NO317796B1 - Dyrkningssubstrat for dyrkning av benceller og fremgangsmate for fremstilling derav,samt anordning til bestemmelse av bencelle-egenskaper - Google Patents

Abstract

En kalsiumbasert tynn film på hvilken benceller kan bli dyrket for å muliggjøre vurdering av de funksjonelle egenskaper hos benceller, omfatter kalsiumfosfat-enheter som fremskaffer en varierende grad av resorpsjon av kalsiumfosfat-enhetene til vurdering av de funksjonelle egenskaper. Filmen er tilstrekkelig tynn til at resorpsjon av enhetene kan påvises. En slik film, som påført et støttemateriale, er en meget nyttig analytisk komponent for å vurdere slike karakteristika hos benceller. En analytisk anordning som kan bli brukt i et analytisk sett kan bli fremskaffet, og som har et antall brønner med anordningene beliggende på bunnen derav. Det er beskrevet en fremgangsmåte ved fremstilling av filmen, og spesielt en film som har en komb inasjon av kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et dyrkningssubstrat for dyrkning av benceller in vitro for å tillate vurdering av funksjonelle egenskaper hos benceller, såsom osteoclastaktivitet, som er nyttig ved analyse av normale bencelle-prosesser, bestemmelse av forskjellige metabolske bensyk-domer, såsom osteoporose hos mennesker og vurdering av potensielle medikamentbehandlinger for å påvirke bencelleaktivitet. Dyrkningssubstrat omfatter de trekk som er angitt i krav l's karakteriserende del.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Det finnes to typer benceller, de som danner ben, osteoblaster, og de som reabsorberer ben, osteoclaster. Disse celler har meget nøyaktige funksjoner, og balansen mellom deres aktiviteter er kritisk for opprettholdelse av skje-lett-systemet. Hos voksne mennesker er f.eks. mellom 10 og 15% av trabekularoverflåtene dekket med osteoid (nytt umineralisert ben dannet av osteoblaster), mens omkring 4% har aktive resorptive overflater. Den dynamiske natur av den kontrollerende strømning av bencelleaktivitet blir illustrert ved beregningen at omkring 18% av totalt skjel-letalt kalsium normalt kan fjernes og avleires over en periode på ett år.

Osteoclaster som reabsorberer ben, er ikke bare av sentral viktighet i utformingsabnormaliteter, såsom osteoporose,

som er særpreget ved hypofunksjon, og Paget<1>s sykdom hvor det blir funnet øket benresorptiv aktivitet, men også i enkelte av de største såkalte metabolske bensykdommer. Uttrykket metabolske bensykdommer refererer til skjelett-lidelser som foreligger generelt i skjelettet, og således finnes ingen områder med normalt benvev i skjelettet. I disse sykdomsprosesser er bencellenes normale funksjon modifisert. Å påvise graden av ødeleggelse av celleopp-førsel og hvordan disse ytterligere kan modifiseres ved virkningen av farmasøytiske midler, er av sentral viktighet

for både en forståelse av sykdomsprosessene og funksjonen av selve cellene.

Aktiviteten av osteoclaster in vivo kan bli målt kun i dyremodeller, hvor rekkefølgen av disse cellers aktivitet blir funnet ved histologiske metoder eller biokjemiske målinger, f.eks. av kalsiumnivå i serum. Flere forsknings-grupper har utviklet metoder for direkte å observere aktiviteten av isolerte osteoclaster in vitro. Det har blitt oppnådd vesentlig suksess når osteoclaster isolert fra benmargcelle-populasjoner har blitt dyrket i tynne skiver av enten spermhvalstannvev (Boyd et al., Brit. Dent. J., 156, 215, 1984) eller ben (Chambers et al., J. Cell Sei., 66, 383, 1984). Den sistnevnte gruppe har vært istand til å vise at denne resorptive aktivitet ikke blir delt av andre celler av den mononukleære fagocytt-serie (Chambers & Hor-ton, Calcif Tissue Int. 36, 556, 1984). Nyligere har forsøk på å bruke andre cellekulturteknikker for å studere osteo-clastlinjen fremdeles måttet basere seg på bruken av cortikale benskiver (Amano et al. og Kerby et al, J. Bone & Min. Res. 7(3), hhv. side 321-328 og s. 353-362), og det er stadig tydeligere at mengdebestemmelse av resorpsjonsakti-viteten baserer seg på enten todimensjonal analyse av resorpsjonslommer av variabel størrelse eller stereo-kartlegging av resorpsjonsvolumet. Slike teknikker kan vanligvis gi en nøyaktighet i resultatet på omkring 40 til 60%. Sistnevnte gir mye større nøyaktiget, kanskje opptil 70%, når resorpsjon av relativt tykke substrater blir undersøkt, med er meget tidskrevende og krever høyt spesialisert utstyr og opplæring, og gir således ikke en potensielt enkel tilnærming til dette problem.

Videre er fremstillingen og etterfølgende undersøkelse av ben- eller tannskiver hverken en lett eller praktisk løs-ning for undersøkelsen av osteoclast-aktivitet. Spesielt kan disse substrater ikke bli foreslått for rutinemessig bruk utenfor det høyt spesialiserte laborieforskningsmiljø. Imidlertid har bruken av kunstige kalsiumfosfatpreparater som substrater for osteoclastdyrkning oppnådd liten suksess. Jones et al (Anat. Embryol. 170, 247, 1984) rappor-terte at osteoclaster resorberte syntetisk apatitt in vitro, men klarte ikke å gi forsøksmessig bevis, og senere har Shimizu et al. (Bone & Mineral 6, 261, 1989) rapportert at isolerte osteoclaster vil resorbere kun devitaliserte benoverflater og ikke syntetisk kalsiumhydroksyapatitt. Disse resultater indikerer at det ikke er verdt å gå videre med kunstige overflater. Også en artikkel av Vrouwenvelder, W.CA. et al. (J. Biomed. Mater. Res. (1993), 27 (4), s. 465-75) beskriver dyrkning av osteoclaster på bioaktivt glass, hydroksyapatitt, en titanlegering eller rustfritt stål.

En annen teknikk ved evaluering av metabolske bensykdommer er å bestemme mengden av kalsium i kroppsvæsker. Japansk patent 04184256, publisert 1. juli 1992, beskriver bruken av en polyakrylamidgel ved evaluering av utstrekningen av kalsium i kroppsvæsker. Kalsium blir avleiret på gelen og utstrekningen av avleiret kalsium blir så målt optisk. Kalsiumet blir avleiret ved bruken av en komponent som induserer kalsifisering. Fortrinnsvis er kroppsvæsken blod, som så blir behandlet for å forårsake kalsifisering og avleiret kalsium på gelen for påfølgende optisk måling. Probemet med denne type undersøkelse er at kilden for kalsiumet ikke kan bestemmes.

Andre teknikker som involverer bruk av lystransmisjon er beskrevet i US patent 4.951.097. To forskjellige mono-kro-matiske fotografier av benprøven blir brukt for å regne ut de kalsifiserte ben-, osteo- og benmargområder. Ekstraksjon av en del ben involvererer imidlertid kirurgisk inngrep, noe som kan føre til forskjellige komplikasjoner.

Betydelig arbeid har også blitt gjort når det gjelder vektløshet eller pasienter som må ligge i sengen i lange perioder. Russisk patent 1.139.414, publisert 15. februar 1985, beskriver vurderingen av hastigheten av fysiologisk rekonstruksjon av benvev. Denne verdi blir beregnet utfra et totalt tap av kalsium fra pasienten over perioden som er under undersøkelse, hastigheten av fysiologisk rekonstruksjon av benet som er under undersøkelse og en total masse av fornyet kalsium. Denne teknikk er av spesiell interesse ved overvåkning av tilstanden hos astronauter.

Mens de fleste mennesker er klar over hvordan muskler vil forsvinne når de ikke blir brukt, vil benmasse på samme måte tapes under lignende omstendigheter. Tap av benmasse er kritisk i mange sykdomsprosesser (f.eks. osteoporose), men er også av vesentlig viktighet etter skade, sengeleie og også mer nylig under forlenget romfart når normale gravitasjonskrefter ikke kan stimulere benaktiviteten. Osteoblaster og osteoclaster virker imidlertid ikke uavhengig av hverandre, og mange tilfeldige bevis eksisterer på celle-signalisering mellom disse to celler {Hersche J.N.M., Calif. Tiss. Res. 26, 81-84 (1978), selv om lite er forstått av disse inviklede prosesser. Virkningen og samvirkningen av benceller er følgelig av interesse for forskjellige grupper forskere, fra de som ansvarlige for å utarbeide trimprogrammer for astronauter til leger som behandler metabolske bensydommer. Produsenter som lager og kirurger som implanterer proteser i ben er også like interessert i å forstå hvordan materialene de bruker kan ødelegge (eller forbedre) den fine balanse i bencelleaktivitet. Av disse grunner er også den farmasøytiske industri involvert i dette forskningsområde, spesielt ved å finne ut hvordan medikamenter kan innvirke på aktiviteten av og balansen mellom disse celler.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er nå i henhold til foreliggende oppfinnelse -utviklet et dyrkningssubstrat som kan brukes i syntetiske kalsiumfosfatfilmer for benceller, og spesielt osteoclaster. Formålet med en tynn film er å gi en lettere anordning enn det som tidligere har vært tilgjengelig for å undersøke den resorptive aktivitet av osteoclaster.

Filmen kan lages på reproduserbar måte og er egnet for bruk som en analytisk test for å undersøke den resorptive aktivitet av enten humane eller dyre-osteoclaster som resultat av sykdom eller behandling med farmasøytiske eller andre bioaktive midler, eller mekaniske, kjemiske eller fysiske miljømessige endringer. Spesielt kan hele de kunstige substrater eller filmen billig pakkes i form av et analyse-sett for å undersøke osteoclast-aktivitet.

Dyrkningssubstratet ifølge oppfinnelsen kan brukes i kliniske medikamentutvelgelsesprogrammer. Ved å bruke dyrkningssubstrat i form av en film, kan en mengde analytiske teknikker anvendes for å etablere nye forbindelser for behandling av metabolske bensykdommer, såsom osteoporose, basert på deres effekt på osteoclastaktivitet.

Dyrkningssubstratet ifølge oppfinnelsen kan også bli brukt i et analytisk sett for å bestemme en pasients bencelleaktivitet, såsom osteoclast-aktivitet, og således tilbøye-lighet til eller grad av metabolsk bensykdom. Et slikt sett er også nyttig for å studere effekten av reduserte gravitasjonskrefter på osteoclaster. Det analytiske sett kan anvendes i rommet for å bestemme osteoclastakivitet under reduserte gravitasjonskrefter.

I henhold til et annet aspekt av oppfinnelsen er det fremskaffet en fremgangsmåte for å fremstille filmer med en sol-gel beleggingsteknikk som angitt i krav 11. Et ytterligere aspekt er fremskaffelsen av en prosess for å dyrke osteoclast-celler på den nye film.

I henhold til et annet aspekt av dyrkningssubstratet- ifølge oppfinnelsen er det fremskaffet en kalsiumfosfatbasert tynn film, på hvilken benceller kan bli dyrket for å muliggjøre vurdering av de funksjonelle egenskaper i benceller: den tynne film omfatter kalsiumfosfatenheter som gir varierende grader av resorpsjon av kalsiumfosfatenhetene ved vurdering av de funksjonelle egenskaper, idet filmen er tilstrekkelig tynn til at resorpsjon av nevnte enheter kan påvises ved en fysisk forsvinning av kalsiumfosfatenhetene.

Dyrkningssubstrat ifølge oppfinnelsen kan anvendes en komponent for bruk i et analytisk eller diagnostisk sett for å vurdere funksjonelle karakteristika hos benceller hvor komponentene omfatter:

et filmsubstrat for å støtte en film pålagt dette,

en kalsiumfosfatbasert film på hvilken benceller kan bli dyrket, hvor filmen har den ovennevnte sammensetning.

I henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det fremskaffet en analytisk eller diagnostisk anordning til vurdering av funksjonelle egenskaper hos benceller, hvor anordningen omfatter:

en innesluttende brønn,

et substrat pålagt bunnen av brønnen, hvor substratet har en film av den ovennevnte sammensetning på seg, og med filmen vendende oppad i brønnen,

anordninger for å avdele filmoverflaten i adskilte forsøkssoner dersom filmsubstratet er større enn en enkelt forsøkssone, og

anordninger for å dekke brønnen inntil den blir brukt.

I samsvar med et ytterligere aspekt av oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten det å danne en film som har de ovennevnte egenskaper hvor sol-gel-prosessen omfatter: å kombinere en sol av et ammoniumfosfat med en sol av et kalsiumnitrat over en forlenget periode for å danne en sol-gel,

påføre en film av sol-gelen på minst en overflate av substratet, og

sintre det filmbelagte substrat for å danne en fast film av kalsiumhydroksyapatitt og/eller trikalsiumfosfat, hvor den relative mengde av kalsiumhydroksyapatitt og tri-kalsiumfosfat blir bestemt ved å variere betingelsene i trinnet for fremstilling av solen og sintringen av filmen, idet de variable betingelser er en eller flere av parameterne ved dannelse og preparering av solen, som innbefatter graden og utstrekningen av blanding under og etter fremstilling av solene og sintringsparameterne som inkluderer temperatur og sintring i en utvalgt atmosfære.

I samsvar med et annet aspekt av substratet ifølge foreliggende oppfinnelse kan dette benyttes i en metode for celle-dyrkning som viser resorpsjonen i kultur av både levende benvev og syntetisk ben. Fordelen med denne prosess er at den anvender celler avledet fra voksne i stedet for embryo-niske eller føtale celler benyttet i andre teknikker. Imidlertid er det underforstått at føtale celler kan brukes, om ønsket.

Ettersom sykdomsforløpene av interesse i hovedsak er for-bundet med voksne, og ettersom det generelt er voksne som får benimplantasjoner og blir romfarere, gir denne dyrk-ningsteknikk en mer realistisk in vitro forsøkstilnærming enn andre metoder.

Dette arbeid har satt oppfinnerne i stand til å undersøke morfologien av resorpsjonsområdene dannet av osteoclastene og å sammenligne disse med lignende områder dannet i biologiske substrata av hardt vev (Jones et al., Anat. EmbryOl. 170, 247, 1984).

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

Den tynne film slik den er anbragt på et passende støttema-teriale i samsvar med foreliggende oppfinnelse, fremmer i hovedsak studiet og forståelsen av de funksjonelle egenskaper hos benceller. Sammensetningen av filmen som beskrevet i samsvar med foreliggende oppfinnelse, tillater dyrkning av benceller på denne, hvor sammensetningen av overflaten kan bli justert for å fremme en signifikant grad av resorpsjon av kalsiumfosfatenhetene i filmmaterialet frem til en neglisjerbar grad av resorpsjon av kalsiumfosfatenhetene. Muligheten for nå å fremskaffe materiale i en film som er tilstrekkelig tynn til at resorpsjon av enhetene kan påvises ved forsvinning av resorberte kalsiumfosfatenheter, gir en enkel og billig mulighet for analyse, sammenlignet med metoder ifølge tidligere teknikk. Det er spesielt overraskende at sammensetningen av filmen i substratet i samsvar med foreliggende oppfinnelse støtter dyrkningen av benceller på grunn av de feilslag som har skjedd tidligere ved forsøk på å dyrke benceller og spesielt osteoblaster og/eller osteoclaster på kalsiumhydroksyapatittfilmer. Oppfinnelsens fordel, at den fremskaffer filmen på et gjennomsiktig støtte-substrat, såsom kvarts eller glass, gjør evalueringsteknikker ved den diagnostiske prosess enklere.

Ideelt er filmtykkelsen større enn 0,1 um, fordi det har blitt funnet at ved filmtykkelser mindre enn 0,1 um er det vanskelig å fremskaffe uniform homogen filmdekning som er fri for adskilte tomme områder. Med hensyn til den øvre grense for filmens tykkelse, kan denne være av enhver ønsket tykkelse, avhengig av dens sluttanvendelse. Slik det vil bli forklart, kan graden av resorpsjon bli påvist ved lystransmittans, noe som fortrinnsvis krever en film som er mindre enn 10 um tykk. Det vil bli forstått at tykkelser større enn 10 um kan være anvendelige, og slike tykkelser kan bli bygget opp av flere gjentatte påføringer til støt-tesubstratet av sol-gelen dannet ifølge oppfinnelsen, hvor sol-gel-belegget får tørke mellom hver påføring. Fortrinnsvis er substratet av kvarts eller et annet termisk tolerant materiale på grunn av den nødvendige sintring av filmen når den har blitt påført substratet. Andre materialer innbefatter metaller, polymerer eller keramiske materialer som er forskjellige fra filmmaterialet. Glass kan brukes når filmmaterialet blir sintret ved bruk at en overflatesintrings-anordning som varmer glassoverflaten til en meget høy temperatur over en kort tidsperiode for å oppnå graden av sintring som er nødvendig for å fremskaffe den ønskede filmtype. Kvarts motstår lett disse temperaturer og har den ønskede grad av gjennomsiktighet for å tillate utføring av lystransmittans-forsøk for å bestemme graden av resorpsjon av kalsiumfosfatenheter fra filmmaterialet.

Det vil bli forstått at forskellige aspekter av oppfinnelsen kan bli utført på en mengde forskjellige måter for å oppnå fordelene med å bestemme osteoclastaktiviteten. Det skal forstås at det finnes mange utførelsesprosesser for å utføre aktivitetesbestemmelse på filmsubstratene ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor de kritiske faktorer som må tas i betraktning ved utviklingen av tynnfilmsubstratene og dens effekt på bioaktivitet innbefatter:

i)filmuniformitet,

ii)filmtykkelse,

iii)filmoverflate-morfologi (fri for overflatesprekker og tomrom),

iv)filmsammensetning,

v)film-krystallstruktur,

vi)film-kornstørrelse,

vii)prosentdel av amorf fase, og

viii)filmadhesjon til støttesubstratet.

Disse faktorer blir påvirket av de følgende prosesspara-metere: 1. Kontrollert utviklet elding i løpet av en sol-gel-prosess for å danne filmen,

Korrekt gelatering sikrer at filmer kan bli fremstilt uten tomrom mellom avleirede partikler.

.2. Kontroll av omgivelses-prosesstemperaturen.

- Temperaturen blir fortrinnsvis opprettholdt ved 23°C + 2°C for å stabilisere reaksjonstider og sol-viskositet. 3. Reaksjonsmediets pH blir fortrinnsvis holdt mellom 11,5 og 12. 4. Renhet av substratet før beleggpåføring er et viktig trekk. 5. Kontroll av dyppebeleggings-hastigheten har også en innvirkning på filmkarakteren.

Substrat-bevegelseshastigheten blir fortrinnsvis holdt ved 10-20 cm pr. minutt. 6. Temperatur og atmosfære ved sintringen er viktige trekk.

7. Mengder av reagenser for å fremstille solene.

8. Kombinasjonshastighet av reagenser.

9. Varighet og hastighet ved blanding innbefattende ingen blanding. 10. Alternativt, varighet og betingelser for elding, innbefattende ingen elding.

11. Hastigheter og metoder for presipitat-separasjon.

12. Omgivelsesbetingelser for prosessen i tillegg til den ovenfor nevnte temperatur.

Oppfinnelsen som en anordning kan bli utført i form av et "sett" omfattende glass-substrater, {eller andre egnede gjennomsiktige støttematerialer) på forhånd belagt med en festende tynnkalsiumfosfatfilm, som kan bli brukt i et celledyrkningskammer (hvis mulig en 24-brønners eventuelt sterilisert multibrønnplate, dvs. med omtrent 15 mm diameter) som et substrat som er egnet for dyrkning av blandede bencellepopulasjoner. Anordningen er enkel og baserer seg kun på rutinemessig laboratorieutstyr og bruksteknikker, den er egnet for kvantitativ analyse og er billig å produ-sere, men sterk nok til å motstå normale håndteringsnivåer og kan bli pakket i større kvanta på (for eksempel) 24 prøver i en presentasjonseske av plast. Tynnfilmoverflåtene har en definert og reproduserbar sammensetning og er mekanisk sterke nok til å motstå transport når de brukes med et passende pakkemateriale.

Modifikasjoner av anordningen kan bli utarbeidet for spesi-elle formål. For eksempel kunne hvert substrat bli presentert i en støttering av plast. Sistnevnte kunne bli anvendt ikke bare som en avstandsgivende anordning i pakken og således bli sterilisert med substratet, men også som en leppe for å forhindre spredning av kulturmedium fra selve substratet, og således lette mengdebestemmelse av den resorptive aktivitet. Slike beskyttelsesringer kunne også bli brukt som stableanordninger for å muliggjøre at flere substrater kan bli anvendt samtidig i samme dyrkningsbrønn. Sistnevnte kunne så bli lukket i et forseglet dyrningskam-mer utstyrt med sirkulerende medium og kunne også bli benyttet for omgivelser med lav eller null gravitasjon.

I hvert tilfelle kan dyrkningsbetingelsene være slik at osteoclaster i enten mononukleær eller multinukleær form kunne ventes å overleve i en funksjonell tlstand og resorbere filmens kunstige kalsiumfosfat.

'Disse substrater kan brukes for å undersøke den resorptive aktivitet av osteoclaster og overvåke endringen i dette nivå av resorptiv aktivitet, enten som resultatet av en sykdomsprosess eller av innbefattelse i kulturmediet av et

middel såsom et medikament, som enten direkte eller indirekte ville invirke på osteoclastisk resorptiv aktivitet.

Anordningen kan bli brukt som en innretning for å mengde-bestemme den resorptive aktivitet av osteoclaster. Slik aktivitetsanalyse kan utføres under kontinuerlig reell-tids-overvåkning, tidsavbrudds-intervaller og endepunkts-bestemmelse. Trinnene for å etablere osteoclastakivitet er felles for hver av de ovennevnte overvåkningsprosedyrer ved at benceller (enten animalske eller humane) blir dyrket under spesifikke betingelser på grupper av anordningene. Dyrkningsperioden er fra flere timer til mange dager og fortrinnsvis fra omkring 2 til 10 dager {den optimale tid er avhengig av celletype og metode), i løpet av hvilken tid utstrekningen av osteoclastaktivitet kan bli kontinuerlig overvåket, periodisk overvåket eller simpelthen ikke overvåket mens den pågår til fordel for endepunkts-bestemmelse.

Flere forskjellige osteoclastaktivitets-analyseteknikker kan bli benyttet uavhengig av hverandre eller i kombinasjon. Premissene for hver teknikk er mengdebestemmelsen av graden av osteoclastcellene i kulturs resorpsjon av kal-siumf osfat-tynnfilmoverflaten. Ved påvisning av at det inntreffer resorpsjon og i betraktning av de forskjellige teknikker for å gjøre dette, vil det bli forstått at på grunn av naturen av den tynne film ifølge oppfinnelsen kan en påvisning nå bli foretatt av den fysiske forsvinning av kalsiumfosfatenhetene. Den fysiske forsvinning kan nå bli påvist enten direkte eller indirekte.

Et eksempel på optisk endepunktsbestemmelse av den resulterende overflate involverer fjerningen av hver skive fra kultur slik at alle celler fjernes fra overflaten, hvoret-ter et rutinemessig histologisk fikseringsmiddel blir anvendt og anordningen blir farget for å vise tilstedeværel-sen av kalsiumfosfat. Fargingen blir tatt opp kun i de områder av kalsiumfosfat-tynnfilmen som ikke har blitt av-dekket, og som derfor vil opptre som mørkere enn de resorberte områder. Ved å plassere anordningen på standard transmisjons-lysmikroskop er det mulig å visualisere de områder som er blottet for kalsiumfosfat, fordi lys vil bli transmittert gjennom disse. Anordninger for å mengdebestem-me mengden av lys som transmitteres kan brukes hvor graden av resorpsjon kan mengdebestemmes, ved å korrelere en . endring i lystransmissivitet og osteoclastaktivitet. I en utvidelse av denne teknikk blir en blank overflate anbrakt på substratet under fremstilling av anordningen, og mengden av lys som reflekteres fra påfølgende områder av resorpsjon, blir mengdebestemt ved å bruke lignende avbildnings-teknikker. I de tilfeller hvor sammensetningen eller struk-turen av det ønskede osteoclast-påvisningssett ikke tillater praktisk bruk av standard mikroskopiinstrumenter, kan imidlertid passende transmisjon av det resulterende bilde fra substratområdet til fjerntliggende bildeanalyseutstyr foregå via optiske fibre eller elektrisk impuls fra lysde-tektoranordninger montert nær substratet.

Det vil også bli forstått at andre teknikker er tilgjengelige for å finne graden av kalsiumresorpsjon, såsom ved å påvise endringer i elektrisk konduktivitet eller kapasitans gjennom filmen. De elektriske egenskaper kan bli relatert til graden av kalsiumfosfatresorpsjon. De elektriske egenskaper kan bli etablert ved å bruke elektrisk ledende pla-ter eller elektroder som har substratet anbrakt mellom seg. Utstrekningen av hull utviklet ved resorpsjon av substratet vil resultere i endringer i de elektriske egenskaper for filmen som ligger mellom platene eller elektrodene. Det vil også bli forstått at disse forskjellige teknikker kan bli brukt uavhengig av hverandre eller en eller flere av disse i kombinasjon.

Det vil bli forstått at de ovennevnte teknikker kan bli automatisert for å øke effektiviteten av analyseprosedyren. Automatikkgraden kan strekke seg fra dyrkningsteknikkene til analysen av osteoclastaktivitet. I tillegg kan slik automatisering bli utformet slik at den kan tilknyttes en computerisert database for statistisk analyse av de resulterende data. Videre vil det bli forstått at det kan vurderes å anvende flere anordninger samtidig, slik at hele 24-brønners settet (for eksempel) kan bli vurdert ved ethvert gitt tidspunkt.

I henhold til foreliggende oppfinnelse, hvis formålet er undersøkelser angående redusert gravitasjon i romfartøyer (f.eks.), vil de beskrevne analyseteknikker og systemer være innesluttet i en passende transportbeholder. Spesielt ville fjernbestemmelsen av osteoclastaktivitet via optiske fibre eller elektriske impulser hjelpe til ved den totale pakking av systemet for å oppta minimal fysisk plass. Inne i transportbeholderen kan det stables skiver i grupper på 10 (f.eks.) og innesluttet i spesialbygde dyrkningskamre. Disse kamre kan bli utviklet som en del av forberedelsene til en romferd. Et eksempel på håndteringssystemet for kulturmediet som er tilstede i dyrkningskammeret involverer at dyrkningsvæske blir pulsert inn i kammeret inneholdende dyrkningsplatene fra et tilsluttet dyrkningvæske-reservoar, mens det brukte medium blir ført til en påfestet avfalls-beholder. Hver plate kan bli tilført celler før endelig pakking og således bli en fullstendig funksjonerende og selvstendig enhet presentert som bagasje i romfartøy under trykk. Antallet dyrkningsenheter pr. bagasjeenhet kan varieres, og kompleksiteten av variablene som undersøkes, vil være avhengig av den tilgjengelige bagasjeplass. Forsø-kets varighet vil være begrenset til det tidspunkt fartøyet vender tilbake, og således blir det ikke nødvendig med opp-bevaring på selve romstasjonen. Energiforbruket blir kontrollert innenfor enheten som inneholder sin egen energi-kilde, og krever således ikke energi fra romfartøyet. Kun en beskjeden del av mannskapets tid vil være nødvendig ut over den som behøves for lasting og lossing av bagasjen ved starten og slutten av hver tur. Data angående osteoclast-aktivitet kan bli fremskaffet både kontinuerlig under reisen eller ved overvåkning ved varierende tider og ende-punktbestemmelse etter turen. Databehandling kan være inne-holdt i dyrknings-enhetene, og innhenting av data angående-hvordan enheten har fungert, kan undersøkes ved tilbakekom-sten .

Dataanalyse rettet mot mengdebestemmelsen av resorptiv aktivitet av cellene kan utføres ved et egnet laboratorium etter hver tur. Det er også underforsått at systemet kan brukes som et diagnostisk sett for å undersøke graden av demineralisering av ben som oppstår spesielt i astronauter som resultat av langtidseksponering for tilstander med null gravitasjon.

Det vil bli forstått at systemene og teknikkene som er beskrevet, kan brukes i forskjellige landbaserte laborato-rier som skaper tilstander som stimulerer enten øket gravitasjon, redusert gravitasjon eller null gravitasjon.

Selv om forbeholdet at ren eller i hovedsak ren kalsium-hydroksyapatitt var ment å være den utvalgte kalsiumfosfat-enhet ved fremstillling av filmen, har oppfinnerne bestemt at filmer som i hovedsak er av kalsiumhydroksyapatitt ikke fremmer normal vekstutvikiing og faktisk blir, ved tilste-deværelse av osteoclaster, meget liten resorpsjon av filmmaterialet observert. Det har imidlertid blitt funnet at ved å tilføre en blanding av kalsiumfosfatenheter som inkluderer kalsiumhydroksyapatitt og trikalsimfosfat, blir graden av resorpsjon fremmet via et bredt område hvor filmen i hovedsak av trikalsiumfosfat gir høyeste grad av resorpsjon, mens en film som i hovedsak består av kalsium-hydroksyapatitt gir en liten grad av resorpsjon. Det er denne oppdagelse som forklarer at andre kalsiumfosfatfilmer ikke klarer å fremme normale funksjonelle egenskaper hos benceller som blir dyrket på filmene. Dette aspekt i kombinasjon méd det andre aspekt av oppfinnelsen, som fremskaffer en tynn film som tillater f.eks. transmittans av lys, gjør det mulig å utføre diagnostiske fremgangsmåter for å vurdere flere funksjonelle egenskaper hos benceller som blir dyrket på filmen i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

I henhold til foreliggende oppfinnelse har forskjellige behandlingsparametere blitt utviklet for på reproduserbar basis å gi et område med forhold mellom kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat for filmsammensetningen. Fortrinnsvis ligger forholdsområdet fra 10:90 til 90:10, hvor det lavere forhold på 10:90 gir største grad av resorpsjon av kalsiumfosfatenhetene av normale benceller av osteoclasttype og hvor øvre forhold på 90:10 gir en neglisjerbar grad av resorpsjon av kalsiumfosfatenhetene av normalt friske benceller av osteoclasttype. Distinksjonen når det gjelder å identifisere normalt sunne osteoclaster er at det er underforstått at forskjellige forhold i filmsammensetningen kan brukes for å vurdere abnormale benceller og spesielt abnormale osteoclaster, for å bestemme deres funksjonelle kakteristika i enten i høyt resorptive omgivelser eller neglisjerbart resorptivte omgivelser, dvs. ved de forskjellige endepunkter av spektrumene av de foreslåtte forhold. Videre kan de forskjellige spektre med hensyn til blandingen av kalsiumhdroksyapatitt og trikalsiumfosfat være anvendelige ved vurdering ikke bare av de funksjonelle aspekter av osteoblaster og osteoclaster, men også av røde og hvite blodceller, stamceller og andre celler som er van-lige i ben. Videre er det underforstått at trikalsiumfos-faten kan foreligge enten som a-trikalsiumfosfat eller B-trikalsiumfosfat. a-formen er foretrukket for trikalsium-fosfaten på grunn av den tilsynelatende resorpsjon av alfa-formen, selv om det er klart at beta-formen eller en kombinasjon av alfa og beta-former kan være anvendelige utfra det standpunkt å observere bencellenes resorptive egenskaper.

Kalsiumfosfaten som påføres substratet blir utført på en måte i samsvar med spesiell kjemi for å gi et tynn lag som i hovedsak består av kalsiumhydroksyapatitt som den foretrukne form av kalsiumfosfat på substratet når minimal eller neglisjerbar resorpsjon skal observeres.

Kalsiumhydroksyapatitt er en type kalsiumfosfat og er til-stede i den uorganiske mineralfase av naturlig hardt vev hos hvirveldyr, og som omfatter 60-70% av ben og 98% av tannemalje. Dets struktur har blitt studert i noen detalj (J.E. Harris et al., Analysis of the Exafs Spectrum of Hydroxsyapatite, J. Phys. C: Solid State Phys., Vol 19, 6859-6872, 1986; M.D. Grynpas et al., X-Ray Diffraction Radial Distribution Function Studies on Bone Mineral and Sythetic Calsium Phosfates. J. Mater, Sei., Vol. 19, 723-736, 1984), og det har blitt rapportert å ha en heksagonal struktur med en P63/m romgruppe og celledimensjoner i enheten på a=b=9,432Å, c=6,881Å, hvor P63/m refererer til en romgruppe med en seksgangers symmetriakse med en tre gangers heliks. I 1970-årene ble en annen struktur, en monoklinisk, pseudoheksagonal form, romgruppe P2i/b, a=9,4-21Å, b=2a, c=6,88lÅ, v=120°C rapportert (J. C. Elliott, Monoclinic Hydroxyapatite, Science, Vol. 180, 1055-1057, 1973, J.C.Elliott, Monoclinic Space Group Hydroxyapatite, Nature Physical Science, Vol. 230, 72, 1971). Faseover-gangen har blitt studert (N. Hitmi et al., OH" Dipole Reorientability in hydroxyapatites: Effeet of Tunnel Size, J. Phys. Chem. Solids. Vol. 47, nr. 6, 533-546, 1986; N. Hitmi et al., OH" Reorientability in Hydroxyapatites: Ef feet of F" and Cl", J. Phys. Chem. Solids, Vol. 49, nr.

5, 541,550, 1988) .

Ved romtemperatur finnes det to typer kalsiumfosfatforbin-delser som er stabile når de er i kontakt med vandig opp-løsning. pH av oppløsningen bestemmer hvilken som er mest stabil. Ved en pH lavere enn 4,2 er forbindelsen Ca-HP04.2H20 (kalsiumhydrogenfosfat) den mest stabile, mens ved en pH høyere enn 4,2 er hydroksyapatitt (Ca5{0H) (P04)3) den stabile fase. Ved høyere temperaturer kan andre faser bli dannet.

Mange metoder for å danne kalsiumhydroksyapatittpulver har blitt publisert (S. R. Lewitt et al. Forming Method of Apatite Prostheses, j.Biomed. Mater. Res., Vol. 3, 683-685, 1969; H. Homma et al., Preparation of hydroxyapatite by the Hydrolysis of Brushite, J. Mater, Sei., Vol. 22, 4247-4250, 1987; G. Dewith, Preparation, Microstructure and Mechanical Properties of Dense Polycrystalline Hydroxyapatite, J. Mater, Sei. Vol. 16, 1592-1598, 1981; M. Jarcho et al., Hydroxyapatite Synthesis and Characterization in Dense Polycrystalline Form, J. Mater, Sei. Vol. 11, 2027-2036,

(1976); J. Arends et al., A Calcium Hydroxyapatite Precipi-tated From an Aqueous Solution, Journal of Crystal Growth, Vol. 84, 515-532, 1987).

Den følgende reaksjon er en foretrukket utførelsesform for å danne kalsiumhydroksyapatitt ifølge foreliggene oppfinnelse ■

Siden hydroksyapatitt er stabil i nøytrale og alkaliske medier, blir reaksjonsmediet brakt til en høy pH-verdi 12) og fosfatoppløsningen blir tilsatt dråpe for dråpe til kalsiumoppløsningen for å forhindre dannelse av tetrakal-siummonohydrogentrif osf at (Ca4H) (P04)3.2H2O) og å fremskaffe et homogent produkt. En nitratoppløsning ble anvendt i dette arbeid i stedet for et klorid, siden nitratet er meget lett å gjøre flyktig under brenning.

I prosessen for å danne kalsiumhydroksyapatittfilmer har det alltid blitt antatt, i samsvar med tidligere teknikk, at enhver urenhet var uønsket. Det var underforstått at i prosessen med plasmaspraying av hydroksyapatittmaterialer ville det dannes urenheter som også kunne innbefatte a-trikalsiumf os fat . Imidlertid var slike urenheter ikke ønsket, fordi det syntes som om filmen spesielt ved anvendelse på implantater fremmet en nedbrytning av filmens karakter og styrke. Det er følgelig overraskende å oppdage at tilstede-værelse av trikalsiumfosfat og spesielt a-trikalsiymfosfat, spiller en viktig rolle i å observere funksjonelle karakteristika av benceller som blir dyrket på filmer som har en blanding av trikalsiumfosfatet med kalsiumhydroksyapatit-ten. Trikalsiumfosfatet blir fremstilt ved å bruke samme reaktanter som benyttet ved fremstilling av kalsiumhydroksyapatitt, hvor det i stedet for kalsiumhydroksyapatitt blir fremstilt trikalsiumfosfat. Det følgende reaksjonsskj-erna blir foreslått for fremstillingen av oe-trikalsiumfos-f at.

Slik det vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse som involverer dannelsen av sol-gelen inneholdende forskjellige forhold av hydroksyapatitt og trikalsiumfosfat, avhenger mengden av det dannede trikalsiumfosfat av et antall pro-sessparametere som generelt innbefatter forholdet mellom reagenser som benyttes ved fremstilling av den ønskede kal-siumf osf atenhet, reaksjonshastigheten og eldingen av sol-gelen samt miljøet hvor sintringen av filmen gjøres.

Sol-gelprosessen har mange fordeler (G. Yi et al, Sol Gel Processing of Complex Oxide Films, Bulletin of the American Ceramic Society, Vol. 70, 1183-1179, 1991) og anvendelser innen for mange områder (G. Yi et al., Preparation of Pb (Zr,Ti)03 Thin Films by Sol-Gel Processing: Electrical, Optical and Electro-Optic Properties, J. Appl. Phys. 64(5), 2717-2724, 1988; G. Yi, et al., Ultrasonic Experiments with Lead Zirkonate Titanat Thin Films Fabricated by Sol-Gel Processing, Electronic Letters, 25(5), 307-308, 1989; A.A.Hussain et al., Fabrication, Characterization and Theoretical Analysis of High-T. Y-Ba-Cu-0 Superconducting Films Prepared by a Chemical Sol Gel Method, J. Appl. Phys., 70(3), 1580-1590, 1991; M. Sayer et al., Ceramic Thin Films: Fabrication and Applications, Science, Vol 247, 1056-1060, 1990. Generelt finnes det to typer sol-gel-teknologi. Den første er en "kolloidal" metode som involverer dispersjon av kolloidale partikler i en væske for å danne en sol og deretter destabilisering av solen for å danne en gel (I.A. Askay et al., Collodial Processing of Ceramics with Ultrafine Particles, s. 3 93 i Ultrastructure Processing of Advanced Ceramics, red. av J.D. McKenzie og D.R. Ulrich, Willey, New York, 1988). Den andre metode benytter organometalliske forbindelser som råingredienser. I vandige eller organiske oppløsningsmidler kan disse forbindelser bli hydrolysert og kondensert for å danne en gel med et kontinuerlig nettverk. Gelen kan bli omdannet til et enkeltfase tredimensjonalt oksydnettverk ved sintring eller brenning ved en passende temperatur (Sol-Gel Technology for Thin Film, Fibres, Preforms, Electronics, and Specialty Shapes, redigert av Lisa C. Klein, Noyes Publications, Park Ridge, New Jersey, U.S.A., 1986). Den "kolloidale" metode er foretrukket for å danne kalsiumfosfatoppløsning for dette substratbelegg.

Det kan brukes forskjellige teknikker for å påføre sol-gel på substratet. For eksempel består dyppe-belegning-metoden (C. J Brinker et al., Fundamentals of Sol-Gel Dip Coating, Thin Solid Films, Vol. 201, nr. 1, 97-108, 1991) av en rekke prosesser: fjerning av substratet fra en sol eller oppløsning ved en konstant hastighet, tørking av den belagte flytende film ved en passende temperatur og brenning av gelfilmen til et endelig keramisk materiale.

Ved spin-belegning blir oppløsningen sluppet ned på en plate som roterer ved en hastighet som er tilstrekkelig til å fordele oppløsningen jevnt ved sentrifugalvirkning. På-følgende behandlinger er de samme som dem for dyppe-belegning.

Det vil bli forstått at det finnes en mengde andre teknikker som kan brukes for å påføre en tynn film av sol-gelen på substratet. Andre teknikker innbefatter spraying av sol-gelen, rullpåføring av sol-gelen, utspreclning av sol-gelen og påmaling av sol-gelen.

Et alternativ til belegging av adskilte skiver med samme størrelse er å belegge et stort substrat med en film av sol-gelen. Hele filmen på substratet blir så sintret. En anordning så som en netting, kan så bli påført over filmen for å oppdele den i et antall adskilte forsøksområder.

I disse forskjellige teknikker av sol-gel-påføringen blir tykkelsen og kvaliteten (porøsitet, mikrostruktur, krystal-linsk tilstand, og uniformitet) av de dannede filmer påvirket av mange faktorer. Disse innbefatter de fysiske egenskaper, sammensetning og konsentrasjon av utgangssolen, renheten av substratoverflaten, trekkhastighet for substratet og brenntemperaturen. Generelt avhenger tykkelsen i hovedsak av trekkhastigheten og solviskositeten i en dyppe-belegningsprosess. Derfor er kontroll av viskositeten meget viktig for å kontrollere filmtykkelsen. Siden heterogenitet i solen er ansvarlig for dannelsen av makroporer og sprekker, bør beleggingsoperasjonen bli foretatt i et renset rom for å unngå at solen forurenses. I varmebehandlingstrinnet er høye temperaturer nødvendig for å utvikle den nødvendige mikrostruktur.

Det er tre formål med å anvende dyppe-belegningsmetoden for å danne kalsiumfosfatfilmer : (a) for å danne filmer med de nødvendige kvaliteter (uniformitet, tykkelse, porøsitet osv.), (b) for å danne gjennomskinnelige kalsiumhydroksyapatitt filmer på gjennomsiktige substrater for biologiske forsøk og (c) for å danne flerlags-belegg.

Røntgenstråle-fraksjonsanalyse av de tynne filmer med sin-tringstemperaturer på 400°C, 600°C, 800°C og 1000°C viste at filmer sintret ved høyere temperaturer hadde høyere krysta-llinitet enn de som var sintret ved lavere temperaturer. Topphøydene som opptrer i røntgenstrålespektra av filmer var lavere enn dem observert i spektraene for utgangspul-verene, noe som høyst sannsynlig er begrunnet i utgangspul-verenes orientering eller tekstureffekter.

Som bemerket kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen få en eller flere av sine parametere endret for å justere det resulteende forhold mellom kalsiumhydrokstapatitt og trikalsiumf osf at i det endelig sintrede lag. Generelt omfatter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse å kombinere en sol av ammoniumdihydrogenortofosfat med en sol av kalsiumnitrat-tetrahydrat over en utstrakt periode for å danne en sol-gel. Støttesubstratet blir så dyppet i sol-gelen og fjernet fra denne, fortrinnsvis ved en konstant hastighet, for å danne en film på minst én overflate av sol-gelen. Substratet med ferskt påført belegg får tørke, og blir så sintret ved en høy temperatur for å danne en fast film som har en blanding av kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat. Forholdet mellom disse to enheter blir bestemt ved å variere forholdene i trinnene ved fremstillingen av solen, påføringen av substrat og sintringen av filmen. De variable forhold som blir brukt, kan være en eller flere av:

1. Mengder av reagenter for fremstilling av solene.

2. Hastigheten for sammenslåing av reagensene.

3. Varighet og hastighet av blanding, innbefattende ingen blanding. 4. Alternativt, varighet og betingelser for elding, innbefattende ingen elding.

5. Hastigheter og metoder for utfellingsseparasjon.

6. Miljømessige prosessbetingelser i tillegg til den ovennevnte temperatur. 7. Graden av blanding under og etter kombinasjon av solene. 8. Fjerningshastighet for substratet fra sol-gelen for derved å variere filmtykkelsen for dyppe-prosessen.

9. Sintringstemperaturen.

10. Sintring-av materialet i en kontrollert atmosfære, såsom en inert gass, et vakuum eller en atmosfære hvor det er vanndamp tilstede.

Disse soler kan enten bli blandet kontinuerlig i løpet av kombinasjonen og deretter i en forlenget tidsperiode, f.eks. opptil 26 timer eller mer. Denne produksjonsfrem-gangsmåte tilgodeser det lavere forhold mellom kalsium-hydroksy-apatitt og trikalsiumfosfat, men blanding under fremstillingen av solene og så fremskaffelse av en stående fase unten blanding, fulgt av kraftig blanding og separasjon av partiklene fra sol-gelen, har en tendens til å favorisere dannelsen av et øvre forhold mot i hovedsak kalsiumhydroksyapatitt .

Ved å variere temperaturen hvor filmen blir sintret, kan et område av forholdene mellom kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumf osf at oppnås uten å variere noen av de andre parametere i prosessen. Det har blitt funnet at ved sintring av en film ved temperaturer i området fra omkring 800°C til omkring 1100°C kan filmsammensetningen variere fra.i hovedsak kalsiumhydroksyapatitt til i hovedsak trikalsiumfosfat, som ifølge diffraksjonsmønsteret ville indikere at det er et ct-trikalsiumf osf at.

Eksempler på fremgangmåter er gitt for fremstillingen av filmen ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor området av forhold mellom kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat kan oppnås, og videre, hvor filmen kan være i hovedsak av enten kalsiumhydroksyapatitt eller trikalsiumfosfat.

Fremgangsmåte 1

Den følgende fremgangsmåte er basert på fremstilling av tilstrekkelig sol-gel til å belegge et begrenset antall substratskiver. Ifølge den ovenfor angitte kjemiske reaksjon omfatter sol A et kalsiumnitrat som fortrinnsvis er kalsiumnitrat-tetrahydrat. Sol B omfatter et ammoniumfosfat som fortrinnsvis er ammnoniumdihydrogen-ortofosfat (mono-basisk). Sol A blandes med sol B for å danne den ønskede blanding av kalsiumhydroksyapatitt med trikalsiumfosfat. Sol A fremstilles ved å tilsette 40 ml dobbeltdestillert vann til 4,772 g kalsiumnitrat - Ca(N03)2. Oppløsningen omrøres ved moderat hastighet i en tid tilstrekkelig til å oppløse all kalsiumnitraten, som normalt er i området 3 minutter. Til denne oppløsning blir 3 ml ammoniumhydroksyd (NH4OH) tilsatt og omrørt i omkring ytterligere 3 minutter. pH av oppløsningen blir undersøkt, hvor en pH på omkring 12 er ønsket. Til denne oppløsning tilsettes 37 ml dobbeltdestillert vann for å gi et totalt oppløsningsvolum på omkring 80 ml. Oppløsningen blir omrørt i ytterligere 7 minutter og tildekket.

Sol B fremstilles ved å tilsette 60 ml dobbeltdestillert vann til en 150 ml kolbe inneholdende 1,382 g NH4H2P04. Kolben dekkes og omrøres ved moderat hastighet i omkring 3 til 4 minutter inntil all NH4H2P04 er oppløst. Til denne oppløsning tilsettes 71 ml NH4OH og kolben blir så dekket og omrøring fortsatt i ytterligere 7 minutter. Oppløsning-ens pH blir undersøkt, hvor en pH på omkring 12 er ønsket. Til dette blir det tilsatt ytterligere 61 ml dobbeltdestillert vann, og kolben blir tildekket for å gi et totalt opp-løsningsvolum på omkring 190 ml. Oppløsningen blir så omrørt i ytterligere 7 minutter og tildekket.

Den ønskede sol-gel blir så fremstilt ved å slå sammen sol B med sol A. Alt av sol A blir innført i en 500 ml reaksjonsflaske. Omrøring blir begynt ved moderat hastighet og sol B blir innført i reaksjonsflasken ved en hastighet på omkring 256 ml pr. time, inntil alt av sol B er avlevert i sol A. Etter avslutning av denne tilsetning og kombinasjon av sol A med sol B, blir den resulterende sol fortsatt omrørt ved moderat hastighet i omkring 22 timer. Den resulterende sol-gel blir inspisert for eventuell abnormal utfelling eller agglomerering. Dersom noen abnormal utfelling eller agglomerering har inntruffet, må oppløsningen kastes og fremstilling må startes på nytt. Solen blir så forsiktig overført til en annen 500 ml reaksjonsflske for å unngå enhver inklusjon av partikkelagglomereringer som kan være tilstede på veggene i den opprinnelige reaksjonsflaske. Omkring 240 ml sol C, dvs. den resulterende sol, blir over-ført til en sentrifugeflaske og sentrifugert i 20 minutter ved omkring 500 omdr/min ved romtemperatur. Etter sentri-fugering blir 180 ml av supernatanten kastet uten å for-styrre sedimentene. Sedimentene blir forsiktig resuspendert ved å blande dem på en jevnt roterende måte i omkring 3 0 minutter. Solens viskositet blir så målt, og denne er fortrinnsvis mellom 20 og 60 cP (0,020-0,060 PaS). Solen er så klar for påføring på substratet ved dyppe-belegning.

Fremgangsmåte 2

En alternativ fremgangsmåte for å fremstille sol A, sol B og sol C og således å variere det resulterende forhold mellom kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat er som føl-ger. 40 ml dobbeltdestillert vann tilsettes 4,722 g kalsiumnitrat med omrøring til fullstendig oppløsning. En mindre mengde, dvs. 2 ml, ammoniumhydroksyd blir så tilsatt til denne oppløsning ved omrøring over omkring 3 minutter. Oppløsningens pH blir undersøkt, hvor en pH på omkring 11 er ønsket. Til denne mengde tilsettes 37 ml dobbeltdestillert vann som har et totalt volum på omkring 80 ml med fortsatt omrøring i omkring 7 minutter og så tildekking av flasken.

Sol B fremstilles på samme måte som fremgangsmåte 1, bort-sett fra at en vesentlig mindre mengde ammoniumhydroksyd, dvs. 41 ml, tilsettes til oppløsningen med omrøring i ytterligere 7 minutter. Oppløsningens pH blir undersøkt, og en pH på over 11 er ønsket. Til dette tilsettes 61 ml dobbeltdestillert vann for å gi et totalt volum på omkring 160 ml, som så blir omrørt i ytterligere 7 minutter og tildekket .

Sol B tilsettes sol A ved bruk av en pumpe, kun med en strømningshastighet på-1,2 ml pr. minutt, dvs. 72 ml pr. time, inntil alt av sol B er avlevert i sol A. Under slik sammenslåing av sol B med sol A blir blanding fortsatt. De resulterende 400 ml sol C får stå i 24 timer i et 25°C vannbad. Sol C blir så inspisert for eventuell abnormal utfelling eller agglomerering. Dersom abnormal utfelling eller agglomerering har inntruffet, blir oppløsningen kastet og ny fremstilling av sol C blir satt igang.

Sol C blir så oppdelt i fire koniske sentrifugerte dyrkningsrør merket A, B, C og D. Ytterligere to sentrifugerte rør kan brukes for å inneholde alt materialet, i betraktning av at kun 40 ml sol plasseres i de første rør A, B, C og D. De siste to rør blir merket E og F. De seks rør sentrifugeres ved 150 omdr/min i 5 min ved 25°C. Supernatanten kastes. Rørene blir så fylt på nytt med 25% am-moniakkoppløsning opp til 20 ml merket. Sol C blir så resuspendert ved hvirvelblanding ved maksimal hastighet inntil ingen aggregering observeres. Innholdet av rør A helles opp i rør B, av rør C i rør D og av rør E i rør F. Rør B, D og F blir så sentrifugert ved 1500 omdr/min i 5 min ved 25°C. Supernatanten kastes. De tre rør blir på nytt fylt med 25% ammoniakkoppløsning opp til 40 ml merket. Sol C blir så resuspendert med hvirvelblanding med maksimal hastighet inntil ingen aggregering blir observert. Rør B, D og F sentrifugeres ved 1500 omdr/min i 5 min ved 25°C, og supernatanten kastes. Rør B og D fylles på nytt med 25% ammoni-akkoppløsning opp til 2 0 ml merket. Rør F fylles på nytt med 25% ammoniakkoppløsning opp til 17,5 ml merket. Sol C resuspenderes så ved hvirvelblanding ved maksimal hastighet i 3 min inntil ingen aggregering kan observeres. Sol C blir så slått sammen fra alle tre rør og ytterligere hvirvelblanding ved maksimal hastighet i ytterligere 5 min. Den endelige sammenslåtte sol C er klar for umiddelbar dyppe-belegning av substratet.

Fremgangsmåte 3

Rensing av kvartsskiver som et foretrukket substrat - skivene plasseres i en glasskolbe og kromsyre renseoppløs-ning tilføres til glasskplben for å dekke alle skiver. Kolben blir så tildekket. Skivene blir så ultralydbehandlet i et vannbad i 1 time. Syren vaskes bort med ledningsvann i 2 0 min. Det gjenværende lednigsvann fjernes med tre skift av dobbeltdestillert vann. Etter det endelige skift av dobbeltdestillert vann blir hver enkelt skive tørket med et lofritt håndkle og inspisert for feil i kvartsoverflaten. Eventuelle gjenværende partikler på overflaten blir fjernet etter behov med nitrogen eller luft under trykk. Skivene blir lagret i tildekkede brett i aseptiske omgivelser, selv om det er underforstått at under visse lagringsbetingelser er skiver som har blitt sterilisert ikke nødvendig.

Fremgangsmåte 4

Kvartsskivesubstratet som et foretrukket substrat dyppes i solen fremstilt enten ved fremgangsmåte 1 eller 2. Skiven gripes ved kantene for å unngå berøring av overflaten. Skiven dyppes i solen, fortrinnsvis maskinelt. Skiven fjernes fra solen ved en foreskrevet fjerningshastighet.

Belegget på en side av skiven fjernes. Det belagte substrat blir så plassert i en ren petriskål og dekket og tørket ved romtemperatur. Denne fremgangmsåte blir gjentatt for å byg-ge opp den ønskede beleggtykkelse etter behov. Filmen, som dannet før sintring, bør være uniform uten sprekker, klum-per eller hull.

Fremgangsmåte 5

Sintring av kalsiumfosfatfilmen - skivene i en passende holder plasseres i en ovn. Temperaturen blir hevet til 1000°C, eller hvilken som helst annen ønsket sintrings-temperatur og skivene sintres ved denne temperatur i omkring 1 time. Substratene som er sintret, får avkjøle seg i ovnen og fjernes og legges på pakningsbrett av plast.

Sammensetningen av filmene kan analyseres ved enhver passende prosedyre, såsom røntgenstrålediffraksjon, for på diffraksjonsmønstrene å vurdere de relative mengder av kalsium-hydroksyapatitt og trikalsiumfosfat, vanligvis i form av a-trikalsiumfosfat.

Ved å følge fremgangsmåte 1 og sintring ved fire forskjellige temperaturer, nemlig 800°C, 900°C, 1000°C og 1100°C, blir en mengde kalsiumfosfat-enhetsblandinger oppnådd. Ved 800°C er filmen i hovedsak kalsiumhydroksyapatitt, mens sitring ved 900°C gir omkring 70% kalsiumhydroksyapatitt og 3 0% trikalsiumf osf at. Ved 1000°C har filmen en stor del trikalsiumfosfat og et forhold på omkring 10:90 av kalsium-hydroksyapatitt til trikalsiumfosfat. Sintring ved 1100°C gir en film som i hovedsak er trikalsiumfosfat.

Ved å følge fremgangsmåte 1 blir filmen i hovedsak trikalsiumf osf at med omkring 15% kalsiumhydroksyapatitt, dvs. et forhold på 15:85, hvor filmen har blitt sintret ved 1000°C. Imidlertid, når filmen påføres ifølge fremgangsmåte 1 og så blir sintret i et vakuum ved 1000°C, er forholdet 66:34. Når fremgangsmåte 2 blir fulgt med sintring ved 1000°C, er det resulterende forhold 90:10.

Muligheten for å gi tynne filmer med forskjellig sammensetning er viktig fordi: 1. Utvelgelsen av filmsammensetning gjør det mulig at forskjellige aktivitetsstandarder for både normale og abnormale cellepopulasjoner kan undersøkes. Spesielt kan abnormal oppførsel komme til syne i et forsøk som anvender et relativt langsomt resorberende materiale mot en relativt rask test og omvendt. 2. Utvelgelsen av filmsammensetning kan være basert på et ønske om å undersøke effekten av benceller, både normale og abnormale, på en film som er lik materiale som blir implan-tert i kroppen. Dette er en potensiell anvendelse for en i hovedsak HA-film, idet implantater vanligvis blir forhan-dlet med et belegg som i hovedsak er HA. 3. Utvelgelsen av filmsammensetning kan influere på aktiviteten av celler som er forskjellige fra osteoclaster for derved å gi ytterligere informasjon angående effekten av cellepopulasjonen som blir undersøkt.

Typisk definerer en celledyrkningsmetode en fast ekspo-neringsperiode av filmen for cellulær aktivitet. Ved enhver tid i løpet av celledyrkningsperioden er undersøkelse av cellulær aktivitet både vanskelig og potensielt misledende ettersom cellene som er tilstede, kan oppholde seg på top-pen av området hvor resorpsjon har funnet sted. Følgelig krever enhver grundig vurdering av overflaten fjerning av alt cellulært materiale, slik at overflaten kan vurderes fritt. Dette nødvendiggjør en standardisert eksponerings-metode.

Siden eksponeringstiden da blir fastlagt i et gitt sammen-ligningsstudium, kan graden av resorpsjon som inntreffer på anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse, bli uttrykt som den prosentvise del av filmen som er fjernet av osteoclastene mot den totale film som er eksponert til mediet. Ettersom filmen er tynn og har uniform tykkelse, kan mengden av fjernet materiale bli relatert til planarealet av de dannede hull. Denne nøyaktige todimensjonale vurdering av en tredimensjonal resorpsjonshendelse forenkler i høy grad teknikkene som er nødvendige for å vurdere graden av resorpsjon i forhold til den som er nødvendig for å vurdere konvensjonelle benskiver som oppviser komplekse irregulære tredimensjonale resorpsjonshull som ikke har en fast dybde. Ved bruk av anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse

blir en høy resorpsjonsgrad uttrykt som store, ofte sammen-bundne hull i filmen med karakteristiske organiske grense-linjer (av hullet natur). I motsetning til dette blir en lav resorpsjonsgrad uttrykt som få og små hull i filmen, noe som danner en punkturert topografi.

Den praktiske bestemmelse av resorpsjonsgraden er mulig ved bruk av en mengde teknikker. Eksempler på optiske metoder er: 1. Filmene kan bli undersøkt méd lysmikroskopi og det totale resorpsjonsområde beregnet visuelt. For forbedret observasjonskontrast kan filmene bli farget eller ikke, utfra operators behov, med en kalsiumspesifikk farge. 2. Filmene kan bli plassert i forskjellige stråler av monokromatisk lys og utvalgte bølgelengder og nivåer av lysabsorpsjon for forskjellige bølgelengder bestemt elek-tronisk og deretter korrelert til graden av resorpsjon. 3. Filmene kan bli plassert i et software-basert bilde-analysesystem og det resulterende bilde analysert på område-etter-område-basis med definerte terskelgrenser for påvisningen av resorberte områder.

Basert på de forskjellige bencellekulturer som oppfinnerne har fullført, blir det minimale påviselige nivå av resorpsjon betraktet å være i nærvær at et enkelt resorpsjonshull med en diameter på 100 um. Ettersom området med filmdekning på prøvene som ble vurdet, var omkring 100 mm<2>, representerer dette resorpsjonshull en prosentvis resorpsjon på omkring 0,01%. Eksempler på i hovedsk HA-filmer har typisk oppvist dette lave resorpsjonsnivå. I motsetning til dette har et høyeste resorpsjonsnivå som er observert vært til-stede på i hovedsak TCP-filmer, hvor resorpsjon i området 20% til 50% er vanlig. Det finnes alltid en variasjons-grad i den biologiske test ettersom uniform osteoclast-utsåingstetthet på overflaten av skiven ikke kan oppnås nøyaktig. Det som er klart er at resorpsjonsgradeen som inntreffer på en i hovedsak Hydroksyapatitt-film mot en i hovedsak Trikalsiumfosfat-film vil være forskjellig med omkring to tierpotenser for ekvivalente-celle-utsåingstettheter.

Selv om, som bemerket, det finnes en menge fremgangsmåter hvor substratet ifølge foreliggende oppfinnelse, som belagt med en tynn film av kalsiumfosfatenheter kan bli brukt til å finne osteoclastaktivitet, er en antydet teknikk eksemp-lifisert som følger: Innenfor grensene av en laminær strømningshette blir sol-gel-belagte kvartsskiver med 12,7 mm diameter plassert i de 24 brønner av et ikke-kulturbehandlet 24 brønners brett. Denne dyrkningsenhet blir lukket med et lokk og satt inn i en steriliseringspose som så blir forseglet.

Sterilisering blir oppnådd ved å bruke gammastråling på 2,5 MegaRad.

Celler blir fremskaffet fra lårbenet hos unge voksne Wistar hannrotter (omkring 12 0 g) under anvendelse av en modifisert metode opprinnelig utviklet av Maniatopoulos et al. i 1988. Ved å arbeide i en laminær strømningshette etter utskjæring, blir begge lårben ført gjennom fire 10 ml vask-inger med a-minimalt essensielt medium (a-MEM) inneholdende 1,0 mg/ml penicillin G, 0,5 mg/ml gentamycin, og 3,0 ug/ml "fungizon". Epifysene blir så skåret bort og skylt ut fra hvert lårben under anvendelse av 10 ml pr. lårben av a-MEM supplementert med 15% føtalt bovin serum, 50 ug/ml ascor-binsyre (tilsatt som 1% av en 5 g/ml nyopptint stamoppløs-ning i fosfatbufret saltvann), 10 mM Na b-glycerofosfat (tilsatt som 1% av en 1 M stamoppløsning i dobbeltdestillert vann), og antibiotika ved 1/10 av konsentrasjonen beskrevet ovenfor.

Den resulterende 20 ml bencellesuspensjon blir slått sammen ved å bli pipettert opp og ned ved forsiktig å bruke en 25 ml pipette.

Hver skive innenfor sin brønn blir inokulert med l ml av denne eksplantat-cellesuspensjon.

Den følgende dag blir kulturmediet inneholdende ufestede celler fjernet ved aspirering og kulturen igjen tilsatt 2 ml pr. brønn av hvert fremstilt identisk medium. Denne prosess blir gjentatt tre ganger pr. uke over en periode på 1-2 uker.

I løpet av celledyrkningsperioden kan aktiviteten av osteoclastene som er tilstede på skivene bli observert og ned-tegnet ved bruk av et fra eksternt kontrollert kontroll-mikroskopstativ med tilfestet videoutstyr. Utvalgte skiver fjernes fra dyrkningsbrettet ved å bruke sterile pinsetter, og blir satt inn i en 35 mm diameters dyrkningsskål med lokk, inneholdende 4 ml C02. Uavhengig tilsettes a-MEM (Gibco 320-8045AJ) med L-glutamin (Gibco 320-503OPE) i forholdet 20 pl til 10 ml dyrkningsmedium (ytterligere supplementert som beskrevet ovenfor).

Skålen blir så forseglet rundt kanten ved å bruke "Parafilm" for å minimalisere fordampning av medium og plasseres i et Nikon invertert fase mikroskopvideofilmings-inkuberingskammer hvis temperatur har blitt stabilisert til 37°C. Et grønt filter (bølgelengde 52 0 til 550 nm) blir brukt med en 2 0x objektivlinse for optimal fremvisning.

Videotaping blir utført med en Sony time-lapse recorder og en 8 mm videotape (rammehstigheten ligger i området fra 1 ramme/8 sek til 1 ramme/4 sek, avhengig av cellemobilitet). Et enkelt felt kan bli filmet over en periode på 1-2 dager hver gang, eller også lenger, hvis forholdene tilsier det.

En fotografisk observasjon kan bli fremskaffet for kvanti-tative eler andre formål, fra en Sony monitor med en opp-løsning på 950 horisontale linjer (modell PVM 122).

Etter avslutningen av celledyrknngsprotokollen blir graden av resorpsjon som er tilstede på skivene observert ved å fjerne skivene fra dyrkningsbrettet, fjerne alle gjenværende celler eller partikulært materiale som er tilstede på overflaten av skiven, og betrakte skiven under et fase-kon-trastmikroskop ved forstørrelser på 100x til 400x.

Claims (14)

1. Dyrkningssubstrat for dyrkning av benceller in vitro for å tillate vurdering av funksjonelle egenskaper hos benceller, karakterisert ved at det omfatter: en kalsiumfosfat-basert tynn film plassert på et støttesubstrat hvor nevnte tynne film omfatter kalsiumfosfat-materialer som muliggjør varierende grader av resorpsjon av nevnte kalsiumfosfat-materialer for vurdering av nevnte funksjonelle egenskaper, hvor nevnte film er tilstrekkelig tynn til at graden av resorpsjon av nevnte materiale kan bli bestemt ved påvisning av et fysisk forbruk av kalsiumfosfat-materialet og hvor nevnte kalsiumfosfat-materialer er kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat som foreligger i et forhold valgt fra forholdsområdet 10:90 til 90:10, hvor det nedre forhold på 10:90 gir større resorpsjon av nevnte kalsiumfosfatmateriale hos friske osteoklast-type benceller, og hvor det øvre forhold på 90:10 gir mindre resorpsjon av nevnte kalsiumfosfatmateriale hos friske osteoklast-type benceller.

2. Dyrkningssubstrat ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte kalsiummateriale innbefatter en blanding kalsiummateriale av kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat hvor nevnte materialer varierer resorpsjonen idet trikalsiumfosfat gir den høyeste grad av resorpsjon og kalsiumhydroksyapatitt gir en mindre grad av resorpsjon.

3. Dyrkningssubstrat ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte forhold mellom kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat er valgt fra forholdsgruppen 15:85, 66:34 og 90:10.

4. Dyrkningssubstrat ifølge krav l, karakterisert ved at nevnte film er av en tykkelse i området 0,1 pm til 1 pm.

5. Dyrkningssubstrat ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte tynne film tillater påvisning av nevnte fysiske forsvinning av nevnte kalsiumfosfatmateriale ved en teknikk som påviser endring i lystransmittans, lysrefraksjon, lysrefleksjon, elektrisk konduktivitet, elektrisk kapasitans eller en kombinasjon av en eller flere av disse teknikker.

6. Dyrkningssubstrat ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte støtte-substrat er gjennomsiktig og fysisk forsvinning av nevnte kalsiumfosfatmateriale påvises ved å påvise en endring av lys transmittert gjennom nevnte tynne film.

7. Dyrkningssubstrat ifølge krav 1, karakteris rt ved at nevnte støttesubstrat er av kvarts, glass, metall, polymerer eller keramiske materialer andre enn kalsiumfosfat.

8. Anordning til anvendelse i et analytisk eller diagnostisk system til vurdering av funksjonelle egenskaper hos benceller, karakterisert ved at nevnte anordning omfatter: er dyrkningssubstrat ifølge krav 1; og innretninger for å dele opp nevnte film i et antall ankeltstående forsøkssoner.

9. Anordning ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte støttesub-strat er av kvarts, glass, metall, polymerer eller keramiske andre enn kalsiumfosfat.

10. Anordning ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte anordning er en oppbevaringsbrønn samt anordninger til å dekke nevnte brønn inntil anvendt.

11. Sol-gel-fremgangsmåte ved fremstilling av et dyrkningssubstrat som har egenskaper i henhold til krav l, karakterisert ved at nevnte sol-gel-fremgangsmåte omfatter: å fremstille en sol-gel ved å kombinere en oppløsning av ammoniumfosfat med en oppløsning av kalsiumnitrat over en lengre periode for å danne en sol-gel; tilføre til et støttesubstrat nevnte sol-gel på minst en overflate av nevnte støttesubstrat for å danne nevnte film; og sintre nevnte filbelagte overflate for å danne en fast film med et i krav 1 angitt forhold mellom kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat, hvor nevnte forhold bestemmes ved å variere tilstandene i nevnte fremstillingstrinn for å danne en sol-gel, påføre nevnte sol-gel til et støttesubstrat og sintre nevnte film.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte varierende tilstander er en eller flere grader og utstrekning av blanding under og etter kombinasjon nevnte ammoniumfosfat-og kalsiumnitratoppløsninger under elding, hvor sintretem-peratur og sintring foretas i en kontrollert atmosfære.

13. Fremgangsåte ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte film sintres i et vakuum som nevnte kontrollerte atmosfære for å favorisere et intermediært forhold mellom nevnte materialer.

14. Fremgangsåte ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte film sintres ved en temperatur valgt fra området 800°C til 1100°C hvor jo høyere de valgte temperaturer er, desto lavere er forholdet mellom kalsiumhydroksyapatitt og trikalsiumfosfat.