NO323554B1 - Bakteriell fermenteringsprosess for fremstilling av et rekombinant protein, samt fremgangsmate for reduksjon av naeringsutfelling i en prosess. - Google Patents

Description

Bakgrunnen for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører en bakteriell fermenteringsprosess for fremstilling av et rekombinant protein. Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for reduksjon av næringsutfelling i en prosess.

Fremskritt innen molekylærbiologi og utforskningen av rekombinante DNA fremgangsmåter har gjort fremstilling av betydelige mengder av fremmede proteiner i bestemte vertscellesystemer mulig. Rekombinante proteiner fremstilles i verts-cellesystemene ved transfektering av vertscellene med DNA som koder for proteiner av interesse, etterfulgt av dyrkning av de transfekterte vertsceller under tilstander som tillater uttrykk av nytt rekombinant protein. Bestemte bakterielle verts-systemer kan anvendes for fremstilling av store mengder rekombinante proteiner som normalt er tilgjengelige i begrensede mengder fra naturlige kilder.

Prokaryoten Escherichia coli. er en bakterie som har vært grundig undersøkt. E. coli er vanligvis valgt for anvendelse i vertscellesystemer med høy ekspresjon, delvis fordi E. coli-celler har en tendens til å være mer medgjørlig ved fremstilling av meget store mengder av rekombinant protein. Vertscellesystemer som gjør anvendelse av eukariote vertsceller og gjærvertsceller har vanskelig for å fremstille rekombinant protein i de samme store mengder som det som kan fremstilles i høyekspresjonsvertscellesystemer som E. coli. Utvikling av fermenteringsprosesser i høy celletetthet har dessuten resultert i økt volumetrisk produktivitet av rekombinante produkter i E. coli. Yee og Blanch, Biotechnology and Bioengineerinq, 41: 221-230 (1993).

Fermenteringsprosessen som er anvendt for å fremstille rekombinante proteiner i vertscellesystemer, slik som E. coli-systemet, utføres i fysisk avgrensede beholdere (f.eks. fermentorer, reaktorer). Beholdere med omrøring representerer de mest populære utformingene av fermentorer, selv om et økende antall av kar med andre fysiske former er utviklet. Måter for fermentordrift kan falle inn i enhver av de følgende kategorier: diskontiuerlig drift {satsprosess), (2) kontinuerlig drift eller (3) ulike typer av semi-kontinuerlig drift, slik som tilføringssatsprosess. Avhengig av driftsmåte og anvendt vertscellesystem, må en definert, balansert sats og/eller næringsmedium planlegges slik at cellevekst og uttrykk av rekombinant protein kan tillates. Mediet kalles "minimalt" dersom det kun inneholder næringsstoffer som er essensielle for vekst. For E. coli-systemet må minimalmediet omfatte en kilde av karbon, nitrogen, fosfor, magnesium og spormengder av jern og kalsium. Gunsalus og Stanter. The Bacteria, Vol.l, Chapter 1 Academic Press Inc., N.Y. (1960). I de fleste minimalmedier anvendes glukose som karbonkilde, ammonium som nitrogenkilde og ortofosfat (f.eks. PO4) som fosforkilde. Det ideelle næringsmediet for cellevekst vil omfatte en eksakt mengde av hvert næringsstoff som forbrukes i løpet av cellevekst, slik at ingen næringsmidler akkumuleres til hemmende nivåer, eller slik at cellene har underskudd på noen næringsmidler. Thompsom et al., Biotechnoloqy and Bioengineering, 27: 818-824 (1985). Et teoretisk balansert mini-malnæringsmiddelmedium for E. coli er tidligere utviklet for anvendelse i ristekolber med lav celletetthet (celletettheter opp til 1,5 g celler tørr vekt/liter). Neidhardt et al., Journal of Bacteriology, 119: 736-747 (1974).

I tillegg til den kjemiske sammensetning av mediet må virkningene av flere andre miljømessige parametre, slik som pH, tid, dyrkningstemperatur og partialtrykk av oppløst oksygen vurderes med omhu. Optimal pH for vekst av E. coli er f.eks. pH = 7,0. I løpet av fermenteringsprosessen kan pH i mediet forandres som følge av forbruk av ammonium eller mik-roorganismesyntese av bestemte metabolske produkter, f.eks. eddiksyre og melkesyre. Etter som forandret pH kan være ufor-delaktig for optimal cellevekst, er det viktig å opprettholde en viss pH i mediet og dette kan oppnås ved syre- og basetil-setning. pH og andre prosessparametre kan kontrolleres manuelt eller ved hjelp av en automatisk anordning.

Ved fermenteringer med høy celletetthet (f.eks. de som oppnår celletettheter > 20 g tørrvekt av celler/liter) må det anvendes et konsentrert medium. Operatører som utfører fermenteringer med høy celletetthet har funnet ut at når man arbeider med konsentrerte næringsmedier, dannes bunnfall når den fosfatinneholdende løsning blandes med løsninger inneholdende andre næringskomponenter. Bunnfallet som dannes i næringsmediet omfatter bunnfall av ortofosfater og inkluderer NH4MgP04, (Mg)3(PC>4)2 og metallfosfater i form av (Me)n(P04)m (der Me ■ Fe, Ca, Zn, Cu, Co). Disse forbindelsene har meget lav løselighet i vann. Dean, John A., Lange' s Handbook of Chemistry, 12. utgave, McGrawHill, New York, side 7-12 (1979). Mengde av bunnfall kan variere avhengig av pH, glukosekonsentrasjon og konsentrasjon av mediekomponenter.

Dannelse av bunnfall kan lede til mange problemer i næringsmediet og i fermentoren. Bunnfall i næringsmediet kan f.eks. føre til en ikke-homogen næringstilførsel (som følge av utfelling av presipitat i næringskar eller tilføringsrør) og næringsbrist i cellene med hensyn til viktige næringsmidler som ikke lenger er løst. Bunnfallet kan også forstyrre næringsstoff pumpene og rør og muligens tette tilførselsrørene.

I fermentoren vil utfelling skje dersom mediet ikke er perfekt balansert med hensyn til cellevekst. Bunnfall i fermentoren kan forårsake tetting av luftsprederen i fermentoren, føre til ikke-homolog blanding (f.eks. setter bunnfallet seg i lavere nivåer i fermentoren) og redusere tilgjen-geligheten av løste næringsstoffer for cellene. Konsentrasjonen av næringsstoffer tilgjengelig for cellene blir således avhengig av grad av næringsmiddeltap som følge av dannelse av bunnfall sammenlignet med grad av næringsmiddelopptak av cellene. Disse virkningene kan løses ved automatisk tilsetning av syre og base for pH-kontroll. Alle disse betingelser redus-erer reproduserbarheten av fermenteringsprosessen. Tilstede-værelsen av presipitater kan dessuten innvirke på protein-rensingen og fremtvinge anvendelse av ekstra rensingstrinn for å separere bunnfallet fra produktet.

I kommersiell sammensetning må problemet med bunnfall reduseres, slik at fermenteringsprosessen kan praktiseres. En foreslått måte å forebygge bunnfelling av næringsstoff i minimalmedium er tilsetning av EDTA og sitrat, slik at metall-ionene i næringsmediet chelateres. Pirt, S.J., Principles of Microbe and Cell Cultivation, side 134 (1975). Det anbefales imidlertid ikke å tilsette chelateringsmiddler, etter som disse stoffene ikke metaboliseres. Derimot akkumuleres de og øker osmolariteten av det cellulære miljø. Høy osmolaritet har skadelig virkning på cellulær metabolisme. Gousebet et al., Journal of Bacteriology, 175: 214-221 (1993). Høye konsentrasjoner av chelateringsstoffer kan også skade cellemem-braner. Ryan et al., Biotechnoloqy and Bioengineering, 37: 430-444 (1991).

I tysk patentsøknad Nr. 290, 212 A5 (innlevert 28. juli 1988) beskriver Riesenberg et al. en fremgangsmåte for fremstilling av et minimalmedium med glukose for anvendelse ved fermetering av store E. coli-kulturer for erholdelse av rekombinante DNA-produkter. Minimalmediet beskrevet av Riesenberg et al. ble laget for å overvinne de store utfellingspro-blemene som normalt oppstår når man arbeider med slike medier. Mediet som er beskrevet i søknaden tilveiebringer ortofosfater som fosforkilde og eliminerer ikke fullstendig næringsutfelling; men det fremviser i stedet lav turbulens som følge av liten bunnfalldannelse.

Bortsett fra diskusjonen ovenfor, står det ingenting i litteraturen vedrørende problemet med effektiv eliminiering av næringsmiddelutfelling i medier ved fermentering i høy celletetthet. Det eksisterer fortsatt et behov for en fremgangsmåte for reduksjon av utfelling i en sats og/eller et næringsmedium der utfelling ikke skjer når alle bestanddeler er blandet (blandet ved nøytral pH for E. coli) og som sikrer at utfelling ikke vil dannes i fermentoren i løpet av prosess-eringen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en slik fremgangsmåte ved anvendelse av natriumfosfatglass som fos-forkilde i det konsentrerte næringsmedium. Til forskjell fra fremgangsmåtene antydet i de ovennevnte motholdte referanser, tilveiebringer fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, tre fordeler i form av: (1) de tillater utforming av konsentrert, fullstendig balanser sats og/eller næringsmedium uten bunnfall; (2) de har evne til å metaboliseres av E. coli; og (3) de tillater økt celletetthet og veksthastigheter. De praktiske fremgangsmåtene ifølge foreliggende, oppfinnelse er anvendbare ved ulike bakterielle fermenteringer, spesielt ved

fermenteringsprosesser med høy celletetthet.

Europeisk patent nr. 378 478 beskriver generelt fermentering av meieriprodukter ved hjelp av melkesyre-bakterier og angir at tilsetning av polyfosfatsalt og citrat-salt oppløser casein. Europeisk patent nr. 181 769 beskriver en næringssammensetning som stimulerer vekst av aerobe bakterier og inneholder bestemte konsentrasjoner av tri-polyfosfat og ortofosfat. U.S. patent nr. 4 906 575 og U.S. patentnr. 4 947 932 beskriver et bakterienæringsmedium som inneholder en metaboliserbar fosfatforbindelse som danner chelater med tunge metallioner, og injeksjon av bakterier med slikt medium inn i en petroleumsdannels.e. Rao et al., J. Bacteriol. 1988, vol. 170, nr. 11, 5216-5223, beskriver dyrkning av E. coli i medium inneholdende lineære polyfosfater. Ingen av disse publikasjoner beskriver anvendelse av fosfatglass i dyrkningsmediet for å underbygge høye bakterie-celletettheter.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører en bakteriell fermenteringsprosess for fremstilling av et rekombinant protein, kjennetegnet ved at den omfatter blanding av et fosfatglass som en fosforkilde til et næringsmedium under fermenteringsproduksjonssyklusen av proteinet, hvori utfelling av fosfat reduseres sammenlignet med celler dyrket i medium uten fosfatglass, og hvori prosessen omfatter fermentering ved en celletetthet på > 20 g celletørrvekt/liter. Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for reduksjon av næringsutfelling i en prosess, kjennetegnet ved at den omfatter tilsetning av fosfatglass med en kjedelengde på ca. fi = 4 til ca. fl = 20 som en fosforkilde til et næringsmedium under fermenteringsproduksjonssyklusen av E. coli som uttrykker et rekombinant protein, hvori prosessen er en fermenteringsprosess ved en celletetthet på > 20 g celletørrvekt/liter. Denne fremgangsmåte utelukker overraskende nok dannelse av bunnfall i mediene og resulterer i økt celletetthet ved van-lige betingelser.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1.viser celletetthetsprofiler fra forsøk C

og forsøk D (o-o), som viser at anvendelse av fosfatglass som fosforkilde i medier fører til en økt celletetthet i forhold til dét' erholdt ved anvendelse av ortofosfat som fosfatkilde. Celletetthet ble målt ved anvendelse av et Perkin-Eimer M35 spektrofotométer og OD6oo ble plottet mot tid.

Detaljert beskrivelse

Fremgangsmåtene hvorved bestemte næringsstoffer i næringsmedierie kontrolleres og justeres for å kontrollere metailfosfatut.felling i løpet av fermenteringsprosessen, er beskrevet mer i detalj i diskusjonen under og er illustrert av eksemplene tilveiebrakt under. Eksemplene viser at alternative fosfatkilder kan anvendes ved fermenteringer i høy celletetthet, for å eliminere utfelling av næringsstoffer. Resultatene er overraskende etter som satsene med høy celletetthet og tilsetningssatsfermenteringer, ved anvendelse av glassaktig natriumfosfat som fosfatkilde i konsentrert sats og/.eller næringsmedium, eliminerte metallfosfatutfelling i mediene og resulterte i økte celletettheter i fermenteringene.

Fermenteringsprosesser involvert i fremstilling av rekombinante proteiner gjør anvendelse av en driftsmåte, som faller innen en av de følgende kategorier: (1) diskontinuerlig (satsprosess) drift, (2) kontinuerlig drift og (3) semikontinuerlig (tilføringssats) drift. En satsprosess er karakterisert ved inokulering av det sterile kulturmedium (satsmed-ium) med mikroorganismer i start av prosessen, dyrket i løpet av en avgrenset reaksjonsperiode. Under kultivering forandres cellekonsentrasjoner, substratkonsentrasjoner (C-kilde, næringssalter, vitaminer etc.) og produktkonsentrasjoner. God blanding sikrer at det ikke er noen signifikante lokale forskjeller i sammensetning eller temperatur i reaksjonsblan-dingen. Reaksjonen er ikke-stasjonær, og celler dyrkes inntil vekstbegrensende substrat (generelt karbonkilden) er fortært.

Kontinuerlig drift er karakterisert ved at ferskt kulturmedium (næringsmedium) tilsettes kontinuerlig til fermentoren og forbrukt medium og celler fjernes kontinuerlig fra fermentoren i samme hastighet. I en kontinuerlig drift er dyrkningshastigheten bestemt av mediumtilsetningshastigheten, og dyrkningsutbyttet er bestemt av konsentrasjonen av det dyrkningsbegrensende substrat (f.eks. karbonkilden). Alle reaksjonsvariabler og kontrollparametere forblir konstant over tid, og derfor etableres en tidskonstant tilstand i fermentoren, som fører til konstant produksjon og utbytte.

Semikontinuerlig drift kan anses som en kombinasjon av sats og kontinuerlig drift. Fermenteringen settes i gang med en satsprosess, og når det vekstbegrensende substrat er fortært tilsettes et kontinuerlig næringsmedium, inneholdende glukose og mineraler på en spesiell måte (tilsetningssats). Med andre ord, denne drift gjør anvendelse både av et sats-medium og et næringsmedium for å oppnå cellevekst og tilstrek-kelig fremstilling av det ønskede protein. Ingen celler tilsettes eller tas ut i løpet av dyrkningsperioden, og av denne grunn drives fermentoren satsvis med hensyn til mikroorganismer. Mens foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved ulike prosesser, deriblant de som er nevnt ovenfor, foretrekkes anvendelse i forbindelse med en tilsetningssatsprosess.

I hver av de ovennevnte prosesser kan cellevekst og produktakkumulering kontrolleres indirekte ved å utnytte fordelen av en korrelasjon mellom metabollttdannelse og enkelte andre variabler, slik som pH i mediet, optisk tetthet, farge og titrerbar surhet. Optisk tetthet tilveiebringer f.eks. en indikasjon på akkumuleringen av uløselige cellepar-tikler og kan kontrolleres i beholderen ved anvendelse av en mikro-OD-enhet, koblet til en anvisningsanordning eller en registrerer eller utenfor beholderen ved prøvetagning. Avles-ninger av optisk tetthet ved 600 nanometer (OD600) anvendes for å bestemme cellenes tørrvekt.

Fermenteringer i høy celletetthet beskrives generelt som prosesser som resulterer i et utbytte >20 g celletørr-vekt/liter (ODeoo >30). I alle fermenteringsprosesser i høy celletetthet anvendes et konsentrert næringsmedium som er jevnt målt inn i fermentoren ved hjelp av en "tilføringssats"-prosess. Et konsentrert næringsmedium er krevet for prosesser i høy celletetthet, for å minimalisere fortynningen av fermen-torinnholdet i løpet av tilsetningen. En tilsetningssatsprosess er påkrevet etter som denne tillater operatøren å kontrollere karbonkildetilsetning, noe som er viktig etter som cellene eksponeres for konsentrasjoner av karbonkilde som er høye nok til å generere høye celletettheter, vil cellene produsere såpass mye hemmende biprodukt, acetat, at veksten vil stoppe. Majewski og Domach, Biotechnoloqy and Bioengineerinq, 35: 732-738 (1990).

Standard reaksjonsbetingelser for fermenteringsprosessen, anvendt for fremstilling av rekombinante proteiner, omfatter generelt opprettholdelse av pH fra ca. 5,0 til 8,0 og dyrkningstemperaturer mellom 20 og 50 °C for E. coli. I foreliggende oppfinnelse vil en foretrukket utførelsesform, der E. coli anvendes som vertssystem, ha en optimal pH på ca. 7,0 og optimal dyrkningstemperatur på ca. 37 °C.

Komponentene i standard næringsmedium i disse fermen-teringsprosessene omfatter generelt en energikilde, karbon, nitrogen, fosfor, magnesium og spormengder av jern og kalsium. I tillegg kan mediet inneholde vekstfaktorer (slik som vitaminer og aminosyrer), uorganiske salter, og enhver annen for-løper som er essensiell for produktdannelse. Den elementære sammensetning av mikroorganismen som undersøkes, kan anvendes for å beregne mengden av hver komponent som trengs for å fremme cellevekst. Komponentkonsentrasjonene vil være avhengig av hvorvidt prosessen er en lavcelletetthets- eller høycel-letetthetsprosess. Glukosekonsentrasjonene i lavcelletetthets-fermenteringsprosess-satser varierer fra 1-5 g/L, mens høycel-letetthetsprosess-satser anvender glukosekonsentrasjoner som varierer fra 45 til 75 g/L.

Det er overveid å anvende mange.ulike fosfatglass som fosfatkilde i mediene, ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse. Fosfatglass er lineære polyfosfater med relativt spesialiserte anvendelsesområder. For en generell diskusjon av lineære polyfosfater, deriblant fosfatglass, se Corbridge, D.E.C., Phosphorus: An Outline of its Chemistry, Biochemistry and Technology, fjerde utgave, kapittel 3, sidene 210-302

(1990). Fosfatglass kan lages ut fra mange ulike sammenset-ninger og består hovedsakelig av en blanding av kationer og atskilte polyfosfatkjeder. Glass laget med Na<+> kationer er best undersøkt og eksisterer i kontinuerlige serier som er stabile ved normale temperaturer, fra sammensetningen P2O5 opp til 5Na20.IOOP2O5. Fosfatglass er laget ved kondensering av or-tofosfatanioner, f.eks. ved varming av NaH2PC>4 til ca. 650 °C og hurtig avkjøling. Et typisk glass fra en hurtig avkjølt smelte ved 650 °C og vanndamptrykk på 55 torr har en gjen-nomsnittlig kjedelengde på fl ■ 60 P04 tetrahedra.

Glassvarianter av natriumpolyfosfat er kommersielt tilgjengelig. Disse produseres med varierende gjennomsnitts kjedelengde (f.eks. fl = 5 til fl = 200).

Generelt er natriumfosfatglass anvendelige polyfosfater ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse.. Særlig natriumfosfatglass mellom ca. n = 2 til n = 100, og mer foretrukket er fl 4 til fl ='20 vurdert anvendt. Disse fos-fatglassene er anvendbare i foreliggende oppfinnelse ettersom: (1) deres løselighetsegenskaper er slik at konsentrerte næringsmedier kan fremstilles uten resulterende utfelling etter blanding; (2) vertscellesystemer, slik som E. coli-systemet, har nødvendige reaksjonsveier slik at fosfatglass metaboliseres; og (3) på grunn av at det ikke er noen utfelling, er alle næringsstoffer fullt ut tilgjengelige for for-tæring, noe som fører til økt celletetthet og økte vekstrater. I en foretrukket utførelsesform er et glassaktig natriumpolyfosfat med en kjedelengde på fl ■ 11 anvendt som fosfatkilde.

Foreliggende oppfinnelse er anvendbar i en prosess for å fremstille ulike rekombinante proteiner. Eksempler på undersøkte proteiner er cytokiner, deriblant ulike hemato-poetiske faktorer slik som G-CSF, SCF, EPO, GM-CSF, CSF-1, interleukiner, slik som fra IL-1 til IL-12, IGF, M-CSF, TNF eller LIF. Andre terapeutiske proteiner, slik som interferoner (alfa-, beta-, gamma- eller consensus-interferoner) og vekstfaktorer eller hormoner er også anvendbare, slik som veksthormoner fra menneske eller andre dyr (f.eks. veksthormoner fra gris eller høne) FGF, KGF, EGF og PDGF. Proteaseinhibitorer, slik som metallproteinasehemmere, er undersøkt (slik som TIMP-1/ TIMP-2 eller andre proteinasehemmere). Nervevekstfaktorer er også undersøkt, slik som BDNF og NT-3. Undersøkt er også peptiddeler av proteiner med fullstendig eller delvis lik primærstruktur som utgangsproteinet, og med minst en av de biologiske egenskapene til utgangsproteinet.

Anvendelig KGF ifølge foreliggende oppfinnelse, har generelt sekvensen til KGF fra menneske eller nært beslektede analoger derav. Publisert PCT-patentsøknad WO 90/08771 beskriver rensing av KGF fra kondisjonert medium fra en human embryogen fibroblastcellelinje, delvis aminosyresekvens av det isolerte polypeptid, kloning av genet og uttrykk i bakterielle celler (E. coli) for å oppnå'rekombinant, biologisk aktivt

KGF.

I en foretrukket utførelsesform er anvendt rekombinant vertscelle i prosessen E. coli. E. coli er et foretrukket system etter som dets genetikk er godt karakterisert, den tillater høye celletettheter og den kan dyrkes effektivt ved normale betingelser (f.eks. pH og temperatur).

Ytterligere elementer som tilveiebringer foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, omfatter nitro-genkomplekskilder, slik som gjærekstrakt og kjemiske oppløs-ninger av kaseinsoyamel, kjøtt, blod eller bomullsfrø. For en person med kunnskap på feltet, kan det forstås at foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåter for kontrollering av metallfosfatutfelling med ulike kombinasjoner av disse til-leggs elementer.

Eksempel 1

Balanserte minimalnæringsstoffer i næringsmedier, typiske for de som ville blitt anvendt for fremstilling av rekombinante proteiner i fermenteringer med høy celletetthet i E. coli, ble fremstilt ved anvendelse av alternative fosfatkilder. En "standard" minimalmediumsats {betegnet medium A) der ortofosfat ble anvendt som fosforkilde, ble sammenlignet med et medium (betegnet medium B) der Hexaphos<21>, et glassaktig natriumfosfat med en kjedelengde på n = 11 og supplert med FMC Corp., som fosforkilde, ble anvendt.

Medium A inneholdt 45 g/L glukose, 3 g/L gjærekstrakt, 1 g/L (NH4)2S04, 4 g/L K2HP04, 4,56 g/L KH2PH4, 0,71 g/L MgSCV 7H20, 0,74 g/L KC1, 4,0 mL/L spormetalløsning A (27 g/L FeCl3-6H20, 2.0 g/L ZnCl24H20, 2,0 g/L CoCl2'6H20, 2,0 g/L MnMo04<*>2H20, 1,0 g/L CaCl2'2h20, 1,9 g/L CuSCv5H20, 0,5 g/L H3BO3, 1,6 g/L MnCl2'4H20, 73,5 g/L natriumsitrat"H20) og 4 mL/L vitaminløsning A (0,06 g/L biotin, 0,04 g/L folinsyre, 1,4 g/L pyridoksin'HCl, 0,42 g/L riboflavin, 5,4 g/L pantotensyre,

6,1 g/L niacin). Medium B var identisk med Medium A bortsett fra at 3,33 g/L Hexaphos™ var anvendt som fosfatkilde istedenfor K2HP04 og KH2P04.

I løpet av sterilisering av vert medium ble glukose og magnesiumsulfat sterilisert sammen, spormetalløsning A ble sterilisert separat og de andre mediumbestanddelene (deriblant ortofosfat) ble sterilisert separat. Dette ble gjort for å forebygge uønskede bireaksjoner. For medium B ble Hexaphos™ også sterilisert separat. Når alle steriliserte mediumbestanddeler var blandet sammen i medium A, var den resulterende løsning uklar. Uklarheten skyldes tilstedeværelse av utfel-lingsreaksjoner. Medium B forble klar etter blanding.

Vekten av det resulterende bunnfall ble målt ved at det ble tatt prøver på 10 mL av mediet og filtrert gjennom to nylonfiltre med porestørrelse på 0,2 um (Nalgene, 214-4020) i en filterholder (Nalgene, 300-4100). Det andre filteret i linjen ble anvendt for å angi masseøkningen som følge av løste faste stoffer som er fanget inne i membranen. Filtrene ble lufttørket i flere timer og så fullstendig tørket i en Labware 9000 mikrobølgetørkeovn med vektskåla. Labware 9000 ble anvendt for bestemmelse av tørrvekt til filtrene før og etter at prøven var tilsatt. Resultatene er oppsummert i tabell 1 under.

Eksempel 2

Tilsetningssatsfermenteringer i høy celletetthet for fremstilling av rekombinant KGF i E. coli ble utført for å sammenligne anvendelse av fosfatglass i forhold til ortofosfat som fosforkilde i satsmediet og det konsentrerte næringsstoff-næringsmediuitr. Virkninger på metallfosfatutfellingsnivåene i mediene, i tillegg til generell celletetthet, ble bestemt. Et "standard" tilføringssatsminimalmediumforsøk (kalt forsøk C), der ortofosfat ble anvendt som fosforkilde, ble sammenlignet med et forsøk (kalt forsøk D) der Hexaphos™ ble anvendt som fosforkilde.

I forsøk C inneholdt satsmediet 5 g/L glukose, l,68g /L (NH4')2S04, 0,05 g/L K2S04, 0,36 g/L NaH2P04*H20, 0,136 g/L MgS04-7H2=, 0,008 g/L KC1, 0,78 mL/L av spormetalløsning A

(27 g/L FeCl3-6H20, 2,0 g/L ZnCl2'4H20, 2,0 g/L CoCl26H20,

2,0 g/L MnMo04'2H20, 1,0 g/L CaCl2<*>2H20, 1,9 g/L CuS04'5H20,

0,5 g/L H3BO3, 1,6 g/L MnCl2<*>4H20, 73,5 g/L natriumsitrat'H20. Forsøkt D var identisk med forsøk C bortsett fra at 0,28 g/L Hexaphos™ ble anvendt istedenfor NaH2PGvH20.

Ved forsøk C inneholdt næringsmediet 651,5 g/L glukose, 6,52 g/L K2S04, 46/91 g/L NaH2P(VH20, 17,69 g/L MgS04-7H20, 1,98 g/L KC1 og 102 ml/L av spormetalløsning A. Næringsmediet i forsøk D var identisk med det i forsøk C, bortsett fra at 37,2 g/L Hexaphos™ ble anvendt i stedet for NaH2P04.H20. Ved hvert forsøk ble-pHi næringsmediet justert til 7,0 ved tilsetning av 36 mL/L 40 % (volum/volum) NaOH-løsning.

I likhet med det som var tilfelle med det balanserte minimalnæringsstoffnæringsmediet fra eksempel 1, resulterte anvendelse av ortofosfat som fosforkilde i dannelse av utfelling etter blanding av steriliserte mediumbestanddeler. På den annen side resulterte anvendelse av Hexaphos™ ingen slik utfelling. Vekt av den resulterende utfelling ble målt ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 og resultatene er oppsummert i tabell 2 under.

Celletettheter ved forsøk C og D ble også målt. I hvert forsøk ble cellene innledningsvis dyrket satsvis i satsmediet. Etter at glukose var fortært ble en kontinuerlig tilføring, ved anvendelse av næringsmedium, igangsatt. I løpet av denne tilføringssatsdelen av fermenteringen ble tilførings-hastigheten økt til to timers intervaller med hensyn til celletetthet. I forsøk C startet veksthastigheten ved 0,08 h"<1> og avtok til 0,04 h-<1> 42 timer etter at tilføringen begynte, når celletettheten ved OD 65 var oppnådd. Etter dette avtok OD. I forsøk D steg fermenteringen i en stabil hastighet på 0,09 h"1 i 43 timer når en celletetthet på OD.92 var oppnådd. Etter dette avtok OD (se figur 1). Resultatet var en endelig celletetthet på 61 g celletørrvekt/liter for forsøk D sammenlignet med kun 43 g celletørrvekt/liter i forsøk C. Som resultat fremstilte forsøk D 180 mgs/liter KGF, mens forsøk C fremstilte 120 mgs/liter KGF.

Eksempel 3

Flere polyfosfater (med kjedelengder i området fra fl = 2 til fl = 19) ble anvendt i tillegg til Hexaphos™, som fos-forkilde, i mediumpreparater som var typiske for fermentering av E. coli i høy celletetthet.

Flere medier som inneholdt glukose:fosfor og glukose: magnesium i forhold som var typiske for det som var nødven-dig ved fermenteringer i høy celletetthet, ble laget ved blanding av konsentrert stamløsning av glukose/magnesiumsulfat (inneholdende 888 glukose/L) med konsentrerte løsninger av ulike fosforinneholdende forbindelser og vann. pH i hver løsning ble justert til pH = 7,0 ved anvendelse av enten 40 % NaOH eller 30 % HC1.

Visuelle undersøkelser av hver løsning ble gjort daglig i fem dager for å sjekke dannelse av bunnfall. Resultater er summert i tabell 3 under. Resultatene viser at anvendelse av Hexaphos™ som fosforkilde i mediet tillater anvendelse av så høye konsentrasjoner av glukose som 800 g/L, uten tilstedeværelse av bunnfall. Anvendelse av glass H™, en glassaktig natriumfosfat med en kjedelengde på n = 19, og Soda-phos™, et glassaktig natriumpolyfosfat med en kjedelengde på n = 4, tillot anvendelse av såpass store glukosekonsentrasjoner som 600 g/L. Anvendelse av ortofosfat tillot, på den annen side, en maksimum glukosekonsentrasjon på 4 62 g/L.

Disse resultater viser at ulike glassaktige natriumpolyfos-fater er effektive for eliminering av næringsmiddelutfelling i konsentrerte medier, anvendt for fremstilling av rekombinante proteiner ved fermenteringer i høy celletetthet.

Resultatene som her er presentert viser en praktisk fremgangsmåte for kontrollering av metallfosfatutfellingsreaksjoner i mediet anvendt ved bakterielle fermenteringsprosesser med høy celletetthet, og tilveiebringer en forbedret cellevekst og proteinfremstilling i forskjellige bakterielle fermenteringsprosesser med høy celletetthet.

Claims (12)

1. Bakteriell fermenteringsprosess for fremstilling av et rekombinant protein, karakterisert ved at den omfatter blanding av et fosfatglass som en fosforkilde til et næringsmedium under fermenteringsproduksjonssyklusen av proteinet, hvori utfelling av fosfat reduseres sammenlignet med celler dyrket i medium uten fosfatglass, og hvori prosessen omfatter fermentering ved en celletetthet på > 20 g celletørrvekt/liter.

2. Fremgangsmøte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte fosfatglass er utvalgt fra gruppen bestående av natriumfosfatglass med formel PO4- (PG*3)n-P04, hvori kjedelengdene er fra ca. fl = 2 til ca. n = 100.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte natriumfosfatglass har en kjedelengde fra ca. fl = 4 til n = 20.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte natriumfosfatglass har en kjedelengde på fl = 11.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fermenteringen ved høy celletetthet utvelges fra gruppen bestående av en sats fermentering, en kontinuerlig fermentering og en tilføringssatsfer-mentering. .

6. Bakteriell fermenteringsprosess for fremstilling av et rekombinant protein ifølge krav 1, karakterisert ved at celletettheten økes etter tilsetning av fosfatglass, og hvori fremgangsmåten er en fermenteringsprosess ved en celletetthet på > 20 g celletørr-vekt/liter .

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte fosfatglass utvelges fra gruppen bestående av natriumfosfatglass med kjedelengder varierende fra ca. n = 2 til fl - 100.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte natriumfosfatglass har en kjedelengde fra ca. fl = 4 til ca. n = 20.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte natriumfosfatglass har en kjedelengde på fl = 11.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte fermentering ved høy celletetthet er utvalgt fra gruppen bestående av en sats fermentering, en kontinuerlig fermentering og en tilførings-satsfermentering.

11. Fremgangsmåte for reduksjon av næringsutfelling i en prosess, karakterisert ved at den omfatter tilsetning av fosfatglass med en kjedelengde på ca. fl = 4 til ca. fl = 20 som en fosforkilde til et næringsmedium under fermenteringsproduksjonssyklusen av E. coli som uttrykker et rekombinant protein, hvori prosessen er en fermenteringsprosess ved en celletetthet på > 20 g celletørrvekt/liter.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte fosfatglass har en kjedelengde på ca. n = 11.