ITTO20060366A1 - Sistema di elaborazione di immagine per l'analisi dell'attivita' osteoclastica - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Sistema di elaborazione di immagine per l'analisi dell'attività osteoclastica",

TESTO DELLA DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce a tecniche di elaborazione di immagini finalizzate allo studio dell'attività osteoclastica in vitro, in particolare tecniche che prevedono di quantificare il riassorbimento di un supporto di coltura per gli osteoclasti, cioè una matrice ossea o un substrato di coltura simile tramite l'analisi di una sua immagine.

La valutazione fisiopatologica dell'attività osteoclastica in diverse malattie coinvolgenti l'osso, come 1'osteoporosi, il morbo di Paget o condizioni neoplastiche e nella stima della risposta osteoclastica a differenti trattamenti, è svolta usualmente sulla base di analisi di immagini.

Il riassorbimento osseo avviene ad opera degli osteoclasti , celle multinucleate formatesi dalla fusione di precursori midollari. Uno squilibrio tra la deposizione di osso ed il suo riassorbimento con un aumento del numero di osteoclasti, o della loro attività, è ritenuto alla base di molte malattie metaboliche come l'osteoporosi e il morbo di Paget già menzionati, ma anche alla base di patologie neoplastiche coinvolgenti l'osso, come il mieloma o tumori solidi. Gli osteoclasti sono indicati anche come potenziali killer di cellule cancerose in un microambiente osseo qualora adeguatamente transfettate con un enzima suicida.

Dunque appare evidente l'importanza di quantificare la formazione di osteoclasti, la loro attività e la loro risposta ad agenti farmaceutici al fine di comprendere i processi fisio-patologici coinvolti nel metabolismo osseo. In particolare la tecnica di riferimento utilizzata al giorno d'oggi per definire la funzionalità osteoclastica è la capacità erosiva di tali osteoclasti.

In generale la capacità erosiva degli osteoclasti e l'efficacia dei trattamenti in vitro può essere stimata quantificando dei marker biochimici rilasciati nel corrispondente medium di coltura, oppure quantificando visivamente la porzione di matrice erosa dalle cellule, cioè identificando in immagini rilevate al microscopio le aree di matrice ossea erosa e quantificando i parametri geometrici di tali aree. Fette di osso corticale, fette di dentina e i film di idrossiapatite sono attualmente le tecniche di cultura più utilizzate per analizzare l'attività erosiva degli osteoclasti.

La tecnica di quantificazione visiva mira a valutare e quantificare il grado di riassorbimento della matrice mineralizzata ad opera degli osteoclasti in coltura. La quantificazione dell'attività riassorbitiva su fette d'osso e di dentina si basa sia sull'analisi bidimensionale delle lacune di riassorbimento di variabile profondità, sia sulla quantificazione del volume riassorbito con tecniche stereomicroscopiche come ad esempio nella pubblicazione di Adamopoulos IE, Sabokbar A., Wordsworth B.P., Carr A., Ferguson D.J., Athanasou N.A. "Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption" J Pathol, 2006, 208(1):35-43. Il grado di riassorbimento può essere rilevato, con accuratezza variabile, mediante tecniche di trasmissione della luce. Le analisi bidimensionali sono più accurate utilizzando i film di idrossiapatite, grazie al loro spessore ridotto e controllato. Dunque è noto operare la quantificazione della capacità erosiva in base all'analisi bidimensionale di lacune di riassorbimento di variabile profondità, basandosi su metodi ottici. Un esempio di tale tecnica si ritrova nel brevetto statunitense US 5, 849, 569.

In particolare, i supporti di coltura possono essere esaminati mediante microscopio a luce invertita e, quindi, sulle immagini così acquisite, viene stimata visivamente l'area totale del riassorbimento. Il riassorbimento della matrice può essere rilevato ad esempio da una modificazione della trasmissione della luce, legata a variazioni di spessore. Le sopra menzionate analisi stereomicroscopiche dei volumi di riassorbimento vengono effettuate su fette di dentina o di osso che mostrano le zone di riassorbimento tridimensionali di profondità variabile. L'impiego di film di idrossiapatite di spessore definito in fase di produzione semplifica questa tecnica. Infatti, poiché il film è sottile e di spessore uniforme la quantità di materiale rimossa può essere correlata all'area della lacuna creata.

Al fine di analizzare le lacune di riassorbimento osteoclastico è noto impiegare delle tecniche di disegno manuale delle aree erose utilizzando un reticolo sovrapposto all'immagine e un microscopio a luce riflessa, come ad esempio insegnato da Massey H.M., Flanagan A.M., "Human osteoclasts derive from CD14-positive monocytes" Br J Haematol, 1999, 106 (1):167-70.). Tuttavia tale sistema che impiega il disegno manuale conduce inevitabilmente a risultati non accurati e imprecisi .

La presente invenzione si prefigge lo scopo di realizzare una soluzione per l'analisi dell'attività osteoclastica che permetta delle valutazioni più precise e accurate, dando l'opportunità all'operatore di valutare continuamente lungo il processo di analisi la bontà del risultato ottenuto.

Secondo la presente invenzione tale scopo viene raggiunto grazie ad un sistema di elaborazione di immagine e un corrispondente procedimento di elaborazione di immagine e prodotto informatico direttamente caricabile nella memoria di un elaboratore digitale aventi le caratteristiche richiamate in un modo specifico nelle rivendicazioni che seguono.

L'invenzione verrà descritta con riferimento ai disegni annessi, forniti a puro titolo di esempio non limitativo, in cui:

- in figura 1 è rappresentato un diagramma di flusso relativo a una prima parte di un procedimento implementato dal sistema secondo l'invenzione;

- in figura 2 è rappresentato un diagramma di flusso di una seconda parte del procedimento implementato dal sistema secondo l'invenzione;

- in figura 3 è rappresentato un diagramma di flusso relativo a una terza parte del procedimento implementato dal sistema secondo l'invenzione;

- in figura 4 è rappresentato un diagramma di flusso relativo a una quarta parte del procedimento implementato dal sistema secondo l'invenzione;

- in figura 5 è rappresentato un diagramma di flusso relativo a una quinta parte del procedimento implementato dal sistema secondo l'invenzione;

- in figura 6 è rappresentato un diagramma di flusso relativo a una sesta parte del procedimento implementato dal sistema secondo l'invenzione;

in figura 7 è rappresentato uno schema di principio del sistema secondo l'invenzione;

- nelle figure 8, 9, 10 e 11 sono rappresentate schematicamente delle immagini elaborate dal sistema secondo l'invenzione in diverse fasi operative.

Il sistema proposto è sostanzialmente un sistema semiautomatico di analisi di immagine per lo studio quantitativo dell'attività osteoclastica di riassorbimento di matrice ossea o, in generale, di un substrato di coltura simile. Tale sistema è suscettibile di determinare la percentuale di matrice esaminata riassorbita dagli osteoclasti in coltura, contando e dimensionando le aree identificate come erose e fornendo in uscita risultati in termini numerici. Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, sono provvisti due procedimenti di codifica a colori utili a favorire l'interpretazione visuale dell'immagine da parte di un operatore. Il procedimento implementato dal sistema secondo l'invenzione è utile a simulare la capacità visiva umana, e attraverso il rilevamento di livelli di grigio, tale sistema è in grado di confrontare il livello di grigio di ogni pixel dell'immagine acquisita con quelli circostanti. Tale sistema semiautomatico implementa inoltre procedure atte a consentire all'operatore di controllare in tempo reale la bontà del processo di valutazione.

In figura 7 è rappresentato uno schema a blocchi di un sistema di elaborazione di immagine per l'analisi di attività osteoclastica secondo l'invenzione. Tale sistema comprende indicato con il riferimento 10 un supporto di coltura. Tale supporto di coltura può essere una fetta di tessuto osseo, una fetta di dentina oppure un pozzetto BD BioCoat™ Osteologie™ Bone Cell Culture System, o altrimenti un differente supporto di coltura sottile. Tale supporto di coltura 10 serve alla coltivazione degli osteoclasti o dei loro precursori.

Il supporto 10 è esaminato tramite un microscopio ottico a luce invertita 20, illuminato da una lampada 30, che ne rileva un'immagine P. Al fine di ottenere delle immagini P leggibili, il supporto 10 contenente i campioni deve essere illuminato in una maniera adeguata. Una regolazione del microscopio secondo la tecnica di Kohler è consigliata per l'acquisizione di immagini di buona qualità. Il microscopio ottico 20 è collegato a sua volta per l'acquisizione delle immagini a una macchina fotografica digitale, indicata con il riferimento 40, che fornisce in uscita un'immagine digitalizzata Pd. Il formato di immagine impiegato preferibilmente è il comune 1536 x 1048, a 24 bit per pixel (16.000.000 di colori). L'immagine digitalizzata Pd prodotta dalla macchina digitale 40 è in formato JPEG.

In presenza di un adeguato collegamento, le immagini possono essere direttamente salvate su un elaboratore 50, come mostrato in figura 7. Altrimenti tali immagini possono essere salvate sulla memoria interna della macchina 45 per un successivo trasferimento su elaboratore 50. Tale macchina digitale 40 fornisce dunque le immagini digitalizzate Pd a un elaboratore 50. L'elaboratore 50 comprende un monitor 55 per la visualizzazione delle immagini e un mouse 60 in qualità di dispositivo di puntamento per permettere a un operatore di interagire con le immagini visualizzate sul monitor 55. Tale elaboratore 50, in una forma realizzativa preferita, è dunque un personal computer Pentium IV, che impiega una CPU a 2,66 GHz e ha una memoria di 512 MegaByte di RAM.

Secondo la forma realizzativa preferita mostrata in figura 1 non è richiesta una scheda di acquisizione nell'elaboratore 50, ma vengono impiegati dei normali protocolli noti di trasferimento, ad esempio tramite connessione USB, delle immagini digitalizzate Pd dalla macchina digitale 40 all'elaboratore 50.

Verrà ora descritta una procedura di elaborazione di immagine per l'analisi dell'attività osteoclastica che è implementata tramite l'elaboratore 50.

In figura 1 è rappresentata, tramite un diagramma di flusso, una prima procedura 200 di calibrazione che fa parte del procedimento secondo l'invenzione. Tale procedura di calibrazione 200 prevede che, per ogni sessione di immagini digitalizzate Pd acquisite tramite la macchina digitale 40, all'operatore venga richiesto di effettuare una calibrazione della luminosità, e, nel caso in cui lo desideri, anche una calibrazione delle dimensioni dell'immagine.

Al fine di velocizzare il procedimento, ogni immagine Pd caricata viene ridimensionata a 1024 x 768 pixel.

In particolare, con riferimento al diagramma di figura 1 è previsto all'inizio della procedura 200 che è all'inizio della sessione di analisi, un passo di calibrazione luminosa 210. Per tale passo di calibrazione luminosa 210 è preferibile utilizzare in connessione al microscopio un supporto 10 vuoto, in particolare un pozzetto vuoto dello stesso spessore dei pozzetti coperti da matrice. Operando sul potenziometro del microscopio 20 per regolare la luminosità della lampada 30 si aumenta la precisione della lettura. Viene fornita all'utente anche una funzione per verificare la compatibilità della luminosità impostata con un valore giudicato ottimale .

La calibrazione luminosa avviene rilevando sempre tramite la macchina digitale 40 pixel per pixel la distribuzione luminosa sul campione e salvando i valori rilevati in un file di dati nell'elaboratore 50. La calibrazione spaziale viene effettuata di consueto utilizzando la foto di un vetrino calibrato.

Dungue, al passo di calibrazione luminosa 210 viene acquisita la distribuzione di luminosità sull'intera immagine e i valori ottenuti vengono salvati in una matrice di correzione naturale N, anche essa relativa a 1024x768 pixel, sul disco fisso dell'elaboratore 50 in un passo 215, e quindi immediatamente caricati nella memoria RAM in un passo 218. Nello stesso passo, viene caricata in memoria RAM una distribuzione artificiale Art di luminosità, parimenti di 1024x768 pixel, tesa a correggere eventuali errori di coniigurazione del microscopio. I valori della matrice di correzione naturale N preferibilmente già a questo stadio vengono elevati alla quinta potenza. Tale distribuzione artificiale Art viene determinata empiricamente ed è inserita preventivamente nei dati a disposizione della procedura. In un passo di scelta 220 viene richiesto se eseguire o meno un'operazione di calibrazione dimensionale. In caso affermativo, viene operata in un passo 225 una conversione pixel/unità di misura e si muove quindi a una procedura di analisi dell'immagine 300. In caso negativo, dal passo di scelta 220 si passa direttamente a tale procedura di analisi dell'immagine 300. I valori di correzione ottenuti mediante la calibrazione luminosa 210 e conservati nella memoria RAM dell'elaboratore 50 vengono utilizzati nell'ambito dell'intero procedimento di elaborazione di una stessa sessione di fotografie, contribuendo ad accelerare l'esecuzione.

In figura 2, con 300 è appunto indicata una procedura di analisi dell'immagine che prevede in un passo 310 di operare un caricamento di immagine 310, nel quale viene caricata l'immagine digitalizzata Pd JPEG .

Tale immagine digitalizzata Pd JPEG viene convertita in scala di grigi e salvata come immagine copia Pg in formato BMP sul disco fisso dell'elaboratore 50. Ciò avviene in un passo di copia immagine indicato con il riferimento 315. In tale passo di copia immagine 315 è anche prevista un' operazione di conversione di formato, nella quale viene fatto corrispondere un singolo colore dell'immagine digitalizzata Pd ad una tonalità di grigio nell'immagine copia Pg, sempre su 24 bit, ma con valori identici per ognuno degli 8 bit che lo compongono. Si noti che l'intero procedimento di elaborazione successivo opera su tale immagine copia Pg in toni di grigio ottenuta al passo di copia immagine 315, lasciando inalterata l'immagine digitalizzata Pd originale acquisita dalla macchina 40. Tale immagine copia Pg viene automaticamente ricaricata nell'elaboratore 50 e su di essa vengono operate una correzione Gamma, di brightness e contrast .

Si noti che nell'ambito del procedimento secondo l'invenzione l'operatore viene guidato mediante messaggi univoci composti da una stringa di testo, e in ogni passo l'operatore è abilitato ad eseguire esclusivamente le operazioni adeguate legate alla fase della procedura di analisi 300, codifica 400 e elaborazione 500; tutte le altre funzioni sono disabilitate .

In quest'ambito, dunque, successivamente al passo di copia immagine 315, il primo passo richiesto all'operatore è un passo di richiesta di selezione di aree erose per operare una correzione specifica per l'immagine in analisi. Tale passo è indicato con il riferimento 320 e richiede all'operatore di selezionare sullo schermo 55 tramite il mouse 60 tre aree, che tale operatore riconosce come erose, in tre differenti porzioni dell'immagine copia Pg visualizzata sullo schermo 55, rispettivamente in una porzione centrale, intermedia e periferica. L'operazione di selezione eseguita dall'operatore dietro il passo di richiesta di selezione di aree 320 porta all'individuazione, per ogni selezione effettuata, tramite mouse, tastiera o altro dispositivo di puntamento, di un punto corrispondente a un pixel. In figura 8 è rappresentata schematicamente l'immagine copia Pg sullo schermo 55 e tre punti selezionati wl, w2, w3 che indicano aree erose.

Per ciascun punto selezionato wl, w2 o w3 viene quindi determinato in un rispettivo passo di calcolo della media 321, 322 e 323 un valore medio di intensità, cioè luminosità o livello di grigio, calcolato su un intorno IM predefinito rappresentato da griglia di 7 x 7 pixel circostanti il punto selezionato. Dunque dai passi 321, 322, 323 vengono ottenuti tre valori mediati, rispettivamente MI, M2, M3 .

In particolare, la procedura di analisi 300 comprende un passo di alterazione 335, che carica gli indici n, k inizializzati al passo 315 per calcolare dei valori di correzione Vcorr con i quali alterare in maniera non lineare il risultato dei passi 321, 322, 323, che calcolano i valori mediati MI, M2, M3. Il passo di alterazione 335 in altre parole corregge i valori mediati MI, M2, M3 applicando agli intorni IM circostanti i punti selezionati wl, w2, w3 il prodotto della matrice di correzione naturale N e della distribuzione artificiale Art, elemento per elemento, elevate rispettivamente agli indici n e k. Si noti che, in generale gli elementi della matrice di correzione naturale N e della distribuzione artificiale Art sono l'inverso delle intensità luminose in punti dell'area esaminata dal microscopio durante il processo di calibrazione luminosa. Pertanto, un'operazione di elevazione alla potenza n o k ha sostanzialmente l'effetto di appiattire la superficie individuata da tale matrice di correzione naturale N e tale distribuzione artificiale Art e, dunque, di avvicinare i valori mediati M1, M2, M3.

Qualora, in un passo di valutazione 325, venga calcolato che lo scostamento tra i tre valori mediati M1, M2, M3 è superiore al 5%, l'indice n è incrementato di uno in un passo 330 fino al raggiungimento del suo valore massimo consentito, verificato in un passo 326, e fornito al passo di alterazione 335 per alterare nuovamente i valori mediati MI, M2, M3. Se il passo di valutazione 325 non è nuovamente soddisfatto, al passo 327 l'indice k viene incrementato di 1 mentre 1'indice n viene riportato al valore iniziale. L'elevazione a potenze di indice n, k porta i valori mediati M1, M2, M3, come detto, a convergere. Quando, in un passo di valutazione 325 è calcolato che lo scostamento tra tali valori mediati MI, M2, M3 è inferiore al 5%, il valore di correzione ottimale valutato viene estratto in un passo 340, quindi in un passo di correzione 345 viene applicato il valore di correzione Vcorr(x,y) ottimale ottenuto al passo 335 a tutta l'immagine copia, pixel per pixel, determinando un'immagine corretta Pr. In altre parole, sia nella definizione dei tre valori mediati M1, M2, M3, sia nella successiva correzione dell'intera immagine la luminosità di ogni punto o elemento considerato dell'intorno IM o dell'intera matrice immagine corrispondente all'immagine Pg vengono corretti moltiplicando il suo valore per il prodotto degli elementi delle matrici N e Art in quel punto, ognuna di tali matrici essendo elevata all'adeguato esponente individuato al passo 325.

In un secondo passo di richiesta selezione aree 350, quindi, l'operatore viene nuovamente invitato a selezionare una qualunque area che egli riconosca come erosa, indicando con il mouse 60 un punto di riferimento wm. Mediante tale passo di richiesta al passo 350 viene definito un valore di media di riferimento MREF, che è aggiornato alla correzione, su un intorno predefinito IREF di 7 x 7 pixel circostanti il punto di riferimento wm selezionato. Tale valore di media di riferimento MREF è calcolato in un apposito passo 355 nel quale viene anche inizializzata a uno una variabile di fase F. Tale variabile di fase F è un contatore di iterazioni di una procedura di codifica dell'immagine 400 che segue il passo di calcolo 355.

Tale procedura di codifica dell'immagine 400, corrisponde sostanzialmente a ricodificare l'immagine digitalizzata e corretta Pr in un'immagine codificata Pe rappresentata solo tramite due livelli, cioè i colori bianco e nero.

Tale procedura 400 è mostrata in dettaglio in figura 3, e prevede un passo di valutazione 410 che verifica se la variabile di fase F sia minore o uguale o di un valore di iterazioni specificato, nella forma realizzativa qui illustrata pari a 3. In caso negativo, cioè qualora non vi siano più iterazioni di codifica da eseguire, il controllo passa a una procedura di esclusione artefatti 500. In caso positivo, invece, la variabile fase F viene incrementata di uno in un passo di incremento 415 e quindi in un passo di calcolo di valor medio 420 viene calcolato, per ogni pixel dell'immagine il valore medio di luminosità su intorno di dimensioni pari a una maschera MSK(F), cioè una maschera corrispondente alla fase F in esecuzione.

Il passo di calcolo di valor medio 420 prevede dunque di calcolare, per ogni pixel (x, y), dove x e y indicano le coordinate spaziali del pixel, un valor medio di luminosità M(x,y) della maschera MSK attorno al pixel (x,y):

La maschera MSK ha valori, come detto, dipendenti dalla fase F in esecuzione, cioè è una maschera MSK(F). Le maschere MSK(F) relative alle diverse fasi F sono caricate da memoria in un apposito passo di caricamento 425. In tale passo di caricamento 425 a titolo di esempio, si ha MSK(1)=3, MSK(2)=4, MSK(3)=5, corrispondenti dunque a aree della maschere di 49, 81 e 121 pixel. Con V(x,y) è indicato il valore del pixel, cioè la sua luminosità o livello di grigio.

Il valor medio di luminosità M(x,y) della maschera MSK M(x,y) viene confrontato con un valore soglia S(F) funzione della fase F.

Ciò in figura 3 è rappresentato tramite il passo 435 nel quale è caricato il valor medio di luminosità M(x,y) della maschera MSK(F) calcolata al passo 420, e dai passi 431, 432, 433 di caricamento di valori di soglia in funzione della fase F in esecuzione. Nel passo 431, in una variabile di soglia S(l) è caricato, per la prima fase F, il valore di media di riferimento MREF. Nei passi 432 e 433 le variabili di soglia S(2) e S(3) vengono calcolate in base alla discriminazione operata nella fase F che le precede. Se il valor medio di luminosità della maschera M(x,y), confrontato in un passo 435 di discriminazione con il valore di soglia S(F), risulta maggiore o uguale alla media di riferimento S(F) al pixel (x,y) viene attribuito il colore bianco in un passo 450. Qualora il valor medio di luminosità della maschera M(x,y) sia inferiore alla soglia di riferimento S(F), invece in un passo 440 il pixel (x,y) viene soprascritto con un pixel nero. Si noti che il passo di sovrascrittura con un pixel bianco 450 è subordinato all'esecuzione di un blocco di valutazione 445 nel quale si valuta se la fase F abbia raggiunto il valore massimo di 3.

I risultati di ogni confronto eseguito al passo di discriminazione 435 vengono scritti in una matrice virtuale aggiornata a video in tempo reale progressivamente per righe. Quando viene cambiata la fase F, la matrice copia di pixel elaborata diventa quella oggetto della nuova analisi. L'immagine convertita in scala di grigi è sempre presente sullo sfondo di ogni fase.

Il processo di discriminazione può essere reiterato a piacere secondo il giudizio dell'operatore e il passaggio ad una fase F successiva è condizionato all'approvazione dell'operatore. Le due fasi F successive alla prima, con i passi di caricamento 432 e 433 delle soglie S (2) e S(3), hanno come obiettivo di affinare l'operazione di discriminazione eseguita dall'operatore. Vi deve essere, infatti, congruenza tra i margini delle aree erose e quelli delle aree rilevate tramite il procedimento proposto, così come gli artefatti della matrice e i residui devono essere adeguatamente attribuiti.

Quando l'operatore non sia soddisfatto del risultato, ha l'opportunità di agire sulla soglia di confronto S(F) aumentandone o diminuendone il valore nei passi 431, 432 e 433. In particolare, nell'interfaccia utente mostrata sullo schermo 55 è possibile predisporre un comando in forma di cursore in modo da permettere all'operatore di variare, al passo 431, 432 o 433, con continuità il valore di media di riferimento MREF, che diventa dunque una soglia S(1) variabile, e delle soglie S(2) o S(3) nelle fasi F corrispondenti, onde visualizzare sullo schermo 55 in rapida successione gli effetti della discriminazione a diverse soglie, ma con una stessa dimensione di maschera MSK(F) corrispondente alla fase F in esecuzione. Naturalmente, a questo fine, è possibile configurare il procedimento per ripetere ogni fase F a piacimento e a velocità di scansione desiderata, compatibilmente con le caratteristiche dell'elaboratore 50 impiegato. Dunque, attraverso l'esecuzione di più passi di discriminazione 435 in più fasi F l'operatore può verificare istantaneamente a video la bontà della discriminazione operata. In altre parole, può rilevare se cambiando le soglie di luminosità certe caratteristiche d'interesse (le aree erose) permangono o scompaiono in quanto artefatti.

Nonostante un blocco di controllo corrispondente non sia rappresentato in figura 4 anche il passaggio alla procedura successiva deve essere autorizzato dall'operatore. Dunque la procedura di codifica 400 è sostanzialmente composta da tre fasi F analoghe il cui scopo è quello di riprodurre con maggiore accuratezza possibile, in un'immagine codificata in bianco, corrispondente all'area erosa, e nero corrispondente all'area non erosa, quelle porzioni del supporto 10, cioè del vetrino, che l'operatore riconosce come erose e come inalterate.

All'operatore è quindi richiesto di operare la valutazione di tale discriminazione, tramite i passi di selezione aree 320, 350 e la matrice virtuale aggiornata a video, mentre l'elaboratore 50 si fa carico di svolgere le operazioni di calcolo. La funzione che implementa il confronto per la discriminazione è identica per tutte e tre le fasi F. Tali fasi differiscono, come illustrato con riferimento ai passi 420 e 425 per le dimensioni della maschera di confronto MSK e per il valore di riferimento, cioè il valore di soglia. L'immagine viene percorsa dall'estremo superiore sinistro a quello inferiore destro, procedendo per righe. La scansione impone di trascurare un numero di pixel, a contorno dell'immagine, pari alla metà meno uno dei pixel della mascherina di dimensioni maggiori. Per ogni pixel viene determinata la media calcolata su un intorno di pixel crescente con la fase F:

F=1: 7x7

F=2: 9x9

F=3: 11x11.

Nell'ultima fase F, cioè con F=3, la risposta al passo di verifica 445 è positiva. Nella matrice virtuale che viene sovrascritta ai pixel bianchi vengono sostituiti i pixel dell'immagine in scala di grigi. In tal maniera l'operatore ha la possibilità di verificare la congruenza dell'analisi effettuata con l'immagine originale.

Prima di passare al conteggio delle aree e alla quantificazione reale, all'operatore viene data in una procedura di esclusione artefatti 500 l'opportunità di eliminare porzioni di immagini chiaramente alterate da artefatti, quali artefatti originati da colpi accidentali inferti con il puntale nel corso della semina, alterazioni macroscopiche della matrice, agglomerati di residui.

In figura 4 è dunque mostrata una procedura di esclusione degli artefatti 505 che è eseguita tramite un passo 510 di richiesta all'operatore se desideri o meno escludere gli artefatti. In caso positivo si passa a un passo 515 di tracciatura manuale sullo schermo 55 dell'elaboratore 50 delle aree da escludere da parte dell'operatore tramite il mouse 60. Successivamente il controllo passa a un passo 520 nel quale viene effettuato il conteggio delle aree erose, a un successivo passo 530 nel quale viene valutata la dimensione delle aree e a un ulteriore passo 540 nel quale viene calcolata la percentuale dell'area erosa. Ciascuno di tali passi 520, 530, 540 fornisce in uscita i propri risultati sia a una procedura di uscita su disco 525 sia a una procedura di uscita su schermo 535.

Come mostrato in figura 5, la procedura di uscita su schermo 535 comprende un passo di visualizzazione della percentuale dell'area erosa 605, un primo passo di codifica colore delle dimensioni delle aree 610, un secondo passo di codifica colore della percentuale area erosa 615, nonché un passo di creazione di un istogramma dimensione-frequenza 620. Dunque, i risultati ottenuti vengono espressi a video in percentuale e mediante due codifiche di colore. La prima codifica, relativa al passo 610 associa un colore di luminosità proporzionale alle dimensioni dell'area. In figura 11 è mostrata una rappresentazione di principio di una visualizzazione sullo schermo 55 di un'immagine Pel sottoposta alla prima codifica colore 610. Le dimensioni di una singola area A offrono informazioni sull'attività di ogni singola cellula. La seconda codifica, espressa nel passo 615, associa una tonalità di colore, in particolare verde, di luminosità proporzionale alla percentuale totale di area erosa. La percentuale di riassorbimento può essere considerata un'immagine dell'aggressività totale delle cellule in coltura. Un esempio dell'utilità della seconda codifica eseguita al passo 615 è la valutazione della attività osteoclastica in pazienti osteoporotici prima e dopo il trattamento con un determinato farmaco .

Nella procedura di uscita su schermo 535, in un passo 625, è possibile procedere al salvataggio dei risultati grafici sul disco 525. In ogni caso la procedura termina con il salvataggio su disco 525 dettagliata in figura 6. Detto salvataggio comprende un passo 635 di creazione di un documento di testo che contiene tutte le informazioni storiche di ogni singola analisi. Inoltre in un passo 640 viene automaticamente creato un foglio elettronico con aggiornamento continuo contenente l'insieme ordinato di tutti i dati di tutte le sessioni di analisi. Questo automatismo è configurato in modo da rendere immediatamente disponibili i dati per analisi statistiche. I risultati riportati nel documento di testo del passo 635 vengono anche visualizzati a video nell'ambito del passo di creazione dell'istogramma di dimensione-frequenza 620.

Dunque dalla descrizione appena riportata, risulta chiaro come il sistema e il procedimento di elaborazione di immagini per l'analisi della attività osteoclastica proposti configurino uno strumento agile, accurato, economico e preciso che permette di condurre ricerche evitando fastidiose e imprecise iterazioni, mantenendo il pieno controllo dei risultati ottenuti. In particolare vantaggiosamente l'adozione delle codifiche colore permette prontamente all'operatore di valutare i risultati ottenuti.

Il sistema e il procedimento proposti sono in grado di determinare la percentuale di matrice esaminata riassorbita dagli osteoclasti in coltura, contare e dimensionare le aree erose e fornire i risultati in termini numerici e mediante due codifiche di colore utili per un'interpretazione visiva.

Vantaggiosamente 1'implementazione di una procedura semiautomatica utile a simulare la capacità visiva umana e l'utilizzo del rilevamento di livello di grigio permettono di confrontare il livello di grigio di ogni pixel con quelli circostanti, implementando poi calcoli semplici che consentono all'operatore di controllare in tempo reale il processo.

Vantaggiosamente, la possibilità di memorizzare su memoria di massa i dati, in particolare in forma tabellare o come dati di immagine, permette di procrastinare l'analisi indefinitamente nel tempo, anche se i pozzetti di supporto vengono in seguito danneggiati, persi o la matrice va incontro a fenomeni degenerativi.

Inoltre, il sistema proposto permette di reiterare in continuazione l'analisi fin quando non si è soddisfatti del risultato ottenuto.

Inoltre, il sistema proposto permette di salvare anche le immagini di codifica colore e quindi di analizzarle e confrontarle successivamente.

Inoltre, il sistema proposto permette di effettuare indagini inter e intra operatore: l'accesso all'uso dell'elaborato per il procedimento di analisi è vincolato a un database di utenti e i dati sono salvati sotto il nome dell'operatore che esegue l'accesso al programma.

Naturalmente, fermo restando il principio dell'invenzione, i particolari di realizzazione e le forme di attuazione potranno essere ampiamente variati rispetto a quanto scritto e illustrato, senza per questo uscire dall'ambito dell'invenzione.

Claims (22)

1. RIVENDICAZIONI 1. Sistema per l'analisi della attività osteoclastica che comprende un modulo (20) di rilevazione (30) di almeno un'immagine (P) di un supporto di coltura per gli osteoclasti (10), un modulo digitalizzatore (40) configurato per produrre da detta immagine rilevata (P) un'immagine digitale (Pd, Pg), un modulo elaboratore (50) configurato per identificare e quantificare aree di matrice erosa (A) in detta immagine digitale (Pd, Pg), caratterizzato dal fatto che detto modulo elaboratore (50) comprende almeno un modulo di visualizzazione (55) configurato per visualizzare detta immagine digitalizzata (Pg) e un dispositivo di puntamento (60) per selezionare (350) uno o più punti (wm) distintivi di un'area erosa (A) in detta immagine digitalizzata (Pg), detto modulo elaboratore (50) essendo inoltre configurato per calcolare (355) uno o più valori di soglia (MREF; S(l), S(2), S(3)) in funzione dell'intensità di uno o più punti (wm) distintivi di un'area erosa (A) selezionati, e per eseguire una ricodifica a due livelli in un'immagine codificata (Pe) di ciascun punto (x,y) dell'immagine digitalizzata (Pd; Pg), attribuendo un primo (450) livello o un secondo livello (440) al corrispondente punto dell'immagine codificata (Pe) in funzione del risultato di un'operazione di paragone (435) fra una funzione dell'intensità (V(x,y) di detto punto (x,y) dell'immagine digitalizzata (Pd) e detti uno o più valori di soglia (MREF; S(l), S(2), S(3)), identificare come area di matrice erosa (A) insiemi di punti adiacenti dell'immagine codificata (Pe) presentanti detto primo livello (450), quantificare parametri geometrici di dette aree di matrice erosa (A) in funzione di detti insiemi di punti adiacenti dell'immagine codificata (Pe) presentanti detto primo livello (450).
2. 2. Sistema secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto modulo elaboratore (50) è configurato per calcolare (355) quale funzione di intensità di detti uno o più punti (wm) distintivi di un'area erosa (A) un valore medio (MREF) di intensità associato a un intorno (IREF, MSK(F) di detti uno o più punti (wm) distintivi di un'area erosa (A) selezionati.
3. 3. Sistema secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto modulo elaboratore (50) è configurato per calcolare (420) per ogni punto (x,y) dell'immagine digitalizzata (Pg) un valor medio di intensità (M(x,y)) su un primo intorno (MSK(l)) di detto punto (x,y) e paragonare (435) detto valor medio di intensità (M(x,y)) con detto valore medio (MREF) associato a un intorno (IREF) di detti uno o più punti (wm) distintivi di un area erosa (A) selezionati.
4. 4. Sistema secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto modulo di elaborazione (50) è configurato per ripetere per una o più successive iterazioni (F) e uno o più ulteriori intorni (MSK(F)) detta operazione di calcolare (420) per ogni punto (x,y) dell'immagine digitalizzata (Pg) un valor medio di luminosità (M (x,y)).
5. 5. Sistema secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto modulo di elaborazione (50) è configurato per impiegare in dette una o più successive interazioni (F) uno o più intorni (MSK(F)) di dimensioni maggiori o uguali a detto primo intorno (IREF).
6. 6. Sistema secondo la rivendicazione 4 o 5, caratterizzato dal fatto che comprende l'operazione di, in una stessa iterazione (F) e con uno stesso intorno (MSK(F), variare il valore di soglia S(F) e visualizzare l'immagine codificata (Pe) conseguente.
7. 7. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che è configurato per visualizzare (610) su detto modulo di visualizzazione (55) detta immagine codificata (Pe) associando ai punti di una stessa area identificata come erosa (A) un colore con intensità proporzionale a una dimensione di detta area erosa.
8. 8. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che è configurato per visualizzare (615) dette aree identificate come erose (A) con punti di uno stesso colore e una stessa intensità proporzionale a una percentuale di area erosa dell'immagine digitalizzata (Pd) calcolata.
9. 9. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto modulo di elaborazione (50) è configurato per selezionare preliminarmente (320) tramite detto dispositivo di puntamento (60) più punti distintivi (wl, w2, w3) di equivalenti aree erose e di valutare corrispondenti valori (MI, M2, M3) associati a intorni (IM) di detti punti (wl, w2, w3) preliminarmente selezionati per controllare un'operazione di correzione (345) dell'immagine digitalizzata (Pd).
10. 10. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto modulo di elaborazione (50) è configurato per eseguire detta operazione di correzione (345) dell'immagine digitalizzata (Pd) applicando una distribuzione ottimale di correzione (340) ai punti dell'immagine digitalizzata (Pg) per ottenere un'immagine corretta (Pr).
11. 11. Sistema secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che comprende di calcolare detta distribuzione ottimale di correzione (N<n>*Art<k>, elemento per elemento) tramite un confronto interativo con un valore prefissato (525) di uno scostamento calcolato fra i valori (MI, M2, M3) associati a intorni (IM) di detti punti (wl, w2, w3) preliminarmente selezionati corretti applicando iterativamente una distribuzione prodotto di una distribuzione di luminosità (N) acquisita in un passo di calibrazione (210) e di una distribuzione di luminosità (Art) preimpostata elevate (335) a rispettivi indici n e k, detti indici n e k essendo iterativamente incrementati.
12. 12. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto dispositivo di puntamento (60) è configurato per eseguire una tracciatura manuale di aree da escludere nell'ambito di una procedura di esclusione (500) di artefatti implementata in detto modulo elaboratore (50).
13. 13. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto modulo (20) di rilevazione (30) di almeno un'immagine (P) di supporto con funzione di matrice ossea (10) comprende un microscopio.
14. 14. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto modulo digitalizzatore (40) comprende una macchina fotografica digitale.
15. 15. Sistema secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che detto microscopio (20) è un microscopio ottico a luce invertita illuminato secondo una configurazione di Kohler.
16. 16. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto primo livello (450) e detto secondo livello (440) per la ricodifica a due livelli sono selezionati fra due colori.
17. 17. Sistema secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto modulo di elaborazione (50) è configurato per regolare tramite l'azione dei mezzi di puntamento (60) detti uno o più valori di soglia (S(l), S(2), S(3)) e visualizzare la conseguente immagine codificata (Pe) in tempo reale.
18. 18. Sistema secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto modulo di elaborazione (50) è configurato per aggiornare progressivamente l'immagine codificata (Pe) mantenendo l'immagine digitalizzata come sfondo.
19. 19. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che comprende un modulo di memorizzazione di massa per immagazzinare (540) in forma tabellare ordinata (640) i dati corrispondenti alle immagini elaborate e/o un documento di testo (635) contenente informazioni storiche di ogni analisi.
20. 20. Sistema secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto modulo di elaborazione (50) è configurato per visualizzare (535) una percentuale dell'area erosa (605) e/o un istogramma dimensione-frequenza (620).
21. 21. Procedimento per l'analisi della attività osteoclastica che comprende le operazioni eseguite dal sistema secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 20.
22. 22. Prodotto informatico direttamente caricabile nella memoria di un elaboratore digitale e comprendente porzioni di codice software per attuare le fasi del procedimento secondo la rivendicazione 21 quando il prodotto informatico è eseguito su un elaboratore digitale.