eneste mulige modell for testing av langtidsaktiviteten til legemiddelsubstansen og immuniseringsevnene til den samme legemiddelsubstans forurenset med molekylære varianter og/eller lege-middelproduktrelaterte forurensninger. Å teste den samme effekt i gnagere ville være resultatløst: for det første pga. at gnagersekvenser viser en viktig delesjon sammenlignet med primatsekvenser, for det andre pga. at i gnagere, har IL-7 en sterk lymfopoietisk effekt på B-celler, ømfintlig for å maskere den T-celle-lymfopoietiske effekt eller hindre en klar, diskriminerende analyse av denne effekt. Av denne årsak måtte for å bevise effekten i primater mens??? mens uetisk testing av et immunogent preparat i mennesker unngås, klones ape-IL-7 og uttrykkes og renses og testes i aper.

Unge Macaca rhesus-aper ble studert i 4 grupper (1-4), hvor hver gruppe inneholdt 3 dyr. Aper i:

• gruppe 1 mottok placebo (IL-7-tynner)

• gruppe 2 mottok r-hlL-7 (ifølge oppfinnelsen) i en dose på 150 ug/kg administrert 1 gang daglig ved subkutan injeksjon i 4 uker • gruppe 3 mottok r-slL-7 (ifølge oppfinnelsen) i en dose på 150 ug/kg administrert 1 gang daglig ved subkutan injeksjon i 4 uker gruppe 4 mottok 1 daglig subkutan administrering av «urent» r-slL-7 i en dose på 150 ug/kg i 4 uker.

Alle dyr ble studert i 4 uker: 4 uker med behandling og 2 uker reverserbarhetsperiode. Perifere blodprøver ble innsamlet fra dyr under ketamintvang før og etter IL-7behandling (på dager 0 (forbehandling), 7,14, 21, 28, 35 og 42)). CD4-cellularitet ble undersøkt i et FACScan-celleanalysesystem (Becton Dickinson). Serumprøver ble undersøkt for nærvær av antistoffer ved Western Blot-analyse og bekreftet ved ELISA-analyse, slik som beskrevet i H.

Blod CD4 T-celletall er angitt i Fig. 11, representert som et gjennomsnitt av blod-CD4 T-celletall for hver gruppe.

Alle dyrene overlevde protokollen og tålte IL-7-administrering uten skadelige reaksjoner mot IL-7-terapi.

De forskjellige IL-7 som ble administrert hadde en moderat effekt på blod CD4 T-celletall

hos normale aper: perifert blod-CD4 T-celletall økte fra 1,4 til 2,1 ganger fra dag 14 til dag 35 og ble værende over forbehandlingsverdier på dag 42 i gruppe 3 (behandlet med r-slL-7) sammenlignet med placebogruppe, og CD4-cellularitet begynte å øke og avtok deretter fra uke 2 til 6 i gruppene 2 (behandlet med r-hlL-7) og 4 (behandlet med «urent» r-slL-preparat).

Anti-IL-7-antistoffer ble detektert i sera fra disse 2 grupper aper (2 og 4) i den andre uke etter mottak av hhv. r-hlL-7 og «urent» r-slL-7 ved subkutan injeksjon (se Fig. 12). I disse normale aper utløste den gjentatte injeksjon av heterolog eller uren IL-7-legemiddelsubstans forekomsten av anti-IL-7-antistoffer, og samtidig frembrakte dette en sterk minskning av IL-7-lymfopoietiske effekt.

Eksempel J. In vivo- aktivitet av r- slL- 7 i bestrålte aper

Rekombinant ape-IL-7 uttrykt i E. coli (Eksempel A1), renset ogkarakterisertsom i Eksempel D, og urent r-slL-7 (som definert i Eksempel G) ble testet for middels og langvarig in wVo-biologisk aktivitet i immundepressive primater. Unge rhesus-aper ble studert i 3 grupper (1-3), hvor hver gruppe inneholdt 3 dyr.

Alle dyr gjennomgikk total kroppsbestråling (TBI) (6.1 Gy).

Aper mottok følgende regimer:

• gruppe 1 mottok placebo (IL-7-tynner)

• gruppe 2 mottok r-slL-7 (ifølge den foreliggende oppfinnelse) i en dose på 70 ug/kg administrert 1 gang daglig ved subkutan injeksjon i 4 uker med start på dag 14 etter bestråling • gruppe 3 mottok 1 daglig subkutan administrering av «urent» r-slL-7 i en dose på 70 ug/kg i 4 uker med start på dag 14 etter bestråling.

Alle dyr ble studert i 10 uker, 10 uker for hematologisk rekonvalesensperiode, 4 uker for IL-7-behandlingsperiode og 4 uker oppfølgingsperiode.

Blodprøver for CD4 T-celletall ble innsamlet fra dyrene under ketamintvang på dagene 0, 7 og 14 med forbehandling, 21, 28, 35 og 42 med behandling og 49, 56, 63 og 70 etter stråling.

CD4-cellularitet ble undersøkt i FACScan-celleanalysesystem (Becton Dickinson), og serumprøver ble undersøkt for nærvær av antistoffer under anvendelse av ELISA- og Western Blot-teknikker slik som beskrevet i Eksempel H.

Alle dyr overlevde protokollen og viste ingen skadelige reaksjoner på IL-7behandlingen.

Som vist i Fig. 13 økte IL-7-administrering CD4 T-cellene vesentlig (2,4-fold) i det perifere blod i de immunrepressive aper i grupper 2 og 3 sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe. Gruppe 3 som var behandlet ved subkutan administrering av «urent» r-slL-7 oppviste en minskning av den in wVo-biologiske effekt av IL-7, som startet etter fra 3-4 uker med IL-7-behandling.

Anti-IL-7-antistoffer ble målt i serumet fra disse dyr hver uke etter begynnelse av IL-7-behandling. Anti-IL-7-antistoffer ble ikke detektert opp til uke 10 (8 ukers etterbehandling) i gruppe 2 som var behandlet med r-s-IL-7 ifølge oppfinnelsen. Derimot viste gruppe 3, som var behandlet med et urent preparat, påvisbare antistoffer så tidlig som uke 6 (4 uker etter begynnelse av IL-7behandling). I uke 10 var antistoffer klart til stede, og eksogent IL-7

hadde ingen lymfopoietisk effekt.

Eksempel K. In wVo- aktivitet av rekombinant humant IL- 7 på farmakodynamiske parametere og totalt lymfocytt- tall i normale cynomolgusaper

Rekombinant hunant IL-7 (r-hlL-7) uttrykt i E. coli (Eksempel A1), renset ogkarakterisertsom i Eksempel D ble testet for in wVo-biologisk aktivitet på farmakodynamiske parametere og totalt lymfocytt-tall i normale cynomolgusaper. 4 normale hunn-cynomolgusaper mottok subkutant, bolus 1 injeksjon av løselig r-hll_-7 i et dosenivå på 100 ng/kg.

Alle dyr ble studert i 961.

Laboratorieundersøkelser (hematologi og fenotypebestemmelse) ble utført før 1 injeksjon av r-hlL-7 og 6, 24, 48, 72 og 961 etter injeksjon.

Cellularitet og immunfenotypebestemmelse av lymfocyttundersett ble undersøkt ved strømnings-cytometri under anvendelse av meget spesifikke celleoverflateantistoff-markører som omfattet: CD3, CD4, CD8, CD20, CD127, Ki67 samt Bcl2 i forskjellige kombinasjoner.

Observerte variasjoner i lymfocytt-tall og spesifikke markører er rapportert i tabellen nedenfor, og i histogram angitt som figur...:

Etter 1 injeksjon av r-hlL-7:

- en tydelig minskning i lymfocytt-tall, CD3+-T-celler, CD4+- og CD8+-under-sett i perifert blod ble iakttatt så tidlig som 6 t og opptil 72 t. Celletallene vendte tilbake til basislinjeverdier ca. 96 t etter injeksjonen. Dette fall i perifere lymfocyttall er i overensstemmelse med en tidlig IL-7-indusert trafikkering av T-lymfocytter fra blod mot lymfoidvev, - en markert, men forbigående minskning i IL-7-reseptor-alfakjede (CD127)-ekspresjon ved perifere lymfocytter ble iakttatt 481 etter injeksjonen, noe som reflekterer en nedmodulering av IL-7-reseptor som reaksjon på én eneste dose av IL-7. CD127-ekspresjon begynte å opptre igjen etter 48 t og kom tilbake til basislinjeverdier 96 t etter injeksjonen, - en forsinket, men vesentlig økning av Ki67-ekspresjon, som er en markør av celleproliferasjon, ble iakttatt både på CD4+- og CD8+-celler opptil 72/96 t etter injeksjonen, - en forsinket økning av Bcl-3, som er en markør av apoptoseinhibering, ble iakttatt og viste seg å være involvert i IL-7-aktivitet.

Variasjonene av de 3 sistnevnte markører viste at den eneste injeksjon av r-hll_-7 indu-serte en respons av T-celler, med vesentlige effekter over 481, detekterbare opptil 72/961. Som vurdert ut fra perifere blodlymfocytt-tall er disse forandringer av cellefenotyper delvis maskert ved T-cellemålsøking.

Av disse data fremgår det at en daglig administrering av r-IL-7 ikke er det mest egnede doseregimet. 1 gang hver annen dag til 1 gang ukentlig synes å være et mer egnet doseregime for mennesker.

Claims

1. Farmasøytisk sammensetning omfattende IL-7 og én eller flere farmasøytisk kompatible eller akseptable bærere, eksipienter eller fortynningsmidler,karakterisert vedat hvor minst 98 vekt% av den totale mengde av IL-7 i sammensetningen består av en IL-7 konformer som omfatter følgende tre disulfidbroer: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) og 3-6 (Cys47-Cys141).

2. Sammensetning i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte IL-7 konformer er en rekombinant human IL-7 konformer.

3. Sammensetning i samsvar med krav 2,karakterisert vedat nevnte IL-7 konformer omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO: 2 eller 4

4. Sammensetning i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte IL-7 konformer er en rekombinant simian IL-7 konformer.

5. Sammensetning i samsvar med krav 4,karakterisert vedat nevnte IL-7 konformer omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO: 12.

6. Sammensetning i samsvar med ethvert av kravene 1-5,karakterisertved at nevnte IL-7 konformer ikke er glykosylert.

7. Sammensetning i samsvar med ethvert av kravene 1-5,karakterisertved at nevnte IL-7 konformer er glykosylert.

8. Sammensetning i samsvar med ethvert av kravene 1-7,karakterisertved at nevnte IL-7 konformer er assosiert til hepatocytt vekstfaktoren som en heterodimer.

9. Sammensetning i samsvar med ethvert av kravene 1-7,karakterisertved at nevnte IL-7 konformer er funksjonelt tilfestet til en Fc-del av en IgG tungkjede gjennom en peptid hengselregion, hvor nevnte IgG er en human lgG1 eller lgG4.

10. Sammensetning i samsvar med ethvert av kravene 1-7,karakterisertved at nevnte IL-7 konformer er funksjonelt assosiert til en Human Serum Albumin (HSA) eller en porsjon av HSA som et fusjonsprotein.

11. Sammensetning i samsvar med ethvert av kravene 1-10,karakterisertved at sammensetningen er fri for en ytterligere IL-7 konformer.

12. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-11,karakterisertved at den totale mengde basert på vekt av nevnte IL-7 konformer er minst 99,5 vekt% av den totale mengde av IL-7 i sammensetningen.

13. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-12,karakterisertved at den omfatter en farmasøytisk kompatibel bærer valgt blant sukrose, trehalose og en aminosyre.

14. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-13,karakterisertved at den omfatter en farmasøytisk kompatibel bærer inneholdt i en egnet buffer slik at det etableres en isotonløsning.

15. Sammensetning i samsvar med krav 14,karakterisert vedat nevnte egnete buffer har et pH-område mellom 5 til 7,5, fortrinnsvis 6 til 7, enda mer foretrukket ca. 6,5.

16. Sammensetning i samsvar med krav 15,karakterisert vedat nevnte egnete buffer er et organisk salt valgt blant en natriumsitrat buffer og en annomiunacetat buffer.

17. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-16,karakterisertved at nevnte sammensetning er en lyofilisert form.

18. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-17,karakterisertved at nevnte sammensetning omfatter et protein (fortrinnsvis humant serum albumin) og/eller en surfaktant (fortrinnsvis Tween 80).

19. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-18,karakterisertved at sammensetningen omfatter et immunstimulerende middel valgt blant en hematopoietisk cellevektsfaktor, et cytokin, et antigen og en adjuvant, eller en kombinasjon derav, for kombinert, separat eller sekvensvis anvendelse.

20. Sammensetning i samsvar med krav 9,karakterisert vedat nevnte hematopoietiske cellevekstfaktor er valgt blant stamcellefaktor (SCF), fortrinnsvis den løselige form av SCF, G-CSF, GM-CSF, Fit-3-ligand, IL-15 og IL-2.

21. Sammensetning i samsvar med krav 19,karakterisert vedat nevnte cytokin er valgt blant y<->interferon, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 og MIP-1a.

22. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-21,karakterisertved at nevnte antigen er valgt blant et syntetisk eller naturlig peptid, et rekombinant protein, et drept, inaktivert eller attenuert patogent produkt, et lipid, en porsjon derav og en kombinasjon derav.

23. Sammensetning i samsvar med krav 22,karakterisert vedat nevnte antigen er valgt blant antigener avledet fra HIV, Varicella Zostervirus, influensavirus, Epsten Barr virus, type 1 eller 2 Herpes Simplex virus, human cytomegalovirus, Dengue virus, hepatitt A, B, C eller E-virus, Syncytium respiratorisk virus, humant papillomavirus, mycobakterium tuberkulosis, Toxoplasma og klamydia.

24. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-23,karakterisertved at nevnte adjuvant er valgt blant enhver substans, blanding løsning eller sammensetning som fremmer eller øker immunogenisiteten av et antigen og som er i stand til å indusere en Th1-type immunrespons, så som CpG, QS21, ISCOM og monofosforyl lipid A.

25. Farmasøytisk sammensetning i samsvar med et av kravene 1-24, for administrering til et menneske for profylaktisk eller terapeutisk stimulering av B eller T-lymfocyttutvikling og -proliferasjon, eller for forsterking av global eller spesifikk immunrekonstituering, eller for forsterking av humorale eller cellulære immunresponser.

26. Farmasøytisk sammensetning i samsvar med et av kravene 1-24, for å hindre eller redusere opportunistiske infeksjoner i immunundertrykte pasienter.

27. Farmasøytisk sammensetning i samsvar med et av kravene 1-24, for å forlenge lymfopoiesestimulering og/eller for å produsere spesifikke immunresponser og/eller for å utvide repertoaret av en spesifikk immunrespons i mennesker.

28. Farmasøytisk sammensetning i samsvar med krav 25, 26 eller 27, for anvendelse i pasienter som er immunsvekkede pasienter, cancerpasienter, pasienter som undergår transplantasjoner, pasienter infisert med et virus eller en parasitt, eldre pasienter eller enhver pasient som har et lavt CD4-tall.

29. Sammensetning i samsvar med et av kravene 1-28, for anvendelse i en effektiv mengde av IL-7 som er i området mellom 3 til 300 ug/kg/dag, fortrinnsvis mellom 10 til 100 ug/kg/dag, og som fortrinnsvis administreres en gang per dag, to ganger eller tre ganger i uke, og ned til kun én gang i uken.

30. Fremgangsmåte for å produsere en farmasøytisk sammensetning som definert i et av kravene 1-29,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: a) å tilveiebringe en prøve som omfatter IL-7 polypeptider, b) rense en IL-7 konformer som omfatter følgende tre disulfidbroer: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129) og 3-6 (Cys47-Cys141) for å produsere en IL-7 medikamentsubstans, og c) valgfritt, måle eller kvantifisere, i medikamentsubstansen, nevnte bestemte IL-7 konformer.

31. Fremgangsmåte i samsvar med krav 30,karakterisert vedat nevnte prøve oppnås fra rekombinante prokaryote eller eukaryote vertsceller som produserer IL-7 polypeptider.

32. Fremgangsmåte i samsvar med krav 31,karakterisert vedat nevnte prøve er (eller avledet fra) en kultur av prokaryote vertsceller som koder for et IL-7 polypeptid og hvor fremgangsmåten ytterligere omfatter, før trinn b): i) behandling av nevnte prøve for å forårsake en fullstendig denaturering av nevnte IL-7 polypeptider, ii) valgfritt rense det denaturerte polypeptid oppnådd i trinn i), og iii) refolde polypeptidene

33. Fremgangsmåte i samsvar med krav 32,karakterisert vedat trinn i) omfatter oppløsning av inklusjonslegemer i en denaturerende buffer.

34. Fremgangsmåte i samsvar med krav 32 eller 33,karakterisert vedat trinn ii) utføres med hydrofob kromatografi, ionebytte eller invers fase kromatografi.

35. Fremgangsmåte i samsvar med krav 33,karakterisert vedat nevnte hydrofobe kromatografi implementeres ved anvendelse av HIC butyl.

36. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 32-35,karakterisertved at trinn ii) utføres ved en pH i området mellom 6 og 9, fortrinnsvis mellom 7 og 8,5 inkluderende.

37. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 32-36,karakterisertved at nevnte trinn b) omfatter utførelse av en affinitetskromatografi.

38. Fremgangsmåte i samsvar med krav 37,karakterisert vedat nevnte affinitetskromatografi utføres på en kolonne av sulfaterte polysakkarider.

39. Fremgangsmåte i samsvar med krav 38,karakterisert vedat nevnte sulfaterte polysakkarid er dekstransulfat eller heparin.

40. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 30-39,karakterisertved at IL-7 konformeren erkarakteriserti medikamentsubstansen med massespektrometri, infrarød spektrometri, NMR, ved å bestemme sirkulær dikroisme, ved å måle affinitet mot et spesifikt monoklonalt antistoff rettet mot nevnte IL-7 konformer, eller heparinaffinitetskromatografi, og målt eller kvantifisert med ELISA, bioassay eller affiniteten av nevnte IL-7 konformer for IL-7 reseptor og enhver fremgangsmåte for proteinkvantifisering appliseres til den isolerte konformer.