NO302184B1

NO302184B1 - Fremgangsmåte for kjemisk modifisering av proteiner og peptider, samt proteiner og peptider fremstilt ved fremgangsmåten

Info

Publication number: NO302184B1
Application number: NO882836A
Authority: NO
Inventors: Guy Levesque; Jerome Souppe; Jean-Louis Seris; Valerie Bellenger
Original assignee: Elf Aquitaine
Priority date: 1987-06-30
Filing date: 1988-06-27
Publication date: 1998-02-02
Also published as: EP0300849B1; CA1331571C; DE3881774D1; EP0300849A1; NO882836D0; GR890300105T1; NO882836L; PT87858A; JP2722205B2; DK359788D0; US4870016A; DK359788A; DE3881774T2; PT87858B; JPS6467185A; ES2056946T3

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for kjemisk modifisering av proteiner, og peptider ved hjelp av en reaksjon som tillater at man på peptid- eller protein-molekylet fikserer en eller flere organiske grupper som kan endre de fysisk-kj emiske egenskaper av protidet. Oppfinnelsen vedrører særlig modifisering av proteiner og særlig modifisering av enzymer. En viktig anvendelse av oppfinnelsen beror i endring av oppløseligheten av peptider eller proteiner og særlig i at enzymene gjøres oppløselige i organiske løsningsmidler.

Oppfinnelsen vedrører også proteiner og peptider som inneholder organiske grupper som modifiserer deres fysisk-kjemiske egenskaper og tilveiebringer særlig enzymer som er gjort oppløselige i organiske løsningsmidler, ved fiksering av de nevnte grupper.

Det er kjent at egenskapene av et protein i større eller mindre grad kan endres ved innvirkning av en kjemisk reaksjonskomponent. I tilfellet av enzymer skjer dette generelt for modifisering av deres fysiske egenskaper, som oppløselig-het, mobilitet, dvs. molekylvektmasse, stabilitet, etc. Man søker likeledes ved hjelp av disse midler å muliggjøre an-. vendelse av disse bemerkelsesverdige katalysatorer under mindre drastiske betingelser enn tilsvarende for det native enzym, særlig pH, temperatur, ionestyrke, motstand overfor inhibitorer, etc. Andre formål beror i modifisering av selve de katalytiske egenskaper, dvs. utvidelse av utvalget av substrat for angjeldende enzym eller også, i motsetning til dette, orientering av den katalytiske aktivitet i retning av en større spesifisitet. Det kan f.eks. dreie seg om å gjøre en protease mer spesifikk overfor en viss peptidbinding som den hydrolyserer i nativ tilstand, et større spektrum av peptider hvor man anvender enzymene i ikke-vandig miljø eller i mindre konsentrasjon i vann hvor reaksjonsretningen kan inverseres i de tilfeller hvor vann inngår.

De fleste av disse kjente kjemiske modifiseringsprosesser for proteiner består i å anvende spesifikke forbindelser, som er i stand til å reagere med de funksjonelle grupper som bæres av de naturlige aminosyre-rester i peptidkjeden eller av glusidsyredelen eller nukleinsyredelen i glykoproteinene eller nukleoproteinene. Således anvendes ofte den nukleofile evne i gruppen e-NH2i lysinrestene overfor aktiverte elek-trofile reaksjonskomponenter. De reaksjonskomponenter som oftest anvendes i den tidligere teknikk, er syreanhydrider og trinitrobenzen-sulfonsyre. Enzymene, modifisert ved hjelp av disse kjente prosesser, har generelt en vesentlig nedsatt aktivitet. Valget av reaksjonskomponenter er meget be-grenset, idet for mye reaksjonskomponent eventuelt vil fullstendig endre enzymaktiviteten, eller også nødvendiggjøre arbeidsbetingelser som er uforlikelige med opprettholdelse av den katalytiske aktivitet eller reaksjon med andre essens-ielle aminosyrer ved opprettholdelse av den aktive struktur i enzymet.

Under forutsetning om interessen for passende modifisering av proteiner og peptider, særlig enzymer, er det et kontinuerlig behov for adekvate reaksjonskomponenter.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et vesentlig fremskritt på området og vedrører en type av forbindelser som har den egenskap at de lett reagerer med aminrestene i proteinene og peptidene for på disse å fiksere en hvilken som helst ønsket organisk gruppe, under ingen eller forholdsvis liten nedsettelse av den katalytiske aktivitet, når proteinet er et enzym, og å gjøre proteinene og peptidene oppløselige i et organisk løsningsmiddel.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for modifisering av et protein eller peptid ved fiksering av en organisk gruppe på dets molekyl, som er kjennetegnet ved at proteinet eller peptidet omsettes med en ditioforbindelse som har formelen

hvor R betegner den organiske gruppe som skal fikseres ved hjelp av C=Stil proteinet eller peptidet, mens X er en

gruppe som fjernes ved reaksjonen mellom -S-X og en aminrest i proteinet eller peptidet, i et vandig, organisk eller vandig organisk løsningsmiddel eller også i heterogent miljø, mellom 10 og 50°C, idet pH i blandingen er mellom 4 og 9.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også kjemisk modifisert protein eller peptid fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at minst et av dets nitrogenatomer bærer en gruppe

hvori R er et organisk radikal, særlig hydrokarbonradikal, som kan omfatte en polar, positiv, negativ eller nøytral del, eller også utgjøres av en polymerkjede.

Man betegner med E molekylet av proteinet eller peptidet og man kan da skjematisere reaksjonen i henhold til oppfinnelsen som følger:

Etter at HSX er fjernet er protein- eller peptidmolekylet modifisert ved fiksering av en eller flere grupper

Denne modifiserende gruppe velges selvfølgelig i samsvar med nye egenskaper som man ønsker å meddele proteinet eller peptidet, f.eks. oppløselighet i hydrokarboner, reaktivitet med baser, motstandsevne mot varme, etc. Den kan følgelig omfatte en R som er et alifatisk eller aryl-hydrokarbon av hydrofob type, spesielt C1til<C>20alkyl eller C2til C20alkenyl, fenyl, fenylenyl, naftyl eller naftylenyl, eller også et tilsvarende alkylaryl eller aryl-alkyl, idet R likeledes kan være en hydrofil, polar, negativ, positiv eller nøytral organisk gruppe, f.eks. omfattende en karboksyl-, hydroksyl-, halogen-, sulfinyl-, sulfonyl-, fosforyl-, fos-fonyl-, sul f hydryl - , amid-, ammonium- og f osf oniumgruppe .

Ved en spesiell utførelsesform er R en polymer eller oligomei i kjede, f.eks. polyetylen, polypropylen, polyakrylsyre, polyetylenglykol eller lignende.

Videre kan R i seg selv utgjøres av en ditioesterrest av

typen

i

hvori R' betegner en toverdig hydrokarbon-

gruppe, særlig alkylen, cykloalkylen, arylen eller alkylarylen, hvorav den første foretrukket inneholder 1 til 20

karbonatomer og de andre 6 til 16 karbonatomer. Y er en

i gruppe av samme type som X, men ikke nødvendigvis identisk med denne. Ved denne variant er reaksjonskomponenten en bis-ditioester:

Anvendelsen av en bis-ditioester tillater å danne et spesielt modifisert protein eller peptid som bærer en polymerkjede, > særlig polyakrylsyre, polyvinylalkohol, polyalkylenglykol eller annen oligomer eller polymer som kan amineres i det minste i enden av kjeden. Med Q-NH2betegnes en slik aminert polymer som kan kombineres med bis-tioesteren ved hjelp av ei reaksjon

5

Deretter omsettes forbindelse med Q oppnådd i (4) med et protid (E)-NH2, og man kommer da frem til:

dvs. et bis-tioamid som samtidig er polymeren Q og proteinet eller peptidet E.

Som illustrasjon angis i det følgende formler for noen av de ditioesterne og bis-ditiodiesterne som kan anvendes ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse.

i

Alt etter arten av proteinet eller peptidet som skal be-handles og den anvendte ditioester, gjennomføres fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen i vandig, organisk eller vandig organisk løsning, generelt ved en temperatur mellom 10 og 50°C. I tilfellet av enzymer er de foretrukne tempera-turer mellom 20 og 45°C.

Mengdene av reaksjonskomponenter beregnes ut fra antallet grupper -NH- eller -NH2i proteinet eller peptidet som skal kombineres med ditioesteren. Det er generelt fordelaktig å anvende et overskudd av ditioester-funksjoner pr. fri -NH-eller -NH2gruppe i proteinet eller peptidet hvortil man skal fiksere den modifiserende gruppe. Reaksjonsblandingen kan eventuelt være heterogen, og kan f.eks. utgjøres av en dis-persjon av proteinet eller peptidet i en organisk oppløsning av ditioesteren. Dette er særlig tilfellet hvor reaksjonen i samsvar med oppfinnelsen oppløseliggjør proteinet eller peptidet i det organiske løsningsmiddel for ditioesteren, og proteinet eller peptidet som er underkastet reaksjonen går i oppløsning i løsningsmidlet.

Ved en variant utgjøres X og/eller Y, som er like eller forskjellige, av en hydrokarbondel (-CH2)n, hvor n er 1 til 6, som bærer en funksjon av typen halogen, karboksyl, sulfinsyre, sulfonsyre, fosforsyrling, fosfonsyrling, fosforsyre, fosfonsyre, aktivt H, SH, amid eller hydroksy.

Et protein eller peptid ppnådd ved oppfinnelsen, særlig protease eller peroksydase, oppløselig i benzen, toluen, eter, etanol, kloroform og/eller dimetylsulfoksyd, omfatter flere lysin-grupper som ved hjelp av -C=S- bærer en gruppe R som utgjøres av et C1til C20alifatisk radikal, et C6til C16aryl-radikal eller en polymerkjede,særlig av polyetylenglykol.

Når X i formelen (1) er et hydrogenatom, dvs. når ditioforbindelsen er en ditiosyre R-CSSH, kan R være et av de ovennevnte radikaler. Særlig egnet for gjennomføring av oppfinnelsen er syrer R-CSSH og deres aminsalter eller kvaternær ammoniumsalter hvor gruppen R er C4til C18alkyl, som f .eks. n-C4H9eller n-<C>xl<H>23-, fenyl eller tolyl -C6H5, CH3-C6H4etc. Saltene av ditiosyre, egnet ved oppfinnelsen, har et kation som skriver seg fra en svak base. Denne svake base, hvor saltet av ditiosyren R-CSS-X kan anvendes ved oppfinnelsen, kan være hvilke som helst salter av ammoniakk, hydrazin, hydroksylamin, piperidin, primært, sekundært eller tertiært amin, diamin eller triamin, pyridin, tetra-alkyl-ammonium, di- eller tri-alkyl henhv. di- eller mono-aryl-ammonium, hydroksyder av Zn, Al, Mn, Pb, etc. og generelt en base hvori ione-dissosiasjonskonstanten i vann ved vanlig temperatur foretrukket er fra IO"<10>til IO"<3>og foretrukket fraIO"<6>til IO"<4>. Således kan man f.eks. anvende salter hvor X er kationet av ammonium, tetrametyl-ammonium, fenyl-trietyl-ammonium, trimetyl-heksadecyl-ammonium, mono-etanolamin, di-etanolamin, dipropylamin, di-isopropylamin, piperazin, tri-isobutylamin, trietylamin, benzylamin, fenyl-etylamin, etc.

Podingen i samsvar med oppfinnelsen gjennomføres ved å bringe det valgte protein eller peptid i kontakt med ditioforbindelsen i en bufferoppløsning med passende pH. Det er fordelaktig å anvende et stort overskudd av denne forbindelse i forhold til proteinet eller peptidet, foretrukket 10 til 100 ekvivalenter R-C-S-S-X pr. NH2gruppe tilgjengelig i proteinet eller peptidet. Dette overskudd fjernes fra den endelige oppløsning, særlig ved dialyse. Det er oftest fordelaktig å forlenge denne kontakt i noen timer, alt etter temperaturen og arten av reaksjonskomponentene som er til-stede, i 1 til 2 0 timer, selv om denne angivelse ikke er kritisk. Selvfølgelig vil man ut fra stabiliteten av proteinet eller peptidet under arbeidsbetingelsene ikke forlenge reaksjonen utover en tid som nedsetter stabiliteten for produktet.

Generelt gjennomføres fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ved pH fra 4 til 9. Det foreligger imidlertid foretrukne områder, alt etter arten av behandlet protein eller peptid og anvendt ditio-forbindelse. Således er det anbefalt å arbeide med en pH som ikke overstiger 7 når man arbeider med proteiner eller peptider som dårlig tåler basisk miljø. Videre oppnås gode resultater med ditio-forbindelserR-CSSX som utgjøres av en ditioester når pH er 7 til9og fordelaktig pH 8 til 9. Derimot, når X er H eller et kation av svak base, foretrekkes pH i området mellom 3 og 7, eller bedre fra 3,5 til 6,5 med generelt et optimum mellom 4 og6.

De etterfølgende eksempler illustrerer detaljert oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

De her beskrevne operasjoner tjener til å vise (I) at det er mulig å fremstille en ditioester fra en annen, f.eks. ved enkel endring av den nukleofuge komponent og deretter (II) å vise at -NH2i en aminosyre reagerer med en ditioester. I. Fremstilling av S-diti obenzoyl- N- acetyl- cystein ( DTAC^1,632 g N-acetyl-cystein og 2,123 g tiobenzoylmerkaptoeddik-syre (eller karboksymetyl-ditiobenzoat), oppløst i 50 ml etanol, tilsettes 2 ml vandig NaOH M oppløsning. Blandingen omrøres ved 20°C i 2 timer og konsentreres deretter ved av-damping av etanol og surgjøres med 6N HC1.

Ved kromatografi over silika, med en blanding heksan/ kloroform som elueringsmiddel, isoleres 2,45 g S-tiobenzoyl-N-

i acetyl-cystein som representerer et utbytte på 86,5 % i forhold til utgangs-acetyl-cysteinet, ved reaksjonen:

/oV-c4s^^ch^-cooh+h|s-ch2-ch-cooh

s NH-Ac

Tiobenzoyl-merkapto- Acetyl-cystein eddiksyre

(C)\-C-S-CH2CH-C0OH + HS-CH2COOH

S NH-Ac

S-ditiobenzoyl-N-acetyl- Merkapto-cystein (DTAC) eddiksyre

II. Fremstillin<g>av N-tiobenzovl-lvsin fra ditiobenzoyl-acetvl-cy stein ( DTAC)

0,425 g ell er 1,5 mmol DTAC, fremstilt i henhold til I, og 0,22 0 g lysin, likeledes 1,5 mmol, oppløses i 10 ml vandig oppløsning av NaOH 0,25 N. Oppløseliggjøringen av blandingenlettes ved tilsetning av en dråpe etanol. Etter 5 timers omsetning ved omgivelsestemperatur surgjøres blandingen og N-tiobenzoyl-lysinet frigjøres

N-1 i obenzoy1-lys in EKSEMPEL 2 Modifisering av pepperrot-peroksydase ved hielp av tridecyl-tiomerkaptoeddiksyre

(dvs. med en karboksy-

metyl-gruppe)

I3ml fosfat-buffer 0,1 M med pH = 8,5 oppløses 6 mg peroksydase fra kommersiell pepperrot (Sigma type II) dvs. 0,15/itnol (etter adsorbsjon ved 402 nm med e = 102 mM^.cm"1) og1,6 mg tridecyl-tiomerkaptoeddiksyre, dvs. 5/zmol (på forhånd oppløst i 0,1 ml etanol). Blandingen omrøres i 18 timer ved omgivelsestemperatur. Oppløsningen dialyseres deretter i 18 timer ved 4°C mot destillert vann og frysetørkes deretter. Det oppnådde enzym analyseres og har følgende egenskaper.

UV-spektrum: tilsynekomst av et bånd ved 277 nm som skyldes dannede tioamid-funksjoner.

Antall berørte lysiner: de fri lysiner bestemmes ved hjelp av den klassiske metode med TNBS (trinitrobenzensulfonsyre) og man finner da at 3 til 4 lysiner er berørt.

Oppløselighet: ettersom det native enzym ikke er oppløselig i vann, er det nye enzym oppløselig med mer enn 5 mg/ml i etanol, kloroform, toluen, eter og vann.

Spesifikk aktivitet: det dreier seg om aktivitet målt ved oksydasjon av ortodianisidin med vandig hydrogenperoksyd. Det dannes en dimer som absorberer ved 444 nm (med e=30mM"1.cm"1) . Den oppnådde spesifikke aktivitet er 850 U pr. mg protein, dvs. 97 % av den spesifikke aktivitet av det native enzym.

Aktivitet i organisk løsning: pepperrot-peroksydasen er kjent for katalyse av oksydasjons-reaksjonen av 9-metoksy-ellipti-cidin:

Denne reaksjon er interessant ettersom 9-oksoellipticin lett reduseres til 9-hydroksyellipticin ved hjelp av askorbinsyre. Den eneste ulempe ligger i den dårlige oppløselighet av 9-metoksyellipticin i vann. Den lave konsentrasjon av substrat, som resulterer for enzymet, begrenser hastigheten av oksydasj onsreaksj onen.

Man har ellers kunnet måle denne reaksjon i eter med peroksydase modifisert i samsvar med oppfinnelsen. I en spektro-fotometerbeholder blandes 0,5 ml 9-metoksyellipticin1mM i eter, 0,5 ml modifisert peroksydase med 1 mg/ml i eter, 10 til 50 fil vandig hydrogenperoksydoppløsning 2 00 mM og man fullfører med eter inntil et endelig volum på 2 ml. Man følger så ved 20°C adsorbsjonen ved 486 nm, som er absorb-sjonsbølgelengden for det dannede 9-oksoellipticin (e =

9,2mM-1.cm_1). Flere forsøk, gjennomført med forskjellige

i mengder vandig hydrogenperoksyd, tillater å vise at oksyda-sjonskinetikken er av michalie-typen med:

EKSEMPEL 3

Fiksering av tiobenzosyre- grupper på papain som gjør dette oppløselig og aktivt i dimetyl- sulfoksyd

I 40 ml fosfatbuffer 0,1M pH = 8,5 oppløses 0,32 g kommersielt papain (Sigma type IV) og 100 mg tiobenzoylmerkapto-eddiksyre på forhånd oppløst i 3 ml etanol. Blandingen settes bort i 2 timer ved 40°C og dialyseres deretter i 16 timer ved 4°C mot vann og frysetørkes deretter. Man utvinner 0,2 6 g, dvs. 81 % kjemisk utbytte. Det oppnådde enzym har følgende egenskaper.

UV-spektrum: forskyvning av absorbsjons-båndet fra 278 nm til 280 nm.

Antall berørte lysiner: 2 i forhold til de 10 som inneholdes i papainet.

Oppløselighet: oppløselig i benzen, DMSO og vann med

10 mg/ml, mens det native enzym ikke er oppløselig i benzen, men bare i vann og DMSO.

Amidaseaktivitet: denne måles ved hydrolyse ved pH = 7,5 og ved 50°C i tris-buffer og i nærvær av cystein og EDTA, av N-benzoyl-D,L-arginin-para-nitroanilid (BAPA) som frigir para-nitroanilin som absorberer ved 410 nm (med e=8,8 mM"1.cm"1) . Mens det native enzym har en aktivitet på 28 mU pr. mg fryse-tørket produkt har det modifiserte enzym 11 mU pr. mg fryse-tørket produkt, dvs. 32 % av den initiale aktivitet. Likevel er det modifiserte enzym meget interessant, ettersom det har aktivitet i organisk løsningsmiddel. Man kan anvende det i DMSO, i fravær av vann, for peptid-syntese. DMSO passer særlig godt for oppløseliggjøring av tallrike peptider, mens det native enzym ikke har noen aktivitet i dette løsnings- middel. I motsetning til dette har det modifiserte enzym en aktivitet på 1,2 mU pr. mg frysetørket produkt.

EKSEMPEL 4

Modifisering av papain ved fiksering av etyltiopropionat-grupper på molekylet

I vandig miljø omsettes ditioesteren karboksymetyl-3-svovel-ditioetylpropionat

med papain.

For dette blandes 4,5 ml fosfatbuffer 0,1 M pH = 8,5 med

36 mg kommersielt papain (Sigma type IV) med 23 mg ditioester

på forhånd oppløst i 0,1 ml etanol. Blandingen holdes ved 40°C i 2 timer og dialyseres deretter i 16 timer ved 4°C mot fosfatbuffer 0,1 M pH = 7,2. Den oppnådde protein-oppløsning analyseres og man finner: UV-spektrum:maksimum absorbsjons-forskyvning fra 278 nm til 270 nm.

Antall berørte lysiner: 4,5 av 10.

Enzymatisk aktivitet i vann, 50 % tap.

Punktene på det modifiserte molekyl kan representeres i samsvar med formel (2) med

Dette eksempel viser at man kan erstatte en gruppe ^NH3med en gruppe -C00" som tillater å endre det isoelektriske punkt og det optimale pH-område for det modifiserte enzym.

EKSEMPEL 5

Fiksering av en polvetvlen-alykol-bis-ditioest<p>r ( PRG- ditio-i ester) på pepperrot-<p>eroksydase

Man fremstiller en funksjonalisert polymer på følgende måte. I 10 ml destillert vann oppløses 0,25 g kommersiell bis-aminert PEG 20.000 (Sigma) tilsvarende 25 [ imol fri NH2-funksjoner. Man tilsetter 0,4 ml trietylamin og44mg karboksymetyl-tetratiooktandioat,

på forhånd oppløst i 0,1 ml etanol. Dette representerer 250 pimol ditioester-funksjon. pH fikseres til 10,8. Man lar blandingen omrøres i 48 timer ved vanlig temperatur og opp-løsningen dialyseres deretter i 16 timer ved omgivelsestemperatur mot destillert vann. Man utvinner da 13 ml av en oppløsning med pH = 6,6 som analyseres.

UV-spektrum tillater bestemmelse ved 308 nm av podede ditioester-funksjoner (med e = 12,2 mM"<1>.cm"<1>) og ved 263 nm de dannede tioamid-funksj oner (e = 12,8 mM" .cm ) . Ved å arbeide med et overskudd av ditioester-funksjoner kan man oppnå at det ikke er tilbake flere fri NH2-funksjoner. Man oppnår da et produkt med formel:

hvor X er CH2COOH

hvor forholdet mellom konsentrasjonene av tioamidfunksjonen (1,31 mM) og ditioester-funksjonen (0,18 mM) tillater be-regning av polymerisasjonsgraden n. Dette forhold er:

og eksperimentelt oppnås: 6 mg kommersiell pepperrot-peroksydase (Sigma type II) opp-løses i den på forhånd fremstilte oppløsning (0,15 [ imol peroksydase og 2,3/xmol ditioester) og pH bringes til 8,5 ved oppløsning av Na2HP04i blandingen. Blandingen omrøres i 18 timer ved omgivelsestemperatur hvoretter oppløsningen dialyseres og frysetørkes til slutt. Det oppnådde enzym har følgende egenskaper.

UV-spektrum: tilsynekomst av et bånd ved 287 nm som skyldes tioamid-funksj onen.

Antall berørte lysiner: 2.

Oppløselighet: enzymet er oppløselig med mer enn 5 mg/ml i løsningsmidlene: aceton, kloroform, dioksan, toluen, dimetyl-formamid, vann.

Spesifikk aktivitet: 780 U pr. mg proteiner dvs. 89 % av den spesifikke aktivitet av det native enzym.

Aktivitet i kloroform: for oksydasjon av 9-metoksyellipticin er aktiviteten tilfredsstillende. I en spektrofotometer-beholder blandes 0,5 ml 9-metoksyellipticin 1 mM i kloroform, 0,3 ml modifisert peroksydase med 1 mg/ml i kloroform, 10 til 4 0 [ il vandig hydrogenperoksyd 2 00 mM (i vandig oppløsning) og volumet bringes til 1,5 ml med kloroform. For forskjellige

mengder av vandig hydrogenperoksyd-løsning iakttas en micha-eli-kinetikk med:

EKSEMPEL 6

Modifisering av papain ved hjelp av en polyetylenglykol- bis-ditioester

Den funksjonaliserte polymer fremstilles som i eksempel 5, men under betingelser med større fortynning. De samme mengder produkt anvendes i 100 ml destillert vann i stedet for10 ml i eksempel 5. Man oppnår da en mindre tung polymer ettersom UV-bestemmelse fører til n = 0. Det foreligger da

1,9mg kommersielt papain (Sigma type IV) og 89 mg Na2HP04oppløses i 23 ml av den ovennevnte oppløsning av funksjonalisert polymer. Volumet bringes til 50 ml med destillert vann. Den oppnådde pH er 8,5.

Oppløsningen holdes ved 40°C i 2 timer og dialyseres deretter i16 timer ved 4°C mot destillert vann. Den dialyserte opp-løsning har en pH = 6,6 og et volum på 58 ml. Etter fryse-tørking gjenvinnes 4 5 mg, dvs. et kjemisk utbytte på 7 6 %. Analyse av det således oppnådde enzym gir følgende resultater.

UV-spektrum: båndet ved 278 nm forskyves til 269 nm med en avsats ved 308 nm som viser at alle tioesterfunksjonene ikke har reagert.

Antall berørte lysiner: 5 lysiner av 10.

Oppløselighet: Enzymet er oppløselig med 10 mg/ml i kloroform, DMSO og vann.

Amidase-aktivitet: 1,5 mU pr. mg frysetørket enzym som

er et aktivitetsutbytte:

Aktivitet i DMSO ved den samme test som i eksempel 3:

3,0 mU pr. mg frysetørket enzym. I kloroform fremstilles oppløsningen av substrat i en blanding av 80 % kloroform med20% DMSO for oppløseliggjøring av bestanddelene nødvendige for testen. Man finner en aktivitet på 4,2 mU pr. mg fryse-tørket enzym. I motsetning til dette viser det native enzym, bragt i suspensjon (etter som det er uoppløselig i kloroform) ved en identisk test, ikke noen aktivitet.

Eksemplene 5 og 6 viser at modifiseringen med PEG-ditioestere tillater oppnåelse av gode aktiviteter i kloroform, og dette medfører et betraktelig teknisk fremskritt.

EKSEMPEL 7

Modifisering av et hemoprotein ved hjelp av ditiopentansyre. Det behandlede protein er pepperrot-peroksydase med isoelektrisk punkt 7,2.

I 5 ml fosfatbuffer 0,2 M pH 6,0 oppløses 25 mg pepperrot, peroksydase (Sigma type II) og 2 mg ren ditiosyre CH3 (CH2) 3CSSH som tilsvarer konsentrasjonene med 0,05 mM enzym for 3 mM ditiosyre.

Blandingen omrøres i 16 timer ved omgivelsestemperatur. Opp-løsningen dialyseres deretter i 16 timer mot citratbuffer 5 mM pH 6,5.

Dialysatet isoleres deretter og analyseres:

Det totale kjemiske utbytte beregnes ved sammenligning av antall mol anvendt utgangs-hemoprotein (bestemt ved absorb-sjon ved 402 nm hvor e = 102 mM"<1.>cm"<1>), med antall mol gjen-vunnet etter modifisering. Utbyttet er 100 %. Med hensyn til aktiviteten, bestemmes for hver oppløsning av peroksydase forholdet mellom aktiviteten av oppløsningen (i U/ml) ut fra konsentrasjonen av hemoprotein (i nmol/ml) som fører til den spesifikke aktivitet i U pr. nmol heme. Den enzymatiske aktivitet av oppløsningen måles ved 30°C i en plastbeholder forsynt med 1,5 ml citratbuffer 0,1 M pH 3,5, 20/il vandig hydrogenperoksyd 0,2M, 2 0/il o-dianisidin 13 mM og 20/il enzymatisk oppløsning som på forhånd var fortynnet 20 ganger. Oksydasjonsproduktet av o-dianisidin følges ved444nm med e = 30 mM"<1>.cm"<1>. I det foreliggende eksempel går man fra en spesifikk aktivitet på 125 U/nmol/ heme for det native enzym til 67 U/nmol heme for det modifiserte enzym som representerer 54 % utbytte. Etter som det kjemiske utbyttet er 100 % er det totale aktivitetsutbytte også 54 %. På den annen side har det modifiserte enzym fordelen med å ha en ligninase-aktivitet på 1,4 U//xmol heme mens det native enzym ikke har noen aktivitet.

Antallet lysin-grupper bestemmes ved hjelp av metoden med TNBS (trinitrobenzen-sulfonsyre): man finner at 3 lysiner ut av 6 er blitt modifisert med ditiopentansyren.

EKSEMPEL 8

Modifisering av pepperrot- peroksydase ved hjelp av et salt av ditiobenzosyre

I 100 ml citratbuffer 0,1 M pH 5,0 oppløses 2,6 mg pepperrot-peroksydase (Sigma type II) og 1,2 mg tetrametylammonium-ditiobenzoat

De initiale konsentrasjoner er følgelig 0,26/xM av enzymet og 5,3/zM av ditiosyre-saltet. Etter 2 timers omrøring ved omgivelsestemperatur dialyseres oppløsningen i 16 timer mot citratbuffer 5 mM pH 6,0.

Analysene gjennomføres som i eksempel 1 og gir:

- kjemisk utbytte 72 %

- totalt aktivitetsutbytte 110 %

- antall podede lysin-grupper: 6.

Man ser at behandlingen i samsvar med oppfinnelsen øker aktiviteten av enzymet og at tiokarbonyl-gruppene er fiksert til alle tilstedeværende lysin-grupper.

EKSEMPEL 9

Modifisering av lignin-peroksydase fra Phanerochaete Chryso-soorium. ved hielp av ditiopentansyre . CH3 ( CH^) 3 CSSH

Det anvendte protein har et isoelektrisk punkt 3,9.

Til 80 ml fosfatbuffer 0,2M pH 6,0 tilsettes 20 ml av det rå lignin-peroksydase-preparat fra en kultur av Phanerochaete Chrysosporium (beskrevet i:TIEN, M. og KIRK, T.K., 1984,Proe. Nati. Acad. Sei. US. 81, 2280-2284) og 1,5 /zl renditiosyre. Konsentrasjonene av hemoprotein og ditiosyre er da 0,52fiM henhv. 130 tiM.

Blandingen omrøres i 7 timer ved omgivelsestemperatur og dia-lyseres deretter i 40 timer mot bis-tris-buffer 1 mM pH 6,0.

Analysene gj ennomføres som i de foregående eksempler 7 og8.

kjemisk utbytte, bestemt ved absorbsj on ved 404 nm (e=

102mM"<1>.cm"<1>) etter modifikasjon er 73 % i forhold til

utgangsenzymet.

totaltaktivitetsutbytte: 65 %. Aktiviteten bestemmes ved30°C i en plastbeholder inneholdende 2 ml laktatbuffer0,1 H pH 3,0, 0,1 ml vandig hydrogenperoksydløsning 10 mM,0,1 ml veratryialkohol 12 mM og 0,1 ml enzympreparat, idet dannelsen av veratrylaldehyd

følges ved 310 nm med e =9,1mM"<1.>cm"<1.>Den lille nedsettelse av aktiviteten av enzymet kompenseres ved det forhold at det modifiserte protein kan frysetørkes, med et aktivitetsutbytte på 23 %, mens det native enzym taper fullstendig sin aktivitet ved frysetørking. Det modifiserte frysetørkede enzym er oppløselig i kloroform og i DMSO.

EKSEMPEL 10

Undersøkelse av virknin<g>en avdH nå modifisering av 1 ianin-pg-^Qkgydase

I»

Man arbeider med det samme enzym som i eksempel 9 og med den samme ditiopentansyre.

Til 80 ml citrat-fosfatbuffer 0,1 M med pH 3,0, 4,0, 5,0,6,0eller 6,8 tilsettes 20 ml av det rå ligninperoksydasepreparat og 2/il ditiopentansyre. Etter 3,5 times omrøring ved omgivelsestemperatur dialyseres blandingen mot citrat-fosfat-buf fer 5 mM pH 6,0 i 18 timer.

Resultatene som funksjon av pH er gitt i følgende tabell:

For alle forsøk iakttas totalt fravær av fri lysingrupper etter modifiseringen med ditiosyren. Det viser seg at pH5,0 er optimal for denne modifisering av lignin-peroksydasen. Ved denne pH økes aktiviteten av enzymer ved poding av gruppene CH3(CH2)CS-. Det er slående å se at hvis man arbeider ved en pH 8,5 som i eksemplene 2 til 4, taper enzymet sin aktivitet med den her anvendte tioforbindelse.

Eksempel 11

Modifisering av papain ved hjelp av ditiopentansyre. Innvirkning av pH

De isoelektriske punkt for papain-proteasen er 8,8. I 4,5 ml fosfatbuffer 0,1M pH 6,0, 6,5 eller 8,5, oppløses 36 mg papain (Sigma type IV) og 23 mg ditiosyre. Blandingen op-pvarmes ved 4 0°C i 2 timer og dialyseres deretter ved 4°C i16 timer mot destillert vann. Resultatene som funksjon av pH er:

Det vises klart at de lavere pH-verdier begunstiger modifi-seringsreaksjonen. På den annen side er dette eksempel viktig ettersom papain er et enzym med aktivt cystein. Ettersom aktivitetene praktisk ikke påvirkes ved modifiseringen med ditiosyre, kan man konkludere at cysteinet i det aktive sted på proteasen ikke angripes av ditiosyren under arbeidsbetingelsene, mens lysingruppene angripes.

EKSEMPEL 12

Modifisering av peroksydase-lianin fra Phanerochaete Chrysosporium ved hielp av et salt av ditiohen^nsyT-e Proteinet er det samme som i eksempel 9 med isoelektrisk punkt 3,9.

Man blander 80 ml citratbuffer O,1 M pH 5,0 og 20 ml

av den rå dialyserte peroksydase-lignin. Man tilsetter deretter 1,2 mg tetrametylammonium-ditiobenzoat. De initiale konsentrasjoner av hemoprotein og ditiosyre-salt er da 0,46/iM henhv. 5,3/xM. Etter 2 timers omrøring ved omgivelsestemperatur dialyseres blandingen ved 4°C i 16 timer mot citratbuffer 5 mM pH 6,8. Dialysatet analyseres som beskrevet i eksempel 3 og gir:

- kjemisk utbytte 100 %

- totalt aktivitetsutbytte 86 %

- ingen fri lysin-grupper etter modifiseringen.

Selv om aktiviteten er noe nedsatt har det podede enzym den fordel at det er særlig stabilt. Mens det native enzym taper2til 5 % av sin aktivitet pr. mnd., vil det modifiserte enzymet konservert under samme betingelser ha beholdt 100% av sin aktivitet etter 2 mnd.

EKSEMPEL 13

Sammenlignin<g>

Poding av papain (isoelektrisk punkt 8,8) gjennomføres som i eksempel 6, men ved pH 6 i stedet for 8,5. Man konstaterer da at den anvendte ditioester ikke fikseres på proteinet. Derimot, som det fremgår av det foregående eksempel 11, fikseres ditiosyren på alle lysingrupper ved pH 6.

Claims

1. Fremgangsmåte for modifisering av et protein eller peptid ved fiksering av en organisk gruppe på dets molekyl,karakterisert vedat proteinet eller peptidet omsettes med en ditioforbindelse som har formelen

hvor R betegner den organiske gruppe som skal fikseres ved hjelp av C=S til proteinet eller peptidet, mens X er en gruppe som fjernes ved reaksjonen mellom -S-X og en aminrest i proteinet eller peptidet, i et vandig, organisk eller vandig organisk løsningsmiddel eller også i heterogent miljø, mellom 10 og 50°C, idet pH i blandingen er mellom 4 og 9.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat R er et alifatisk eller aryl-hydrokarbon, særlig Cx til C20alkyl, C2til C20alkenyl, fenyl, fenylenyl, naftyl, naftylenyl, alkylaryl eller aryl-alkyl.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat R er en hydrofil polar negativ, positiv eller nøytral hydrofil organisk gruppe, som særlig bærer karboksyl, hydroksyl, halogen, sulfinyl, sulfonyl, fosforyl, fosfonyl, sulfhydryl eller amid.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat R er en polymer eller oligomer kjede, særlig polyetylen, polypropylen, polyakrylsyre, polyetylenglykol eller polyvinylalkohol.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat R er av typen hvori R' betegner en toverdig hydrokarbongruppe, spesielt C-l til<C>20, eller C6til C16cykloalkylen, arylen eller alkylarylen, mens Y er en gruppe som kan fjernes ved reaksjonen mellom -S-Y og en aminrest i proteinet eller peptidet.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 5,karakterisert vedat X og/eller Y som er like eller forskjellige, utgjøres av en hydrokarbondel -(CH2-)nhvori n er 1 til 6, som bærer en funksjon av typen halogen, karboksyl, sulfinsyre, sulfonsyre, fosforsyrling, fosfonsyrling, fosforsyre, fosfonsyre, aktivt H, SH, amid eller hydroksy.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 5,karakterisert vedat X er et hydrogenatom eller et kation fra en svak base.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 7,karakterisert vedat den gjennomføres ved 20 til 45°C, særlig i tilfellet av enzymer.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8,karakterisert vedatpHi reaksjonsblandingen er 7 til 9 når ditioforbindelsen er en ditioester, og 4 til 7 når forbindelsen er en ditiosyre eller et salt av en svak base av en slik syre.

10. Kjemisk modifisert protein eller peptid fremstilt ifølge kravene 1 - 9, karakterisert vedat minst et av dets nitrogenatomer bærer en gruppe

11. Protein eller peptid som angitt i krav 10, i form av et enzym, karakterisert vedat det er oppløselig i organiske løsningsmidler.

12. Protein eller peptid som angitt i krav 11, særlig protease eller peroksydase, karakterisert vedat det er oppløselig i benzen, toluen, eter, etanol, kloroform og/eller dimetylsulfoksyd, hvor flere lysin-grupper ved hjelp av en -C=S- I gruppe, bærer en gruppe R som utgjøres av et Cx til C20alifatisk radikal, et C6til C16arylradikal eller en polymerkjede, særlig polyetylenglykolkjede.

13. Protein eller peptid som angitt i krav 11,karakterisert vedat det utgjøres av et enzym, særlig hydrolase, som kan katalysere en invers reaksjon, særlig syntese av estere, amider og tioamider og peptider.