FI120977B - Suuren solutiheyden bakteerifermentaatioviljelmä - Google Patents
Suuren solutiheyden bakteerifermentaatioviljelmä Download PDFInfo
- Publication number
- FI120977B FI120977B FI20095510A FI20095510A FI120977B FI 120977 B FI120977 B FI 120977B FI 20095510 A FI20095510 A FI 20095510A FI 20095510 A FI20095510 A FI 20095510A FI 120977 B FI120977 B FI 120977B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- culture
- medium
- cell density
- phosphate
- high cell
- Prior art date
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000005365 phosphate glass Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 18
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 16
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 24
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 6
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 33
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 19
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 19
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 12
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 11
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 229910001463 metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 7
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000000306 component Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019982 sodium hexametaphosphate Nutrition 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 2
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 2
- -1 orthophosphate anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000824878 Gallus gallus Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100026262 Metalloproteinase inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910017621 MgSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010031374 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010031372 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 Proteins 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- GYQBBRRVRKFJRG-UHFFFAOYSA-L disodium pyrophosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O GYQBBRRVRKFJRG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010037248 lantibiotic Pep5 Proteins 0.000 description 1
- SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N lantibiotic pep5 Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N\C(=C(/C)S)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=O)CC SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005341 metaphosphate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- HDKLIZDXVUCLHQ-UHFFFAOYSA-N non-3-en-2-one Chemical compound CCCCCC=CC(C)=O HDKLIZDXVUCLHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000019830 sodium polyphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
- Treatment Of Sludge (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Suuren solutiheyden bakteerifermentaatioviljelmä Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FI 964208.
5 Keksinnön tausta Tämä keksintö liittyy sellaisiin bakteerifermen-tointiprosesseihin rekombinanttiproteiinin tuottamiseksi, joissa tiettyjä syöttöalustan ravinteita monitoroidaan ja säädetään niin että saadaan säädeltyä metallifosfaatin sa-10 ostumista alustassa. Erityisesti keksintö liittyy fermen- tointiprosessiin, jossa solutiheys on suuri ja joka sisältää menetelmän, jossa alustassa käytetään tiettyjä polyfos-faatteja ja/tai metafosfaatteja ravinteiden saostumisen eliminoimiseksi ja solutiheyden kasvattamiseksi. Erityises-15 ti keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 mukaista suuren solutiheyden bakteeritermentointivilj elmää.
Edistysaskeleet molekyylibiologiassa ja geeniteknologisten menetelmien hyödyntäminen on tehnyt mahdolliseksi vieraiden proteiinien merkittävien määrien tuotannon tie-20 tyissä isäntäsolujärjestelmissä. Rekombinanttiproteiineja tuotetaan isäntäsolujärjestelmissä transfektoimalla isän-täsolut haluttua proteiinia koodittavalla DNA:11a, ja kasvattamalla sitten transfektoituja isäntäsoluja olosuhteissa, jotka mahdollistavat uuden rekombinanttiproteiinin eks-25 pression. Tiettyjä bakteeri-isäntäsolujärjestelmiä voidaan käyttää tuottamaan suuria määriä rekombinanttiproteiineja, jotka ovat normaalisti saatavilla rajallisina määrinä luonnollisista lähteistä.
Prokaryootti Escherichia coli on laajalti tutkittu 30 bakteeri. E. coli. valitaan yleisesti käytettäväksi korkean ekspressiotason isäntäsolujärjestelmissä, osaksi koska E. coli -soluilla on taipumus soveltua paremmin rekombinanttiproteiinin äärimmäisen suurten määrien tuotantoon. Isän-täsolujärjestelmät, jotka käyttävät eukaryoottisia isän-35 täsoluja ja hiivaisäntäsoluja, eivät yleensä onnistu tuottamaan rekombinanttiproteiinia sellaisina valtavina määri- 2 nä, joita tuotetaan korkean ekspressiotason isäntäsolujär-jestelmissä kuten E. coli. Lisäksi sellaisten fermentointi-prosessien kehittäminen, joissa solutiheys on suuri, on johtanut rekombinanttiproteiinien kasvaneeseen volymetri-5 seen tuottavuuteen E. colissa. Yee ja Blanc, Biotechnology and Bioengineering, 41:221-230 (1993).
Fermentointiprosessit, joita käytetään tuottamaan rekombinanttiproteiineja isäntäsolujärjestelmissä, kuten E. coli.-järjestelmässä, suoritetaan äärellisissä fysikaali-10 sissa säiliöissä (se on: fermentoreissa, reaktoreissa). Sekoitettavat tankit edustavat suosituinta fermentoreiden geometriaa, vaikka kasvava määrä muulla tavalla fysikaalisesti muotoiltuja säiliöitä onkin kehitteillä. Fermentorin käyttötavat voivat kuulua johonkin seuraavista luokista: 1) 15 epäjatkuva käyttö (panosprosessi), 2) jatkuva käyttö tai 3) monet eri epäjatkuvan käytön tyypit, kuten fed-batch-prosessi.
Käyttötavasta ja käytettävästä isäntäsolujärjestel-mästä riippuen täytyy keksiä määrätty tasapainotettu panos-20 ja/tai syöttöalusta, joka mahdollistaa solujen kasvun ja rekombinanttiproteiinin ekspression. Määrättyä alustaa nimitetään "minimialustaksi", jos se sisältää pelkästään kasvulle välttämättömät ravinteet. E. coli -järjestelmää varten minimialustojen täytyy sisältää hiilen, typen, fosfo-25 rin, magnesiumin lähde sekä pieniä määriä rautaa ja kalsiumia. Gunsalus ja Stanter, The Bacteria, volyymi 1, kappale 1, Academic Press Inc., N.Y. (1960). Useimmat mini-mialustat käyttävät glukoosia hiilenlähteenä, ammoniakkia typenlähteenä ja ortofosfaattia (esim. P04) fosforinlähtee-30 nä. Ideaalinen alusta solujen kasvua varten sisältäisi tarkan määrän kutakin sellaista ravinnetta, joka kulutetaan solujen kasvun aikana, niin että mitkään ravinteet eivät kasaannu inhiboiviksi tasoiksi, eivätkä solut nälkiinny minkään ravinteen suhteen. Thompson ym., Biotechnology and 35 Bioengineering, 27:818 - 824 (1985). Yksi teoreettisesti tasapainotettu minimialusta E. coliIle on suunniteltu ai- 3 kaisemmin käytettäväksi ravistettavissa pulloissa, joissa solutiheys on pieni (solutiheydet korkeintaan 1,5 g solun kuivapainoa/litra). Neidhardt ym., Journal of Bacteriology, 119:736-747 (1974) .
5 Alustojen kemiallisen koostumuksen lisäksi täytyy huolella harkita useiden muiden ympäristöparametrien vaikutusta, kuten pH, aika, viljelylämpötila ja liuenneen hapen osapaine. Esimerkiksi E. colin kasvulle optimaalinen pH on 7,0. Fermentointiprosessin aikana alustojen pH voi muuttua 10 ammoniakin kulutuksen vuoksi, tai sen vuoksi että mikro-organismi syntetisoi tiettyjä aineenvaihduntatuotteita, esim. etikkahappoa ja maitohappoa. Koska muuttunut pH voi olla epäsuotuisa optimaalista solujen kasvua ajatellen, on kriittisen tärkeää säilyttää alusta tietyssä pH:ssa ja tämä 15 voidaan saada aikaan lisäämällä happoa ja emästä. pH:ta ja muita prosessin parametreja voidaan monitoroida manuaalisesti tai automaattisilla laitteilla.
Fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri (se on: niissä joissa saavutetaan solutiheyksiä > 20 g solun 20 kuivapainoa/litra) , täytyy käyttää konsentroitua alustaa.
Operaattorit jotka suorittavat fermentointeja, joissa solu-tiheys on suuri, ovat havainneet että kun käytetään konsentroituja alustoja, muodostuu sakkoja kun fosfaatin sisältävä liuos sekoitetaan liuokseen joka sisältää muita ra-25 vinnekomponentteja. Sakkoihin, jotka muodostuvat alustoi hin, kuuluu ortofosfaattien saostuminen, ja näihin kuuluvat NH4MgP04, (Mg)3(P04)2 ja metallit osfaatit joilla on kaava (Me)n(P04)m (jossa Me = Fe, Ca, Zn, Cu, Co) . Näillä yhdisteillä on hyvin matalia liukoisuuksia vedessä. Dean, John 30 A., Lange's Handbook of Chemistry, 12. laitos, McGraw-Hill,
New York, sivut 7 - 12 (1979) . Saostumisen määrä voi vaihdella riippuen pH:sta, glukoosin konsentraatiosta ja alustojen komponenttien konsentraatiosta.
Sakan muodostuminen voi johtaa moniin ongelmiin 35 syöttöalustassa ja fermentorissa. Sakat syöttöalustassa voivat esimerkiksi johtaa ei-homogeeniseen syöttöön (mikä 4 johtuu sakan asettumisesta syöttöastioihin tai syöttölin-joihin) ja solujen näIkiintyrniseen niiden kriittisten ravinteiden suhteen, jotka eivät ole enää liukoisia. Sakat voivat myös naarmuttaa syöttöpumppuja ja putkia ja mahdol-5 lisesti tukkia syöttölinjat täysin.
Fermentorissa tapahtuu saostumista, jos alusta ei ole täysin tasapainossa solujen kasvua ajatellen. Saostuminen fermentorissa voi saada aikaan ilmastuslaitteen tukkeutumisen fermentorissa, johtaa ei-homogeeniseen sekoittumi-10 seen (se on: sakka asettuu alemmille tasoille fermentorissa) ja vähentää liukoisten ravinteiden saatavuutta soluille. Solujen saatavilla olevien ravinteiden konsentraatio tulee riippuvaiseksi sellaisen ravinnekadon nopeudesta, joka johtuu sakan muodostumisesta, verrattuna solujen suorit-15 tämän ravinteiden sisäänoton nopeuteen. Nämä vaikutukset voidaan sovittaa säätämällä pH:ta hapon ja emäksen automaattisen lisäyksen avulla. Kaikki nämä olosuhteet vähentävät fermentointiprosessin toistettavuutta. Lisäksi sakkojen läsnäololla voi olla vaikutusta proteiinin puhdistusvaihei-20 siin ja se voi pakottaa ylimääräisten puhdistusvaiheiden käyttöön sakan erottamiseksi tuotteesta.
Kaupallisessa ympäristössä saostumisongelmaa pitää lievittää jotta fermentointiprosessi olisi käytännöllinen. Yksi ehdotettu tapa estää ravinteiden saostuminen mini-25 mialustassa on EDTA:n ja sitraatin lisääminen metalli- ionien kelatoimiseksi alustassa. Pirt, S.J., Principles of Microbe and Cell Cultivation, sivu 134 (1975). Kelatoivien agenssien lisäyksen tarve ei ole kuitenkaan suotava, koska agenssit eivät metaboloidu. Niinpä ne kasaantuvat ja lisää-30 vät solujen ympäristön osmolaarisuutta. Korkealla osmolaa-risuudella on haitallinen vaikutus solujen aineenvaihduntaan. Gouesbet ym., Journal of Bacteriology, 175:214-221 (1993). Kelatoivien agenssien korkeat konsentraatiot voivat myös vahingoittaa solumembraaneja. Ryan ym., Biotechnology 35 and Bioengineering, 37:430-444 (1991).
5 DE-patenttihakemuksessa nro 290 212 A5 (pantu vireille 28. heinäkuuta 1988) Riesenberg ym. kuvaavat menetelmän jolla voidaan valmistaa glukoosi-minimialusta E. Colin massaviljelmäfermentointia varten yhdistelmä-DNA-5 tuotteiden hankkimiseksi. Riesenbergin ym. kuvaava mini-mialusta suunniteltiin niin että sillä voitettaisiin voimakkaan saostumisen ongelmat joita normaalisti kohdataan työskenneltäessä sellaisilla alustoilla. Patenttihakemuksessa kuvattu alusta hyödyntää ortofosfaatteja fosforinläh-10 teenä eikä eliminoi täysin ravinteiden saostumista, pikemminkin siinä sanotaan ilmenevän vain vähäistä turbulenssia mikä johtuu vähäisestä sakanmuodostuksesta.
Edellä olevaa pohdintaa lukuun ottamatta kirjallisuudesta ei löydy mitään joka koskisi sellaisten alustojen 15 valmistusta sellaisia fermentointeja varten, joissa soluti-heys on suuri, joissa eliminoitaisiin tehokkaasti ravinteiden saostumisongelma. On olemassa edelleen tarve menetelmälle, jolla voitaisiin vähentää saostumista panos- ja/tai syöttöalustassa, joka ei sisällä saostumista kun kaikki 20 komponentit sekoitetaan yhteen (sekoitetaan neutraalissa pH:ssa E. colia ajatellen), ja joka takaa sen että fermen-torissa ei muodostu mitään sakkaa prosessoinnin aikana. Tämä keksintö tarjoaa sellaisen menetelmän käyttämällä natri-umfosfaattilasia fosforin lähteenä konsentroidussa alustas-25 sa. Toisin kuin edellä siteeratuissa viitteissä esitetyt menetelmät, tämän keksinnön mukaiset menetelmät tarjoavat seuraavan kolminkertaisen edun: 1) mahdollistavat sellaisen konsentroidun, täysin tasapainotetun panos- ja/tai syöttö-alustan suunnittelun, joka ei sisällä sakkaa, 2) ovat E. 30 colin metaboloitavissa, ja 3) mahdollistavat kasvaneen solut iheyden ja kasvunopeudet. Tämän keksinnön käytännön menetelmät ovat hyödyllisiä monissa eri bakteeritermentoin-neissa, erityisesti fermentointiprosesseissa joissa soluti-heys on suuri.
β
Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö liittyy sellaiseen bakteerifermen-tointiprosessiin rekombinanttiproteiinin tuottamiseksi, jolle on tunnusmerkillistä että tiettyjä syöttöalustan ra-5 vinteita monitoroidaan ja säädetään niin että prosessin aikana saadaan torjua metallifosfaatin saostumista. Erityisesti keksintö liittyy sellaiseen fermentointiprosessiin, jossa solutiheys on suuri ja jolle on tunnusmerkillistä että konsentroitu ravinneliuos käyttää natriumfosfaattilasia 10 fosforinlähteenä. Yllättävää kyllä tämä menetelmä eliminoi sakan muodostuksen alustoissa ja saa aikaan solutiheyksien kasvua standardioloissa. Erityisesti keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 mukaista suuren solutiheyden bakteeri-fermentointiviljelmää.
15 Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 esittää solutiheysprofiilit ajosta C ( —) ja ajosta D (o-o), ja osoittaa että fosfaattilasin käyttö fosforinlähteenä alustoissa johtaa solutiheyden kasvuun siihen verrattuna joka saatiin kun fosforinlähteenä käytet-20 tiin ortofosfaattia. Solutiheys mitattiin käyttämällä Per-kin-Elmerin M35 spektrofotometriä ja ODgoo piirrettiin kuvaajaan ajan funktiona.
Yksityiskohtainen kuvaus
Menetelmät, joilla tiettyjä syöttöalustan ravintei-25 ta monitoroidaan ja säädellään niin että fermentointipro-sessin aikana saadaan torjuttua metallifosfaatin saostumista, kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä olevassa pohdinnassa ja niitä havainnollistavat jäljempänä tarjotut esimerkit. Esimerkit osoittavat, että vaihtoehtoisia fosfo-30 rinlähteitä voidaan hyödyntää fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri, ravinteiden saostumisen eliminoimiseksi. Tulokset olivat yllättäviä sikäli että panosiermentoinneissa ja fed-batch-fermentoinneissa, joissa solutiheys oli suuri, lasimaisen natriumfosfaatin käyttö fosforinlähteenä 35 konsentroidussa erä- ja/tai syöttöalustassa eliminoi alus- 7 toissa tapahtuvan metallitosfaatin saostumisen, ja tuloksena oli fermentoinneissa olevien solutiheyksien kasvu.
Rekombinanttiproteiinien tuotannossa mukana olevat fermentointiprosessit käyttävät käyttötapaa, joka kuuluu 5 johonkin seuraavista luokista: 1) epäjatkuva (panosproses- si) käyttö 2) jatkuva käyttö ja 3) puolijatkuva ("fed-batch") käyttö. Panosprosessille on tunnusmerkillistä, että steriiliin alustaan (panosalusta) ympätään mikro-organismit prosessin alussa, ja näitä viljellään tietty reaktioaika. 10 Viljelyn aikana solutiheydet, substraattien pitoisuudet (hiilenlähde, ravintosuolat, vitamiinit jne.) ja tuotteiden konsentraatiot muuttuvat. Hyvä sekoittaminen varmistaa, että reaktioseoksen koostumuksessa tai lämpötilassa ei ole merkittäviä paikallisia eroja. Reaktio on ei-stationäärinen 15 ja soluja kasvatetaan kunnes kasvua rajoittava substraatti (yleensä hiilenlähde) on käytetty.
Jatkuvalle käytölle on tunnusmerkillistä, että tuoretta alustaa (syöttöalustaa) lisätään jatkuvasti fermento-riin ja käytettyä alustaa ja soluja otetaan jatkuvasti fer-20 mentorista samalla nopeudella. Jatkuvassa käytössä kasvunopeuden määrää se nopeus jolla alustaa lisätään, ja kasvatuksen saannon määrää kasvua rajoittavan substraatin (se on: hiilenlähden) pitoisuus. Kaikki reaktion muuttujat ja kontrolliparametrit pysyvät vakiona ajan suhteen ja näin 25 ollen fermentorissa saadaan aikaan ajan suhteen vakio tila, mistä seuraa jatkuva tuotantokyky ja tuotto.
Puolijatkuvaa käyttöä voidaan pitää panoskäytön ja jatkuvan käytön yhdistelmänä. Fermentointi aloitetaan pa-nosprosessina ja kun kasvua rajoittava substraatti on kulu-30 tettu, lisätään tietyllä tavalla jatkuva syöttöalusta joka sisältää glukoosia ja mineraaleja ("fed-batch"). Toisin sanoen tässä käytössä käytetään sekä panosalustaa että syöttöalustaa, jotta saadaan solujen kasvu ja halutun proteiinin tehokas tuotto. Mitään soluja ei lisätä eikä oteta pois 35 viljelyaikana ja näin ollen fermentori toimii erä kerrallaan sikäli kuin mikro-organismeista on kyse. Vaikka tätä 8 keksintöä voidaan käyttää monissa eri prosesseissa, mukaan lukien edellä mainitut, edullinen hyötykäyttö on fed-batch-prosessin yhteydessä.
Kussakin edellä mainitussa prosessissa solujen kas-5 vua ja tuotteen keräämistä voidaan monitoroida epäsuorasti hyödyntämällä korrelaatiota aineenvaihduntatuotteen muodostumisen ja jonkin muun muuttujan välillä, kuten alustan pH, optinen tiheys, väri ja titrattavissa oleva happamuus. Optinen tiheys esimerkiksi tarjoaa osoituksen 1iukenemattorni-10 en solupartikkeleiden kasaantumisesta ja sitä voidaan monitoroida suoraan käyttämällä mikro-OD-yksikköä joka on liitetty näyttöön tai piirturiin, tai irrallisesti ("offline") ottamalla näytteitä. Optisen tiheyden lukemia 600 nanometrin aallonpituudella (OD6oo) käytetään keinona mää-15 rittää solujen kuivapaino.
Fermentoinneiksi, joissa solutiheys on suuri, kuvataan yleensä niitä prosesseja jotka tuottavat saannoksi > 20 g solujen kuivapainoa/litra (OD60o > 30) . Kaikissa fer-mentointiprosesseissa, joissa solutiheys on suuri, käyte-20 tään konsentroitua alustaa joka mitataan asteittain fermen-toriin "fed-batch"-prosessissa. Prosesseihin, joissa solu-tiheys on suuri, tarvitaan konsentroitu syöttöalusta jotta saataisiin minimoitua fermentorin sisällön laimeneminen syötön aikana. Fed-batch-prosessi vaaditaan koska se mah-25 dollistaa sen että operaattori kontrolloi hiilenlähteen syöttöä, mikä on tärkeää koska jos solut altistetaan sellaisille hiilenlähteen pitoisuuksille, jotka ovat tarpeeksi korkeita saamaan aikaan korkeita solutiheyksiä, solut tuottavat niin paljon inhibitorista sivutuotetta, asetaattia, 30 että kasvu loppuu. Majewski ja Domach, Biotechnology and
Bioengineering, 35: 732 - 738 (1990).
Standardireaktio-olosuhteet niitä fermentointipro-sesseja varten, joita käytetään rekombinanttiproteiinien tuottamiseksi, sisältävät yleensä sen että pH pidetään noin 35 arvossa 5,0 - 8,0 ja viljelylämpötilat ovat välillä 20 °C -50 °C E. colia. varten. Tässä keksinnössä edullisessa suori- 9 tusmuodossa, joka käyttää hyödyksi E. colia isäntäjärjes-telmänä, optimaalinen pH on noin 7,0 ja optimaalinen vilje-lylämpötila on noin 37 °C.
Standardinomaiset alustan komponentit näissä fer-5 mentointiprosesseissa sisältävät yleensä energian, hiilen, typen, fosforin, magnesiumin lähteen ja pieniä määriä rautaa ja kalsiumia. Lisäksi alusta voi sisältää kasvutekijöitä (kuten vitamiineja ja aminohappoja), epäorgaanisia suoloja ja muita esiasteita jotka ovat välttämättömiä tuotteen 10 muodostumiselle. Harkittavan mikro-organismin alkuainekoos- tumusta voidaan käyttää laskemaan kunkin sellaisen komponentin suhde, jota tarvitaan solukasvun tukemiseen. Komponentin pitoisuudet vaihtelevat riippuen siitä onko prosessi sellainen jossa solutiheys on matala vai sellainen 15 jossa solutiheys on korkea. Esimerkiksi glukoosin pitoisuudet sellaisissa panosfermentointiprosesseissa, joissa solu-tiheys on alhainen, ovat välillä 1-5 g/1, kun taas panos-prosessit, joissa solutiheys on korkea, käyttävät glukoosin pitoisuuksia jotka ovat välillä 45 - 75 g/1.
20 Tämän keksinnön suorittamisessa alustojen fosfaa- tinlähteenä ajatellaan käytettäväksi laajaa fosfaattilasien kirjoa. Fosfaattilasit ovat lineaarisia polyfosfaatteja, joilla on suhteellisen erikoistuneita sovellutuksia. Lineaarisista polyfosfaateista, mukaan lukien fosfaattilasit, 25 löytyy yleistä pohdintaa teoksessa Corbridge, D.E.C.,
Phosphorus: An Outline of its Chemistry, Biochemistry and Technology, neljäs laitos, kappale 3, sivut 210 - 302 (1990). Fosfaattilaseja voidaan valmistaa monina eri koostumuksina ja ne koostuvat enimmäkseen kationien ja erillis-30 ten polyfosfaattiketjujen seoksesta. Na+-kationeista muodostuneita laseja on tutkittu perusteellisimmin, ja ne ilmenevät jatkuvana sarjana, stabiileina normaalilämpötilois-sa, koostumuksesta P205 jopa 5Na20*100P2C>5:een. Fosfaatti-laseja muodostuu kun ortofosfaattianioneita kondensoidaan, 35 se on: kuumentamalla NaH2P04 noin 650 °C:n lämpötilaan ja sammuttamalla. Sammutetusta sulatteesta peräisin olevalla 10 tyypillisellä lasilla 650 °C:n lämpötilassa ja 55 torrin (7331,5 Pa) vesihöyrypaineessa on ketjun keskipituus n = 60 PC>4-tetrahedriä.
p O Be O He O R* BO—r~~0— — P—*0· Oi Γμχι 5
Natriumpolyfosfaatin lasimaisia muunnoksia on kai-pallisesti saatavilla. Näitä valmistetaan monilla erilaisilla ketjun keskipituuksilla (esim. n = 5 - n = 200).
10 Yleensä tähän keksinntöön liittyvissä menetelmissä hyödylliset polyfosfaatit ovat natriumfosfaattilaseja. Käyttöä ajatellen pohditaan erityisesti natriumfosfaattilaseja, jotka ovat välillä noin h = 2 - n = 100, ja mieluummin noin n = 4 - noin n = 20. Nämä fosfaattilasit ovat 15 hyödyllisiä tässä keksinnössä, koska: 1) niiden liukoisuus-ominaisuudet ovat sellaisia että konsentroituja alustoja voidaan valmistaa ilman sekoittaessa tapahtuvaa saostumista, 2) isäntäsolujärjestelmissä kuten E. coli -järjestelmässä on tarvittavat reitit fosfaattilasien metaboloimisek-20 si, ja 3) koska saostumista ei tapahdu, kaikki ravinteet ovat täysin saatavilla kulutusta varten, mikä täten johtaa kasvaneisiin solutiheyksiin ja kasvunopeuksiin. Edullisessa suoritusmuodossa fosforinlähteenä käytetään lasimaista nat-riumpolyfosfaattia, jonka ketjunpituus h = 11.
25 Tämä keksintö on hyödyllinen prosessissa jonka ta voite on tuottaa monia erilaisia rekombinanttiproteiineja. Ajateltuja proteiiniesimerkkejä ovat sytokiinit, mukaan lukien monet erilaiset hematopoieettiset tekijät kuten G-CSF, SCF, EPO, GM-CSF, CSF-1, interleukiinit kuten IL-1- IL-12, 30 IGF:t, M-CSF, TNF tai LIF. Muut terapeuttiset proteiinit kuten interferonit (alfa-, beta-, gamma- tai konsensus-interferonit) ja kasvutekijät tai hormonit ovat myös hyödyllisiä, kuten ihmisen tai muun eläimen kasvuhormonit (esimerkiksi sian tai kanan kasvuhormoni), FGF, KGF, EGF ja 11 PDGF. Proteaasin inhibiittorit, kuten metalliproteinaasin inhibiittorit (kuten TIMP-1, TIMP-2 tai muut proteinaasin inhibiittorit) otetaan lukuun. Hermokasvutekijät, kuten BDNF ja NT-3, otetaan myös lukuun. Otetaan myös lukuun pep-5 tidiosat proteiineista, joissa on koko lähtöproteiinin pri-määrirakenne tai osa siitä, ja ainakin yksi lähtöproteiinin biologinen ominaisuus.
Yleensä tässä keksinnössä hyödyllisellä KGF:llä on ihmisen KGF:n tai sille läheisten analogien sekvenssi. Julio kaistu PCT-hakemus W0 90/08 771 kuvaa KGF:n puhdistusta ihmisen embryonisen fibroblastisolulinjan muokatusta elatus-aineesta, eristetyn polypeptidin osittaisen aminohappose-kvensoinnin, geenin kloonauksen ja ekspression bakteerisoluissa (E. coli) jolloin saatiin rekombinanttinen, bio-15 logisesti aktiivinen KGF.
Edullisessa suoritusmuodossa prosessissa käytetty rekombinanttinen isäntäsolu on E. coli. E. coli on edullinen järjestelmä, koska sen genetiikka on karakterisoitu hyvin, se mahdollistaa korkeat solutiheydet, ja sitä voidaan 20 kasvattaa tehokkaasti normaaleissa olosuhteissa (esim.
pH:ssa ja lämpötilassa).
Muihin elementteihin, jotka tarjoavat keksinnön edullisia suoritusmuotoja, kuuluvat kompleksiset typenläh-teet kuten hiivaekstrakti ja kaseiinin, soijapapujauhon, 25 lihan, veren tai puuvillasiemenjauhon kemialliset diges-tiotuotteet. Kuten ammattimies ymmärtäisi, tämä keksintö käsittää sellaiset menetelmät metallifosfaatin saostumisen torjumiseksi, joissa on monia erilaisia näiden lisäelement-tien yhdistelmiä.
3 0 Esimerkki 1
Tasapainotettuja minimialustoja, jotka olivat tyypillisiä niille joita käytettäisiin tuotettaessa rekombi-nanttiproteiineja E. colissa fermentoinneissa, joissa solu-tiheys on suuri, valmistettiin käyttäen vaihtoehtoisia fos-35 faatinlähteitä. Minimialustan (annettu nimeksi alusta A) , jossa käytettiin ortofosfaattia fosfaatinlähteenä, "stan- 12 dardierää" verrattiin alustaan (annettu nimeksi alusta B) joka hyödynsi fosforinlähteenä Hexaphos™: ia, lasimaista natriumpolyfosfaattia, jonka ketjunpituus on h = 11 ja jota myy FMC Corp.
5 Alusta A sisälsi glukoosia 45 g/1, hiivaekstraktia 3 g/1, (NH4) 2S04: ää 1 g/1, K2HP04: ää 4 g/1, KH2P04:ää 4,56 g/1, MgS04'7H20: ta 0,71 g/1, KCl:ää 0,74 g/1, 4,0 ml/1 hi- venainemetalliliuosta A (FeCl3-6H20: ta 27 g/1, Ζη(3ΐ2·4Η20: ta 2,0 g/1, CoCl2-6H20: ta 2,0 g/1, MnMo04-2H20: ta 2,0 g/1, 10 CaCl2’2H20: ta 1,0 g/1, CuS04-5H20: ta 1,9 g/1, H3BO3: ea 0,5 g/1, MnCl2-4H20: ta 1,6 g/1, natriumsitraatti-H20: ta 73,5 g/1) ja 4 ml/1 vitamiiniliuosta A (biotiinia 0,06 g/1, foolihappoa 0,04 g/1, pyridoksiini-HCl: ää 1,4 g/1, ribofla-viinia 0,42 g/1, pantoteenihappoa 5,4 g/1, niasiinia 6,1 15 g/1). Alusta oli identtinen alustan A kanssa, paitsi että fosfaatinlähteenä käytettiin Hexaphos™: ia (3,33 g/1) K2HP04:n ja KH2P04:n sijasta.
Kunkin alustan steriloinnin aikana glukoosi ja magnesiumsulfaatti steriloidaan yhdessä, hivenainemetalliliuos 20 A steriloidaan erikseen, ja muut alustan komponentit (mukaan lukien ortofosfaatti) steriloidaan erikseen. Tämä tehdään epäsuotavien sivureaktioiden välttämiseksi. Alustaa B varten Hexaphos™ steriloidaan myös erikseen. Alustan A tapauksessa, kun kaikki steriloidut alustan komponentit se-25 koitetaan yhteen, tuloksena oleva liuos muuttui sameaksi.
Sameuden ajateltiin johtuvan saostumisreaktioiden tapahtumisesta. Alusta B pysyi kuitenkin läpinäkyvänä sekoitettaessa .
Tuloksena olevan sakan paino mitattiin ottamalla 30 alustasta 10 ml:n näytteitä ja suodattamalla kahden nailon-suodattimen läpi (huokoskoko 0,2 pm) (Nalgene, 215 -4 020) suodattimenpitimessä (Nalgene, 300 - 4 100). Linjassa olevaa toista suodatinta käytettiin arvioimaan massan kasvu, joka johtui liukoisista kiinteistä aineista jotka jäävät 35 kiinni membraaniin. Suodattimia kuivattiin ilmassa useita tunteja ja sitten ne kuivattiin täydellisesti Labware 9000 13
Microwave -kuivatusuunissa jossa oli vaaka. Labware 9000:ta käytettiin määrittämään suodattimien kuivapaino ennen näytteen laittoa ja sen jälkeen. Tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa 1 jäljempänä.
5 Taulukko 1
Alusta Sakan paino A 0,20 g/1 B Ei havaittavissa 10 Esimerkki 2
Suoritettiin fed-batch-fermentointeja, joissa solu-tiheys oli suuri, ja jotka oli suunniteltu tuottamaan re-kombinanttista KGF:ää E. colissa, jotta saataisiin verrattua fosfaattilasin ja ortofosfaatin käyttökelpoisuutta fos-15 forinlähteenä panosalustassa ja konsentroitussa syöttöalus-tassa. Määritettiin vaikutukset metallifosfaatin saostumis-tasoihin alustoissa, samoin kuin yleiseen solutiheyteen. Ajo "standardilla" fed-batch-minimialustalla (nimetty ajoksi C) jossa käytettiin ortofosfaattia fosforinlähteenä, 20 verrattiin ajoon (nimetty ajoksi D) jossa käytettiin He-xaphos™:ia fosforinlähteenä.
Ajo C:tä varten panosalusta sisälsi glukoosia 5 g/1, (NH4) 2S04: ää 1,68 g/1, K2S04:ää 0,05 g/1, NaH2P04· H20: ta 0,36 g/1, MgS04'7H20: ta 0,136 g/1, KCl:ää 0,008 g/1, 25 0,78 ml/1 hivenainemetalliliuosta A (FeCl3-6H20: ta 27 g/1,
ZnCl2-4H20: ta 2,0 g/1, CoCl2-6H20: ta 2,0 g/1, MnMo04-2H20: ta 2,0 g/1, CaCl2'2H20: ta 1,0 g/1, CuS04-5H20: ta 1,9 g/1, H3B03:a 0,5 g/1, MnCl2'4H20: ta 1,6 g/1, natriumsitraatti· H20:ta 73,5 g/1) . Ajo D oli identtinen ajon C kanssa paitsi että 30 NaH2P04-H20:n sijasta käytettiin 0,28 g/1 Hexaphos™:a.
Ajo C:tä varten syöttöalusta sisälsi glukoosia 651,5 g/1, K2S04:ää 6,52 g/1, NaH2P04-H20: ta 46,91 g/1,
MgS04-7H20: ta 17,69 g/1, KCl:ää 1,08 g/1 ja hivenainemetalliliuosta A 102 ml/1. Syöttöalusta ajo D oli identtinen 35 ajon C syöttöalustan kanssa paitsi että NaH2P04-H20:n sijasta käytettiin 37,2 g/1 Hexaphos™: ia. Kutakin ajoa varten 14 syöttöalustan pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä 36 ml/1 NaOH-liuosta (40 %, v/v).
Kuten oli tilanne esimerkin 1 tasapainotettujen syöttöminimialustojen kanssa, ortofosfaatin käyttö fosfo-5 rinlähteenä johti sakan muodostumiseen kun steriloidut alustakomponentit sekoitettiin. Hexaphos™:n käyttö ei toisaalta saanut aikaan sellaista saostumista. Tuloksena olevan sakan paino mitattiin käyttämällä esimerkissä 1 kuvattua menetelmää ja tulokset esitetään yhteenvetona taulukos-10 sa 2 jäljempänä.
Taulukko 2
Aj o Sakan paino C 0,33 g/1 15 D Ei havaittavissa
Monitoroitiin myös solutiheyksiä ajoissa C ja D. Kussakin ajossa solut kasvatetaan alun perin erinä pa-nosalustassa. Sen jälkeen kun glukoosi on kulutettu, aloi-20 tetaan jatkuva syöttö käyttämällä syöttöalustaa. Tämän fer-mentoinnin fed-batch-osuuden aikana syöttönopeutta kasvatetaan kahden tunnin välein solutiheyden mukaan. Ajossa C kasvunopeus alkoi 0,08 h-1:sta ja laski 0,04 tf-'ueen 42 tuntia syötön alkamisesta kun saatiin solutiheys OD 65. Sitten 25 OD laski. Ajossa D fermentointi kasvoi tasaisella nopeudella 0,09 h-1 43 tuntia, kun saatiin solutiheys OD 92. Sitten OD laski (katso kuvio 1). Tuloksena oli lopullinen solutiheys 61 g solukuivapainoa/litra ajolle D, verrattuna vain 43 g:aan solukuivapainoa/litra ajolle C. Tuloksena ajo D 30 tuotti 180 mg/litra KGF:ää kun taas ajo C tuotti 120 mg/litra KGF:ää.
Esimerkki 3
Useita muita polyfosfaatteja (joiden ketjunpituudet olivat välillä n = 2 - n = 19) kuin Hexaphos™ käytettiin 35 fosforinlähteenä alustapreparaateissa, jotka olivat tyypillisiä niille joita käytettiin E. colissa fermentoinneissa 15 joissa solutiheys on suuri. Useita alustoja, jotka sisälsivät glukoosi:fosfori- ja glukoosi:magnesium-suhteita, jotka olivat tyypillisiä niille suhteille, jotka ovat välttämättömiä fermentoinneissa, joiden solutiheys on suuri, formu-5 loitiin siten että sekoitettiin glukoosi/magnesiumsulfaatin väkevä kantaliuos (joka sisälsi glukoosia 888 g/1) eri fosforia sisältävien yhdisteiden konsentroitujen vesiliuosten kanssa. Kunkin tuloksena olevan liuoksen pH säädettiin pH-arvoon 7,0 käyttämällä joko 40 % NaOH:ta tai 30 % HCl:ää.
10 Kunkin liuoksen visuaalisia tutkimuksia suoritet tiin päivittäin viiden päivän ajan sakan muodostumisen tutkimiseksi. Tulokset esitetään yhteenvetona jäljempänä taulukossa 3. Tulokset osoittavat, että Hexaphos™:n käyttö fosforinlähteenä alustassa mahdollistaa niinkin korkeiden 15 glukoosikonsentraatioiden käytön kuin 800 g/1 ilman saostu-misen ilmenemistä. Glass H™:n, lasimaisen natriumpolyfos-faatin, jonka ketjunpituus on n = 19, ja Sodaphos™:n, lasimaisen natriumpolyfosfaatin, jonka ketjunpituus on n=4, käyttö mahdollistaa niinkin korkeiden glukoosikonsentraati-20 oiden käytön kuin 600 g/1. Toisaalta ortofosfaatin käyttö sallii maksimiglukoosikonsentraatioksi vain 462 g/1.
_Taulukko 3_
Fosforilähde Ketjun- Sakan muodostumiseen tarvittava päivien määrä __Pituus__
800 g/L 600 g/L 400 g/L 200 g/L 100 g/L
___glukoosi__glukoosi__glukoosi__glukoosi__glukoosi
Glass H™__19__2__Ei mitään Ei mitään Ei mitään__Ei mitään
Hexaphos™__11__Ei mitään Ei mitään Ei mitään Ei mitään__Ei mitään
Sodaphos™__4__2__Ei mitään Ei mitään Ei mitään__Ei mitään
Tripolyfosfaatti__1__1__1__1__Ei mitään__Ei mitään
Ortofosfaatti__N/A__N/A__O*__Ei mitään Ei mitään__Ei mitään 1 Nämä tulokset osoittavat, että monet eri lasimaiset natriumpolyfosfaatit eliminoivat tehokkaasti ravinteiden saostumista konsentroiduissa alustoissa, joita käytetään 16 tuotettaessa rekombinanttiproteiineja fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri.
Tässä esitetyt tulokset osoittavat käytännöllisen menetelmän, jolla voidaan torjua metallifosfaatin saostu-5 misreaktioita alustassa jota käytetään bakteeritermentoin-tiprosesseissa, joissa solutiheys on suuri, ja ne tarjoavat parantuneen solujen kasvun ja proteiinintuotannon monissa erilaisissa bakteeritermentointiprosesseissa, joissa solutiheys on suuri.
Claims (8)
1. Suuren solutiheyden bakteerifermentointiviljelmä, tunnettu siitä, että se käsittää fosfaattilasia fosfo- 5 rinlähteenä, jolloin fosfaattilasi vähentää fosfaatin saostumista verrattuna soluihin, joita kasvatetaan kasvatus-alustassa ilman fosfaattilaseja.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelmä, tunnettu siitä, että mainittu fosfaattilasi valitaan ryhmäs- 10 tä, joka koostuu natriumfosfaattilaseista, joilla on kaava PO4 - (PO3) n - PO4, jolloin ketjun pituudet vaihtelevat välillä noin n = 2 - noin n = 100.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen viljelmä, tunnettu siitä, että mainitulla natriumfosfaattilasilla on 15 ketjunpituus noin n = 4 - noin n = 20.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen viljelmä, tunnettu siitä, että mainitulla natriumfosfaattilasilla on ketjunpituus n = 11.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelmä, tun- 20 nettu siitä, että suuren solutiheyden fermentointiviljelmä valitaan ryhmästä, joka koostuu panosfermentointiviljelmäs-tä, jatkuvan fermentoinnin viljelmästä tai fed-batch-fermentointivil j elmästä .
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelmä, tun- 25 nettu siitä, että suuren solutiheyden viljelmä tuottaa saannon, joka on enemmän kuin 20 grammaa solun kuivapai-noa/litra kasvatusalustaa.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelmä, tunnettu siitä, että kasvatusalusta käsittää glukoosia kon- 30 sentraatiossa, joka on 45 g/litra - 75 g/litra.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen viljelmä, tunnettu siitä, että bakteerifermentointiviljelmä käsittää E. colin, joka ilmentää rekombinanttiproteiinia.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23557394A | 1994-04-28 | 1994-04-28 | |
| US23557394 | 1994-04-28 | ||
| US9505294 | 1995-04-27 | ||
| PCT/US1995/005294 WO1995029986A1 (en) | 1994-04-28 | 1995-04-27 | Method for controlling metallophosphate precipitation in high cell density fermentations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20095510A FI20095510A (fi) | 2009-05-05 |
| FI120977B true FI120977B (fi) | 2010-05-31 |
Family
ID=22886063
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI964208A FI120405B (fi) | 1994-04-28 | 1996-10-18 | Menetelmä metallofosfaatin saostumisen kontrolloimiseksi fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri |
| FI20095510A FI120977B (fi) | 1994-04-28 | 2009-05-05 | Suuren solutiheyden bakteerifermentaatioviljelmä |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI964208A FI120405B (fi) | 1994-04-28 | 1996-10-18 | Menetelmä metallofosfaatin saostumisen kontrolloimiseksi fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7118884B1 (fi) |
| EP (1) | EP0755438B1 (fi) |
| JP (1) | JP3592330B2 (fi) |
| CN (1) | CN1105776C (fi) |
| AT (1) | ATE199166T1 (fi) |
| AU (1) | AU699554B2 (fi) |
| CA (1) | CA2188434C (fi) |
| DE (1) | DE69520098T2 (fi) |
| DK (1) | DK0755438T3 (fi) |
| ES (1) | ES2153896T3 (fi) |
| FI (2) | FI120405B (fi) |
| GR (1) | GR3035808T3 (fi) |
| IL (2) | IL113497A0 (fi) |
| MX (1) | MX9604878A (fi) |
| NO (1) | NO323554B1 (fi) |
| PT (1) | PT755438E (fi) |
| WO (1) | WO1995029986A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA953452B (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2535562A1 (en) | 2003-08-13 | 2005-03-03 | Chiron Corporation | Improved method of purifying tfpi and tfpi analogs |
| GB0522303D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Chiron Srl | Culture method |
| GB0818453D0 (en) | 2008-10-08 | 2008-11-12 | Novartis Ag | Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom |
| US10237679B2 (en) * | 2008-06-27 | 2019-03-19 | Here Global B.V. | Method, apparatus, and computer program product for location sharing |
| US8213591B2 (en) * | 2008-11-13 | 2012-07-03 | At&T Intellectual Property I, L.P. | Methods, systems, and products for providing ring tones |
| MX2011013417A (es) | 2009-06-25 | 2012-03-29 | Amgen Inc | Procesos de purificacion por captura para proteinas expresadas en un sistema no mamifero. |
| CN115867641A (zh) | 2020-07-01 | 2023-03-28 | 龙沙有限公司 | 微生物培养基 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE290212C (fi) | ||||
| US3640827A (en) * | 1968-10-09 | 1972-02-08 | Fmc Corp | Phosphate glass bodies |
| US4727031A (en) * | 1984-11-08 | 1988-02-23 | International Technology Corporation | Nutrient for stimulating aerobic bacteria |
| US4906575A (en) * | 1987-03-06 | 1990-03-06 | Chevron Research Company | Phosphate compound that is used in a microbial profile modification process |
| US4947932A (en) * | 1987-03-06 | 1990-08-14 | Chevron Research Company | Phosphate compound that is used in a microbial profile modification process |
| DD290212A5 (de) | 1988-07-28 | 1991-05-23 | Zi Fuer Mikrobiologie Und Experimentelle Therapie,De | Verfahren zur herstellung eines glukose-minimalmediums fuer escherichia coli-massenkulturfermentation |
| US5128260A (en) * | 1989-01-12 | 1992-07-07 | Sanofi Bio Ingredients, Inc. | Process for preparing culture concentrates for direct vat set dairy products production |
| CA2078054A1 (en) | 1991-09-13 | 1993-03-14 | Sun Yukun | High-yield fermentation processes |
-
1995
- 1995-04-25 IL IL11439795A patent/IL113497A0/xx unknown
- 1995-04-25 IL IL11349795A patent/IL113497A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-04-27 CN CN95193686A patent/CN1105776C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-27 CA CA002188434A patent/CA2188434C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-27 AU AU23691/95A patent/AU699554B2/en not_active Expired
- 1995-04-27 EP EP95917747A patent/EP0755438B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-27 PT PT95917747T patent/PT755438E/pt unknown
- 1995-04-27 MX MX9604878A patent/MX9604878A/es unknown
- 1995-04-27 JP JP52841295A patent/JP3592330B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-27 AT AT95917747T patent/ATE199166T1/de active
- 1995-04-27 DK DK95917747T patent/DK0755438T3/da active
- 1995-04-27 ES ES95917747T patent/ES2153896T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-27 DE DE69520098T patent/DE69520098T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-27 WO PCT/US1995/005294 patent/WO1995029986A1/en active Application Filing
- 1995-05-08 ZA ZA953452A patent/ZA953452B/xx unknown
-
1996
- 1996-08-21 US US08/701,032 patent/US7118884B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-14 NO NO19964368A patent/NO323554B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-10-18 FI FI964208A patent/FI120405B/fi not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-04-27 GR GR20010400656T patent/GR3035808T3/el unknown
-
2006
- 2006-10-04 US US11/543,323 patent/US7381545B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-05-05 FI FI20095510A patent/FI120977B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09512439A (ja) | 1997-12-16 |
| AU2369195A (en) | 1995-11-29 |
| MX9604878A (es) | 1998-01-31 |
| CA2188434C (en) | 1999-08-31 |
| EP0755438A1 (en) | 1997-01-29 |
| PT755438E (pt) | 2001-07-31 |
| WO1995029986A1 (en) | 1995-11-09 |
| FI120405B (fi) | 2009-10-15 |
| EP0755438B1 (en) | 2001-02-14 |
| IL113497A0 (en) | 1995-07-31 |
| FI20095510A (fi) | 2009-05-05 |
| US20070026497A1 (en) | 2007-02-01 |
| ZA953452B (en) | 1996-01-17 |
| NO964368L (no) | 1996-12-30 |
| ATE199166T1 (de) | 2001-02-15 |
| CA2188434A1 (en) | 1995-11-09 |
| DE69520098T2 (de) | 2001-07-19 |
| JP3592330B2 (ja) | 2004-11-24 |
| FI964208A (fi) | 1996-10-18 |
| AU699554B2 (en) | 1998-12-10 |
| NO323554B1 (no) | 2007-06-11 |
| ES2153896T3 (es) | 2001-03-16 |
| FI964208A0 (fi) | 1996-10-18 |
| CN1151182A (zh) | 1997-06-04 |
| US7381545B2 (en) | 2008-06-03 |
| DE69520098D1 (de) | 2001-03-22 |
| CN1105776C (zh) | 2003-04-16 |
| US7118884B1 (en) | 2006-10-10 |
| DK0755438T3 (da) | 2001-03-19 |
| GR3035808T3 (en) | 2001-07-31 |
| IL113497A (en) | 2001-01-11 |
| NO964368D0 (no) | 1996-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI120977B (fi) | Suuren solutiheyden bakteerifermentaatioviljelmä | |
| EP2247737B1 (en) | Fermentation medias and processes thereof | |
| CA2417689C (en) | Improved methods for growing mammalian cells in vitro | |
| US11401499B2 (en) | Fermentation medium for growth of methanotrophic bacteria and method for producing said medium | |
| JPH08116964A (ja) | Ｌ−アスコルビン酸含有バイオマス | |
| KR20150063541A (ko) | 관류 세포배양 시스템을 최적화하기 위한 방법 및 시스템 | |
| MXPA96004878A (en) | Method for controlling the precipitation of meta phosphate in cell density fermentations eleva | |
| Curless et al. | Phosphate glass as a phosphate source in high cell density Escherichia coli fermentations | |
| CN109182438B (zh) | 利用芽孢杆菌发酵生产维生素b2的培养基及培养方法 | |
| EP0511226B1 (de) | Verfahren zur hochzelldichte-fermentation von escherichia coli in einem rührkesselfermentor | |
| CN117222668A (zh) | 制备spesolimab的方法 | |
| WO2017186327A1 (en) | Bacterial strain and method for high throughput of sugar in the microbial conversion into biosynthetic products | |
| IL299373A (en) | Microbial culture medium | |
| SU907072A1 (ru) | Способ получени лимонной кислоты | |
| Pöhland et al. | High performance fermentation process using methanol utilizing bacteria | |
| CN117701459A (zh) | 一种大肠杆菌高密度发酵培养基及发酵工艺 | |
| CN117187199A (zh) | 一种活性增强的谷胱甘肽合成酶及应用 | |
| JP2020162544A (ja) | 微生物培養用液体培地及び液体培地を用いた微生物の培養方法 | |
| CN116064698A (zh) | 一种四氢甲基嘧啶羧酸发酵方法 | |
| Altamirano et al. | Bi-Phasic Culture Strategies Based on Medium Formulation: Substitution of Glucose by Galactose in CHO Culture | |
| CZ249993A3 (en) | Fermentation process of l-threonine by cultivating production strain escherichia coli 472 t - 23 | |
| CS232830B1 (cs) | Způsob výrcby kvasnic s vyšším obsahem bílkovin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120977 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |