FI120405B - Menetelmä metallofosfaatin saostumisen kontrolloimiseksi fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri - Google Patents

Description

Menetelmä metallofosfaatin saostumisen kontrolloimiseksi fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri

Keksinnön tausta 5 Tämä keksintö koskee menetelmää saostumisen vähen tämiseksi bakteerifermentointiprosessissa rekombinanttipro-teiinin tuottamiseksi, jossa menetelmässä tiettyjä syöttö-alustan ravinteita monitoroidaan ja säädetään niin että saadaan säädeltyä .metallifosfaatin saostumista alustassa. 10 Erityisesti keksintö koskee menetelmää, jossa solutiheys on suuri, jossa alustassa käytetään tiettyjä polyfosfaatteja ja/tai metafosfaatteja ravinteiden saostumisen eliminoimiseksi ja solutiheyden kasvattamiseksi.

Edistysaskeleet molekyylibiologiassa ja geenitekno-15 logisten menetelmien hyödyntäminen on tehnyt mahdolliseksi vieraiden proteiinien merkittävien määrien tuotannon tietyissä isäntäsolujärjestelmissä. Rekombinanttiproteiineja tuotetaan isäntäsolujärjestelmissä transfektoimalla isän-täsolut haluttua proteiinia koodittavalla DNA:11a, ja kas-20 vattamalla sitten transfektoituja isäntäsoluja olosuhteissa, jotka mahdollistavat uuden rekombinanttiproteiinin ekspression. Tiettyjä bakteeri-isäntäsolujärjestelmiä voidaan käyttää tuottamaan suuria määriä rekombinanttiproteiineja, jotka ovat normaalisti saatavilla rajallisina määrinä luon-25 nollisista lähteistä.

Frokaryootti Escherichia coli on laajalti tutkittu bakteeri. E. coli. valitaan yleisesti käytettäväksi korkean ekspressiotason isäntäsolujärjestelmissä, osaksi koska E. coli -soluilla on taipumus soveltua paremmin rekombinantti-30 proteiinin äärimmäisen suurten määrien tuotantoon. Isän-täsolujärjestelmät, jotka käyttävät eukaryoottisia isäntäsoluja ja hiivaisäntäsoluja, eivät yleensä onnistu tuottamaan rekombinanttiproteiinia sellaisina valtavina määrinä, joita tuotetaan korkean ekspressiotason isäntäsolujär-35 jestelmissä kuten E. coli. Lisäksi sellaisten fermentointi- prosessien kehittäminen, joissa solutiheys on suuri, on 2 johtanut rekombinanttiproteiinien kasvaneeseen volymetri-seen tuottavuuteen E. colissa. Yee ja Blanc, Biotechnology and Bioengineering, 41:221-230 (1993).

Fermentointiprosessit, joita käytetään tuottamaan 5 rekombinanttiprotelineja isäntäsolujärjestelmissä, kuten E. coli.-järjestelmässä, suoritetaan äärellisissä fysikaalisissa säiliöissä (se on: fermentoreissa, reaktoreissa). Sekoitettavat tankit edustavat suosituinta fermentoreiden geometriaa, vaikka kasvava määrä muulla tavalla fysikaali-10 sesti muotoiltuja säiliöitä onkin kehitteillä. Fermentorin käyttötavat voivat kuulua johonkin seuraavista luokista: 1) epäjatkuva käyttö (panosprosessi), 2) jatkuva käyttö tai 3) monet eri epäjatkuvan käytön tyypit, kuten fed-batch-prosessi.

15 Käyttötavasta ja käytettävästä isäntäsolujärjestel- mästä riippuen täytyy keksiä määrätty tasapainotettu panos-ja/tai syöttöalusta, joka mahdollistaa solujen kasvun ja rekombinanttiproteiinin ekspression. Määrättyä alustaa nimitetään "minimialustaksi", jos se sisältää pelkästään kas-20 vulle välttämättömät ravinteet. E. coli -järjestelmää varten minimialustojen täytyy sisältää hiilen, typen, fosforin, magnesiumin lähde sekä pieniä määriä rautaa ja kalsiumia. Gunsalus ja Stanter, The Bacteria, volyymi 1, kappale 1, Academic Press Inc., N.Y. (I960). Useimmat mini-25 mialustat käyttävät glukoosia hiilenlähteenä, ammoniakkia typenlähteenä ja ortofosfaattia (esim. PO4} fosforinlähtee-nä. Ideaalinen alusta solujen kasvua varten sisältäisi tarkan määrän kutakin sellaista ravinnetta, joka kulutetaan solujen kasvun aikana, niin että mitkään ravinteet eivät 30 kasaannu inhiboiviksi tasoiksi, eivätkä solut nälkiinny minkään ravinteen suhteen. Thompson ym., Biotechnology and Bioengineering, 27:818 - 824 (1985). Yksi teoreettisesti tasapainotettu minimialusta E. colilie on suunniteltu aikaisemmin käytettäväksi ravistettavissa pulloissa, joissa 35 solutiheys on pieni (solutiheydet korkeintaan 1,5 g solun 3 kuivapainoa/litra). Neidhardt ym., Journal of Bacteriology, 119:736-747 (1974).

Alustojen kemiallisen koostumuksen lisäksi täytyy huolella harkita useiden muiden ympäristöparametrien vaiku-5 tusta, kuten pH, aika, viljelylämpötila ja liuenneen hapen osapaine. Esimerkiksi E. colin kasvulle optimaalinen pH on 7,0. Fermentointiprosessin aikana alustojen pH voi muuttua ammoniakin kulutuksen vuoksi, tai sen vuoksi että mikro-organismi syntetisoi tiettyjä aineenvaihduntatuotteita, 10 esim. etikkahappoa ja maitohappoa. Koska muuttunut pH voi olla epäsuotuisa optimaalista solujen kasvua ajatellen, on kriittisen tärkeää säilyttää alusta tietyssä pH:ssa ja tämä voidaan saada aikaan lisäämällä happoa ja emästä. pH:ta ja muita prosessin parametreja voidaan monitoroida manuaali-15 sesti tai automaattisilla laitteilla.

Fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri (se on: niissä joissa saavutetaan solutiheyksiä > 20 g solun kuivapainoa/litra), täytyy käyttää konsentroitua alustaa. Operaattorit jotka suorittavat fermentointeja, joissa solu-20 tiheys on suuri, ovat havainneet että kun käytetään konsentroituja alustoja, muodostuu sakkoja kun fosfaatin sisältävä liuos sekoitetaan liuokseen joka sisältää muita ra-vinnekomponentteja. Sakkoihin, jotka muodostuvat alustoihin, kuuluu ortofosfaattien saostuminen, ja näihin kuuluvat 25 NH4MgP04, (Mg}3(P04)2 ja metallif osf aatit joilla on kaava (Me)n(PO4)m (jossa Me = Fe, Ca, Zn, Cu, Co) . Näillä yhdisteillä on hyvin matalia liukoisuuksia vedessä. Dean, John A., Lange's Handbook of Chemistry, 12. laitos, McGraw-Hill, New York, sivut 7-12 (1979). Saostumisen määrä voi vaih- 30 della riippuen pH:sta, glukoosin konsentraatiosta ja alustojen komponenttien konsentraatiosta.

Sakan muodostuminen voi johtaa moniin ongelmiin syöttöalustassa ja fermentorissa. Sakat syöttöalustassa voivat esimerkiksi johtaa ei-homogeeniseen syöttöön (mikä 35 johtuu sakan asettumisesta syöttöastioihin tai syöttölin-joihin) ja solujen nälkiintymiseen niiden kriittisten ra- 4 vinteiden suhteen, jotka eivät ole enää liukoisia. Sakat voivat myös naarmuttaa syöttöpumppuja ja putkia ja mahdollisesti tukkia syöttölinjat täysin.

Fermentorissa tapahtuu saostumista, jos alusta ei 5 ole täysin tasapainossa solujen kasvua ajatellen. Saostuminen fermentorissa voi saada aikaan ilmastuslaitteen tukkeutumisen fermentorissa, johtaa ei-homogeeniseen sekoittumiseen (se on: sakka asettuu alemmille tasoille fermentorissa) ja vähentää liukoisten ravinteiden saatavuutta soluil-10 le. Solujen saatavilla olevien ravinteiden konsentraatio tulee riippuvaiseksi sellaisen ravinnekadon nopeudesta, joka johtuu sakan muodostumisesta, verrattuna solujen suorittaman ravinteiden sisäänoton nopeuteen. Nämä vaikutukset voidaan sovittaa säätämällä pH:ta hapon ja emäksen auto-15 maattisen lisäyksen avulla. Kaikki nämä olosuhteet vähentävät fermentointiprosessin toistettavuutta. Lisäksi sakkojen läsnäololla voi olla vaikutusta proteiinin puhdistusvaiheisiin ja se voi pakottaa ylimääräisten puhdistusvaiheiden käyttöön sakan erottamiseksi tuotteesta.

20 Kaupallisessa ympäristössä saostumisongelmaa pitää lievittää jotta fermentointiprosessi olisi käytännöllinen. Yksi ehdotettu tapa estää ravinteiden saostuminen mini-mialustassa on EDTA:n ja sitraatin lisääminen metalli-ionien kelatoimiseksi alustassa. Pirt, S.J., Principles of 25 Microbe and Cell Cultivation, sivu 134 (1975) . Kelatoivien agenssien lisäyksen tarve ei ole kuitenkaan suotava, koska agenssit eivät metaboloidu. Niinpä ne kasaantuvat ja lisäävät solujen ympäristön osmolaarisuutta. Korkealla osmolaa-risuudella on haitallinen vaikutus solujen aineenvaihdun-30 taan. Gouesbet ym. , Journal of Bacteriology, 175:214-221 (1993) . Kelatoivien agenssien korkeat konsentraatiot voivat myös vahingoittaa solumembraaneja. Ryan ym., Biotechnology and Bioengineering, 37:430-444 (1991).

DE-patenttihakemuksessa nro 290 212 A5 (pantu vi-35 reille 28. heinäkuuta 1988) Riesenberg ym, kuvaavat menetelmän jolla voidaan valmistaa glukoosi-minimialusta E. co- 5

Iin massaviljelmäfermentointia varten yhdistelmä-DNA-tuotteiden hankkimiseksi. Riesenbergin ym. kuvaava minimialusta suunniteltiin niin että sillä voitettaisiin voimakkaan sa-ostumisen ongelmat joita normaalisti kohdataan työskennel-5 taessa sellaisilla alustoilla. Patenttihakemuksessa kuvattu alusta hyödyntää ortofosfaatteja fosforinlähteenä eikä eliminoi täysin ravinteiden saostumista, pikemminkin siinä sanotaan ilmenevän vain vähäistä turbulenssia mikä johtuu vähäisestä sakanmuodostuksesta.

10 Edellä olevaa pohdintaa lukuun ottamatta kirjalli suudesta ei löydy mitään joka koskisi sellaisten alustojen valmistusta sellaisia fermentointeja varten, joissa soluti-heys on suuri, joissa eliminoitaisiin tehokkaasti ravinteiden saostumisongelma. On olemassa edelleen tarve menetel-15 mälle, jolla voitaisiin vähentää saostumista panos- ja/tai syöttöalustassa, joka ei sisällä saostumista kun kaikki komponentit sekoitetaan yhteen (sekoitetaan neutraalissa pH:ssa E. colidi ajatellen), ja joka takaa sen että fermen-torissa ei muodostu mitään sakkaa prosessoinnin aikana. Tä-20 mä keksintö tarjoaa sellaisen menetelmän käyttämällä natri-umfosfaattilasia fosforin lähteenä konsentroidussa alustassa. Toisin kuin edellä siteeratuissa viitteissä esitetyt menetelmät, tämän keksinnön mukaiset menetelmät tarjoavat seuraavan kolminkertaisen edun: 1) mahdollistavat sellaisen 25 konsentroidun, täysin tasapainotetun panos- ja/tai syöttö-alustan suunnittelun, joka ei sisällä sakkaa, 2) ovat E. colin metaboloitavissa, ja 3) mahdollistavat kasvaneen solut iheyden ja kasvunopeudet. Tämän keksinnön käytännön menetelmät ovat hyödyllisiä monissa eri bakteerifermentoin-30 neissa, erityisesti fermentointiprosesseissa joissa soluti- heys on suuri.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee menetelmää saostumisen vähentämiseksi bakteerifermentointiprosessissa rekombinanttipro-35 teiinin tuottamiseksi, jolle on tunnusmerkillistä että tiettyjä syöttöalustan ravinteita monitoroidaan ja sääde- 6 tään niin että prosessin aikana saadaan torjua metallifos-faatin saostumista. Erityisesti keksintö koskee sellaista menetelmää, jossa solutiheys on suuri ja jolle on tunnusmerkillistä että konsentroitu ravinneliuos käyttää natrium-5 fosfaattilasia fosforinlähteenä. Yllättävää kyllä tämä menetelmä eliminoi sakan muodostuksen alustoissa ja saa aikaan solutiheyksien kasvua standardioloissa.

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää solutiheysprofiilit ajosta C (·-♦) 10 ja ajosta D (o-o), ja osoittaa että fosfaattilasin käyttö fosforinlähteenä alustoissa johtaa solutiheyden kasvuun siihen verrattuna joka saatiin kun fosforinlähteenä käytettiin ortofosfaattia. Solutiheys mitattiin käyttämällä Per-kin-Elmerin M35 spektrofotometriä ja OD60o piirrettiin ku-15 vaajaan ajan funktiona.

Yksityiskohtainen kuvaus

Menetelmät, joilla tiettyjä syöttöalustan ravinteita monitoroidaan ja säädellään niin että fermentointipro-sessin aikana saadaan torjuttua metallifosfaatin saostumis-20 ta, kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä olevassa poh dinnassa ja niitä havainnollistavat jäljempänä tarjotut esimerkit. Esimerkit osoittavat, että vaihtoehtoisia fosfo-rinlähteitä voidaan hyödyntää fermentoinneissa, joissa solutiheys on suuri, ravinteiden saostumisen eliminoimiseksi. 25 Tulokset olivat yllättäviä sikäli että panosfermentoinneissa ja fed-batch-fermentoinneissa, joissa solutiheys oli suuri, lasimaisen natriumfosfaatin käyttö fosforinlähteenä konsentroidussa erä- ja/tai syöttöalustassa eliminoi alustoissa tapahtuvan metallifosfaatin saostumisen, ja tulokse-30 na oli fermentoinneissa olevien solutiheyksien kasvu.

Rekombinanttiproteiinien tuotannossa mukana olevat fermentointiprosessit käyttävät käyttötapaa, joka kuuluu johonkin seuraavista luokista: 1) epäjatkuva (panosproses-si) käyttö 2) jatkuva käyttö ja 3) puolijatkuva {"fed-35 batch”) käyttö. Panosprosessille on tunnusmerkillistä, että steriiliin alustaan (panosalusta) ympätään mikro-organismit 7 prosessin alussa, ja näitä viljellään tietty reaktioaika. Viljelyn aikana solutiheydet, substraattien pitoisuudet (hiilenlähde, ravintosuolat, vitamiinit jne.) ja tuotteiden konsentraatiot muuttuvat. Hyvä sekoittaminen varmistaa, et-5 tä reaktioseoksen koostumuksessa tai lämpötilassa ei ole merkittäviä paikallisia eroja. Reaktio on ei-stationäärinen ja soluja kasvatetaan kunnes kasvua rajoittava substraatti (yleensä hiilenlähde) on käytetty.

Jatkuvalle käytölle on tunnusmerkillistä, että tuo-10 retta alustaa (syöttöalustaa) lisätään jatkuvasti fermento-riin ja käytettyä alustaa ja soluja otetaan jatkuvasti fer-mentorista samalla nopeudella. Jatkuvassa käytössä kasvunopeuden määrää se nopeus jolla alustaa lisätään, ja kasvatuksen saannon määrää kasvua rajoittavan substraatin {se 15 on: hiilenlähden) pitoisuus. Kaikki reaktion muuttujat ja kontrolliparametrit pysyvät vakiona ajan suhteen ja näin ollen fermentorissa saadaan aikaan ajan suhteen vakio tila, mistä seuraa jatkuva tuotantokyky ja tuotto.

Puolijatkuvaa käyttöä voidaan pitää panoskäytön ja 20 jatkuvan käytön yhdistelmänä. Fermentointi aloitetaan pa-nosprosessina ja kun kasvua rajoittava substraatti on kulutettu, lisätään tietyllä tavalla jatkuva syöttöalusta joka sisältää glukoosia ja mineraaleja ("fed-batch"). Toisin sanoen tässä käytössä käytetään sekä panosalustaa että syöt-25 töalustaa, jotta saadaan solujen kasvu ja halutun proteiinin tehokas tuotto. Mitään soluja ei lisätä eikä oteta pois viljelyaikana ja näin ollen fermentori toimii erä kerrallaan sikäli kuin mikro-organismeista on kyse. Vaikka tätä keksintöä voidaan käyttää monissa eri prosesseissa, mukaan 30 lukien edellä mainitut, edullinen hyötykäyttö on fed-batch-prosessin yhteydessä.

Kussakin edellä mainitussa prosessissa solujen kasvua ja tuotteen keräämistä voidaan monitoroida epäsuorasti hyödyntämällä korrelaatiota aineenvaihduntatuotteen muodos-35 tumisen ja jonkin muun muuttujan välillä, kuten alustan pH, optinen tiheys, väri ja titrattavissa oleva happamuus. Op- 8 tinen tiheys esimerkiksi tarjoaa osoituksen liukenemattomien solupartikkeleiden kasaantumisesta ja sitä voidaan monitoroida suoraan käyttämällä mikro-OD-yksikköä joka on liitetty näyttöön tai piirturiin, tai irrallisesti ("off-5 line") ottamalla näytteitä. Optisen tiheyden lukemia 600 nanometrin aallonpituudella (ODgoo) käytetään keinona määrittää solujen kuivapaino.

Fermentoinneiksi, joissa solutiheys on suuri, kuvataan yleensä niitä prosesseja jotka tuottavat saannoksi > 10 20 g solujen kuivapainoa/litra (OD60o > 30) . Kaikissa fer- mentointiprosesseissa, joissa solutiheys on suuri, käytetään konsentroitua alustaa joka mitataan asteittain fermen-toriin "fed-batch"-prosessissa. Prosesseihin, joissa solu-tiheys on suuri, tarvitaan konsentroitu syöttöalusta jotta 15 saataisiin minimoitua fermentorin sisällön laimeneminen syötön aikana. Fed-batch-prosessi vaaditaan koska se mahdollistaa sen että operaattori kontrolloi hiilenlähteen syöttöä, mikä on tärkeää koska jos solut altistetaan sellaisille hiilenlähteen pitoisuuksille, jotka ovat tarpeeksi 20 korkeita saamaan aikaan korkeita solutiheyksiä, solut tuottavat niin paljon inhibitorista sivutuotetta, asetaattia, että kasvu loppuu. Majewski ja Domach, Biotechnology and Bioengineering, 35: 732 - 738 (1990).

Standardireaktio-olosuhteet niitä fermentointipro-25 sesseja varten, joita käytetään rekombinanttiproteiinien tuottamiseksi, sisältävät yleensä sen että pH pidetään noin arvossa 5,0 - 8,0 ja viljelylämpötilat ovat välillä 20 °C -50 °C E. colia varten. Tässä keksinnössä edullisessa suoritusmuodossa, joka käyttää hyödyksi E. colia isäntäjärjes-30 telmänä, optimaalinen pH on noin 7,0 ja optimaalinen vilje-lylämpötila on noin 37 °C.

Standardinomaiset alustan komponentit näissä fer-mentointiprosesseissa sisältävät yleensä energian, hiilen, typen, fosforin, magnesiumin lähteen ja pieniä määriä rau-35 taa ja kalsiumia. Lisäksi alusta voi sisältää kasvutekijöitä (kuten vitamiineja ja aminohappoja), epäorgaanisia suo- 9 loja ja muita esiasteita jotka ovat välttämättömiä tuotteen muodostumiselle. Harkittavan mikro-organismin alkuainekoos-tumusta voidaan käyttää laskemaan kunkin sellaisen komponentin suhde, jota tarvitaan solukasvun tukemiseen. Kom-5 ponentin pitoisuudet vaihtelevat riippuen siitä onko prosessi sellainen jossa solutiheys on matala vai sellainen jossa solutiheys on korkea. Esimerkiksi glukoosin pitoisuudet sellaisissa panosfermentointiprosesseissa, joissa solu-tiheys on alhainen, ovat välillä 1-5 g/1, kun taas panos-10 prosessit, joissa solutiheys on korkea, käyttävät glukoosin pitoisuuksia jotka ovat välillä 45 - 75 g/1.

Tämän keksinnön suorittamisessa alustojen fosfaa-tinlähteenä ajatellaan käytettäväksi laajaa fosfaattilasien kirjoa. Fosfaattilasit ovat lineaarisia polyfosfaatteja, 15 joilla on suhteellisen erikoistuneita sovellutuksia. Lineaarisista polyfosfaateista, mukaan lukien fosfaattilasit, löytyy yleistä pohdintaa teoksessa Corbridge, D.E.C., Phosphorus: An Outline of its Chemistry, Biochemistry and

Technology, neljäs laitos, kappale 3, sivut 210 - 302 20 (1990). Fosfaattilaseja voidaan valmistaa monina eri koos tumuksina ja ne koostuvat enimmäkseen kationien ja erillisten polyfosfaattiketjujen seoksesta. Na+-kationeista muodostuneita laseja on tutkittu perusteellisimmin, ja ne ilmenevät jatkuvana sarjana, stabiileina normaalilämpötilois-25 sa, koostumuksesta P2O5 jopa SNaaO* 100P205: een. Fosfaatti-laseja muodostuu kun ortofosfaattianioneita kondensoidaan, se on: kuumentamalla NaH2P04 noin 650 °C:n lämpötilaan ja sammuttamalla. Sammutetusta sulatteesta peräisin olevalla tyypillisellä lasilla 650 °C:n lämpötilassa ja 55 torrin 30 (7331,5 Pa) vesihöyrypaineessa on ketjun keskipituus n = 60 PO4-tetrahedriä.

ani ‘ok· o «a

Μιι·Ρ>ιι·0» n ρ· IO» Γ n OB

Γμ jTi 10

Natriumpolyfosfaatin lasimaisia muunnoksia on kaupallisesti saatavilla. Näitä valmistetaan monilla erilaisilla ketjun keskipituuksilla (esim. ö = 5 - n = 200).

Yleensä tämän keksinnön menetelmissä hyödylliset 5 polyfosfaatit ovat natriumfosfaattilaseja. Käyttöä ajatel len pohditaan erityisesti natriumfosfaattilaseja, jotka ovat välillä noin n = 2 - h = 100, ja mieluummin noin h = 4 - noin h = 20. Nämä fosfaattilasit ovat hyödyllisiä tässä keksinnössä, koska: 1) niiden liukoisuusominaisuudet ovat 10 sellaisia että konsentroituja alustoja voidaan valmistaa ilman sekoittaessa tapahtuvaa saostumista, 2) isäntäsolu-järjestelmissä kuten E. coli -järjestelmässä on tarvittavat reitit fosfaattilasien metaboloimiseksi, ja 3) koska saostumista ei tapahdu, kaikki ravinteet ovat täysin saatavilla 15 kulutusta varten, mikä täten johtaa kasvaneisiin solutihe-yksiin ja kasvunopeuksiin. Edullisessa suoritusmuodossa fosforinlähteenä käytetään lasimaista natriumpolyfosfaat-tia, jonka ketjunpituus n = 11.

Tämä keksintö on hyödyllinen prosessissa jonka ta-20 voite on tuottaa monia erilaisia rekombinanttiproteiineja. Ajateltuja proteiiniesimerkkejä ovat sytokiinit, mukaan lukien monet erilaiset hematopoieettiset tekijät kuten G-CSF, SCF, EPO, GM-CSF, CSF-1, interleukiinit kuten IL-1- IL-12, IGF:t, M-CSF, TNF tai LIF. Muut terapeuttiset proteiinit 25 kuten interferonit (alfa-, beta-, gamma- tai konsensus-interferonit) ja kasvutekijät tai hormonit ovat myös hyödyllisiä, kuten ihmisen tai muun eläimen kasvuhormonit (esimerkiksi sian tai kanan kasvuhormoni), FGF, KGF, EGF ja PDGF. Proteaasin inhibiittorit, kuten metalliproteinaasin 30 inhibiittorit (kuten TIMP-1, TIMP-2 tai muut proteinaasin inhibiittorit) otetaan lukuun. Hermokasvutekijät, kuten BDNF ja NT-3, otetaan myös lukuun. Otetaan myös lukuun pep-tidiosat proteiineista, joissa on koko lähtöproteiinin pri-määrirakenne tai osa siitä, ja ainakin yksi lähtöproteiinin 35 biologinen ominaisuus.

11

Yleensä tässä keksinnössä hyödyllisellä KGF:llä on ihmisen KGF:n tai sille läheisten analogien sekvenssi. Julkaistu PCT-hakemus WO 90/08 771 kuvaa KGF:n puhdistusta ihmisen embryonisen fibroblastisolulinjan muokatusta elatus-5 aineesta, eristetyn polypeptidin osittaisen aminohappose-kvensoinnin, geenin kloonauksen ja ekspression bakteerisoluissa (E. coli) jolloin saatiin rekombinanttinen, biologisesti aktiivinen KGF.

Edullisessa suoritusmuodossa prosessissa käytetty 10 rekombinanttinen isäntäsolu on E. coli. E. coli on edullinen järjestelmä, koska sen genetiikka on karakterisoitu hyvin, se mahdollistaa korkeat solutiheydet, ja sitä voidaan kasvattaa tehokkaasti normaaleissa olosuhteissa (esim. PH :ssa ja lämpötilassa).

15 Muihin elementteihin, jotka tarjoavat keksinnön edullisia suoritusmuotoja, kuuluvat kompleksiset typenläh-teet kuten hiivaekstrakti ja kaseiinin, soijapapujauhon, lihan, veren tai puuvillasiemenjauhon kemialliset diges-tiotuotteet. Kuten ammattimies ymmärtäisi, tämä keksintö 20 käsittää sellaiset menetelmät metallifosfaatin saostumisen torjumiseksi, joissa on monia erilaisia näiden lisäelement-tien yhdistelmiä.

Esimerkki 1

Tasapainotettuja minimialustoja, jotka olivat tyy-25 pillisiä niille joita käytettäisiin tuotettaessa rekombi-nanttiproteiineja E. colissa fermentoinneissa, joissa solu-tiheys on suuri, valmistettiin käyttäen vaihtoehtoisia fos-faatinlähteitä. Minimialustan (annettu nimeksi alusta A) , jossa käytettiin ortofosfaattia fosfaatinlähteenä, "stan-3 0 dardierää1' verrattiin alustaan (annettu nimeksi alusta B) joka hyödynsi fosforinlähteenä Hexaphos™: ia, lasimaista natriumpolyfosfaattia, jonka ketjunpituus on n = 11 ja jota myy FMC Corp.

Alusta A sisälsi glukoosia 45 g/1, hiivaekstraktia 35 3 g/1, (NH4)2S04:ää 1 g/1, K2HP04:ää 4 g/1, KH2P04:ää 4,56 g/1, MgS04'7H20: ta 0,71 g/1, KCl:ää 0,74 g/1, 4,0 ml/1 hi- 12 venainemetalliliuosta A (FeCl3-6H20: ta 27 g/1, ZnCl2-4H20: ta 2,0 g/1, CoC12-6H20: ta 2,0 g/1, ΜηΜο04·2Η20: ta 2,0 g/1,

CaCl2-2H20: ta 1,0 g/1, CuS04-5H20: ta 1,9 g/1, H3B03: ea 0,5 g/1, Μη012·4Η20: ta 1,6 g/1, natriumsitraatti-H20: ta 5 73,5 g/1) ja 4 ml/1 vitamiiniliuosta A (biotiinia 0,06 g/1, foolihappoa 0,04 g/1, pyridoksiini-HCl:ää 1,4 g/1, ribofla-viinia 0,42 g/1, pantoteenihappoa 5,4 g/1, niasiinia 6,1 g/1) . Alusta oli identtinen alustan A kanssa, paitsi että fosfaatinlähteenä käytettiin Hexaphos™:ia (3,33 g/1) 10 K2HP04:n ja ΚΗ2Ρ04:η sijasta.

Kunkin alustan steriloinnin aikana glukoosi ja magnesiumsulfaatti steriloidaan yhdessä, hivenainemetalliliuos A steriloidaan erikseen, ja muut alustan komponentit (mukaan lukien ortofosfaatti) steriloidaan erikseen. Tämä teh-15 dään epäsuotavien sivureaktioiden välttämiseksi. Alustaa B varten Hexaphos™ steriloidaan myös erikseen. Alustan A tapauksessa, kun kaikki steriloidut alustan komponentit sekoitetaan yhteen, tuloksena oleva liuos muuttui sameaksi. Sameuden ajateltiin johtuvan saostumisreaktioiden tapahtu-20 misesta. Alusta B pysyi kuitenkin läpinäkyvänä sekoitettaessa .

Tuloksena olevan sakan paino mitattiin ottamalla alustasta 10 ml:n näytteitä ja suodattamalla kahden nailon-suodattimen läpi (huokoskoko 0,2 pm) (Nalgene, 215 -4 020) 25 suodattimenpitimessä (Nalgene, 300 - 4 100) . Linjassa olevaa toista suodatinta käytettiin arvioimaan massan kasvu, joka johtui liukoisista kiinteistä aineista jotka jäävät kiinni membraaniin. Suodattimia kuivattiin ilmassa useita tunteja ja sitten ne kuivattiin täydellisesti Labware 9000 30 Microwave -kuivatusuunissa jossa oli vaaka. Labware 9000:ta käytettiin määrittämään suodattimien kuivapaino ennen näytteen laittoa ja sen jälkeen. Tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa 1 jäljempänä.

13

Taulukko 1

Alusta Sakan paino A 0,20 g/1 B Ei havaittavissa 5

Esimerkki 2

Suoritettiin fed-batch-fermentointeja, joissa solu-tiheys oli suuri, ja jotka oli suunniteltu tuottamaan re-kombinanttista KGF:ää E. colissa, jotta saataisiin verrat-10 tua fosfaattilasin ja ortofosfaatin käyttökelpoisuutta fos-forinlähteenä panosalustässä ja konsentroitussa syöttöalus-tassa. Määritettiin vaikutukset metallifosfaatin saostumis-tasoihin alustoissa, samoin kuin yleiseen solutiheyteen. Ajo "standardilla" fed-batch-minimialustalla (nimetty ajok-15 si C) jossa käytettiin ortofosfaattia fosforinlähteenä, verrattiin ajoon (nimetty ajoksi D) jossa käytettiin He-xaphos™:ia fosforinlähteenä.

Ajo C:tä varten panosalusta sisälsi glukoosia 5 g/1, (NH4)2S04:ää 1,68 g/1, K2S04:ää 0,05 g/1, NaH2P04· 20 H20:ta 0,36 g/1, MgS04-7H20: ta 0,136 g/1, KCl:ää 0,008 g/1, 0,78 ml/1 hivenainemetalli liuos ta A (FeCl3-6H20: ta 27 g/1, ZnCl2-4H20: ta 2,0 g/1, CoCl2-6H20: ta 2,0 g/1, MnMo04-2H20: ta 2,0 g/1, CaCl2-2H20:ta 1,0 g/1, CuS04-5H20:ta 1,9 g/1, H3B03:a 0,5 g/1, MnCl2-4H20: ta 1,6 g/1, natriumsitraatti· H20:ta 73,5 25 g/1) . Ajo D oli identtinen ajon C kanssa paitsi että

NaH2P04-H20:n sijasta käytettiin 0,28 g/1 Hexaphos™:a.

Ajo C:tä varten syöttöalusta sisälsi glukoosia 651,5 g/1, K2S04:ää 6,52 g/1, NaH2P04-H20: ta 46,91 g/1,

MgS04-7H20: ta 17,69 g/1, KCl:ää 1,08 g/1 ja hivenainemetal-30 liliuosta A 102 ml/1, Syöttöalusta ajo D oli identtinen ajon C syöttöalustan kanssa paitsi että NaH2P04-H20:n sijasta käytettiin 37,2 g/1 Hexaphos™: ia. Kutakin ajoa varten syöttöalustan pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä 36 ml/1 NaOH-liuosta (40 %, v/v).

35 Kuten oli tilanne esimerkin 1 tasapainotettujen syöttöminimialustojen kanssa, ortofosfaatin käyttö fosfo- 14 rinlähteenä johti sakan muodostumiseen kun steriloidut alustakomponentit sekoitettiin. Hexaphos™:n käyttö ei toisaalta saanut aikaan sellaista saostumista. Tuloksena olevan sakan paino mitattiin käyttämällä esimerkissä 1 kuvat-5 tua menetelmää ja tulokset esitetään yhteenvetona taulukos-sa 2 jäljempänä.

Taulukko 2

Ajo Sakan paino 10 C 0,33 g/1 D Ei havaittavissa

Monitoroitiin myös solutiheyksiä ajoissa C ja D. Kussakin ajossa solut kasvatetaan alun perin erinä pa-15 nosalustassa. Sen jälkeen kun glukoosi on kulutettu, aloitetaan jatkuva syöttö käyttämällä syöttöalustaa. Tämän fer-mentoinnin fed-batch-osuuden aikana syöttönopeutta kasvatetaan kahden tunnin välein solutiheyden mukaan. Ajossa C kasvunopeus alkoi 0,08 h_1:sta ja laski 0,04 h‘1:een 42 tun-20 tia syötön alkamisesta kun saatiin solutiheys OD 65. Sitten OD laski. Ajossa D fermentointi kasvoi tasaisella nopeudella 0,09 h"1 43 tuntia, kun saatiin solutiheys OD 92. Sitten OD laski (katso kuvio 1). Tuloksena oli lopullinen solutiheys 61 g solukuivapainoa/litra ajolle D, verrattuna vain 25 43 g:aan solukuivapainoa/litra ajolle C. Tuloksena ajo D

tuotti 180 mg/litra KGF; ää kun taas ajo C tuotti 120 mg/litra KGF:ää.

Esimerkki 3

Useita muita polyfosfaatteja (joiden ketjunpituudet 30 olivat välillä n = 2 - n = 19} kuin Hexaphos™ käytettiin fosforinlähteenä alustapreparaateissa, jotka olivat tyypillisiä niille joita käytettiin E. colissa fermentoinneissa joissa solutiheys on suuri. Useita alustoja, jotka sisälsivät glukoosi:fosfori- ja glukoosi:magnesium-suhteita, jotka 35 olivat tyypillisiä niille suhteille, jotka ovat välttämättömiä fermentoinneissa, joiden solutiheys on suuri, formu- 15 loitiin siten että sekoitettiin glukoosi/magnesiumsulfaatin väkevä kantaliuos (joka sisälsi glukoosia 888 g/1) eri fosforia sisältävien yhdisteiden konsentroitujen vesiliuosten kanssa. Kunkin tuloksena olevan liuoksen pH säädettiin pH-5 arvoon 7,0 käyttämällä joko 40 % NaOH:ta tai 30 % HCl:ää.

Kunkin liuoksen visuaalisia tutkimuksia suoritettiin päivittäin viiden päivän ajan sakan muodostumisen tutkimiseksi. Tulokset esitetään yhteenvetona jäljempänä taulukossa 3. Tulokset osoittavat, että Hexaphos™:n käyttö 10 fosforinlähteenä alustassa mahdollistaa niinkin korkeiden glukoosikonsentraatioiden käytön kuin 800 g/1 ilman saostu-misen ilmenemistä. Glass H™:n, lasimaisen natriumpolyfos-faatin, jonka ketjunpituus on h = 19, ja Sodaphos™:n, lasimaisen natriumpolyfosfaatin, jonka ketjunpituus on h=4, 15 käyttö mahdollistaa niinkin korkeiden glukoosikonsentraatioiden käytön kuin 600 g/1. Toisaalta ortofosfaatin käyttö sallii maksimiglukoosikonsentraatioksi vain 462 g/1.

Taulukko 3

Fosforilähde Ketjun- Sakan muodostumiseen tarvittava päivien määrä __pituus__

800 g/L 600 g/L 400 g/L 200 g/L 100 g/L

___glukoosi__glukoosi__glukoosi__glukoosi glukoosi

Glass H™__19__2__Ei mitään Ei mitään Ei mitään Ei mi jääti

Hexaphos™__11__Ei mitään Ei mitään Ei mitään Ei mitään Ei mitään

Sodaphos™__4__2__Ei mitään Ei mitään Ei mitään Ei mitään

Tripolyfosfaatti 1__1__1__1__Ei mitään Ei mitään

Ortofosfaatti N/A__M/A__0^__Ei mitään Ei mitään Ei mitään 20 Nämä tulokset osoittavat, että monet eri lasimaiset natriumpolyfosfaatit eliminoivat tehokkaasti ravinteiden saostumista konsentroiduissa alustoissa, joita käytetään tuotettaessa rekombinanttiproteiineja fermentoinneissa, 25 joissa solutiheys on suuri.

16 Tässä esitetyt tulokset osoittavat käytännöllisen menetelmän, jolla voidaan torjua metallifosfaatin saostu-misreaktioita alustassa jota käytetään bakteeritermentoin-tiprosesseissa, joissa solutiheys on suuri, ja ne tarjoavat 5 parantuneen solujen kasvun ja proteiinintuotannon monissa erilaisissa bakteeritermentointiprosesseissa, joissa solu-tiheys on suuri,

Claims (12)

1. Menetelmä saostumisen vähentämiseksi bakteerifer-mentointiprosessissa rekombinanttiproteiinin tuottamista var- 5 ten mainitussa prosessissa, tunnettu siitä, että siinä käytetään fosfaattilaseja fosforinlähteenä kasvualustassa mainitun proteiinin tuotannon aikana, jolloin mainittu prosessi on suuren solutiheyden fermentaatioprosessi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-10 n e t t u siitä, että mainitut fosfaattilasit valitaan ryhmästä, joka koostuu natriumfosfaattilaseista, joiden ketjun pituudet ovat välillä noin n = 2 - noin h = 100, jolloin ketjun pituus on määritelty kuten kaavassa PO4 - (PO3) h - PO4.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n-15 n e t t u siitä, että mainitulla fosfaattilasilla on ket- junpituus noin n = 4 - noin h = 20.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitulla natriumfosfaattilasilla on ketjunpituus n = 11.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittu fermentointi, jossa soluti-heys on suuri, voi olla panosfermentointi, jatkuva fermentointi tai fed-batch-fermentointi.

6. Menetelmä solutiheyden kasvattamiseksi bakteeri-25 fermentointiprosessissa rekombinanttiproteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että alustassa käytetään fosfo-rinlähteenä fosfaattilaseja mainitun proteiinin tuotannon aikana, jolloin mainittu prosessi on suuren solutiheyden fermentaatioprosessi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainitut fosfaattilasit valitaan ryhmästä natriumfosfaattilaseja, joiden ketjunpituus on välillä noin n = 2 - noin n = 100, jolloin ketjunpituus on määritelty kuten kaavassa PO4 - (PO3) n - P04.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitulla natriumfosfaattilasilla on ketjunpituus noin n - 4 - noin n = 20.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että mainitulla natriumfosfaattilasilla on ketjunpituus n = 11.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu fermentointi, jossa soluti-heys on suuri, voi olla panosfermentointi, jatkuva fermen- 10 tointi tai fed-batch-fermentointi.

11. Menetelmä saostumisen vähentämiseksi fermentoin-tiprosessissa, jonka solutiheys on suuri, rekombinanttipro-teiinin tuottamiseksi E. colissa, tunnettu siitä, että käytetään fosfaattilasia jonka ketjunpituus on noin 15 n = 4 ~ noin n = 20, jolloin ketjupituus on määritelty kuten kaavassa P04 - (PO3) n - PO4 fosforinlähteenä alustassa mainitun proteiinin tuotannon aikana.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitulla fosfaattilasilla on 20 ketjunpituus noin n = 11.