NO315005B1 - Innretning for massedyrking av celler - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en innretning for massedyrking av celler, særlig av leverceller (hepatocytter) på platelignende cellekulturbærere.

I medisinen og i farmasien er det ofte nødvendig å gjennomføre forsøk med cellekulturer. Dette gjelder for eksempel for deres dyrking, for deres observasjon, deres reak-sjon på fremmed- og/eller giftstoffer, for konservering og lignende.

Utover dette blir letingen efter egnede organerstarninger alltid viktigere.

Et av hovedområdene er forsøk med henblikk på stoffskiftefunksjonen og særlig for leveren.

Kompleksiteten for de mangfoldige hepatocellulære stoffskiftefunksjonen stiller imidlertid høye krav til en kunstig organerstatning for leveren. Når det gjelder kunstige nyrer, står filtrasjons- og stoffskifteoppgavene i første rekke, oppgaver som kan opp-fylles av et apparat som gjennomfører en dialyse. På samme måte erstattes når det gjelder kunstige hjerte fremfor alt pumpefunksjonen med en maskin. Leveren har i motsetning til dette et stort antall enkelt funksjoner som grovt kan deles opp i kategorier som giftfjerningsfunksjonen, proteinsekresjon, endokrine oppgaver, lagringsfunksjoner, fagocytose eller fett- og karbohydratstoffskifteoppgaver.

Ved kjente kultursystemer mister levercellene, nemlig hepatocyttene, sin funksjonsdyk-tighet allerede i løpet av de første dager efter isolering. Således er allerede efter 2 til 3 dager, alt efter undersøkt funksjon, kun ca. 80% og efter 1 uke kun minimale restfunk-sjoner tilbake. Derefter skjer cellédød og en overvoksing med fibroblastlignende celler. Forsøk til nu med levercellekulturer har måttet gjennomføres i en fase med stadig frem-skridende cellenedbrytning.

For å opprettholde den hepatocytære funksjon i kulturen er det allerede foreslått for eksempel å gjennomføre en epitelial kokultur, tilførsel av dimetylsulfoksyd (DMSO) til mediet, eller anvendelse av en kompleks matriks (Matrigel). Hvis målet imidlertid er anvendelsen av en levercellekultur der man skal komme nærmest mulig "in vivo"-situa-sjoner, oppstår det ved disse konvensjonelle dyrkingsteknikker en rekke problemer. Således er DMSO et kjemisk stoff som også har en hepatotoksisk virkning. Epiteliale kokulturer er transformerte cellelinjer og har onkogen karakter. Slutninger til oppfør-selen til naturlige, fuHdifferensierte celler, er derfor ikke mulig på fullstendig sikker måte. Matrigel er i sin tur avledet fra sarkomcellelinjer (Engelbrecht Holm-sarkom) og ikke karakterisert i sine komponenter. En klinisk anvendelse av onkogene celler eller deres ikke nærmere definerte produkter er derfor ikke å anbefale.

Det er også allerede foreslått et system hvorved dette generelt består av et hepatocytt-monosjikt som på en side kleber til glass, plast eller proteinholdig, ekstracellulær matriks som cellekulturbærer.

Kjent er også et såkalt sandwich-kultursystem som har en matriks-hepatocytt-matriks-oppbygning. Dette systemer krever dog for realisering en flate som underlag og som må være tilgjengelig for påføring av det andre, øvre sjikt. Innretninger på basis av hulfibre eller mikrobærere muliggjør riktignok teoretisk en massekultur, men anvender dog stadig med konvensjonelle kulturkonfigurasjoner. Dette betinger et raskt funksjonstap for hepatocyttene hvorved det i tillegg oppstår signifikante oksygeneringsproblemer. Et sandwich-kultursystem kan ikke realiseres på denne måte da det kommer til sammen-klebinger.

En ytterligere mangel ved de kjente kulturer og særlig sandwich-kulturene ligger i at oksygentilførselen til cellene kun løses på utilfredsstillende måte. Områdevis oppstod det en for liten tilførsel, mens det i andre områder ved en økning av perfusjonshastig-heten i kulturmediet kom til en uønsket økning av skjærkreftene.

For å omgå slike oksydasjonsproblemer for cellekulturer og særlig for hepatocytter i kultur, er det allerede også foreslått gasspermeable membraner. Derved blir cellene som ligger på den ene side av membranet enten matet gjennom transmembranluftkontakt eller via et med oksygen anriket medium som strømmer forbi på det overforliggende side. Slike enkeltmembraner er dog kun egnet for laboratorieformål henholdsvis for små mengder og størrelser.

En ytterligere hovedmangel ved den kjente metode og konstruksjon ligger i rompro-blemet, det vil si det store plassbehov. Således krever for eksempel løsningen av oksy-generings- og næringsmiddeltilmatningsproblemene kompliserte, adskilte pumpe-kretsløp, noe som fører til en enorm forstørrelse av aggregatet i forhold til det virkelig dyrkede cel lean tall. En massekultur er ikke mulig på denne måte da en total organerstatning, for eksempel en menneskelever, ville kreve et helt hus ved en slik teknikk.

Foreliggende oppfinnelse har derfor til oppgave å tilveiebringe en innretning av den innledningsvis nevnte art med hvilken det er mulig med en massekultur under fornuftige rombetingelser og i en tilstand som så langt det er mulig minner om en "in vivo"-tilstand.

Ifølge oppfinnelsen løses denne oppgave ved en innretning for massedyrking av celler, særlig hepatocytter på cellekulturbærere, hvorved i det minste en del av overflatene av cellekulturbæreren er gassgjennomtrengelig, der innretningen karakteriseres ved at oksygen kan ledes inn i det indre av den plateformede cellekulturbærer og at det på cellekulturbæreren er påført et celledekkende kollagensjikt, hvorved den neste cellekulturbærer er anordnet direkte eller med liten avstand over kollagensjiktet, og hvorved kulturmedium kan ledes inn i kollagensjiktet eller i mellomrommet mellom kollagensjiktet og den neste cellekulturbærer.

Oppfinnelsens bygningsprinsipp i form av en bioreaktor muliggjør at det på meget små rom kan tilveiebringe en anordning for behandling av cellekulturer ved hjelp av hvilke det kan dyrkes et vesentlig høyere antall celler enn det som var mulig med de kjente løsninger. Ved oppfinnelsens utforming av cellekulturbæreren tilveiebringes det også en tilstrekkelig og i det vesentlige over det hele jevn oksygentilførsel for cellekulturen.

Oppfinnelsens bygningsprinsipp for bioreaktoren imiterer den mikroanatomiske og funksjonelle enhet for leverparenkymet, den såkalt leverlobulus. Dette muliggjør, ved separat arteriell og portalvenøs-venøs fase, samtidig flere vesentlige fordeler i forhold til kjente anlegg og metoder. For eksempel er det mulig med en optimal, umiddelbar, nøyaktig doserbar og jevn fordelt tilførsel til hepatocyttene av oksygen. Videre kan totalcelleantallet være så høyt det vil og tilpasset de angjeldende krav (massekultur). Dødvolumet i bioreaktoren kan holdes minimalt.

Når det i en meget fordelaktig utførelsesform av oppfinnelsen er sørget for at cellekulturen er anordnet på et første kollagensjikt og at det over cellekulturen ligger et andre, øvre kollagensjikt, er hepatocyttene i en kollagen-sandwich immobilisert, hvorved man muliggjør en ennu bedre "in vivo"-Hgnende morfologi og funksjon for cellene.

En ytterligere meget fordelaktig videreutvikling av oppfinnelsen består i at det på grunn av oppfinnelsens tildanning av bioreaktoren også er mulig, ved siden av den første cellekultur, også å behandle en andre cellekultur, for eksempel ikke parenkymale celler. På denne måte er det mulig med en kokultivering i ordnede, tredimensjonale strukturer, for eksempel sinusoid - matriks - hepatocytt - matriks -ikke-parenkymalcelle - sinusoid Det utgjør den første sinusoid oksygentilførselsrommet i cellekulturbæreren, mens den andre sinusoid dannes av spalterommet mellom det øvre kollagensjikt og den neste cellekulturbærer henholdsvis det neste cellekultursjikt.

Hvis oppfinnelsens bioreaktor anvendes for eksempel for dyrking av hepatocytter, ut-gjør cellekulturbæreren et tverrsnitt gjennom en leverlobulus. Levercellene (hepatocyttene) er forankret i konfluierende sjikt i kollagenmatriksen, bestående av nedre og øvre kollagensjikt, analogt disse's spalterom. Over og under de stabelbare cellesjikt befinner det seg kapillære mellomrom som tilsvarer sinusoidene. Disse transporterer portalvenøst næringsmedium som kulturmedium og, i en separat, arteriell fase, oksygen gjennom den indre cellekulturbærer. Tilførselen skjer ved periferien av cellekulturbæreren anordnede portalfelt. Oksygen trer også over i en portalvenøse fase og strømmer med denne inn i den venøse fase som dannes av spalterommet. Analogt sentralvenen blir her næringsmedium samlet fra alle cellekulturbærere som imiterer lobuli henholdsvis spaltings-rommene og ført bort.

Næringsmedium fra alle spalterom kan så samles i et reservoar og føres i kretsløp tilbake til bioreaktoren via en pumpe, for eksempel en peristaltisk pumpe. Ved en mel-lomkoblet filterinnretning kan likeledes stoffer fra kretsløpet skilles ut. Dette gjelder for eksempel for gallevæske så sant man ikke på enkel måte bytter ut dyrkingsmediet inni-mellom.

Cellekulturbæreren kan fremstilles av forskjellige materialer. Det vesentlige er at de er bilaminære, det vil si at minst de største mot-hverandre-liggende overflater er gassgjennomtrengelige, men ikke væskegjennomtrengelige. Efter behov kan overflatene dog også være semipermeable henholdsvis væskegjennomtrengelige. I et slikt tilfelle kan eventuelt oksygenutbyttingen skje via cellekulturbæreren.

I en enkel utførelsesform kan det derved tas sikte på at cellekulturbæreren dannes av et øvre og et nedre sintermetallbånd som er separert fra hverandre med avstandsholdere. Mellom de to bånd fører man så inn oksygen henholdsvis luft med karbondioksyd. Alt efter antall og type cellekulturbærere kan derved normalt, atmosfærisk trykk eller et lite overtrykk være tilstrekkelig, derved oppnår man at oksygen diffunderer gjennom det gassgjennomtrengelige sjikt og derved når frem til det ved siden av liggende kollagen-sjikt.

Slike cellekulturbærere har en høy mekanisk stabilitet.

I stedet for sintermetall kan man som cellekulturbærermateriale også anvende plaster som er tilsvarende gassgjennomtrengelige. For dette formål egner seg for eksempel polypropylen- og silikonfolier som har den ytterligere fordel at de er lysgjennom-trengelige. På denne måte muliggjøres en lysmikroskopisk observasjon av cellene.

Oppfinnelsens utforming av bioreaktoren sikrer en i utstrakt grad enhet fordeling av oksygentilførselen, da hver celle har sin egen oksygenplass. Oksygentilførselen er i tillegg nøyaktig doserbar alt efter kravene og uavhengig av indre, strømningstekniske forhold.

Ved stabling av et hvilket som helst antall cellekulturbærere over en felles oksygen-tilførsel kan det nødvendige totalcelletall på enkel måte tilpasses kravene (modul-teknikk). Spalterommet som fører kulturmediet separeres fra cellekulturbæreme og deres oksygentilførsel ved hjelp av pakningsringer.

Betydningen av denne umiddelbare oksygenering ved hjelp av bilaminære membraner og deres stablingsmodul blir klar når man tenker på at man på denne måte for første gang også kan mate store celleaggregater i tredimensjonale strukturer med lite plassbehov samtidig med oksygen. Avstanden mellom platene reguleres via tetningsringene, for eksempel elastiske silikontetningsringer som samtidig tjener som avstandsholdere og også som skillemiddel mellom væskefasen (venøs) og gassfasen (arteriell). Ved valget av størrelse henholdsvis diameter for tetningsringene blir avstanden mellom platene fritt regulerbar. Efter behov kan det bli tilbake kun en kapillær spalt mellom platene og derved oppstår det en "sinusoid". En ytterligere fordel ved dette er at avstandene kan minimaliseres ved innsparing av dødvolum.

I stedet for en fremstilling av de plateformede cellekulturbærere av sintermetall kan disse eventuelt også fullstendig dannes av en ikke-oksydisk plast hvorved man for dette forhold fortrinnsvis anvender en gjennomsiktig plast, da det i dette tilfellet er mulig med en enkel observasjon av kulturen.

En mulig utførelsesform kan bestå i at cellekulturbæreme hele tiden er dannet av en

bærerribbe på henholdsvis over hvilken det er spent en gassgjennomtrengelig membran.

Bærerribben kan derved bestå av et ytre ringlegeme og et indre ringlegeme som omslutter den sentrale boring, hvorved begge ringlegemer er forbundet med hverandre via eke-

lignende ribber.

Denne utførelsesform er meget enkel å fremstille og gir en tilstrekkelig stor stabilitet for bærerribben slik at det kan fremstilles cellekulturbærere som eventuelt har en tykkelse på mindre enn 1 mm. De gassgjennomtrengelige membraner kan for eksempel være av teflonfolie med en tykkelse på 0,0025 mm.

På fordelaktig måte anordner man i minst en del av ribbene tilførselsåpninger for oksygen, hvorved det i ribbene er anordnet luftføringskanaler. Luftføringskanalene sørger for fordelingen av det tilførte oksygen til det indre av cellekulturbæreme.

Med en hepatocyttdyrking ifølge oppfinnelsen har man til nu oppnådd en stabil funksjon i opptil 7 uker. Cellesjikt som ligger mellom platene kan derved oksygeneres tilstrekkelig fra to sider. Dette muliggjør en tredimensjonal rekonstruering av en normal leverarkitektur: sinusoid - matriks -hepatocytt - matriks - ikke-parenkymalcelle - sinusoid og så videre uten iskemiproblemer. Over cellesj iktene oppstår det en fri gassutbytting med den arterielle og portalvenøs-venøse fase.

Alternativt til den ovenfor angitte rekkefølge kan det efter behov også anordnes en kom-plett dobbeltenhet på oversiden av cellekulturbæreren. I dette tilfellet er sjikt oppbygningen på oversiden av cellekulturbæreren som følger: første kollagensjikt - cellekultur - andre kollagensjikt - cellekultur -tredje kollagensjikt. På det tredje, det vil si det øvre kollagensjikt, legger man så på den neste cellekulturbærer. Derved må man ved sammenbygning kun passe på at det mellom det tredje, øvre, kollagensjikt og undersiden av den derpå satte cellekulturbærer oppnås et spalterom. Til dette spalterom fører man så inn kulturmediet. I et slikt tilfelle faller således et fjerde kollagensjikt ut da det midlere kollagensjikt avslutter begge cellekulturer mot det ytre. Riktignok skjer tilførselen av kulturmedium derfor ikke sentrale mellom de to midlere, kollagensjikt, men da kolla-gensjiktene uten vanskelighet gjennomtrenges av kulturmediet, oppnår man også i dette tilfellet en tilstrekkelig tilførsel for den nedre cellekultur.

Gass- henholdsvis oksygentilførselen til de bilaminære cellekulturbærere kan skje ved periferien av cellekulturen tilsvarende den arterielle tilførsel i portalfeltet til en leverlobulus. Cellekulturbæreren kan befinne, seg i en glassbeholder som hus. Dyrkingsmediet kan også tilføres perifert og nedenfra (portalvenøs tilførsel) og fordeler seg så oppadstigende langs zirkumferensen av platene og strømmer over og under hver enkelt bilaminær cellekulturbærer til en sentral åpning. Der befinner det seg for eksempel en oppover til spisset kjegle. Denne fører dermed til en oppover-rettet lumentilførsel henholdsvis en økning av lysåpningen for spalten til "sentralvenen" og muliggjør ved bortfall av unødig dødvolum, en ordnet bortføring av kulturmediet fra omfanget av senteret og deretter oppover. Bioreaktoren tømmer seg over topp og medialt (venøs fase). Ved overstrøm av cellesjiktene fullføres derved overgang fra den portalvenøse og arterielle fase til den venøse fase. Dette tilsvarer leverens "in vivo"-organisasjon.

Oppfinnelsens bioreaktor har tallrike anvendelsesmuligheter både i medisin og farmasi.

Et av tyngdepunktene er derved anvendelsen som kunstig lever henholdsvis lever-erstatning.

Metaboliseringen av et stort antall medikamenter skjer i leveren. Lipofile medikamenter som for eksempel Ciclosporin eller FK 506 blir spesieavhengig stoffskiftet til forskjellige metabolitter. Disse metabolitter er delvis ansvarlig for stoffets virkning, også imidlertid for deres toksisitet. Først ved den kliniske utprøving kan det annerledes virkende metabolittmønster og dets toksisitet hos mennesker påvises til forskjell fra dyreforsøk.

Utviklingen av et dynamisk, menneskelig system, uten mennesker, har prinsipielle fordeler i forhold til dyreforsøk ved begynnelsen av en klinisk utprøving med henblikk på gyldigheten av resultatene. Også i etisk hensikt oppstår spørsmålet om man på grunn av usikre dyreforsøk kan forsvare den første utprøving, særlig høye aktiv-bestanddel-konsentrasjoner av lipofile medikamenter i mennesker innenfor rammen av den kliniske utprøving.

I tillegg tilstrebes i stor-dyr- og primatforsøk utviklingen av en temporær organerstatning ved hjelp av dyrelever. Kryssperfusjon med en bavianlever blir allerede anvendt klinisk med varierende hell.

Ifølge oppfinnelsen kan de pulsatile egenskaper for bioreaktorkretsløpet utnyttes og metabolittene erkjennes av Pharmaka. Medikamenter og hormoner kommer pulsatilt frem til leveren "in vivo".

Disse betingelser kan simuleres i bioreaktoren. Man kan faststlå "peak- and through"-verdier for en modersubstans og også dennes metabolitter. Første gjennomløps- og resirkuleirngsstudier er mulige. I tillegg kan man fastslå metabolittmønsteret ved dyriske og menneskelige celler. En undersøkelse av den direkte toksisitet, særlig ved høye doseringer, er også mulig.

Mulig kan man realisere den kontrollerte bestemmelse av en dosisavhengig kinetikk for metabolittdannelsen. En slik situasjon kunne til nu kun undersøkes ved dyreforsøk.

Det består fysiologiske forskjeller i oppførselen mellom humane og rottehepatocytter. Også for dyreforsøk per se gjelder disse begrensninger.

Antallet anvendte dyr for farmakokinetiske og metabolske undersøkelser i industrien er meget høyt, da disse så å si utelukkende gjennomføres på forsøksdyr. På grunn av over-førbarheten til mennesker må en av to dyrearter tilsvare mennesket når det gjelder stoff-skifteforløpet. Dette kan dog være forskjell alt efter anvendt substans. En egnet dyreart er derfor forutsigbar kun med begrensninger. Belastningen er selvfølgelig avhengig av den anvendte substans.

Med oppfinnelsens anvendelse av bioreaktorer kan slike forsøk eventuelt bortfalle i utstrakt grad. Således står for eksempel humane hepatocytter fra operasjonspreparater efter leverreseksjon eller fra ikke eller kun delvis transplanterte organer til disposisjon og disse kan derved anvendes i oppfinnelsens bioreaktor.

Leversykdommer som kan føre til fullstendig bortfall av organ er utbredt og kan treffe et hvilket som helst menneske akutt og uforutsigbart. Dertil hører hepatitt på samme måte som levertumorer, også leverskader på grunn av gift (sopp, alkohol), men også ulykker.

Den kunstige organerstatning med oppfinnelsens bioreaktor forfølger to mål:

1. Man skal slå en bro over ventetiden mellom inntredenen av leversvikten og dis-ponerbarheten av et nytt organ ved planlagt levertransplantasjon. Deke sjelden dør pasienter nettopp i denne ventetiden. 2. En leversvikt må ikke bestandig være fatal. Kunne man gi en pasient i en slik situasjon muligheten til en støttebehandling ved hjelp av en midlertidig organerstatning, kan pasienten eventuelt overleve en slik situasjon. Den egne lever vil ha tid til regenerering. Dette er fremfor alt tenkbart ved akutte traumatiske eller toksiske skader på leveren. Også ved utstrakt tumoroperasjoner kan en reserve i form av en temporær organerstatning redusere operasjonsrisikoen eller muliggjøre større inngrep. Legemet produserer selv en stor mengde vekstfaktorer som mulig-gjør en eftervekst av blivende, sunn restlever.

Behandlingsmetodene til nu inneholder fjerning av stoffskiftegift og en filtrering av blodet. Dessverre blir derved også vekstfaktorene fjernet og en helbredelse hindret.

En ytterligere anvendelsesmulighet for oppfinnelsens bioreaktorer består i den stor-tekniske fremstilling av blodkoaguleringsfaktorer som for eksempel leversynteseprodukter. Til nu har man fremstilt blodkoaguleringsfaktorer fra humanblod fra blodgivere. Derved består dog en fare for en hepatittsmitte eller en AIDS-infeksjon. Med oppfinnelsens bioreaktor kan man nu uavhengig av blodgivere oppnå for eksempel blodkoaguleringsfaktorer på infeksjonsfri måte. Dette er en alternativ løsning til den kompliserte genteknologiske oppnåelse av leversynteseprodukter.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til de ledsagende tegninger, der: Figur I viser en skjematisk illustrasjon av oppbygningsprinsippet for bioreaktoren, i tverrsnitt; Figur 2 viser en prinsippskisse av virkningsmåten for bioreaktoren; Figur 3 viser en cellekulturbærerplate, sett ovenfra;

Figur 4 viser oppfinnelsens bioreaktor i total oppriss; og

Figur 5 viser en cellekulturbærerplate av en annen konstruksjon, sett ovenfra.

Kjernen av bioreaktoren danner et antall i avstand fra hverandre, over hverandre anordnede cellekulturbærere 1 som er tildannet som silikonbelagte plater av sintringsmetall.

Slik det er vist i den forstørrede illustrasjon i figur 1, er hver plate dannet av et tynt overflatesjikt, for eksempel et sintermetall- eller plastbånd IA som er ombøyet ved den ytre periferi og tilbakeført innover. Ved hjelp av ikke nærmere viste avstandsholdere 2 som derved danner et fritt innerrom mellom den øvre bånddel og den nedre bånddel, tilveiebringes det et fritt rom. Slik man kan se fra figur 3, er hver plate utstyrt med en sentral åpning 3.1 tillegg er det til stede to diametralt overfor-hverandre-liggende boringer 4 hvorved boringene 4 befinner seg mellom den ytre omkrets og den sentrale åpning 3. Ved boringen 4 tjener for tilførsel av oksygen til det indre av platene 1. Derfor bør boringene 4 være anordnet i platen 1 med en slik fordeling at det kan gjennomføres en tilstrekkelig og jevn oksygenfordeling.

På oversiden av det øvre bånd IA påføres det et første, hydrert kollagensjikt 5 (for eksempel protein fra hud, knoke eller brusk) i en tykkelse på ca. 0,5 mm. På denne kollagensjikt 5 følger et cellekultursjikt 6, for eksempel hepatocytter. På cellekultursjiktet 6 påføres det et andre, øvre kollagensjikt 7. Eventuelt kan det over dette påføres et sjikt, for eksempel av ikke-parenkymale celler 8 (se den stiplede illustrasjon i figur 1). De to kollagensjikt 5 og 7 utgjør ingen vesentlig barriere for gass- henholdsvis lufttilførselen og næringsstoffdiffusjonen til hepatocyttene. Selv store molekyler kan trenge gjennom disse sjikt uten problemer. Da cellene 6 ligger direkte på cellekulturbæreren 1 som oksygenbærer ved hjelp av det første kollagensjikt 5, gir det seg derved, med henblikk på gassdiffusjonen, en situasjon som i en inkubator efter fjerning av mediet. Dette er der forutsetningen for optimeringen av oksygentilførselen ved dyrk-ingen av større celletall i konfluierende sjikt. I bioreaktoren gir man dog ikke avkall på det næringsbærende dyrkingsmedium. Dette tilføres via den lille åpning henholdsvis spalt mellom det øvre kollagensjikt 7 og en ytterligere påleggsenhet. Den ytterligere (og følgende) påleggsenhet består i sin tur av et nedre henholdsvis indre kollagensjikt 5' som med avstand er påført på den over den første cellekulturbærer 1 anordnede ytterligere cellekulturbærer 1<*>. På det indre kollagensjikt 5<*> følger så cellekultursjiktet 6' som utvendig er dekket med det andre henholdsvis ytre kollagensjikt 7'. Denne enhet er stablet praktisk og forsyningen med for eksempel næring eller plasma skjer via det felles spalterom 9.

I en variant av den i figur 1 viste oppbygning kan den viste dobbeltenhet fullstendig være oppbygget med to sjikt av cellekulturer 6 og 6' som i sin tur er anordnet mellom to cellekulturbærere 1 henholdsvis 1', fra oversiden av den nedre cellekulturbærer 1. Denne fremgangsmåte er da spesielt gunstig når det består en fare for at kollagensjiktet 5' ikke eller kun dårlig hefter ved undersiden av den i hvert tilfelle derover anordnede cellekulturbærer 1'. I tillegg lettes arbeidet på henholdsvis oppbygningen av bioreaktoren.

I dette tilfellet blir i stedet for spalterommet 9 den øvre cellekultur 6' lagt direkte på det øvre kollagensjikt 7 slik dette for eksempel er vist ved det ikke-parenkymale cellekultursjikt 8. På det øvre cellekultursjikt 6<*> påfører man så det øvre kollagensjikt 5' og derefter den neste cellekulturbærer 1'. Derved må man kun passe på at det ved sammen-bygningen mellom det øvre kollagensjikt 5' og undersiden av cellekulturbæreren 1<* >forblir et lite mellomrom for tilførsel av dyrkingsmedium. I dette tilfellet skjer derved næringsmiddeltilførselen til cellekultursjiktene 6 og 6' ovenfra gjennom kollagensjiktet 5'. Kollagensjiktet T faller bort og det finnes nu et midlere kollagensjikt 7.

Slik man ser garanteres oksygenbehovet for stoffskitfeaktive hepatocytter uavhengig av mediet og gjennomløpshastigheten for mediet. Cellekulturbæreren 1 er oksygenatoren, hvorigjennom også konfiuierende cellesjikt 6 under anvendelse av kapillarnettet eksakt kan doseres med oksygen.

I figur 2 vises skjematisk oppbygningen av bioreaktoren. Derved viser de sorte piler veien henholdsvis strømningsretningen for kulturmediet, mens de hvite piler viser oksygenløpet. Det samme gjelder også for de øvre pilillustrasjoner i figurene 1 og 4. Derved blir oksygenet ført inn via en felles oksygenledning 23 som skal forklares nærmere i sammenheng med figur 4. Dyrkingsmediet føres likeledes inn via en felles ledning 18 i jevn fordeling til alle spalterom 9.

Den totale oppbygning av bioreaktoren sees i figur 4. Som vist blir et antall cellekulturbærere anordnet i avstand fra og over hverandre, hvorved det anbringes tetningsringer i form av silikontetningsringer 10 rundt oksygenboringene 4 for hver plate, både for å holde en avstand mellom platene 1 og for å sørge for en avtetning mellom væskefasen (venøs) og gassfasen (arteriell). Valget av størrelse henholdsvis tykkelse for silikontetningsringene 10 som presses sammen ved sammenbygning av platene, sørger også for at det dannes et kapillært spalterom 9 mellom platene, noe som derved gir "sinusoiden".

Tilførselen av oksygen til huset 11 i bioreaktoren skjer via en oksygenmateledning 23 til de i flukt over-hverandre-liggende oksygenboringer 4 i cellekulturbæreren 1. For forbindelse av cellekulturbæreme 1 med hverandre tjener en stav 12 som, sett i tverrsnitt, har trekantform. På denne måte forblir det mellom boringsveggen for oksygenboringene 4 og staven 12 tilstrekkelig frirom for innførsel av oksygen (se figur 3). Staven 12 er utstyrt med en sentral boring gjennom hvilken det føres en spennskrue som på ikke-vist måte sammen med en kontramutter henholdsvis kontraplate 14 på undersiden sørger for en forbindelse og en gasstett spenning av silikontetningsringene 10.1 frirommet som

oppstår mellom de fluktende, over-hverandre-liggende, sentrale åpninger 3 i cellekulturbæreme 1, er det satt inn en kjegle, for eksempel en glasskjegle 15. Glasskjeglen 15 har

en mindre diameter enn diameteren til de sentrale åpninger 3, hvorved det oppstår et spalteformet rom 16. Da kjeglen 15 tilspisses oppover, blir spaltrommet 16 større hvorved det sørges for en god og jevn bortføring av dyrkingsmediet via en felles avløps-ledning 17.

Slik man ser strømmer kulturmediet på begge sider av bioreaktoren via celletilførsels-ledningen 18 til huset 11 og derfra utenfra, perifert langs spalterommet 9 innover, hvorved det så føres bort via spaltrommet 16.

Dyrkingsmediet kan føres i kretsløp, hvorved det er sørget for et samlereservoar 19 og en nedstrøms dette liggende pumpe 20 som via de stiplet, viste ledninger fører dyrkingsmediet tilbake til tilførselsledningen 18. Eventuelt kan det i kretsløpsledningen også være anordnet en filterinnretning for å separere uønskede bestanddeler fra dyrkingsmediet som kommer fra bioreaktoren.

Hvis bioreaktoren ikke er anordnet i en inkubator, blir generelt oksygenet hvortil det kan være satt ca. 5% karbondioksyd, ført via en forvarmer 21 og en fukter 22 til bioreaktoren. Luften som forlater bioreaktoren kan føres gjennom en vannsøyle. På denne måte hindres en karbondioksyd utbytting med den omgivende luft, hvorved det ønskede høye karbondioksydinnhold i praksis kan stabiliseres i et slags lukket system.

I figur 5 vises en konstruktiv utforming av en skiveformet cellekulturbærer 1 som fortrinnsvis består av en ikke-toksisk plast. Som bærerribbe tjener derved et ytre ringlegeme 24 og et indre ringlegeme 25 som omslutter den sentral boring 3. Forbindelsen mellom de to ringlegemer 24 og 25 med hverandre skjer via eke-tildannede ribber 26.1 to overfor-hverandre-liggende eker 26 er det anordnet tilførselsåpninger 4 for oksygen. Denne bærerribbe overspennes på oversiden og på undersiden med en transparent membran, for eksempel en teflonfolie. For at oksygenet skal fordeles jevn i det indre av cellekulturbæreren 1, er ekene 26 også utstyrt med en eller flere lufUedekanaler 27 på overflaten (over- og undersiden) og som gjennomløper ekene i full bredde.

Tykkelsen henholdsvis avstanden mellom de enkelte sjikt velges avhengig av de cellekulturer som skal behandles. For dyrking av hepatocytter har tykkelser på ca. 0,5 mm vist seg egnet for cellekulturbæreren 1 hvorved det gassgjennomtrengelige overflatesjikt henholdsvis sinterbåndet kan ha en tykkelse på kun 0,1 mm eller mindre.

For de to kollagensjikt har tykkelser på 0,4 til 0,6 mm og fortrinnsvis 0,5 mm vist seg egnet. Cellekultursjiktet kan ha en tykkelse på 0,002 til 0,003 mm. For spalterommet 9 er det tilstrekkelig med noen tiendedels millimeter.

Anslår man innholdet av hepatocytter i 1 g lever til 100 millioner, vil leveren til en 150 g tung rotte med en vekt på 8 til 10 g, inneholde 800 millioner til 1 milliard hepatocytter. Forsøk har vist at her er det kapasiteten til en bioreaktor med en indre høyde på ca. 30 mm og en diameter for de plateformede cellekulturbærere på 10 til 15 cm, er tilstrekkelig.

For å overta oppgavene til en menneskelig lever henholdsvis som kunstig menneskelig lever, ville det anslagsvis være nødvendig med ca. 2000 over-hverandre-liggende plater, noe som ved en anordning av platene i 4 søyler, for eksempel i en kløverstruktur, ville gi en totalhøyde på 80 til 100 cm. Egenvolumbehovet for bioreaktoren av dyrkingsmedium ville derved være relativt lite med sine ca. 101. Via et reservoar kan derved stoffskifte mot pasientplasma gjennomføres.

Claims (22)

1. Innretning for massedyrking av celler, særlig hepatocytter, på cellekulturbærere, hvorved i det minste en del overflatene av cellekulturbæreren er gassgjennomtrengelig, karakterisert ved at oksygen kan ledes inn i det indre av den plateformede cellekulturbæreren (1) og at det på cellekulturbæreren (1) er påført et celledekkende kollagensjikt (5,7), hvorved den neste cellekulturbærer (1) er anordnet direkte eller med liten avstand over kollagensjiktet (5,7) og hvorved kulturmedium kan ledes inn i kollagensjiktet (5,7) eller i mellomrommet mellom kollagensjiktet (5, 7) og den neste cellekulturbærer (1).

2. Innretning ifølge krav 1, karakterisert ved at cellekulturen (6) er anordnet på et første kollagensjikt (S) og at det over cellekulturen (6) ligger et andre, øvre kollagensjikt (7).

3. Innretning ifølge krav 2, karakterisert ved at det mellom to kollagensjikt (7, 7') og mellom et kollagensjikt (5<1>) og undersiden av en cellekulturbærer (1') er anordnet et mellomrom (9) for tilførsel av dyrkingsmedium.

4. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det på den første cellekultur (6) er anordnet en andre cellekultur (8).

5. Innretning ifølge krav 4, karakterisert ved at den andre cellekultur (8) er dannet av ikke-parenkymale celler.

6. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at cellekulturbæreren (1) består av sintermetall.

7. Innretning ifølge krav l, karakterisert ved at hver cellekulturbærer (1) består av et øvre og et nedre gassgjennomtrengelig sjikt eller bånd (IA) som er separert fra hverandre ved avstandsholdere.

8. Innretning ifølge krav 7, karakterisert ved at sjiktet (IA) består av sintermetall.

9. Innretning ifølge krav 8, karakterisert ved at cellekulturbæreren (1) består av en gassgjennomtrengelig plast eller oppviser en gassgjennomtrengelig plast.

10. Innretning ifølge krav 9, karakterisert ved at cellekulturbæreren (1) er dannet av en bærerribbe (24,25,26) på eller over hvilken det er spent en gassgjennomtrengelig membran.

11. Innretning ifølge krav 10, karakterisert ved at bærerribben består av et ytre ringlegeme (24) og et indre, den sentrale boring (3) omsluttende ringlegemet (25), hvorved begge ringlegemer (24,25) er forbundet med hverandre med ekelignende ribber (26).

12. Innretning ifølge krav 11, karakterisert ved at det i minst en del av ribbene (26) er anordnet tilførselsåpninger (4) for oksygen og at det i ribbene (26) er anordnet luftledekanaler (27).

13. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 12, karakterisert ved at de gassgjennomtrengelige overflater er dannet av en silikon- eller polypro-pylenfolie.

14. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13, karakterisert ved at det mellom de enkelte cellekulturbærere (1) er anordnet avtetningsringer (10) som tjener som avstandsholdere og/eller tetninger.

15. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, karakterisert ved at den er tildannet byggkomponentlignende med et antall av i et hus over-hverandre-anordnede cellekulturbærere (1) med minst en tilførselsledning (23) for oksygen og minst en tilførselsledning (18) og minst en bortføringsledning (17) for dyrkingsmedium.

16. Innretning ifølge krav 15, karakterisert ved at cellekulturbæreren (1) i det minste tilnærmet oppviser, en skiveform hvorved tilførselen av dyrkingsmedium skjer fra siden og bortføringen fra det sentrale området av den på dette punkt med et fritt rom utstyrt cellekulturbærer (1), og at cellekulturbæreren (1) er utstyrt med minst to jevnt over omfanget av cellekulturbæreren (1) anordnede tilførselsåpninger (4) for oksygen.

17. Innretning ifølge krav 15 eller 16, karakterisert ved at cellekulturbæreren (1) er utstyrt med en sentral boring (3) og at det gjennom den sentrale boring er anordnet en i avløpsretningen tilspissende kjegle (15) som oppviser en slik diameter at det blir tilbake et ringrom mot veggene av den sentrale boring (3) i cellekulturbæreren (1).

18. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 16 til 17, karakterisert ved at cellekulturbæreme (1) er forenet med hverandre til en enhet ved hjelp av spenninnretninger (12,13) som forløper gjennom oksygentilførselsåpningene (4).

19. Innretning ifølge krav 18, karakterisert ved at oksygentilførsels-åpningene (4) er tildannet sirkelformige og at spenninnretningene oppviser en fra sirkelformen avvisende føringsstav (12) gjennom hvis indre det er stukket en spennskrue.

20. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 19, karakterisert ved at flere av cellekulturbærere (l) dannede tårn er anordnet ved siden av hverandre i kløverform.

21. Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 20, karakterisert ved at næringsmediet føres i kretsløp via en samlereservoar (19) og en pumpe (20).

22. Innretning ifølge krav 21, karakterisert ved at det i kretsløpet er anordnet en filterinnretning for utskilte stoffer.